Charakterisierung der CX3CR1-/Ly6C-Expression

Um die Charakteristika von eingewanderten Makrophagen und residenten Mikroglia genauer zu untersuchen, wurden im Rahmen der durchflusszytometrischen Untersu-chungen Analysen der Oberflächenantigene CX3CR1, Ly6C, CD86 und CD206 durchgeführt. Die Expression von CX3CR1 und Ly6C wird nachfolgend, die Expres-sion von CD86 und CD206 auf Mikroglia/Makrophagen im nächsten Kapitel (5.2.3.1.2) beschrieben.

Sowohl die Mikroglia- als auch die Makrophagen-Population wurden getrennt auf die Expression der Antigene hin untersucht (siehe Abb. 31). Dabei wurden vier Expres-sionsgruppen unterschieden, die sich als vier Quadranten in Abb. 31 darstellen.

Die Expression der Oberflächenrezeptoren wurde mittels zweier Methoden darge-stellt: als relative Verteilungen der Gesamtpopulationen (siehe Abb. 32) und als Box-Whisker-Plot (siehe Abb. 33). Gleiches gilt für die nachfolgend dargestellten Ergeb-nisse.

Die Mikroglia-Population wies zu allen Infektionszeitpunkten eine hohe Expression von CX3CR1 auf, während Ly6C von weniger Zellen gebildet wurde (siehe Abb. 32A bis C). Eine Doppelexpression von CX3CR1 und Ly6C trat in Folge der TMEV-Infektion bei einigen Zellen auf. Einige der Zellen exprimierten keines der beiden Proteine.

Bei Untersuchung der Expressionszustände von Makrophagen waren mock-infizierte Mäuse entweder doppel-negativ oder nur CX3CR1⁺ (siehe Abb. 32D). Ly6C alleine wurde nur von sehr wenigen Zellen gebildet - wenn es exprimiert wurde, war es zu-sammen mit CX3CR1 auf der Zelloberfläche vorhanden. Wichtig ist es hierbei zu er-wähnen, dass nicht infizierte Tiere nur eine geringe Infiltration peripherer Makropha-gen aufwiesen und daher die Ergebnisse keine optimale Aussagekraft haben. Pi än-derte sich die Expression der Antigene stark und es herrschte ein proinflammatori-scher Phänotyp, gekennzeichnet durch Ly6C⁺ Zellen (nur Ly6C oder in Kombination mit CX3CR1), vor (siehe Abb. 32E und F). Es wurde entsprechend deutlich, dass die einwandernden Makrophagen (und die aktivierten Mikroglia, welche in das CD45^highCD11b⁺-Segment übergewechselt waren) einen proinflammatorischen Cha-rakter aufwiesen.

Abb. 31: Beispiel für die Darstellung der CX3CR1 und Ly6C Verteilung bei der durchflusszyto-metrischen Auswertung. Bei den gezeigten Beispielen handelt es sich um die Daten eines Kontroll-tieres nach Injektion von mock (obere Reihe) und eines TMEV-infizierten Tieres (untere Reihe). Bei der linken Spalte handelt es sich um die Daten für Zellen aus der Mikroglia-Population (CD45^lowCD11b⁺), bei der rechten Spalte um die Zellen aus der Makrophagen-Population (CD45^highCD11b⁺). Die Daten sind als Verteilung zwischen CX3CR1 (y-Achse) und Ly6C Fluores-zenzintensität (x-Achse) dargestellt und in vier Quadranten (Q1-4) aufgestellt. Diese Quadranten er-geben sich durch zwei Trennlinien, die zwischen CX3CR1- bzw. Ly6C-positiven und -negativen Wer-ten trennen. Die prozentualen Anteile der in dem QuadranWer-ten befindlichen Zellen an der insgesamt betrachteten Population sind für das Einzeltier aufgeführt. Diese Prozentwerte wurden für weitere Analysen verwendet.

Abb. 32: Charakterisierung der CX3CR1- und Ly6C-Expression bei verschiedenen Zellpopula-tionen. Zellen, welche zu der Mikroglia-Population (CD45^lowCD11b⁺) oder der Makrophagen-Population (CD45^highCD11b⁺) gehören, wurden auf die Expression von CX3CR1 und Ly6C unter-sucht. Diese Daten wurden mit Hilfe einer durchflusszytometrischen Messung erhoben (siehe dazu Abb. 31). Um eine übersichtlichere und vereinfachte Darstellung zu ermöglichen, wurden die prozen-tualen Anteile der Zellen an den vier Zellenpopulationen (CX3CR1⁺Ly6C^-, CX3CR1^-Ly6C⁺, CX3CR1⁺Ly6C⁺, CX3CR1^-Ly6C^-) errechnet und als Diagramm dargestellt. (A)-(C) zeigen die Expres-sionswerte von Mikroglia, (D)-(F) von Makrophagen. (A) und (D) zeigen die Werte mock-infizierter Kontrolltiere, (B), (C), (E) und (F) TMEV-infizierter Tiere. Als Grundlage für die prozentualen Berech-nungen wurden die Mittelwerte der einzelnen Gruppen (mock Kontrollen (2 und 7 dpi wurden ge-poolt), TMEV-Infektion 2 dpi und TMEV-Infektion 7 dpi) verwendet. Die zugrunde liegenden Rohdaten sind in Tab. 9 und normiert als Box-Whisker-Plots in Abb. 33 dargestellt. Mikroglia zeigten pi eine überwiegende Expression von CX3CR1 (A)-(C). Makrophagen zeigten pi eine Mischung aus CX3CR1⁺Ly6^-- und CX3CR1⁺Ly6⁺ -Zellen^.

Zusätzlich wurden die Expressionswerte der Mikroglia bzw. Makrophagen-Population in Abb. 33 als Box-Whisker-Plots dargestellt.

Mikroglia zeigten bei allen Gruppen eine hohe Expression von CX3CR1 (siehe Tab.

9), welche auch im Verlauf der Infektion relativ konstant blieb (CX3CR1⁺Ly6C^-, siehe Tab. 9 und Abb. 33A). Die Expressionsmenge reduzierte sich nur bei Tieren der Gruppe 7 dpi TMEV signifikant im Verhältnis zu Kontrolltieren⁵⁸. Ly6C hingegegen wurde alleine im Mikroglia Ruhezustand, also in mock-infizierten Tieren, von nur we-nigen Zellen gebildet (siehe Tab. 9); die Expression von Ly6C erhöhte sich bei den Infektionsgruppen in Relation jedoch deutlich⁵⁹ (siehe Abb. 33B). Auch die Anzahl doppelexprimierender Zellen nahm pi stark zu⁶⁰ (siehe Abb. 33C). Rund 20 % der Mikroglia exprimierten weder CX3CR1, noch Ly6C auf ihrer Oberfläche (siehe Tab.

9). Der Anteil dieser Zellen sank in Folge der TMEV-Infektion (mehr Zellen wurden aktiviert), sodass zu den Zeitpunkten 2 und 7 dpi ein statistischer⁶¹ Unterschied nachweisbar war (siehe Abb. 33D).

Bei der Betrachtung der als Makrophagen identifizierten Zellen muss bedacht wer-den, dass mock-infizierte Tiere nur eine sehr geringe Infiltration peripherer Makro-phagen aufwiesen (keine Entzündung, keine Entzündungszellen). Daher waren die Ergebnisse der Expressionsanalysen weniger verlässlich. Die Makrophagen-Population wies, anders als die Mikroglia Zellen, v. a. im Anschluss an die TMEV-Infektion, nur geringe Mengen CX3CR1⁺ Zellen auf (siehe Tab. 9 und Abb. 33E).

Stattdessen exprimierten diese Zellen pi große Mengen des proinflammatorischen Proteins Ly6C (siehe Tab. 9 und Abb. 33F und G) - entweder nur Ly6C⁶², oder als Koexpression Ly6C und CX3CR1⁶³.

58 H-Test p = 0,0145 post-hoc-Test *

59 H-Test p = 0,0003 post-hoc-Test mock vs. TMEV 2 dpi * und 7 dpi **

60

Bei mock-infizierten Mäusen gab es einige Zellen, die keines der beiden Antigene auf ihrer Oberfläche trugen (siehe Tab. 9). Der Anteil dieser Zellen bei Virus-infizierten Mäusen nahm durch die resultierende Aktivierung der Zellen stark ab⁶⁴ (siehe Tab. 9).

Statistisch gesehen unterschieden sich die meisten Infektionsgruppen von ihren Kontrollen zum selben Zeitpunkt. Unterschiede zwischen Tag 2 und 7 pi konnten nicht gemessen werden.

Tab. 9: Werte der CX3CR1-/Ly6C-Expression. Da durch die Normierung der Daten auf das Niveau der Kontrolltiere die Daten über den Anteil der jeweiligen Population an der Gesamtpopulation verlo-ren gegangen sind, wurden die Rohdaten der durchflusszytometrischen Untersuchung in der Tab. als Mittelwert ± SEM für Mikroglia und Makrophagen abgebildet.

Mikroglia CD45^lowCD11b⁺

CX3CR1⁺Ly6C^- CX3CR1^-Ly6C⁺ CX3CR1⁺Ly6C⁺ CX3CR1^-Ly6C -2 dpi mock 76,4 ± 0,71 0,48 ± 0,043 3,49 ± 0,38 19,64 ± 0,79 7 dpi mock 77,01 ± 0,43 0,31 ± 0,02 2,61 ± 0,31 20,03 ± 0,49 2 dpi TMEV 70,44 ± 3,02 2,11 ± 0,63 17,06 ± 3,97 10,71 ± 2,52 7 dpi TMEV 71,77 ± 0,98 1,37 ± 0,21 16,16 ± 3,31 10,54 ± 3,66

Makrophagen CD45^highCD11b⁺

2 dpi mock 29,1 ± 2,96 21,51 ± 1,91 26,28 ± 4,58 23,06 ± 2,86 7 dpi mock 33,23 ± 2,22 18,07 ± 1,64 21,32 ± 3,85 27,43 ± 2,81 2 dpi TMEV 5,67 ± 1,24 48,61 ± 6,07 43,06 ± 7,51 2,671 ± 0,48 7 dpi TMEV 4,31 ± 1,31 44 ± 4,37 48,1 ± 6,45 3,614 ± 1,10

64 H-Test p = 0,0001 post-hoc-Test mock vs. TMEV 2 dpi * und 7 dpi **

Abb. 33: Vergleich der CX3CR1- und Ly6C-Antigenexpression in den Mikroglia- und Makrophagen-Populationen. Die Graphen (A) bis (D)

Prozentuale Veränderung in der CD45lowCD11+ -Population

Anteil der CX3CR1⁺Ly6C^- -Population

*

Prozentuale Veränderung in der CD45highCD11+ -Population

Anteil der CX3CR1⁺Ly6C^- -Population

# #

Anteil der CX3CR1^-Ly6C⁺-Population

** *

Anteil der CX3CR1^-Ly6C⁺-Population

**

Anteil der CX3CR1⁺Ly6C⁺-Population

**

Anteil der CX3CR1⁺Ly6C⁺-Population

***

Anteil der CX3CR1^-Ly6C^- -Population

***

Anteil der CX3CR1^-Ly6C^- -Population

** *