Ccr2-KO-Mäuse

5.3.1.1 Anfälle

Um den Einfluss von Makrophagen auf die Anfallsentstehung zu untersuchen, wur-den Ccr2-KO-Mäuse mit dem DA-Stamm des TMEV-infiziert und für eine Woche auf die Entwicklung von Anfällen hin überwacht. Während dieser sieben Tage zeigten 50

% der infizierten Mäuse (5 von 10) akute Anfälle, was vergleichbar mit der Anfallsin-zidenz von 57,6 % bei B6-Wildtyp-Mäusen ist⁷² (siehe Abb. 45). Um zu untersuchen, ob sich der Schweregrad der akuten Krampfanfälle zwischen den beiden Maus-stämmen unterscheidet, wurden verschiedene Anfallsparameter verglichen. Der ku-mulative Anfallsscore beschreibt die Summe der für einzelne Mäuse erreichten An-fallsschweregrade nach Racine. Dieser unterschied sich nicht beim Vergleich zwi-schen Wildtyp- und Ccr2-KO-Mäusen⁷³ (siehe Abb. 45). Auch der Vergleich zwi-schen maximal erreichtem Anfallsschweregrad⁷⁴ (siehe Abb. 45) und der Gesamtan-zahl von Anfällen pro Maus⁷⁵ (siehe Abb. 45) erbrachte keine Unterschiede. Bei Be-trachtung des maximal erreichten Anfallsschweregrades fiel jedoch auf, dass keine der fünf Mäuse mit Krampfanfällen den maximalen Schweregrad 5 erreichten, wo-hingegen B6-Wildtyp-Mäuse diesen sehr häufig zeigten (siehe Tab. 16).

72 Fisher’s Exact Test p > 0,9999

73 U-Test p = 0,9945

74 U-Test p = 0,3477

75 U-Test p = 0,7331

Tab. 15: Gruppenübersicht Ccr2-KO-Mäuse. Bei dieser Untersuchung wurden ♂ und ♀ Ccr2-KO-Mäuse entweder mit DA-TMEV oder einer mock-Lösung infiziert und für eine Woche auf die Entwick-lung von akuten Anfällen hin beobachtet.

Gruppengrößen Ccr2-KO Untersuchung

Ccr2-KO-Mäuse - akut (7 dpi) [n =]

mock 5 (3 ♂, 2 ♀)

DA 10 (4 ♂, 6 ♀)

Tab. 16: Verteilung der einzelnen Racine Stages bei B6-Wildtyp- und Ccr2-KO-Mäusen. Wäh-rend 63,2 % der beobachteten Anfälle bei B6-Wildtyp-Mäusen den maximalen Schweregrad 5 zeig-ten, konnten bei Ccr2-KO-Mäusen keine Anfälle dieses Schweregrades beobachtet werden. 80 % der Tiere zeigten stattdessen Anfälle vom Typ 4.

Maus- und Virusstamm

Anzahl an Mäu-sen

Anzahl (%) an Mäusen mit maximalen Schweregrad

1 2 3 4 5

B6-Wildtyp mock 0/25 0 0 0 0 0

B6-Wildtyp DA 19/33 0 0 3 (15 %) 4 (21 %) 12 (63 %)

Ccr2-KO mock 0/5 0 0 0 0 0

Ccr2-KO DA 5/10 0 0 1 (20 %) 4 (80 %) 0

Abb. 45: Gegenüberstellung Anfallscharakteristika von B6-Wildtyp und Ccr2-KO-Mäusen. (A) Anzahl an Mäusen mit akuten Anfällen. Die Anfallsprävalenz zwischen B6-Wildtyp-Mäusen und Ccr2-KO-Mäusen in Folge einer DA-TMEV-Infektion unterschied sich nicht (57,6 [19 von 33] vs. 50 % [5 von 10]). Der schwarze Anteil stellt die Mäuse ohne Anfälle, der schraffierte Anteil die Mäuse mit An-fällen dar. Ein Vergleich der beiden Gruppen mittels Fisher’s Exact Test erbrachte keine statistischen Unterschiede (p > 0,9999). (B) Gegenüberstellung des kumulativen Anfallsscores. Es stellten sich keine Unterschiede zwischen B6-Wildtyp- und Ccr2-KO-Mäusen dar. U-Test p = 0,7915. (C) Gegen-überstellung des maximalen Anfallsscores. Es stellten sich keine Unterschiede zwischen B6-Wildtyp- und Mäusen dar (U-Test p = 0,3477), wobei jedoch deutlich wurde, dass es keine Ccr2-KO-Mäuse gab, die den maximalen Schweregrad 5 erreichten. (D) Gegenüberstellung der Gesamtanzahl an Anfällen pro Maus. Es gab keine Unterschiede (U-Test p = 0,2406). Daten in (B), (C) und (D) wur-den als Box-Whisker-Plots mit Median, 25/75 Quartil und Minimum/Maximum dargestellt. Einzelwerte wurden zusätzlich als Kreise eingezeichnet.

B6 CCR2

Mäuse mit vs. ohne akute Anfälle

keine Anfälle (alle Racine stages pro Maus summiert)

B6

CCR2-KO 0

5 10

Anzahl an akuten Anfällen pro Maus

Gesamtanzahl Anfälle pro Maus

DA-infizierte B6-Wildtyp- vs. Ccr2-KO-Mäuse

A B

C D

5.3.1.2 Neurodegeneration

Die Untersuchung der hippocampalen Neurodegeneration und eine Gegenüberstel-lung zwischen B6-Wildtyp- und Ccr2-KO-Mäusen zeigte ein Ausbleiben der neurona-len Degeneration: Während Wildtyp-Mäuse in Folge der DA-TMEV-Infektion eine ausgeprägte hippocampale Neurodegeneration aufwiesen⁷⁶, konnte dies bei Ccr2-KO-Mäusen nicht beobachtet werden. Dementsprechend gab es keine Unterschiede zwischen mock-infizierten und DA-infizierten Ccr2-KO-Mäusen⁷⁷. Eine Unterschei-dung zwischen Mäusen, bei denen akute Anfälle beobachtet wurden und Mäusen, bei denen keine Anfälle beobachtet wurden, ergab sowohl bei KO-Mäusen⁷⁸ als auch bei B6-Wildtyp-Mäusen⁷⁹ keine signifikanten Unterschiede.

Abb. 46: Hippocampale Neurodegeneration bei B6-Wildtyp- und Ccr2-KO-Mäusen an Tag 7 dpi.

Die beiden Graphen zeigen die hippocampale Neurodegeneration (in der Region CA1+2) bei B6-Wildtyp (A) und Ccr2-KO-Mäusen (B). Verglichen werden jeweils mock-Kontrolltiere und DA-TMEV-infizierte Tiere. Während es bei B6-Mäusen zu einem ausgeprägten hippocampalen Nervenzellunter-gang kommt, zeigen Ccr2-KO-Tiere nur basale Scorewerte. Auch besteht zwischen Tieren mit Anfäl-len und ohne Anfälle kein Unterschied. Der neuronale Zellverlust wurde mittels eines semiquantitati-ven Scores beurteilt. Signifikante Unterschiede sind als * (Gruppenvergleich), # (Vergleich mit Kon-trollgruppe) und † (Vergleich zwischen B6 und Ccr2-KO) angegeben und weisen auf einen p-Wert ≤ 0,05 hin. Sie wurden mittels Mann-Whitney U-Test errechnet. Es werden Box-Whisker-Plots mit Me-dian und 25/75 Quartil und Minimum/Maximum gezeigt. In einigen Fällen ist der MeMe-dian nicht sicht-bar, da er in die äußere Box der Plots fällt. Einzelwerte sind zusätzlich als Kreise eingezeichnet.

5.3.1.3 Aktivierte Makrophagen/Mikroglia

Um die Entzündungsantwort im Rahmen der TMEV-Infektion bei Ccr2-KO-Mäusen zu charakterisieren, wurden Gehirnschnitte gegen Mac3 gefärbt, sodass aktivierte Mikroglia und eingewanderte Makrophagen quantifiziert werden konnten. Während die Entzündungsantwort bei B6-Wildtyp-Mäusen sehr ausgeprägt war, stellte sich diese bei Ccr2-KO-Mäusen nur basal dar. Dies bestätigt die Hypothese, wonach die genetische Veränderung bei diesen Mäusen dazu führt, dass periphere Monozyten nicht mehr in das Gehirnparenchym einwandern können. Infizierte KO-Mäuse unter-scheiden sich nicht von den mock Kontrollen⁸⁰, wohingegen infizierte B6-Mäuse deutlich mehr Mikroglia/Makrophagen im Hippocampus aufweisen als die Kontrol-len⁸¹. Die Unterschiede zwischen Wildtyp und transgenen Mäusen sind signifikant⁸². Untersucht man die Mikroglia-/Makrophagen-Reaktion bei Tieren ohne bzw. mit An-fällen, unterschied sich diese bei Wildtyp Mäusen signifikant⁸³, wohingegen sie sich bei KO-Mäusen nur als Tendenz⁸⁴ darstellten. Durch die genetische Ausschaltung von Ccr2 kam es zu einer starken Reduktion von Mikroglia/Makrophagen im hippo-campalen Parenchym.

80 U-Test p = 0,6144

81 U-Test p = 0,0010

82 U-Test DA-infizierte B6 vs. Ccr2-KO p = 0,0005

83 U-Test p = 0,0119

84 U-Test p = 0,0556

Abb. 47: Statistik über aktivierte Mikroglia und Makrophagen im Hippocampus, 7 dpi, Verglei-chend zwischen Ccr2-KO- und Wildtyp-B6-Mäusen. Die dargestellten Graphen stellen die Auswer-tung der hippocampalen Mac3-positiven Zellen dar. Die AuswerAuswer-tung wurde mittels semiquantitativem Score ausgewertet. Dabei sind Ccr2-KO-Mäuse mit B6-Wildtyp-Mäusen verglichen worden. Während DA-infizierte B6-Mäuse eine ausgeprägte Entzündungsantwort zeigten, welche sich von der Kontroll-gruppe unterschied, waren im Hippocampus von Ccr2-KO-Mäusen nur geringe Mengen an Entzün-dungszellen zu finden. Dabei gab es bei DA-infizierten Tieren statistische Unterschiede zwischen Ccr2-KO- und B6-Mäusen. Mäuse, bei welchen akute Anfälle beobachtet wurden, zeigten nur eine statistische Tendenz zu mehr aktivierten Mikroglia und Makrophagen im Vergleich zu Mäusen ohne Anfälle (U-Test p = 0,0556). Bei B6-Mäusen war der Unterschied zwischen Mäusen mit und ohne An-fälle signifikant (U-Test p = 0,0119). Die Daten sind als Box-Whisker-Plots aufgetragen. Statistisch signifikante Unterschiede sind als *, † oder # dargestellt (*/†/# p ≤ 0,05; †† p ≤ 0,01; ††† p ≤ 0,001), wobei # Unterschiede zur Kontrollgruppe, * Unterschiede zwischen einzelnen Gruppen und † Unter-schied zwischen Mausstämmen darstellt. Es werden Box-Whisker-Plots mit Median und 25/75 Quartil und Minimum/Maximum gezeigt. In einigen Fällen ist der Median nicht sichtbar, da er in die äußere Box der Plots fällt. Einzelwerte sind zusätzlich als Kreise eingezeichnet.

mock B6 DA B6 DA

aktivierte Mikroglia / Makrophagen (7 dpi)

#

*

aktivierte Mikroglia / Makrophagen (7 dpi)

0.0556

††† ††

A B