Charakterisierung der CD86-/CD206-Expression

5 Ergebnisse

5.2.3 Durchflusszytometrische Untersuchungen

5.2.3.1 B6-Wildtyp-Mäuse

5.2.3.1.2 Charakterisierung der CD86-/CD206-Expression

Nachfolgend wird die Expression von CD86 (einem Marker für einen M1-ähnlichen Phänotyp) und CD206 (einem Marker für einen M2-ähnlichen Phänotyp) auf Mikrog-lia/Makrophagen beschrieben (siehe Abb. 34). Wie bereits im vorherigen Kapitel wurden die Mikroglia- und Makrophagen-Populationen von mock- oder TMEV-infizierten Mäusen untersucht.

Abb. 34: Beispiel für die Darstellung der CD86- und CD206-Verteilung bei der durchflusszyto-metrischen Auswertung. Bei den dargestellten Beispielen handelt es sich um die Daten eines mock-infizierten Tieres (obere Reihe) und eines TMEV-mock-infizierten Tieres (untere Reihe). Bei der linken Spal-te handelt es sich um die DaSpal-ten für Zellen aus der Mikroglia-Population (CD45^lowCD11b⁺), bei der rechten Spalte um die Zellen aus der Makrophagen-Population (CD45^highCD11b⁺). Die Daten sind als Verteilung zwischen CD86 (y-Achse, ein Marker für M1-artige Zellen) und CD206 Fluoreszenzintensi-tät (x-Achse, ein Marker für M2-artige Zellen) dargestellt und in vier Quadranten (Q1-4) eingeteilt.

Diese Quadranten ergeben sich durch zwei Trennlinien, die zwischen CD86 bzw. CD206 positiven und negativen Werten trennen. Die prozentualen Anteile der in dem Quadranten befindlichen Zellen an der insgesamt betrachteten Population sind für das Einzeltier aufgeführt. Diese Prozentwerte kön-nen für weitere Analysen verwendet werden. Mögliche Phänotypen waren CD86⁺CD206^- (M1-Phänotyp), CD86^-CD206⁺ (M2-Phänotyp), CD86⁺CD206⁺ (gemischter M1/M2 Phänotyp) und CD86 -CD206^- (ohne phänotypische Marker)

Die Mikroglia-Population mock-infizierter Mäuse zeigte überwiegend keine Expressi-on phänotypischer Marker, ansExpressi-onsten vor allem einen M2-artigen Phänotyp (siehe Abb. 35A). In Folge der TMEV-Infektion ging der Anteil an Zellen ohne M1/Phänotyp deutlich zurück, und die Zellen zeigten entweder einen M1- oder M2-artigen Phänotyp. Ein gemischter Phänotyp trat nur bei sehr wenigen Zellen auf (siehe Abb. 35B und C). Die weitaus meisten Zellen exprimierten CD206, was für einen Zustand alternativer Aktivierung sprach, welcher v. a. für Gewebsreparatur und Abmilderung der Entzündungsantwort steht.

Mock-infizierte Mäuse wiesen in der Makrophagen-Population eine Mischung aus Zellen der verschiedensten Antigenkombinationen auf (siehe Abb. 35D), wobei hier darauf hingewiesen werden muss, dass diese Zellpopulation nur sehr klein und die Aussagekraft daher nicht sehr hoch war. Bei TMEV-infizierten Tiere zeigten 62,5 % bzw. 34 % der Zellen einen gemischten M1+M2-artigen Phänotyp, 23 % bzw. 54,2 % der Zellen waren hingegen alleinige Expressoren von CD86. Nur wenige Zellen zeig-ten eine alleinige Expression von CD206.

Die Mikroglia-Population mock-infizierter Mäuse zeigte überwiegend keine Expressi-on phänotypischer Marker, ansExpressi-onsten vor allem einen M2-artigen Phänotyp (siehe Abb. 35A). In Folge der TMEV-Infektion ging der Anteil an Zellen ohne M1/Phänotyp deutlich zurück und die Zellen zeigten entweder einen M1- oder M2-artigen Phänotyp. Ein gemischter Phänotyp trat nur bei sehr wenigen Zellen auf (siehe Abb. 35B und C). Die weitaus meisten Zellen exprimierten CD206, was für einen Zustand alternativer Aktivierung sprach, welcher v. a. für Gewebsreparatur und Abmilderung der Entzündungsantwort steht.

Abb. 35: Charakterisierung der CD86- und CD206-Expression bei verschiedenen Zellpopulatio-nen. Zellen welche zu der Mikroglia-Population (CD45^lowCD11b⁺) oder der Makrophagen-Population (CD45^highCD11b⁺) gehören, wurden mittels Durchflusszytometrie auf die Expression von CD86 (Mar-ker für Zellen eines M1-ähnlichen Phänotyps) und CD206 (Mar(Mar-ker für Zellen eines M2-ähnlichen Phänotyps) untersucht. Siehe Abb. 32 für weitere Informationen. Die zugrunde liegenden Werte sind in Tab. 10 aufgeführt und normiert als Box-Whisker-Plots in Abb. 36 dargestellt.

In der Box-Whisker-Plot Darstellung (siehe Abb. 36) zeigten Mikroglia bei mock-infizierten Mäusen eine variable Expression der Oberflächenantigene: Während nur geringe Mengen der Zellen CD86⁺CD206^- waren, zeigten viele Zellen eine CD206-Expression (siehe Tab. 10). Hierbei wurde jedoch die große Streuung deutlich: Wäh-rend manche Tiere nur einen basalen Anteil an Zellen mit diesen Strukturen aufwie-sen v. a. CD206+ und CD86-CD206-), präaufwie-sentierten andere hier große Zellzahlen

hung der CD86⁺ Zellen⁶⁵. Im Gegensatz dazu schwand der Anteil der CD86^-CD206 -Zellen⁶⁶. Andere Populationen unterschieden sich nicht von den Kontrollgruppen.

Makrophagen stellten sich als Gruppe mit gemischter Antigenzusammensetzung dar. Die überwiegende Anzahl der Makrophagen pi exprimierte CD86 (CD86⁺CD206⁺ oder CD86⁺CD206^-). Der Anteil CD206-bildender Zellen verringerte im Infektionsverlauf, allerdings erst 7 dpi⁶⁷ (siehe Abb. 36E). Gleichzeitig stieg der Anteil CD86⁺-Zellen im Zuge einer Infektion im Vergleich zu Kontrolltieren 7 dpi deut-lich an⁶⁸ (siehe Abb. 36F). Die CD86^-CD206^--Population sank durch die Aktivierung der Zellen entsprechend 2 und 7 dpi ab⁶⁹ (siehe Abb. 36H).

Tab. 10: Werte der CD86-/CD206-Expression. Da durch die Normierung der Daten anhand der Kon-trolltiere die Daten über den Anteil der jeweiligen Population an der Gesamtpopulation verloren ge-gangen sind, wurden die Rohdaten der durchflusszytometrischen Untersuchung in der Tab. als Mit-telwert ± SEM für Mikroglia und Makrophagen abgebildet.

Mikroglia CD45^lowCD11b⁺

CD86⁺CD206^- CD86^-CD206⁺ CD86⁺CD206⁺ CD86^-CD206 -2 dpi mock 6,05 ± 2,96 29,14 ± 9,49 2,43 ± 0,28 44,99 ± 12,98 7 dpi mock 4,78 ± 2,38 26,54 ± 8,58 1,86 ± 0,22 48,89 ± 12,85 2 dpi TMEV 16,23 ± 7,61 42,16 ± 14,34 2,69 ± 0,37 25,36 ± 11,17 7 dpi TMEV 13,51 ± 6,11 34,5 ± 14,51 1,76 ± 0,49 30,09 ± 13,53

Makrophagen CD45^highCD11b⁺

2 dpi mock 28,87 ± 6,28 14,31 ± 5,45 36,84 ± 2,35 19,83 ± 2,86 7 dpi mock 30,99 ± 8,11 13,87 ± 5,37 30,97 ± 1,99 24,16 ± 4,21 2 dpi TMEV 23,02 ± 4,36 8,17 ± 2,68 62,56 ± 1,81 6,25 ± 0,29 7 dpi TMEV 54,16 ± 8,00 4,61± 2,02 34,03 ± 4,58 7,19 ± 2,10

65 H-Test p = 0,0214 post-hoc-Test mock vs. TMEV 2 dpi *, 7 dpi ns

Abb. 36: Vergleich der CD86- und CD206-Antigenexpression in den Mikroglia- und Makrophagen-Populationen. Die Unterschiede zwischen den Infektionsgruppen (mock vs. TMEV-infizierte Mäuse zu zwei Zeitpunkten (2 und 7 dpi)) sind aufgetragen, wobei statistische Unterschiede

zwi-2 dpi mock 7 dpi mock zwi-2 dpi TMEV

Anteil der CD86^-CD206⁺-Population

2 dpi mock 7 dpi mock 2 dpi TMEV

Anteil der CD86^-CD206⁺-Population

Anteil der CD86⁺CD206^- -Population

Anteil der CD86⁺CD206⁺-Population

2 dpi mock 7 dpi mock 2 dpi TMEV

Anteil der CD86⁺CD206⁺-Population

Anteil der CD86^-CD206^- -Population

5.2.3.2 Cx3cr1-Reporter-Mäuse

Um eine bessere Unterscheidung zwischen Mikroglia und Makrophagen vor allem hinsichtlich ihrer Aktivierungszustände nach Virusinfektion zu ermöglichen, wurden induzierbare Cx3cr1-Reporter-Mäuse verwendet. In diesen Mäusen konnten auch Zellen identifiziert werden, die durch Änderung ihrer Oberflächenantigene „schein-bar“ in eine andere Zellpopulation gewechselt hatten. Diese Mäuse wurden wie die vorher dargestellten Tiere mit dem DA-TMEV-Stamm oder einer mock-Lösung infi-ziert und 2 bzw. 7 dpi getötet. Es wurden zwei zeitlich voneinander getrennte Versu-che durchgeführt⁷⁰: Bei dem ersten Versuch wurden Gehirne 2 und 7 dpi, bei dem zweiten Versuch nur 7 dpi untersucht. Entsprechend wurden während des ersten Versuches manche Mäuse nur für zwei Tage auf die Entwicklung von Anfällen über-wacht. Es kann daher nicht ausgeschlossen werden, dass diese Tiere im weiteren Verlauf Anfälle gezeigt hätten.

Die Tiere wurden täglich für zwei Stunden hinsichtlich der Entwicklung von Anfällen kontrolliert. Zwei DA-infizierte Tiere verstarben während der Versuchsphase an sehr stark ausgeprägten Anfällen (SE). Insgesamt zeigten insgesamt 82 % (14 von 17) der Tiere einen oder mehrere Anfälle. Zwölf der 14 Mäuse mit Anfällen präsentierten diese bereits an Tag 2 pi, wobei 10 dieser Tiere ausschließlich an Tag 2 Anfälle zeigten. Nur drei Tiere hatten an mehr als nur einem Tag Anfälle. Der späteste Anfall wurde an 6 dpi beobachtet.

70 Gruppengrößen:

Durchgang 1: Placebo 2 und 7 dpi n = 2 / 3, TMEV 2 und 7 dpi n = 4 (ursprünglich 3 Kontrolltiere

Tab. 11: Anfälle und Schweregradverteilung bei Cx3cr1-Reporter-Mäusen. Siehe vergleichend Tab. 7. Zu beachten ist, dass 5 der DA-infizierten Mäuse nur bis Tag 2 dpi untersucht wurden.

Anfälle, Racine Score -

Maximaler Anfallsschweregrad in Cx3cr1-Reporter-Mäusen

Virusstamm Anzahl an Mäusen Anzahl (%) an Mäusen mit maximalen Schweregrad

1 2 3 4 5

mock 0/10 0 0 0 0 0

DA 14/17 0 0 7 (50 %) 1 (7 %) 6 (42 %)

Betrachtete man zunächst, ohne Berücksichtigung der tdTomato-Expression, die Mikroglia- (CD45^lowCD11b⁺) und Makrophagen-Populationen (CD45^highCD11b⁺), so zeigten sich mit B6-Wildtyp-Mäusen vergleichbare Ergebnisse (keine statistischen Unterschiede zwischen den beiden Mausgruppen⁷¹). So kam es auch bei Cx3cr1 Reporter Mäusen pi zu einem Anstieg der Makrophagen-Zahl im Gehirn (siehe Abb.

37C). Die Mikroglia-Population im Mäusegehirn änderte sich hingegen nicht (siehe Abb. 37A). Durch die geringen Gruppengrößen bei dieser Untersuchung bedingt, konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede erreicht werden, teilweise je-doch Tendenzen (siehe Abb. 37). Für eine bessere Vergleichbarkeit der Ergebnisse mit den B6-Wildtyp-Mäusen wurden diese Gruppen in Abb. 37C und D zusammen-gefasst. Dabei wurde ersichtlich, dass sich die Werte der beiden Tiergruppen über-schnitten. Mit den größeren Gruppenzahlen ließen sich die statistischen Unterschie-de besser berechnen und es wurUnterschie-den Unterschie-deutliche UnterschieUnterschie-de Unterschie-der Infektionsgruppen zu den entsprechenden Kontrollgruppen deutlich (siehe Abb. 37D).

71 H-Tests Mikroglia WT vs. Reporter 2 dpi und 7 dpi p = 0,0599;

Makrophagen WT vs. Reporter 2 dpi und 7 dpi p = 0,1434

Abb. 37: Auswertung der Cx3cr1-Reporter-Mäuse nach den gewöhnlichen CD45^lowCD11b⁺- bzw. CD45^highCD11b⁺-Populationen und Vergleich mit B6-Wildtyp-Mäusen. Reportermäuse wurden in den Graphen als rote Kreis dargesellt, während Wildtyp-B6-Mäuse für einen besseren Vergleich der Ergebnisse als graue (mock) bzw. schwarze (infiziert) Kreise eingezeichnet wurden.

(A) und (C) stellen die relativen Veränderungen der Zellzusammensetzungen 2 und 7 dpi bei Cx3cr1 Reporter-Mäusen dar. Bei der Mikroglia-Population (CD45^lowCD11b⁺) kam es im Anschluss an die Infektion zu keiner statistischen Veränderung der Zellpopulation (A). Bei der Makrophagen-Population (CD45^highCD11b⁺ ) hingegen kam es zu beiden Zeitpunkten zu einem Anstieg der Zell-population (2 dpi Tendenz p = 0,0571, 7 dpi p < 0,0001). (B) und (D) zeigen die in (A) und (C) ge-zeigten Daten zusammen mit den im vorangegangen Kapitel gege-zeigten B6-Wildtyp-Mäusen. Die Werte der beiden Mauspopulationen unterschieden sich nicht signifikant voneinander und zeigten eine ähnliche Verteilung. Makrophagen nahmen zu beiden Zeitpunkten zu. Mikroglia änderten sich nur zum Zeitpunkt 2 dpi im Vergleich zu den Kontrollen. Statistische Unterschiede wurden als # (Un-terschied zur Kontrollgruppe, p ≤ 0,05) und * (Un(Un-terschied zwischen zwei Zeitpunkten) gekenn-zeichnet. Statistischer Test: Mann-Whitney U-Test. Daten wurden als Box-Whisker-Plots mit Medi-an, 25/75 Quartil und Minimum/Maximum dargestellt. In einigen Fällen ist der Median nicht sichtbar, da er in die äußere Box der Plots fällt.

Durch die Verwendung von Cx3cr1-Reporter-Mäusen wurde die Differenzierung zwi-schen Makrophagen, welche in das Gehirn einwandern und nicht fluoreszenzmar-kiert sind, und Mikroglia, die ortsständig im Gehirn vorhanden sind und den Fluores-zenzfarbstoff tdTomato exprimieren, ermöglicht. Zunächst erfolgte für die Zellcharak-terisierung die Einteilung der Zellen nach den bisher angewandten Kriterien:

CD45^lowCD11b⁺ Zellen wurden als Mikroglia-Population angesehen, CD45^highCD11b⁺Zellen als Makrophagen-Population. Durch die Unterscheidung zwi-schen tdTomato⁺ und tdTomato^- Zellen konnten vier Mikroglia-/Makrophagen-Populationen unterteilt werden (siehe Abb. 38).

Abb. 38: Beschreibung der Unterscheidung verschiedener Mikroglia- und Makrophagen-Populationen. Wie bei den vorangegangenen Experimenten wurden aus mock bzw. TMEV-infizierten Gehirnen Zellen isoliert, gefärbt und mit Hilfe eines Durchflusszytometers analysiert. Die erste Diffe-renzierung der Zellen wurde mit Hilfe der Marker CD11b und CD45 vorgenommen. Zellen mit den Eigenschaften CD45^highCD11b⁺ wurden als Makrophagen-Population angesehen, Zellen mit den Ei-genschaften CD45^lowCD11b⁺ als Mikroglia-Population. Da bei dem vorliegenden Experiment Cx3cr1-Reporter-Mäuse verwendet wurden, konnten die beiden beschriebenen Populationen weiter in tdTo-mato⁺ oder tdTomato^- Zellen unterteilt werden. So konnten die Populationen A bis D (siehe Abb. 38) beschrieben und untersucht werden. Als Beispiel wird hier eine mock-infizierte Maus zum Zeitpunkt 7 dpi gezeigt.

Population A sind tdTomato⁺ Makrophagen. Diese Zellen stammen von gehirnstän-digen Mikroglia ab, da sie den Fluoreszenzfarbstoff exprimieren, weisen jedoch den Phänotyp von Makrophagen auf, weshalb sie als „Mikroglia-stämmige Makrophagen“

bezeichnet wurden.

Bei Population B handelt es sich um tdTomato^- Makrophagen. Diese Zellen reprä-sentieren die klassischen Makrophagen, die als Monozyten aus dem Blut in das Ge-hirn eingewandert sind.

Bei den Populationen C und D handelt es sich um Mikroglia. Dabei sind Mikroglia, welche tdTomato⁺sind, die klassischen Mikroglia, die ortsständig im Gehirn vor-kommen und sich auch phänotypisch als Mikroglia darstellen. Dahingegen sind tdTomato^- Mikroglia entweder eingewanderte Monozyten, welche den Phänotyp von Mikroglia eingenommen haben oder eigentliche Mikroglia, bei denen das Reporter-Genkonstrukt nicht funktionell ist. Da in dieser Population (D) nur sehr wenige Zellen vertreten waren und Aussagen über diese Zellgruppe nicht aussagekräftig wären, wurde diese Population bei weiteren Analysen nicht berücksichtigt.

Eine Analyse der Verteilung von tdTomato⁺ bzw. tdTomato^- Zellen in der Mikroglia- und Makrophagen-Population gab weitere Aufschlüsse über die Funktionalität des Reporter-Genkonstruktes und die Zellverteilung. Im ersten Experiment waren mehr als 90 % der CD45^lowCD11b⁺ Zellen sowohl bei mock-infizierten als auch TMEV-infizierten Tieren tdTomato⁺ (siehe Abb. 1A). Dies erlaubte eine Aussage über die Funktionsfähigkeit der genetischen Veränderungen: Fast alle Mikroglia Zellen expri-mierten den spezifischen Marker. Im zweiten Versuch (siehe Abb. 39B) war der An-teil der tdTomato⁺ Mikroglia zwar geringer (74,84 ± 6,945 %), jedoch war die Menge der Fluoreszenz-positiven Zellen bei diesen Mäusen hoch genug, um Mikroglia von Makrophagen unterscheiden zu können.

Bei infizierten Tieren (2 und 7 dpi) exprimierten die meisten Zellen tdTomato nicht:

Es handelte sich hier um eingewanderte Zellen. Fünfzehn bis 20 % der Zellen waren hingegen tdTomato⁺: Hierbei handelte es sich um aktivierte Mikroglia. Durch die Verwendung der transgenen Mäuse war es im Gegensatz zum Einsatz von B6-Wildtyp-Mäusen entsprechend möglich, die Population der CD45^highCD11b⁺

Makro-Abb. 39: Verhältnis und zeitlicher Verlauf der tdTomato⁺ und tdTomato^- Zellen in der Mikroglia- und Makrophagen-Population. (A) und (C) zeigen die Ergebnisse aus dem ersten Versuch, (B) und (D) aus dem zweiten Experiment. In (A) sind Zellen der klassischen Mikroglia-Population aufgeführt.

Hierbei ist ersichtlich, dass mehr als 90 % dieser Zellen tatsächlich aus dem Gehirn stammten (sie waren tdTomato⁺). Im zweiten Versuch (B) war die Effizienz des Genkonstruktes nicht so hoch wie im vorangegangen Versuch. Dennoch lag die Effizienz bei rund 75 %, was eine gute Aussagekraft impli-zierte. In (C) und (D) sind Zellen der klassischen Makrophagen-Population aufgeführt. Hier wird deut-lich, dass diese Population aus tdTomato⁺ und tdTomato^- Zellen bestand. In Folge einer TMEV-Infektion kam es jedoch zur Aktivierung von Mikroglia plus Einwanderung von Makrophagen in das Gehirn. Dabei traten dann sowohl Makrophagen, die von Monozyten abstammten (tdTomato^-), als auch Makrophagen, die von Mikroglia abstammten (tdTomato⁺) auf. Daten wurden als Mittelwert mit Standardfehler dargestellt.

CD45^lowCD11b⁺tdTomato

+/-2+7

CD45^highCD11b⁺tdTomato

+/-tdTomato pos.

CD45^highCD11b⁺tdTomato

+/-CD45 high CD1 1b + Makrophagen CD45 low CD1 1b + Mikroglia

Versuch 1 Versuch 2

A B

C D

5.2.3.2.1 Charakterisierung der CX3CR1-/Ly6C-Expression

Während Kontrolltiere überwiegend keine Marker oder nur CX3CR1 exprimierten, kam es in Folge der Infektion 2 und 7 dpi zu einem weiteren Anstieg der CX3CR1+Ly6C--Population (siehe Abb. 40A bis C). Diese Aktivierung war 2 dpi noch nicht sichtbar und stellte sich erst 7 dpi dar. Nur wenige Zellen waren CX3CR1+Ly6C+ oder CX3CR1-Ly6C-.

Die Populationen der Mikroglia- und Monozyten-stämmigen Makrophagen enthielten ohne Infektion nur sehr wenige Zellen, was die Aussagekraft über diese Population erschwerte. Mikroglia-stämmige Makrophagen (siehe Abb. 40D-F) zeigten ohne In-fektion (mock-InIn-fektion) eine Mischung aus verschiedenen Zellen: Es überwogen dabei doppelt-negative Zellen und ausschließlich CX3CR1 exprimierende Zellen.

Nur 18 % der Zellen waren CX3CR1-Ly6C+. Pi kam es jedoch zu einer deutlichen Zunahme der CX3CR1-Ly6C+-Population (von 18 auf 58 bzw. 54 %). Dies sprach für eine Aktivierung der Zellen.

Bei Monozyten-stämmigen Makrophagen (siehe Abb. 40G-I) kam es im Zuge der TMEV-Infektion zu einer deutlichen Zunahme der CX3CR1-Ly6C+-Zellen (84 und 62

%). Dahingegen waren nur sehr wenige Zellen CX3CR1+Ly6C-. Einige Zellen wie-sen jedoch eine Doppelexpression von CX3CR1 und Ly6C auf (7 bzw. 26 %).

In den Box-Whisker-Plots (siehe Abb. 41) wird deutlich, dass es in der Mikroglia-Population durch die TMEV-Infektion zu einer deutlichen Zunahme der CX3CR1-Expression kam (Abb. 41A). Im Gegenzug kam es 7 dpi zu einer Verringerung der Ly6C+ und CX3CR1+Ly6C+ Zellen (41B und C).

Die Komposition der Mikroglia-stämmigen Makrophagen änderte sich pi v. a. in dem Sinne, dass Zellen mit CX3CR1+Ly6C+-Expression deutlich zunahmen (Abb. 41G).

Auch Monozyten-stämmige Makrophagen zeigten eine Zunahme dieses Zelltyps (Abb. 41K). Bei allen drei Mikroglia-/Makrophagen-Populationen kam es durch die Aktivierung der Zellen als Reaktion auf die virale Infektion zu einer Verminderung der doppelt-negativen Zellen (Abb. 41D, H und L).

Abb. 40: Charakterisierung der CX3CR1- und Ly6C-Expression bei verschiedenen Zellpopula-tionen. Mikroglia-Population (CD45^lowCD11b⁺tdTomato⁺) oder Makrophagen-Populationen (CD45^highCD11b⁺tdTomato^+/-) wurden wie bereits in Abb. 32 beschrieben charakterisiert. Die zugrunde liegenden Werte sind in Tab. 12 zu finden und normiert als Box-Whisker-Plots in Abb. 41 dargestellt.

TMEV 2 dpi mock 2+7 dpi

CD45lowCD11b+TdTomato+CD45highCD11b+TdTomato+ CD45highCD11b+TdTomato- Mikroglia-stämmige MakrophagenMonozyten-stämmige MakrophagenKlassiche Mikroglia

TMEV 7 dpi

Tab. 12: CX3CR1-/Ly6C-Expressionswerte der Zellpopulationen. Auflistung der Expressions-werte als MittelExpressions-werte mit Standardfehler.

Mikroglia CD45^lowCD11b⁺ tdTomato⁺

CX3CR1+Ly6C- CX3CR1-Ly6C+ CX3CR1+Ly6C+ CX3CR1-Ly6C- 2 dpi mock 27,13 ± 3,00 1,76 ± 0,37 10,11 ± 0,92 61,03 ± 3,58 7 dpi mock 37,65 ± 8,22 2,78 ± 1,53 11,70 ± 2,09 47,87 ± 6,47 2 dpi TMEV 60,13 ± 7,29 0,40 ± 0,12 5,61 ± 1,28 33,83 ± 7,44 7 dpi TMEV 70,06 ± 2,95 0,41 ± 0,06 5,70 ± 0,46 23,84 ± 3,09

Makrophagen CD45^highCD11b⁺ tdTomato⁺

2 dpi mock 33,00 ± 5,73 7,94 ± 2,13 11,35 ± 1,29 47,73 ± 3,18 7 dpi mock 27,47 ± 7,05 13,67 ± 3,94 24,38 ± 4,85 34,48 ± 6,15 2 dpi TMEV 32,73 ± 2,63 2,59 ± 0,59 58,30 ± 3,50 6,42 ± 1,22 7 dpi TMEV 20,65 ± 0,92 14,11 ± 1,25 53,53 ± 1,93 11,68 ± 1,02

Makrophagen CD45^highCD11b⁺tdTomato

-2 dpi mock 12,40 ± 4,09 14,93 ± 5,26 16,97 ± 4,12 55,73 ± 7,25 7 dpi mock 4,45 ± 1,12 26,90 ± 6,23 9,61 ± 2,28 59,02 ± 4,74 2 dpi TMEV 1,02 ± 0,45 7,41 ± 0,99 84,95 ± 1,39 6,61 ± 0,54 7 dpi TMEV 1,37 ± 0,17 27,84 ± 2,24 60,34 ± 2,55 10,47 ± 0,81

Abb. 41: Vergleich der CX3CR1- und Ly6C-Antigenexpression in den Mikroglia- und Makrophagen-Populationen. Untersucht wurden Mikro-glia (CD45^lowCD11b⁺tdTomato⁺, A-D), Mikroglia-stämmige Unter-schiede zur Kontrollgruppe wurden mit

#, Unterschiede zwischen Infektions-gruppen mit * gekennzeichnet (p ≤ 0,05), H-Test. Daten wurden als Box-Whisker-Plots mit Median, 25/75 Quartil und Minimum/Maximum dar-gestellt. In einigen Fällen ist der Me-dian nicht sichtbar, da er in die äußere Box der Plots fällt. Einzelwerte wurden zusätzlich als Kreise eingezeichnet.

Prozentuale Veränderung in der CD45lowCD11+ Population

Anteil der CX3CR1⁺Ly6C^- -Population

Prozentuale Veränderung in der CD45highCD11+tdT+-Population

Anteil der CX3CR1⁺Ly6C^- -Population ns

Prozentuale Veränderung in der CD45highCD11+tdT--Population

Anteil der CX3CR1⁺Ly6C^- -Population

0.0007

Anteil der CX3CR1^-Ly6C⁺-Population

** *

Anteil der CX3CR1^-Ly6C⁺-Population

0.0242

Anteil der CX3CR1⁺Ly6C⁺-Population

***

Anteil der CX3CR1⁺Ly6C⁺-Population 0.0009

Anteil der CX3CR1^-Ly6C^- -Population

Anteil der CX3CR1⁺Ly6C^- -Population

***

Anteil der CX3CR1⁺Ly6C^- -Population

0.0003

# #

CD45lowCD11b+tdTomato+CD45highCD11b+tdTomato+highCD11b+tdTomato- Mikroglia-stämmige MakrophagenKlassiche Mikroglia

A B C D

E F G H

I J K L

5.2.3.2.2 Charakterisierung der CD86-/CD206-Expression

Mikroglia aus mock-infizierten Mäusen exprimierten weitestgehend keinen der bei-den Marker (siehe Abb. 42A). Während der viralen Infektion verblieb der Großteil der Zellen doppelt-negativ (siehe Abb. 42B und C). Zum Zeitpunkt 7 dpi wiesen circa 32

% der Zellen einen M1-ähnlichen Phänotyp auf, was durch den hohen Anteil CD86+

Zellen angezeigt wurde (siehe Abb. 42C).

Die Population der Mikroglia- und Monozyten-stämmigen Makrophagen enthielten ohne Infektion nur sehr wenige Zellen, was die Aussagekraft über diese Population erschwerte. In beiden Populationen fanden sich Zellen verschiedener Expressions-typen. Durch die Infektion kam es bei Mikroglia-stämmigen Makrophagen zu einer deutlichen Zunahme CD86⁺Zellen, was v. a. an Tag 7 pi sichtbar wurde (siehe Abb.

42E und F). Der Anteil CD206⁺ Zellen nahm im Verlauf der Infektion ab (2 dpi: 18 %;

7 dpi 3 %) (siehe Abb. 42E und F). Monozyten-stämmige Makrophagen zeigten pi einen sehr ausgeprägten M1-ähnlichen Phänotyp (gekennzeichnet durch einen ho-hen Anteil CD86⁺ Zellen, siehe Abb. 42H und I). Ein gemischter Phänotyp konnte 7 dpi bei 10 % der Zellen identifiziert werden (siehe Abb. 42I).

Die in den Box-Whisker-Plots dargestellten normierten Expressionsänderungen stel-len die oben bereits dargestellten Befunde in anderer Form dar. Mikroglia zeigten im Zuge der TMEV-Infektion zum Zeitpunkt 2 dpi eine starke Zunahme der CD86⁺CD206^- Zellen (siehe Abb. 43A). Diese Zellgruppe nahm zum Zeitpunkt 7 dpi jedoch wieder ab und unterschied sich dann nicht mehr von den entsprechenden Be-funden der Kontrolltiere. CD206⁺ Zellen nahmen hingegen 7 dpi ab (siehe Abb. 43B).

Mikroglia-stämmige Makrophagen zeigten durch die virale Infektion eine deutliche Zunahme CD86 exprimierender Zellen (siehe Abb. 43E). Auch hier nahm der Anteil CD206⁺ Zellen, allerdings nur zum Zeitpunkt 7 dpi, ab (siehe Abb. 43F). Auch bei Monozyten-stämmigen Makrophagen kam es zu einer deutlichen Zunahme der CD86⁺ Zellen und einer Abnahme der CD206⁺ Zellen (siehe Abb. 43I und J). Bei Mikroglia- und Monozyten-stämmigen Makrophagen kam es zu einem Rückgang der

Im Dokument Die Rolle der Leukozyteninfiltration im Gehirn für die Entstehung von Anfällen im Theiler Virus-Modell der Temporallappenepilepsie (Seite 120-139)