Durchflusszytometrie (FACS)

Zwar gab eine histologische Untersuchung Aufschluss über den Charakter einer Entzündung und über die Anwesenheit von verschiedenen Entzündungszellen im Gehirn, allerdings erlaubte es diese Methode nicht, sehr ähnliche Entzündungszell-populationen im Gehirnparenchym zu differenzieren. Für solche Analysen verwendet man die Durchflusszytometrie (engl.: Flow cytometry), welche es ermöglicht, einzel-ne Zellen anhand ihrer Fluoreszenzintensität zu unterscheiden.

Diese Methodik ermöglicht es, Entzündungszellen im Gehirn zu differenzieren und dadurch Mikroglia von Makrophagen zu unterscheiden. Die dafür etablierte Methode basiert auf der unterschiedlichen Expression der Antigene CD45 und CD11b auf die-sen beiden Zelltypen.

Mikroglia und Makrophagen exprimieren beide CD11b („CD11b⁺“) auf ihrer Oberflä-che (spezifisch für Mikroglia und Zellen des mononukleären Phagozytensystems („mononuclear-phagocyte system“); dadurch ist es möglich, andere Immunzellen, welche dieses Antigen nicht exprimieren, z. B. Lymphozyten oder Granulozyten, auszublenden. Die Expression von CD45 („common leucocyte antigen“) differiert hingegen: Mikroglia exprimieren nur geringe („CD45^low“) und Makrophagen hohe Mengen („CD45^high“). Eine weitere Charakterisierung von Mikroglia und Makropha-gen erfolgte anhand der Expression von CX3CR1, Ly6C, CD86 und CD206 (siehe Kapitel 2.5.2).

Die Untersuchung von Gehirnen mit Hilfe der Durchflusszytometrie wurde in Zu-sammenarbeit mit Prof. Ulrich Kalinke und Chintan Chhatbar im TWINCORE (Institut für Experimentelle Infektionsforschung, TWINCORE, Hannover, Deutschland) durchgeführt. Die Voranalysen der entstandenen Durchflusszytometrie-Werte wur-den von Chintan Chhatbar, die weiteren Analysen von mir durchgeführt.

4.10.1 Isolierung der Zellen

Für eine durchflusszytometrische Untersuchung von Entzündungszellen im Gehirn war es zunächst notwendig, diese Zellen aus dem Gehirnparenchym zu isolieren und aufzureinigen.

Für diese Analyse wurden Mäuse euthanasiert (Chloralhydrat, i. p.) und transkardial mit 4 °C warmer PBS Lösung perfundiert (5 Minuten, Flussrate 10 ml/min). An-schließend wurde der Schädel eröffnet und das Gehirn entnommen. Zum Transport wurden die Gehirne in PBS Lösung auf Eis gelagert und möglichst zeitnah weiter verarbeitet.

Zunächst wurden die Gehirne mit Hilfe des “neuronal tissue dissociation” Kits (Milte-nyi, Bergisch Gladbach, Deutschland) nach Angaben des Herstellerprotokolls ver-daut. Bei diesem Protokoll handelt es sich um eine Kombination aus enzymatischer Verdauung und mechanischer Zerkleinerung des Gehirnparenchyms. Nach Ab-schluss des initialen Verdauungsschrittes wurde die Zellsuspension mit PBS gewa-schen, um in den Kit-Lösungen enthaltene Enzyme zu entfernen.

Um Entzündungszellen von anderen Zellen und Substanzen des Gehirns zu trennen, war es notwendig, eine Auftrennung mit Hilfe eines Percoll-Dichtegradienten durch-zuführen. Es wurden dazu drei verschiedene Percoll-Lösungen (Percoll, Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, München, Deutschland gemischt mit 10x PBS Gibco Lösung (Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland)) unterschiedlicher Konzentration angesetzt: 30 %, 37 % und 70 %. Je höher die Konzentration der Percoll-Lösung, desto höher war das spezifische Gewicht der Lösung. Bei dieser Methode macht man es sich zu Nutze, dass Entzündungszellen eine bestimmte spezifische Dichte aufweisen und sich daher im Dichtegradienten darstellen lassen. Diese Konzentrati-onsgradienten wurden in einem Falcon-Röhrchen übereinander geschichtet: Die 37

%ige Percoll-Lösung wurde mit einem Tropfen Phenolrot angefärbt (bessere opti-sche Differenzierung der Schichten) und mit Hilfe einer 20 G Spinalkanüle (0,9 x 70 mm, 20G, B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland) in eine 5 ml Spritze (B. Braun) aufgezogen. Durch die Spinalkanüle wurde die 37 %ige Percoll-Lösung (höhere spezifische Dichte) auf den Boden des Falkonröhrchens unter die 30 %ige

Percolllösung appliziert. Ein sehr vorsichtiges Arbeiten war notwendig, um ein Ver-mischen des Gradienten zu verhindern.

Die Gehirnsubstanz wurde nun mit der 70 %igen Percoll-Lösung vermischt und mit Hilfe einer Spinalkanüle in eine 5 ml Spritze aufgezogen. Das Aufsaugen durch die Nadel diente dabei ebenfalls einer weiteren, endgültigen Zerkleinerung evtl. noch vorhandener Gehirnpartikel. Das Gehirn-Percoll-Gemisch wurde nachfolgend als dritte Ebene in das Falcon-Gefäß unter die beiden vorliegenden Percoll-Lösungen appliziert (siehe ).

Für die Auftrennung wurde der Percollgradient dann für 30 Minuten mit 300 G bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand enthielt unerwünschte Abfälle wie bei-spielsweise Myelin und wurde daher mit einer Absaugpumpe und einer Pasteur-Pipette abgesogen. Mit Hilfe einer 1000 µl Mikropipette wurde dann die sich nun als trübe Schicht im Falcon-Röhrchen darstellende Entzündungszellpopulation in ein neues Gefäß überführt, mit PBS gewaschen und erneut zentrifugiert. Das entste-hende Zellpellet wurde mit einem MACS-Puffer (Miltenyi) auf 500 µl resuspendiert.

Abb. 8: Schichtung des Percoll Dichtegradienten. Der Dichtegradient wurde vorbereitet indem zunächst die 30 %ige Percolllösung vorgelegt und dann mit der 37 %igen Percollösung (mit Phenolrot angefärbt) unterlegt wurde. Die Gehirnzellsuspension wurde dann mit der 70 %igen Percolllösung als unterste Schicht in das Reagenzröhrchen verbracht. Durch die nachfolgende Zentrifugation trennten sich die Bestandteile der Gehirnzellsuspension auf. Die Immunzellschicht fand sich zwischen der 70 und 37 % Percollschicht.

4.10.2 Zellmessung

Nach erfolgreicher Isolierung der Entzündungszellen aus den Gehirnen wurde die Einzelzellsuspension für eine Charakterisierung mit verschiedenen Antikörpern ent-sprechend den Herstellerangaben angefärbt. Um aussagekräftige Ergebnisse zu er-halten, wurden sämtliche Proben parallel mit oder ungefärbter Zellsuspension oder Antikörper-Isotypenkontrollen analysiert. Dabei handelt es sich um Antikörper, die zwar ebenfalls Fluorochrome für die Erkennung im FACS-Gerät besitzen, allerdings keine spezifische Bindungsstelle aufweisen. Dadurch war es möglich, falsch positive oder unspezifische Antikörperreaktionen aus den resultierenden Ergebnissen heraus zu rechnen.

Jeweils 300 µl Zellisolat wurden mit einer Antikörpermischung (Tab. 1) bei 4 °C über Nacht inkubiert. Gleichzeitig wurden circa 200 µl Zellisolat entweder als ungefärbte Negativ-Kontrolle verwendet oder mit einer Isotypenkontrollmischung inkubiert. Die Zellen wurden mit Hilfe des Durchflusszytometrie-Gerätes FACS calibur (BD Biosciences, San Jose, USA) und der Software BD FACSDiva (BD Biosciences) analysiert. Eine weitere Auswertung wurde in der FlowJo Software (FlowJo LLC, Ashland, USA) durchgeführt.

Bei durchflusszytometrischen Analysen entstanden große Mengen an Daten, deren Auswertung in verschiedenen Schritten stattfand. Ein wichtiges Verfahren dabei war das sog. „gating“. Dabei trug man Zellen in einem X-Y Koordinatensystem als Scat-ter-Plot auf. Auf der X- und Y-Achse wurden zwei Messwerte aufgetragen. Nun wähl-te man nur diejenigen Zellpopulationen aus, die bestimmwähl-te Charakwähl-teristika aufwie-sen. Beispielsweise nur Zellen die einen bestimmten Schwellenwert der Färbeinten-sität überstiegen. Diese Zellpopulation wurde ausgewählt und ist in den Scatter-Dot-Plots als schwarzes Polygon dargestellt (siehe , dort wurden z. B. drei „gates“ aufge-tragen: CD45^lowCD11b⁺, CD45^highCD11b⁺, CD45^highCD11b^-). Zellen, die sich inner-halb eines solchen „gates“ befanden, konnten für weitere Analysen aussortiert wer-den und somit ohne die anderen Zellen betrachtet und analysiert werwer-den (als Bsp.

konnten nur CD45^lowCD11b⁺ Zellen auf die Expression von weiteren Markern wie CX3CR1, Ly6C, CD86 und CD206 untersucht werden).

Daten, die aus durchflusszytometrischen Analysen hervorgingen, wurden meist als

%-Werte der angezeigten Population dargestellt (z. B. in der Abb. 8 16,2 % der Zel-len waren Mikroglia, 4,78 % waren Makrophagen).

Neben der durch Fluoreszenzantikörper gemessenen Fluoreszenz von Zellen wur-den für die Analyse auch weitere Parameter verwendet. Dazu gehörten der sog. Si-descatter (SSC-A) und Forwardscatter (FSC-A, FSC-W). Indem man Zellen anhand dieser Parameter sortierte, konnte man Verunreinigungen (Debris), tote Zellen und zusammenhängende Zellkonglomerate von der Analyse ausschließen. Forwardscat-ter ist ein Messwert für die Größe des gemessenen Partikels. Zelldebris hat für ge-wöhnlich einen niedrigen FSC Wert. Tote Zellen haben meist einen niedrigeren FSC

4.10.3 Normierung und Darstellung der Daten

Die zugrunde liegenden Originaldaten aus den durchflusszytometrischen Untersu-chungen wurden, um die Variabilität zwischen Experimenten zu reduzieren, auf Kon-trolltiere normiert. Dazu wurde der Mittelwert der jeweiligen mock-infizierten Tiere aus jeder Gruppe bestimmt und die prozentuale Abweichung der einzelnen Werte von diesem Mittelwert errechnet. Die resultierenden Werte wurden als „% Verände-rung“ dargestellt. Die Rohdaten wurden zusätzlich in Tabellen abgebildet.

Für die Darstellung zeitlicher Veränderungen in der Expression von Oberflächenmo-lekülen wurden Tortendiagramme (Darstellung als relative Verteilung der Gesamtpo-pulationen) erstellt. Dabei wurden die Mittelwerte der jeweils dargestellten Populati-onen errechnet und als Grundlage für diese Diagramme verwendet. Die Variabilität zwischen den Einzeltieren wurde dabei außer Acht gelassen.

Die Durchflusszytometrie-Daten wurden zusätzlich als Box-Whisker-Plot abgebildet.

Dies ermöglicht die Abbildung der Werte mitsamt den Quartilen und der Verhältnisse zwischen den verschiedenen Infektionsgruppen.

Die Expression der beiden Antigen-Kombinationen CX3CR1/Ly6C und CD86/CD206 der verschiedenen Phagozytenpopulationen wurde analysiert. Berücksichtigt man die Kombinationsmöglichkeiten der Antigenexpression, konnten Zellen dabei jeweils vier Zustände aufweisen: CX3CR1⁺Ly6C^-, CX3CR1^-Ly6C⁺, CX3CR1⁺Ly6C⁺, CX3CR1^-Ly6C^- bzw. CD86⁺CD206^-, CD86^-CD206⁺, CD86⁺CD206⁺, CD86^-CD206^-. Diese Populationen wurden jeweils für weitere Analysen zugrunde gelegt.