Differenzierung zwischen Mikroglia und Makrophagen sowie deren

Eine etablierte Methodik, Mikroglia und Makrophagen voneinander zu unterscheiden, ist die Durchflusszytometrie mit CD45- und CD11b-Antikörpern (Becher & Antel, 1996; Stevens et al., 2002; Hickman et al., 2013). Diese Methode wurde in der vor-liegenden Arbeit angewendet. Makrophagen und Mikroglia exprimierten das auf allen Leukozyten vorhandene Zelloberflächenprotein CD45 (common leucocyte antigen), jedoch exprimierten Mikroglia es nur in geringen Mengen, Makrophagen hingegen in hohen Mengen. Auf diese Weise lässt sich eine CD45^high- (hohe Expression) von ei-ner CD45^low- (niedrige Expression) Zellpopulation differenzieren. Mit Hilfe des Mikroglia- und Makrophagen-spezifischen Antigens CD11b, können weitere Leuko-zyten ausgeschlossen werden, da diese negativ für CD11b sind, wie z. B. Lympho-zyten und neutrophile GranuloLympho-zyten (siehe ).

Abb. 1: Beispiel für die Differenzierung zwischen Mikroglia und Makrophagen mittels Durch-flusszytometrie. Für die durchflusszytometrische Unterscheidung zwischen Mikroglia und Makro-phagen macht man sich die Expression von CD11b und CD45 zu Nutze. Sowohl Mikroglia als auch Makrophagen exprimieren das Oberflächenmolekül CD11b („CD11b⁺“). Sie unterscheiden sich jedoch in der Expression von CD45. Mikroglia exprimieren nur geringe Mengen dieses Antigens („CD45^low“), Makrophagen jedoch hohe Menge („CD45^high“). Andere Immunzellen (wie Lymphozyten oder natürli-che Killerzellen) exprimieren ebenfalls hohe Mengen CD45, jedoch exprimieren sie CD11b nicht („CD45^highCD11b^-“).

Bei der Durchflusszytometrie können neben den oben aufgeführten Antigenen (CD45 und CD11b) mit weiteren Antikörpern auch weitere Antigene und deren Ex-pression bestimmt werden. Dies ist wichtig für eine nähere Charakterisierung von Zelluntergruppen und deren Phänotypen.

Mikroglia exprimieren charakteristischerweise sowohl in ruhendem als auch aktivier-tem Zustand das Oberflächenprotein CX3CR1, den Rezeptor für CX3CL1 (Fraktal-kin). Da dieses Protein sehr verlässlich und in hoher Menge in diesen Zellen gebildet wird, wird es oftmals als spezifischer Marker in durchflusszytometrischen Untersu-chungen verwendet. Außerdem wird der Promotor für dieses Gen oftmals angewen-det um Mikroglia gezielt zu markieren oder zu verändern. CX3CR1 ist zwar relativ spezifisch, um im Gehirn Mikroglia anzuzeigen, jedoch wird dieses nicht nur auf Mikroglia exprimiert: Auch einige Monozyten-Populationen exprimieren diesen Re-zeptor in hohen Mengen (so genannte Ly6C^-CCR2^-CX3CR1⁺-Monozyten). Monozy-ten, die im Blut zirkulierenden Vorstufen von Makrophagen, werden üblicherweise in zwei Populationen unterteilt: inflammatorische und residente Monozyten. Während residente Monozyten große Mengen CX3CR1 auf ihrer Oberfläche exprimieren, wei-sen sie keine oder nur geringe Mengen proinflammatorischer Marker auf. Diese wer-den hingegen auf inflammatorischen Monozyten exprimiert: Ly6C und CCR2 (C-C-Chemokin-Rezeptor 2) sind die bekanntesten und gebräuchlichsten Marker für diese Zelltypen. Im Gegenzug zeigen diese Zellen nur geringe Mengen CX3CR1 auf ihrer Oberfläche (sogenannte Ly6C⁺CCR2⁺CX3CR1^--Monozyten).

Die beiden Monozyten-Typen haben unterschiedliche Funktionen und zeigen unter-schiedliche Verhaltensweisen: Während residente Monozyten im Blut zirkulieren und letztendlich die Gefäße verlassen, um gewebsständige Phagozyten zu unterstützen bzw. zu erneuern, haben inflammatorische Monozyten die Aufgabe, schnell zu Orten der Entzündung zu gelangen und dort Schäden zu beheben und eingedrungene Or-ganismen zu bekämpfen. Dabei dienen Oberflächenantigene wie z. B. CCR2 als Re-zeptoren für chemotaktische Signale. Zellen wandern diesen Signalen entgegen, um Orte der Schädigung oder Infektion zu erreichen und um aus dem Blut in Gewebe einzuwandern.

Oberflächenantigenzusammensetzung: CX3CR1 wird nur noch basal exprimiert und Ly6C sowie CCR2 werden in hohen Konzentration gebildet. Entsprechend zeigen aus dem Gehirn von infizierten Tieren isolierte Zellen unterschiedliche Phänotypen:

Während Mikroglia, in ruhendem und aktiviertem Zustand zu hohen Anteilen CX3CR1 exprimieren (CX3CR1⁺Ly6C^-), können diese Zellen durch Aktivierung Anti-gene wie beispielsweise Ly6C exprimieren („inflammatorische Mikroglia“, CX3CR1⁺Ly6C⁺). Einwandernde Zellen weisen für gewöhnlich nur geringe Mengen CX3CR1 auf, wohingegen sie hohe Mengen an Ly6C und CCR2 bilden (CX3CR1 -Ly6C⁺).

Monozyten und Makrophagen werden seit vielen Jahren anhand der Expression ver-schiedener Oberflächenantigene oder Genprodukte und ihres biologischen Verhal-tens in unterschiedliche Phänotypen eingeteilt (Gordon & Taylor, 2005). Diese Ein-teilung ist seit vielen Jahren umstritten, da sie ursprünglich auf in vitro-Versuchen und der artifiziellen Reizung und Differenzierung von Monozyten/Makrophagen ruhen. Dennoch handelt es sich um eine etablierte Methode, diese Zelltypen zu be-schreiben, und um Rückschlüsse auf die Funktionen und Aufgaben dieser Zellen zu ziehen. Die gröbste Unterteilung ist die in M1- oder M2-Makrophagen (Gordon &

Taylor, 2005). M1-Makrophagen werden als klassisch aktivierte Zellen bezeichnet.

Sie zeigen einen proinflammatorischen Phänotyp, was sich in der Bildung von proin-flammatorischen Zytokinen und einer hohen Mikroben-abtötenden Aktivität ausdrückt (Gordon & Taylor, 2005). Diese Zellen lenken die Immunreaktion in Richtung einer zellulären Immunität. M2-Makrophagen werden auch als alternativ aktivierte Zellen bezeichnet. Ihre Funktion trägt zur Gewebsreparatur und Abschwächung von Ent-zündungsreaktionen bei. Die Immunreaktion wird durch diese Zellen eher in Rich-tung einer humoralen Immunität gelenkt (Gordon & Taylor, 2005).

Mikroglia haben viele Ähnlichkeiten mit Makrophagen, jedoch gibt es auch sehr viele Unterschiede, die von ihrem Ursprung bis hin zu den physiologischen Aufgaben rei-chen (Prinz & Priller, 2014). Dennoch gibt es Versuche, diese Zellen, in Anlehnung an Monozyten/Makrophagen, anhand verschiedener Oberflächenantigene oder Genprodukte in M1- oder M2-artige Mikroglia zu kategorisieren (Boche et al., 2013b;

Jablonski et al., 2015). Entsprechend können, beispielsweise durch durchflusszyto-metrische Verfahren, Zellen mit charakteristischen M1- und M2-Markern

unterschie-den werunterschie-den. Typische Beispiele für diese Marker sind CD86 für M1-ähnliche Zellen (ein Protein welches bei der Co-Aktivierung der MHC-II-assoziierten Antigenpräsen-tation beteiligt ist) oder CD206 für M2-ähnliche Zellen (ein Mannose-Rezeptor) (Bo-che et al., 2013b; Jablonski et al., 2015). Diese Oberflä(Bo-chenantigene wurden auch in der vorliegenden Arbeit verwendet, um Makrophagen und Mikroglia aus dem Gehirn TMEV-infizierter Mäuse zu charakterisieren.

Neben der CD45/CD11b-Methode, Mikroglia von Makrophagen zu differenzieren, haben wir so genannte Cx3cr1-Reporter-Mäuse verwendet (Goldmann et al., 2013;

Gao et al., 2015), bei denen nur Mikroglia mit einem Fluoreszenzfarbstoff angefärbt sind (siehe Kapitel 2.5.3).

Die Zucht genetisch veränderter Mauslinien ist jedoch sehr aufwändig, daher wurden diese Mäuse nur für einzelne Versuche verwendet. Der Vorteil der Methode besteht darin, dass die Unterscheidung zwischen den Zellpopulationen genauer ist als die Durchflusszytometrie: Durch die Verwendung dieser transgenen Mäuse wurde be-kannt, dass die zuvor verwendete CD45/CD11b-Methode einige Zellen falsch zuord-net, da Mikroglia im Zuge ihrer Aktivierung hohe CD45-Konzentrationen exprimieren können und dann entsprechend zu der CD45^highCD11b⁺ Makrophagen-Population gezählt werden (Goldmann et al., 2013, Yona et al., 2013).