Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie
Die Rolle des zentralen cholinergen Systems und weiterer Neurotransmitter in Nagermodellen
der Temporallappenepilepsie
These
zur Erlangung des Grades eines
DOCTOR OF PHILOSOPHY -Ph.D.-
durch die
Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von
Sebastian Meller
aus Wittlich
Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie;
detaillierte bibliografische Daten sind im Internet abrufbar über http://dnb.ddb.de
© 2018 by Verlag:
Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen Printed in Germany
ISBN 978-3-86345-466-1 1. Auflage 2018
Verlag:
DVG Service GmbH Friedrichstraße 17 35392 Gießen Tel.: 0641/24466 info@dvg.de www.dvg.de
Tierärztliche Hochschule Hannover Zentrum für Systemische Neurowissenschaften Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie
Die Rolle des zentralen cholinergen Systems und weiterer Neurotransmitter in Nagermodellen der Temporallappenepilepsie
These
zur Erlangung des Grades eines
DOCTOR OF PHILOSOPHY -Ph.D.-
durch die
Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von Sebastian Meller
aus Wittlich
Hannover 2018
Supervisor: Prof. Dr. Wolfgang Löscher
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Wolfgang Löscher Prof. Dr. Herbert Hildebrandt Prof. Dr. Evgeni Ponimaskin
1. Gutachten: Prof. Dr. Wolfgang Löscher
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Prof. Dr. Herbert Hildebrandt Institut für Zelluläre Chemie
Medizinische Hochschule Hannover
Prof. Dr. Evgeni Ponimaskin Institut für Neurophysiologie
Medizinische Hochschule Hannover
2. Gutachten: Prof. Dr. Ulrich Ebert
Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co KG Biberach an der Riß
Datum der mündlichen Prüfung: 19. Oktober 2018
Unterstützt durch ein Promotionsstipendium der Studienstiftung des deutschen Volkes e. V.
Die Arbeit wurde im Rahmen des Ph.D.-Studiengangs „Systems Neuroscience“ des Zentrums für Systemische Neurowissenschaften Hannover angefertigt und ist Teilprojekt des European Union’s Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013) unter dem Fördervertrag n°602102 (EPITARGET).
Meinen Eltern
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 1
2 Stand der Forschung ... 3
2.1 Epilepsie ... 3
2.1.1 Definition und Wesen der Epilepsien ... 3
2.1.2 Klassifizierung von epileptischen Anfällen und Epilepsien ... 3
2.1.3 Temporallappenepilepsie ... 4
2.1.4 Therapiemöglichkeiten der Epilepsien ... 5
2.1.5 Das Konzept der (Anti-)Epileptogenese ... 7
2.1.6 Tiermodelle in der Epilepsieforschung ... 10
2.1.6.1 Das Lithium-Pilocarpin-Modell ... 12
2.1.6.2 Das BLA-Modell ... 13
2.2 Das cholinerge System ... 15
2.2.1 Das zentrale cholinerge System ... 16
2.2.2 Der muskarinerge Acetylcholin-Rezeptor ... 19
2.2.3 Der nikotinerge Acetylcholin-Rezeptor ... 20
2.2.4 Das cholinerge System im Hippokampus ... 22
2.2.5 Verteilung und Funktion cholinerger Rezeptoren im Hippokampus ... 25
2.3 Das cholinerge System und Epilepsie ... 27
2.3.1 Die Rolle des cholinergen Systems in der Anfallssymptomatik ... 27
2.3.1.1 Acetylcholin in Tiermodellen der Epilepsie ... 27
2.3.1.2 Acetylcholinesterase ... 29
2.3.2 Die Rolle des cholinergen Systems in der Epileptogenese ... 30
2.3.2.1 Acetylcholin in Tiermodellen der Epilepsie ... 30
2.3.2.2 Genetische Formen der Epilepsie mit cholinerger Beteiligung ... 32
2.3.3 Die Mikrodialyse ... 33
2.3.3.1 Mikrodialyse von Acetylcholin und diversen Aminosäuren ... 35
2.3.4 Anticholinerge Substanzen: Atropin und Scopolamin ... 36
3 Ziele und Arbeitshypothesen ... 39
4 Material und Methoden ... 41
4.2 Stereotaktische Operationstechnik ... 42
4.3 Induktion des Status epilepticus ... 46
4.3.1 Lithium-Pilocarpin-Modell ... 46
4.3.2 BLA-Modell ... 47
4.4 Mikrodialyse ... 48
4.5 Video-EEG-Überwachung ... 52
4.6 Neurochemische Analyse der Proben ... 54
4.6.1 in vitro Recovery ... 54
4.6.2 Acetylcholin und Cholin ... 56
4.6.3 Aminosäuren ... 57
4.7 Studie zur Prämedikation mit Scopolamin im BLA-Modell ... 58
4.7.1 Prämedikation und elektrische Stimulation ... 58
4.7.2 Video-EEG-Überwachung ... 58
4.7.3 Verhaltensversuche ... 59
4.8 Überprüfung der Lokalisation von Elektrode und Führungsrohr ... 61
4.9 Statistische Auswertung ... 62
5 Ergebnisse ... 63
5.1 Induktion des Status epilepticus in den Mikrodialysestudien ... 63
5.1.1 Lithium-Pilocarpin-Modell ... 63
5.1.2 BLA-Modell ... 64
5.2 Mikrodialyse im chemischen und elektrischen Modell im Hippokampus der Ratte ... 65
5.2.1 Technische Aspekte in den Mikrodialysestudien ... 65
5.2.2 Veränderungen der extrazellulären Konzentrationen von Acetylcholin und Cholin im Lithium-Pilocarpin-Modell ... 66
5.2.2.1 Acetylcholin im Lithium-Pilocarpin-Modell ... 66
5.2.2.2 Cholin im Lithium-Pilocarpin-Modell ... 69
5.2.3 Veränderungen der extrazellulären Konzentrationen von Acetylcholin und Cholin im BLA-Modell ... 71
5.2.3.1 Acetylcholin im BLA-Modell ... 71
5.2.3.2 Cholin im BLA-Modell ... 73
5.2.4 Veränderungen der extrazellulären Konzentrationen von GABA und Glutamat im
Lithium-Pilocarpin-Modell ... 75
5.2.4.1 GABA im Lithium-Pilocarpin-Modell ... 75
5.2.4.2 Glutamat im Lithium-Pilocarpin-Modell ... 77
5.2.5 Veränderungen der extrazellulären Konzentrationen von GABA und Glutamat im BLA-Modell ... 79
5.2.5.1 GABA im BLA-Modell ... 79
5.2.5.2 Glutamat im BLA-Modell ... 81
5.2.6 Zusammenfassende und modellvergleichende Übersicht für Acetylcholin, Cholin, GABA und Glutamat ... 83
5.2.7 Weitere neurochemische Veränderungen im Lithium-Pilocarpin-Modell (Aspartat, Serin, Glycin und Glutamin) ... 85
5.2.7.1 Aspartat im Lithium-Pilocarpin-Modell ... 85
5.2.7.2 Serin im Lithium-Pilocarpin-Modell ... 85
5.2.7.3 Glycin im Lithium-Pilocarpin-Modell ... 86
5.2.7.4 Glutamin im Lithium-Pilocarpin-Modell ... 86
5.2.8 Weitere neurochemische Veränderungen im BLA-Modell (Aspartat, Serin, Glycin und Glutamin) ... 91
5.2.8.1 Aspartat im BLA-Modell ... 91
5.2.8.2 Serin im BLA-Modell ... 91
5.2.8.3 Glycin im BLA-Modell ... 91
5.2.8.4 Glutamin im BLA-Modell ... 92
5.2.9 Zusammenfassende und modellvergleichende Übersicht für Aspartat, Serin, Glycin und Glutamin ... 97
5.3 Prämedikation mit Scopolamin im BLA-Modell ... 100
5.3.1 Die prämedikative Behandlung mit Scopolamin reduziert Dauer und Intensität des Status epilepticus im BLA-Modell ... 100
5.3.2 Verhaltensversuche eine Woche nach Status epilepticus zeigen keine Unterschiede zwischen Vehikel- und Scopolamingruppe ... 102
6 Diskussion ... 103
6.1 Mikrodialyse verschiedener Neurotransmitter ... 103
6.2 Acetylcholin im Anfallsgeschehen ... 108
6.2.1 Prokonvulsive Eigenschaften des Acetylcholins ... 108
6.2.1.1 Acetylcholin und die Initiierung von Anfällen in chemischen und
elektrischen Modellen der Temporallappenepilepsie ... 108
6.2.1.2 Acetylcholin und die Aufrechterhaltung von Anfällen im Pilocarpin- Modell ... 110
6.2.1.3 Acetylcholin und die Aufrechterhaltung von Anfällen im elektrischen BLA-Modell ... 114
6.2.1.4 Aufrechterhaltung von Anfällen als Multi-Transmitter-Phänomen115 6.2.1.5 Zusammenfassende Betrachtung der prokonvulsiven Eigenschaften des Acetylcholins ... 117
6.2.2 Antikonvulsive Eigenschaften des Acetylcholins ... 117
6.2.2.1 Antikonvulsive Eigenschaften des nikotinergen a7-Rezeptors ... 118
6.2.2.2 Antikonvulsive Eigenschaften bestimmter Acetylcholinesterasehemmer ... 119
6.2.2.3 Mögliche cholinerg vermittelte GABAerge Aktivierung ... 120
6.2.3 Zusammenfassende Betrachtung der pro- und antikonvulsiven Eigenschaften des Acetylcholins ... 121
6.3 Acetylcholin in der Epileptogenese und in der Epilepsie ... 122
6.3.1 Die Entwicklung der extrazellulären Acetylcholinkonzentration im Verlauf von Epileptogenese und in der chronisch epileptischen Phase ... 122
6.3.2 Veränderungen cholinerger Rezeptoren und Enzyme in Epileptogenese und Epilepsie ... 125
6.3.3 Strategien zur Antiepileptogenese durch muskarinerge Antagonisten ... 126
6.4 Veränderungen von GABA und Glutamat in der Epilepsieentwicklung 128 6.4.1 Messung der extrazellulären Konzentrationen von GABA und Glutamat im Anfallsgeschehen ... 129
6.4.2 Messung der extrazellulären Konzentrationen von GABA und Glutamat in Epileptogenese und Epilepsie ... 130
6.4.3 Vergleich zwischen GABA, Glutamat und Acetylcholin ... 131
6.5 Veränderungen der Konzentrationen weiterer Neurotransmitter in der Epilepsieentwicklung ... 133
6.5.1 Aspartat ... 133
6.5.2 Serin ... 133
6.5.3 Glycin ... 134
6.5.4 Glutamin ... 136
6.5.5 Cholin ... 137
6.6 Abschließende Betrachtung ... 137
7 Zusammenfassung ... 140
8 Summary ... 142
9 Literaturverzeichnis ... 144
10 Anhang ... 193
10.1 Verbrauchsmaterialien und Geräte ... 193
10.2 Ansatz der verwendeten Substanzen und Lösungen ... 199
11 Publikationen ... 200
12 Danksagung ... 202
Abkürzungsverzeichnis
% Prozent
°C Grad Celsius
ACh Acetylcholin
AChE Acetylcholinesterase
(a)CSF artifizielle Zerebrospinalflüssigkeit
ADNFLE autosomal dominante nächtliche Frontallappenepilepsie
Ag/AgCl Silber-Silberchlorid
BLA basolaterale Amygdala
bzw. beziehungsweise
C18 Octadecylsilan
CA Cornu ammonis
ca. circa
Ca2+ Calcium/Calciumionen
ChOx Cholinoxidase
cm Zentimeter
cm2 Quadratzentimeter
d Tag
DG Gyrus dentatus
EC entorhinaler Kortex
EEG Elektroenzephalogramm
engl. englisch
et al. und andere (et alii, et aliae)
g Gramm
GABA g-Aminobuttersäure
ggr. geringgradig
h Stunde
H2O2 Wasserstoffperoxid
HET Hyperexzitabilitätstest
HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
HS Hippokampussklerose
HWZ Halbwertszeit
Hz Hertz
i.p. intraperitoneal
IBE International Bureau for Epilepsy
ILAE International League Against Epilepsy
K+ Kalium/Kaliumionen
kDA Kilodalton
kg Kilogramm
l Liter
Li Lithium
mg Milligramm
min Minute
ml Milliliter
mm Millimeter
mmol Millimol
mol Mol
ms Millisekunde
mV Millivolt
ng Nanogramm
nm Nanometer
NMDA N-Methyl-D-Aspartat
nmol Nanomol
One-Way ANOVA einfache Varianzanalyse
OP Operation
p.o. per os
PaS Parasubiculum
PrS Präsubiculum
s Sekunde
s. siehe
s.c. subkutan
Sb Subiculum
SD Standardabweichung
SE Status epilepticus
SEM Standardfehler
TLE Temporallappenepilepsie
TTX Tetrodotoxin
Two-Way ANOVA zweifache Varianzanalyse
u.a. unter anderem
UV Ultraviolett
V Volt
v.a. vor allem
vgl. vergleiche
w Woche
z.B. zum Beispiel
z.T. zum Teil
ZNS zentrales Nervensystem
µA Mikroampere
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µm Mikrometer
µmol Mikromol
µs Mikrosekunde
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Schematische Darstellung des zeitlichen Ablaufs der Epileptogenese und der Konzepte therapeutischer Interventionen ... 10 Abbildung 2: Schematische Darstellung des zentralen cholinergen Systems anhand eines Sagittalschnitts eines Rattenhirns ... 17 Abbildung 3: Schematische Darstellung der trisynaptischen Verschaltung im
Hippokampus im Querschnitt ... 23 Abbildung 4: Mikrodialysesonde und ihre Funktionsweise ... 35 Abbildung 5: Schematische Darstellung des Schädels der Ratte (Draufsicht) mit Bregma als Bezugspunkt und mit den Lokalisationen der implantierten Komponenten in der
stereotaktischen Operation für die Studien im Lithium-Pilocarpin-Modell ... 44 Abbildung 6: Schematische Darstellung des Schädels der Ratte (Draufsicht) mit Bregma als Bezugspunkt und mit den Lokalisationen der implantierten Komponenten in der
stereotaktischen Operation für die Studien im BLA-Modell ... 45 Abbildung 7: Lichtbild von Erdungselektrode (links), Tiefenelektrode (mittig) und
Führungsrohr mit Verschluss (rechts) ... 45 Abbildung 8: Schematische Darstellung des Gehirns der Ratte im Querschnitt mit
Elektrodenverlauf und -lokalisation im Lithium-Pilocarpin- und BLA-Modell (rote Pfeile) . 46 Abbildung 9: Versuchsdesign für die Mikrodialysestudien ... 49 Abbildung 10: Schematische Darstellung eines Gehirns der Ratte im Querschnitt mit
Lokalisation von implantiertem Führungsrohr (orange) und eingesetzter Sonde (rot) ... 50 Abbildung 11: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus für die Mikrodialyse ... 51 Abbildung 12: Aufzeichnung eines Elektroenzephalogramms aus dem Hippokampus
einer Ratte ... 54 Abbildung 13: Schematische Darstellung einer Apparatur für die
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie von Acetylcholin und Cholin ... 57 Abbildung 14: Elektroenzephalogramm während und nach Status epilepticus ... 59 Abbildung 15: Konzentrationen von Acetylcholin in Dialysaten aus dem Hippokampus der Ratte während eines durch Pilocarpin induzierten Status epilepticus im Li-Pilocarpin- Modell und folgender Epileptogenese sowie chronischer Phase der Epilepsie ... 67 Abbildung 16: Änderung der Konzentration des Acetylcholins in Dialysaten zwischen
erster Verabreichung von Pilocarpin und Auftreten des Status epilepticus ... 68
Abbildung 17: Konzentrationen von Cholin in Dialysaten aus dem Hippokampus der Ratte während eines durch Pilocarpin induzierten Status epilepticus im Li-Pilocarpin-
Modell und folgender Epileptogenese sowie chronischer Phase der Epilepsie ... 70 Abbildung 18: Konzentrationen von Acetylcholin in Dialysaten aus dem Hippokampus der Ratte während eines elektrisch induzierten Status epilepticus im BLA-Modell und
folgender Epileptogenese sowie chronischer Phase der Epilepsie ... 72 Abbildung 19: Konzentrationen von Cholin in Dialysaten aus dem Hippokampus der
Ratte während eines elektrisch induzierten Status epilepticus im BLA-Modell und
folgender Epileptogenese sowie chronischer Phase der Epilepsie ... 74 Abbildung 20: Konzentrationen von GABA in Dialysaten aus dem Hippokampus der
Ratte während eines durch Pilocarpin induzierten Status epilepticus im Li-Pilocarpin-
Modell und folgender Epileptogenese sowie chronischer Phase der Epilepsie ... 76 Abbildung 21: Konzentrationen von Glutamat in Dialysaten aus dem Hippokampus der Ratte während eines durch Pilocarpin induzierten Status epilepticus im Li-Pilocarpin-
Modell und folgender Epileptogenese sowie chronischer Phase der Epilepsie ... 78 Abbildung 22: Konzentrationen von GABA in Dialysaten aus dem Hippokampus der
Ratte während eines elektrisch induzierten Status epilepticus im BLA-Modell und
folgender Epileptogenese sowie chronischer Phase der Epilepsie ... 80 Abbildung 23: Konzentrationen von Glutamat in Dialysaten aus dem Hippokampus der Ratte während eines elektrisch induzierten Status epilepticus im BLA-Modell und
folgender Epileptogenese sowie chronischer Phase der Epilepsie ... 82 Abbildung 24: Modellvergleichende Darstellung der Konzentrationen von Acetylcholin, Cholin, GABA und Glutamat in Dialysaten aus dem Hippokampus der Ratte ... 84 Abbildung 25: Konzentrationen von Aspartat in Dialysaten aus dem Hippokampus der Ratte während eines durch Pilocarpin induzierten Status epilepticus im Li-Pilocarpin-
Modell und folgender Epileptogenese sowie chronischer Phase der Epilepsie ... 87 Abbildung 26: Konzentrationen von Serin in Dialysaten aus dem Hippokampus der Ratte während eines durch Pilocarpin induzierten Status epilepticus im Li-Pilocarpin-Modell
und folgender Epileptogenese sowie chronischer Phase der Epilepsie ... 88 Abbildung 27: Konzentrationen von Glycin in Dialysaten aus dem Hippokampus der
Ratte während eines durch Pilocarpin induzierten Status epilepticus im Li-Pilocarpin-
Modell und folgender Epileptogenese sowie chronischer Phase der Epilepsie ... 89
Abbildung 28: Konzentrationen von Glutamin in Dialysaten aus dem Hippokampus der Ratte während eines durch Pilocarpin induzierten Status epilepticus im Li-Pilocarpin-
Modell und folgender Epileptogenese sowie chronischer Phase der Epilepsie ... 90 Abbildung 29: Konzentrationen von Aspartat in Dialysaten aus dem Hippokampus der Ratte während eines elektrisch induzierten Status epilepticus im BLA-Modell und
folgender Epileptogenese sowie chronischer Phase der Epilepsie ... 93 Abbildung 30: Konzentrationen von Serin in Dialysaten aus dem Hippokampus der Ratte während eines elektrisch induzierten Status epilepticus im BLA-Modell und folgender
Epileptogenese sowie chronischer Phase der Epilepsie ... 94 Abbildung 31: Konzentrationen von Glycin in Dialysaten aus dem Hippokampus der
Ratte während eines elektrisch induzierten Status epilepticus im BLA-Modell und
folgender Epileptogenese sowie chronischer Phase der Epilepsie ... 95 Abbildung 32: Konzentrationen von Glutamin in Dialysaten aus dem Hippokampus der Ratte während eines elektrisch induzierten Status epilepticus im BLA-Modell und
folgender Epileptogenese sowie chronischer Phase der Epilepsie ... 96 Abbildung 33: Modellvergleichende Darstellung der Konzentrationen von Aspartat,
Serin, Glycin und Glutamin in Dialysaten aus dem Hippokampus der Ratte ... 98 Abbildung 34: Prämedikativ verabreichtes Scopolamin verkürzt die Dauer des SE bei
Ratten im BLA-Modell ... 101 Abbildung 35: Prämedikativ verabreichtes Scopolamin reduziert die Intensität des SE bei Ratten im BLA-Modell ... 101 Abbildung 36: Keine Unterschiede im Verhalten der Vehikelgruppe im Vergleich zur
Scopolamingruppe, stattdessen aber zur Kontrollgruppe (Hyperexzitabilitätstest) ... 102
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Beispiele für Agonisten und Antagonisten cholinerger Rezeptoren ... 22
Tabelle 2: Anzahl, Züchter und Verwendung der Versuchstiere ... 41
Tabelle 3: Koordinaten, Hirnregionen und Funktion der Elektrode und des Führungsrohrs pro Studie ... 43
Tabelle 4: Stimulationsprotokoll der verwendeten Geräte für die BLA-Stimulation ... 48
Tabelle 5: Hyperexzitabilitätstest mit Scoring, modifiziert nach Rice et al. (1998) ... 60
Tabelle 6: Dosierung des Pilocarpins, Anzahl der Injektionen und Zeit bis zum SE ... 63
Tabelle 7: Stand der Anzahl und der Gruppenverteilung der Versuchstiere unmittelbar nach Induktion des SE ... 65
Tabelle 8: Übersicht über die die Entwicklung der Neurotransmitterkonzentrationen im Vergleich zu Kontrolltieren und/oder Tieren ohne SE im Lithium-Pilocarpin- bzw. BLA- Modell der Ratte ... 99
1 Einleitung
Epilepsien stellen sowohl beim Menschen als auch beim Tier die weltweit am häufigsten auf- tretenden chronisch neurologischen Erkrankungen des Gehirns dar (Löscher, 1994, 2003;
Löscher & Schmidt, 2002; Thomas, 2010). Laut der Weltgesundheitsorganisation (WHO) leiden zurzeit über 50 Millionen Menschen weltweit an der Erkrankung (WHO, 2018). Im Jahr 2015 beliefen sich die Schätzungen der Prävalenz in der Gesamtpopulation auf 0,5 - 1,0 % (Robertson et al., 2015). Innerhalb der Veterinärmedizin ist die Epilepsie primär bei Hunden mit einer Prävalenz von 0,5 - 5,0 % und Katzen mit einem relativen Wert von 0,5 % anzutreffen (Bielfelt et al., 1971; Löscher & Meldrum, 1984; Löscher, 2003; Thomas, 2010).
Epilepsien stellen eine chronische Störung der physiologischen Funktion des Gehirns dar, die sich durch wiederkehrende, spontane, sogenannte epileptische Anfälle äußert und in zahlrei- che Syndrome gegliedert werden kann (Chang & Lowenstein, 2003; Fisher et al., 2005;
Löscher & Brandt, 2010; Falco-Walter et al., 2018) Für den betroffenen Patienten steht die Erkrankung im Zusammenhang mit Komorbiditäten, kognitiven und neurobiologischen Be- einträchtigungen sowie mit daraus folgenden negativen psychosozialen Konsequenzen (Kerr, 2012).
Die bis heute übliche Therapieform stellt die pharmakologische Unterdrückung der epilepti- schen Anfälle durch meist lebenslange Verabreichung geeigneter antiepileptischer Arzneimit- tel dar. Trotz einer belebten Entwicklung neuer antiepileptischer Substanzen in den letzten Jahrzehnten konnte die Problematik einer ausgeprägten Pharmakoresistenz nicht gelöst wer- den, die bei ca. 30 % der Patienten und sogar bei ca. 50 % der erkrankten Hunde vorkommt (Löscher, 2003; Schmidt & Löscher, 2005; Shorvon, 2009; Brodie, 2010; Löscher & Schmidt, 2011). Eine folglich wünschenswertere therapeutische Prävention der Epilepsieentstehung an sich ist jedoch bisher kaum entwickelt (Pitkänen, 2010; Löscher & Schmidt, 2011; Jehi &
Vezzani, 2014). Diese missgünstige Lage wird weiterhin durch den Umstand verstärkt, dass Epilepsien oftmals das Resultat vorangegangener bekannter Hirninsulte sind, die gezielte pharmakologische Interventionen vor der Entwicklung der Epilepsie prinzipiell ermöglichen würden.
Einen pharmakologischen Ansatzpunkt zur Unterdrückung der Epileptogenese, ergo des Pro- zesses, der zur Entstehung der Epilepsie führt, könnte die Inhibition des cholinergen Systems darstellen, denn es gibt Hinweise dafür, dass ein erhöhtes cholinerges Signal im Gehirn die
Entstehung von Anfällen sowie eventuell von Epilepsien begünstigen kann (Friedman et al., 2007). Der Hippokampus als für die Epilepsie äußerst relevante Struktur ist stark von choli- nergen Nervenfasern innerviert, die dort eine modulierende Funktion auf den wichtigsten er- regenden Neurotransmitter Glutamat und den wichtigsten hemmenden Neurotransmitter g-Aminobuttersäure (GABA) ausüben und somit in der Regulation der Exzitabilität des hip- pokampalen Netzwerkes eine wichtige Rolle einnehmen (Dutar et al., 1995; Cobb & Davies, 2005; Lebois et al., 2018; Albuquerque et al., 2009). Aus dem humanmedizinischen Bereich ist bekannt, dass ein exzessiver extrazellulärer Konzentrationsanstieg des cholinergen Neuro- transmitters Acetylcholin (ACh) im Gehirn durch Vergiftungen mit Hemmern der Acetylcho- linesterase (AChE) wie Soman oder Sarin zu Anfällen führt bzw. dass genetische Epilepsien durch Mutationen in cholinergen Rezeptoren entstehen können (McDonough & Shih, 1997;
Steinlein & Bertrand, 2010). In der präklinischen Epilepsieforschung wurde weiterhin ge- zeigt, dass ACh im Tiermodell eine Rolle bei der Initiierung und möglicherweise auch Auf- rechterhaltung von Anfällen (Buterbaugh et al., 1986; Jope et al., 1986; Morrisett et al., 1987;
Clifford et al., 1987; George & Kulkarni, 1996; Friedman et al., 2007; Brandt et al., 2015) sowie bei funktionellen und strukturellen Veränderungen im Hirngewebe spielt (Arnold et al., 1973; Westerberg & Corcoran, 1987; Adams et al., 2002). Inwiefern jedoch Prozesse der Epi- leptogenese durch das cholinerge System beeinflusst werden, ist bis dato weitgehend unbe- kannt.
In der vorliegenden Arbeit wurden Veränderungen in der extrazellulären, hippokampalen Konzentration des ACh sowohl während des Anfallsgeschehens als auch in der Phase der Epi- leptogenese in zwei verschiedenen Tiermodellen der Temporallappenepilepsie ermittelt: Das Lithium (Li)-Pilocarpin-Modell und das Modell der elektrischen Stimulation der basolateralen Amygdala, kurz BLA-Modell. Zum Sammeln und Messen der ACh-Konzentration diente das Mikrodialyseverfahren, gekoppelt mit der Analyse per Hochleistungsflüssigkeitschromato- graphie (HPLC). Um weitreichendere Veränderungen im Neurotransmitterhaushalt simultan zu detektieren, wurden auch weitere Neurotransmitter aus der Gruppe der Aminosäuren, u.a.
Glutamat und GABA, gemessen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das cholinerge System während des Anfallsgeschehens sowie in der Epilepsieentwicklung genauer zu cha- rakterisieren bzw. zu visualisieren und es als potentiellen Angriffspunkt für Strategien zur antiepileptogenen Therapie durch Anticholinergika wie Scopolamin in weiterführenden Stu- dien genauer zu untersuchen.
2 Stand der Forschung
2.1 Epilepsie
2.1.1 Definition und Wesen der Epilepsien
Die Internationale Liga gegen Epilepsie (engl.: International League Against Epilepsy; ILAE) und das Internationale Büro für Epilepsie (engl.: International Bureau for Epilepsy; IBE) de- finieren Epilepsien als Hirnerkrankungen, die durch die fortdauernde Prädisposition, epilepti- sche Anfälle zu generieren, und durch die daraus folgenden neurobiologischen, kognitiven, psychologischen und sozialen Konsequenzen charakterisiert sind (Fisher et al., 2005, 2014).
Epileptische Anfälle sind wiederkehrende, vorübergehende und häufig unvorhersehbare Stö- rungen der physiologischen Integrität des Gehirns, die von Beeinträchtigungen im Gleichge- wicht zwischen exzitatorischen und inhibitorischen neuronalen Signalen herrühren (Fisher et al., 2005). Jenes temporäre Ungleichgewicht basiert auf der permanenten Neigung des epilep- tisch erkrankten Gehirns, in Nervenzellen bzw. Nervenzellverbänden exzessiv hyperexzitable und/oder synchrone neuronale Aktivität zu generieren.
2.1.2 Klassifizierung von epileptischen Anfällen und Epilepsien
Im Jahr 2017 veröffentlichte die ILAE eine überarbeitete Klassifizierung von Epilepsien und epileptischen Anfällen (Fisher et al., 2017; Scheffer et al., 2017; Falco-Walter et al., 2018).
Eine primäre grobe Einteilung der epileptischen Anfälle ermöglichen die Kriterien des Aus- maßes der Lokalisation, von der ein Anfall ausgeht, und seine anschließende Ausbreitung.
Während fokale Anfälle auf örtliche neuronale Netzwerke beschränkt sind, die nicht über eine Hirnhemisphäre hinausgehen, und entweder mit ungestörtem oder beeinträchtigtem Bewusst- sein einhergehen, betreffen generalisierte Anfälle beide Hirnhemisphären und werden in der Mehrheit von Bewusstseinsstörungen bzw. -verlust begleitet. Ein fokaler Anfall kann sich auch zu einem sogenannten bilateral tonisch-klonischen Anfall auf die kontralaterale Hirnhe- misphäre ausdehnen (früher: sekundär generalisierter Anfall). Letztlich erlaubt die neue Klas- sifizierung auch die Definition von Anfällen mit unbekannter bzw. unbestimmter Lokalisati- on. Anfälle fokalen, generalisierten sowie unbekannten Ursprungs können entweder mit oder ohne motorische Symptome auftreten. Für eine detaillierte Auflistung der verschiedenen (nicht-)motorischen Korrelate s. Fisher et al. (2017). Im zweiten Schritt ist eine aus dem
Auftreten der Anfallstypen hergeleitete Einteilung in Epilepsien fokaler, generalisierter, kom- biniert generalisierter und fokaler sowie unbekannter Natur möglich (Scheffer et al., 2017).
Eine Sonderform des epileptischen Anfalls stellt der Status epilepticus (SE) dar, der den Zu- stand von nicht selbstlimitierenden, verlängerten und/oder oft rasch wiederkehrenden Anfäl- len ohne Wiedererlangen normaler Verhaltens- und Elektrophysiologie in den interiktalen Abschnitten beschreibt (Lowenstein, 1999; Walker et al., 2002; Löscher, 2003). Bei verspäte- ten therapeutischen Maßnahmen kann der SE zu pharmakologischen Resistenzen, neuronalen Schäden und sogar zum Tode führen (Chen & Wasterlain, 2006; Betjemann & Lowenstein, 2015; Löscher, 2015; Stelzer et al., 2015). Abhängig von verschiedenen Faktoren wie z.B. der Ursache können die Mortalitätsraten bei einem SE durchschnittlich bis zu 40 % betragen (Neligan & Shorvon, 2010; Löscher, 2015; Stelzer et al., 2015). Ursachen des SE können In- fektionen, Ischämien und Hypoxien des zentralen Nervensystems sowie übermäßiger Alko- holgenuss sein (Walker et al., 2002).
Da Epilepsien in der Regel verschiedene Grunderkrankungen vorausgehen können, wird auch eine Einteilung mittels der Ätiologie vorgenommen. Während bis 2017 unterteilt wurde in strukturell-metabolische, genetische und unbekannte Ursachen (Berg, 2011), bietet die neue Klassifizierung eine ausführlichere Auflistung, die allerdings Freiheiten in der Abgrenzung und mehrere ätiologische Bezeichnungen parallel zulässt. Die Ätiologien können struktureller (z.B. Schädel-Hirn-Trauma, Schlaganfall, Malformationen), genetischer, infektiöser (z.B.
Neurozystizerkose, zerebrale Malaria, Zika-Virus-Infektion, virale Enzephalitis), metaboli- scher (z.B. Porphyrie, nephrogene Enzephalopathie), immunologischer (z.B. Anti-N-Methyl- D-Aspartat (NMDA)-Rezeptor-Enzephalitis, Anti-LGI1-Enzephalitis) oder unbekannter Natur sein (Scheffer et al., 2017; Falco-Walter et al., 2018).
2.1.3 Temporallappenepilepsie
Die am häufigsten auftretende und am schwierigsten zu behandelnde Epilepsieform beim Er- wachsenen ist die den fokalen Epilepsien zugeordnete Temporallappenepilepsie (TLE) (Engel, 2001; Schmidt & Elger, 2005). Ihrem Namen entsprechend befindet sich der fokale Anfallsursprung im Temporallappen, der den Hippokampus, die Amygdala und den parahip- pokampalen Kortex als für die Anfallsentstehung häufig relevante Strukturen beherbergt (Chang & Lowenstein, 2003). Häufig breiten sich die fokalen Anfälle zu bilateral tonisch- klonischen Anfällen (früher: sekundär generalisierte Anfälle) auf die kontralaterale
Hirnhemisphäre aus (Löscher & Brandt, 2010). In den meisten Fällen liegt der TLE eine in der Vergangenheit zurückliegende, lokale Hirnschädigung strukturellen Charakters wie bei- spielsweise Schädel-Hirn-Traumata, Tumore oder Schlaganfälle zu Grunde. Es sind allerdings auch infektiöse oder genetische Ursachen bekannt, die zu spezifischen Veränderungen und zur konsekutiven Anfallsgenerierung im Temporallappen führen können (Engel, 2001; Chang
& Lowenstein, 2003).
Von den limbischen Strukturen wird u.a. dem Hippokampus bei der TLE eine kritische Rolle als anfallsgenerierender bzw. -verstärkender Fokus zugesprochen, wobei ihm diesbezüglich kein Alleinstellungsmerkmal eingeräumt wird und komplexere Prozesse mit Involvierung weiterer Strukturen und Netzwerke angenommen werden (Bertram et al., 1998; Bertram, 2013). Ein typischer neuropathologischer Befund bei Patienten mit pharmakoresistenter TLE ist die Hippokampussklerose (HS) (Blümcke & Spreafico, 2012; Aronica & Mühlebner, 2017), die bei etwa 60 % der zu Therapiezwecken chirurgisch entfernten Hippokampi auftritt (Thom, 2004). Die HS ist in erster Linie durch Astrogliose und verstärkte Neuronenverluste in der Pyramidenzellschicht des Hippokampus charakterisiert und äußert sich makroskopisch in einer Schrumpfung und Verhärtung des hippokampalen Gewebes. Im Cornu ammonis (CA), speziell in der CA1- und CA3-Region, und im Hilus, einem unmittelbar ins CA über- gehenden Teil des Gyrus dentatus (DG), sind Neuronenverluste im Regelfall anzutreffen. Py- ramidenzellen der CA2-Region und Neurone des DG (Körnerzellen) bleiben hingegen in va- riablem Maße intakt (Chang & Lowenstein, 2003; Thom, 2004; Malmgren & Thom, 2012;
Aronica & Mühlebner, 2017). Letztere weisen jedoch häufig eine progressive Zerstreuung (Dispersion) und eine Neuorganisation ihrer Axone (Moosfasern) in Form von Aussprossung von Axonkollateralen mit Innervierung der Ursprungsneurone auf (Tauck & Nadler, 1985;
Sutula et al., 1989; Parent, 2007; Schmeiser et al., 2017). Eine bis dato nicht abschließend geklärte Frage ist allerdings, ob die HS und die neuronale Neuorganisation Ursachen oder Konsequenzen der auftretenden Anfälle sind (Jefferys, 1999; Mathern et al., 2002; Blümcke
& Spreafico, 2012). Für weitere Informationen zur Anatomie des Hippokampus s. Kapitel 2.2.4 und Abbildung 3.
2.1.4 Therapiemöglichkeiten der Epilepsien
Die standardmäßige Therapie der Epilepsien erfolgt durch die meist lebenslange Verabrei- chung sogenannter Antiepileptika, die der Suppression von Anfällen und in diesem
Zusammenhang der Verbesserung der Lebensqualität der Patienten dienen sollen (Walker et al., 2002; Shorvon, 2009; Pitkänen, 2010). Da der in der Epileptologie etablierte und zurzeit regulär verwendete Begriff „Antiepileptikum“ irrtümlicherweise die Bekämpfung der Ursache der Anfallsentstehung suggeriert und nicht das tatsächliche Wirkungsergebnis der bloßen symptomatischen Anfallsunterdrückung hinreichend charakterisiert, wäre die Bezeichnung
„Antikonvulsivum“ treffender. Das grundlegende Wirkungsprinzip der Antiepileptika basiert auf der Reduktion synchroner neuronaler Aktivität und auf der Korrektur der Gleichgewichts- verhältnisse zwischen erregenden und inhibierenden Einflüssen im Gehirn durch Abschwä- chung der erregenden bzw. Verstärkung der inhibierenden Komponenten. Dies geschieht in Form von Modulation von spannungs- bzw. ligandengesteuerten Ionenkanälen sowie von Transport- und Enzymsystemen des Neurotransmitterhaushalts (Löscher, 2003; Rogawski &
Löscher, 2004; Herdegen, 2010).
In der pharmakologischen Forschung spielen bis heute die Neuentwicklung von Antiepilepti- ka mit neuen Wirkungsmechanismen, die Optimierung pharmakodynamischer und -kinetischer Eigenschaften der Arzneimittel und die Milderung häufiger Nebenwirkungen und Langzeitfolgen eine wichtige Rolle. Trotz vieler Fortschritte und der Entwicklung zahl- reicher neuer Antiepileptika ab der zweiten Hälfte des 20. Jahrhunderts stellte sich ein größe- rer Durchbruch in der Behandlung der chronischen Epilepsie durch Erreichen von Anfalls- freiheit unter Medikation nicht ein (Schmidt & Löscher, 2009; Shorvon, 2009; Löscher &
Schmidt, 2011). So werden mehr als 30 % der Epilepsiepatienten als pharmakoresistent ein- gestuft (Schmidt & Löscher, 2005; Shorvon, 2009; Brodie, 2010; Löscher & Schmidt, 2011), während im speziellen Fall der TLE sogar bis zu 75 % der Patienten nicht auf die pharmako- logische Behandlung ansprechen (Leppik, 1992; Spencer, 2002). Fasst man zwei veterinär- medizinische Studien zusammen, so wurden unter der regelmäßigen Einnahme von Pheno- barbital und Primidon etwa 15 - 40 % der erkrankten Hunde anfallsfrei, während 35 - 64 % lediglich eine leichte und 20 - 40 % keine Verbesserung der Anfallssymptomatik aufwiesen (Schwartz-Porsche et al., 1985; Riek et al., 2002; Löscher, 2003).
Neben einigen Alternativen wie z.B. der elektrisch bzw. magnetisch induzierten Neurostimu- lation (Martlé et al., 2014; Lin & Wang, 2017) bildet die chirurgische Entfernung des epilep- tischen Hirngewebes in Form einer Fokusresektion mit oder gar ohne begleitender Pharmako- therapie die bis dato erfolgreichste Therapiemöglichkeit pharmakoresistenter Epilepsien (Engel, 2001; Spencer, 2002; Tellez-Zenteno et al., 2012; Braun & Schmidt, 2014). Bei etwa
der Hälfte der Patienten führt der Eingriff zu einer Anfallsfreiheit bei weiterer Verabreichung von Antiepileptika (Moshé et al., 2015). Eine derartige Resektion ist allerdings nicht durch- führbar, wenn der epileptische Fokus trotz moderner diagnostischer Mittel nicht eindeutig lokalisierbar ist, mehrere Foki vorliegen oder das Entfernen des betroffenen Hirnareals mit für eine angemessene Lebensqualität unvertretbaren Konsequenzen verbunden wäre (Spencer, 2002; Nilsen & Cock, 2004; Duncan, 2011; Anyanwu & Motamedi, 2018). Beim Hund ist die Fokusresektion aufgrund der routinemäßig nicht durchführbaren Diagnostik zur Fokuslokali- sation klinisch nicht etabliert (Löscher, 2003; Martlé et al., 2014).
2.1.5 Das Konzept der (Anti-)Epileptogenese
Bei etwa 40 % der Epilepsiepatienten liegen ihrem Leiden bekannte Ätiologien zu Grunde, wie z.B. Schädel-Hirn-Traumata, ischämische Schlaganfälle, Tumore, Infektionen oder SE (Banerjee et al., 2009; Löscher et al., 2013). Zwischen einer solchen Hirnschädigung und dem Auftreten erster spontaner wiederkehrender Anfälle als definierendes Kriterium für den Aus- bruch der Erkrankung besteht in der Regel ein Zeitintervall, welches zunächst in den meisten Fällen jeglicher Anfallssymptomatik entbehrt (Walker et al., 2002; Löscher & Brandt, 2010).
In der Epileptologie besteht die Hypothese, dass es in dieser „stillen“ und variabel von Wo- chen bis Jahren andauernden Latenzzeit zu strukturellen, funktionellen und molekularen Ver- änderungen des neuronalen Gewebes mit dem Resultat der „Epileptisierung“ des Gehirns kommt (Pitkänen & Lukasiuk, 2009; Löscher & Brandt, 2010). Im Falle des Scheiterns von natürlichen Reparaturmechanismen und des Auftretens von begünstigenden Faktoren wie z.B.
weiteren Komorbiditäten oder eines „second hit“ führen jene Veränderungen schließlich zu einer persistierenden Umstrukturierung des Gehirns, die die intrinsische Generierung sponta- ner wiederkehrender Anfälle ermöglicht (Walker et al., 2002; Löscher & Brandt, 2010). Das Zusammenspiel dieser Veränderungen wird unter dem Begriff „Epileptogenese“ zusammen- gefasst (s. Abbildung 1) und wird nicht nur durch bekannte Ätiologien induziert, sondern kann ebenfalls durch genetische Mutationen ausgelöst werden bzw. bei Epilepsien unbekann- ter Ätiologie wirken (Löscher & Brandt, 2010; Löscher et al., 2013). Auch die pathologischen Prozesse nach bereits etablierter Epilepsie mit der Konsequenz der Progression der Erkran- kung werden als (sekundäre) Epileptogenese bezeichnet (Pitkänen et al., 2013).
Zu den epileptogenen Vorgängen zählen u.a. Neuroinflammation, Neurodegeneration, Hyper- exzitabilität der Neurone, modifizierte Expression und Funktion von Ionenkanälen und
Rezeptoren sowie Neuorganisation neuronaler Netzwerke mittels synaptischer Plastizität (Lehmann et al., 2001; Dichter, 2009; Pitkänen & Lukasiuk, 2009; Löscher & Brandt, 2010;
Kobow et al., 2012; Löscher et al., 2013). Die unbeantwortete Kernfrage hinsichtlich der Epi- leptogenese bleibt jedoch das bis dato dürftige Verständnis des Zusammenhangs zwischen Ursache und Konsequenz der ablaufenden Prozesse und folglich des anscheinend multifakto- riellen Pathomechanismus der Epilepsie (s. Abbildung 1). Dies stellt insofern ein Dilemma dar, als dass die vollständige pharmakologische Verhinderung der Epileptogenese eine wün- schenswertere Therapieoption darstellt als die oben beschriebene symptomatische und lebens- lange Anfallsunterdrückung (Pitkänen, 2010; Löscher & Schmidt, 2011). Ergo ist eine pro- phylaktische Verhinderung der Epilepsieentstehung bis heute nicht möglich und bildet einen wichtigen Fokus in der Forschung zur Epilepsieprävention (White & Löscher, 2014; Jehi &
Vezzani, 2014; Löscher, 2016).
Dieses Konzept der Antiepileptogenese bzw. der antiepileptogenen Therapie hat demnach das Ziel, unter einer zeitlich begrenzten pharmakologischen Einflussnahme vor dem möglichen Auftreten erster spontaner Anfälle einerseits die Epilepsie im Idealfall erst gar nicht entstehen zu lassen oder andererseits die Anfälle in ihrer Frequenz, Dauer und Intensität im Sinne einer Krankheitsmodifikation einzugrenzen (Löscher & Brandt, 2010; Pitkänen et al., 2013). Die Latenzzeit präsentiert sich bei diesem Konzept als geeignetes Zeitfenster für antiepileptogene Maßnahmen (Walker et al., 2002; Pitkänen, 2004; Dichter, 2009; Jensen, 2009). In welchem Umfang die Existenz einer Latenzzeit jedoch zu definieren ist und ob sie überhaupt eine not- wendige Entität für die Epileptogenese darstellt, wird in neueren Studien kritisch betrachtet (Sloviter, 2011; Löscher et al., 2015). Sie weist unter anderem häufig keine genau definierba- ren zeitlichen Größen auf. Weiterhin kann ihr Bild bei nicht exakt vollführten Überwachungsmaßnahmen zur Detektion von Anfällen im Tiermodell verschwommen er- scheinen. Nichtsdestotrotz finden epileptogene Prozesse nach dem Primärinsult statt, sodass sich bereits unmittelbar danach ein potentielles Therapiefenster eröffnet. Bei einer antiepilep- togenen Behandlung nach dem Auftreten der ersten Anfälle spricht man ebenfalls von Krank- heitsmodifikation (Pitkänen et al., 2013). Diese soll gleichermaßen eine langfristige Abmilde- rung der Symptomatik einleiten, mögliche Pharmakoresistenzen zu Gunsten der klassischen, begleitenden antiepileptischen Behandlung rückgängig machen und/oder die Progression bzw.
die Ausprägung von Komorbiditäten chronischer Epilepsien einschränken (s. Abbildung 1).
Bei dem naheliegenden Schritt, Antiepileptika auf ein mögliches antiepileptogenes Potential zu überprüfen, stellte sich bis dato der Erfolg weder in klinischen Studien nach Schädel-Hirn- Trauma noch in tierexperimentellen Versuchen ein (Temkin, 2001, 2009; Löscher & Brandt, 2010; Löscher, 2011). Bei letzteren konnte lediglich ein krankheitsmodifizierender Effekt durch die Antiepileptika Carisbamat, Topiramat und Valproat nachgewiesen werden. Dieser Umstand zeigt offensichtlich, dass sich die Prozesse der Anfallsentstehung (Iktogenese) von denjenigen der Epileptogenese grundlegen unterscheiden (Weaver, 2003). Um jene kritischen Prozesse fokussierter anzusteuern, wurden anhand von zahlreichen Studien rationale Strate- gien zur Epilepsieprävention entwickelt. Zu diesen Strategien zählen in erster Linie Neuropro- tektion (Brandt et al., 2006; Langer et al., 2011), Antiinflammation (Vezzani & Granata, 2005; Jung et al., 2006; Polascheck et al., 2010), Immunmodulation (Chwiej et al., 2010) und Neuromodulation (Brandt et al., 2010).
Ein weiteres Ziel in der Forschung zur Epilepsieprävention bildet das Identifizieren von Bio- markern der Epileptogenese, die es ermöglichen würden, nach einem initialen Hirninsult die Entstehung der Epilepsie mit einer bestimmten Sicherheit voraussagen zu können (Engel, 2018). Da nur etwa 15 - 25 % der Patienten mit Traumata Epilepsien entwickeln, könnten Biomarker klinische Studien effektiver, ökonomischer und zeitsparender gestalten (Engel et al., 2013). Insbesondere können sie als eine Art Visualisierung bzw. Charakterisierung der epileptogenen Prozesse im zeitlichen Verlauf fungieren und auf diesem Wege den Erfolg bzw.
den optimalen Zeitpunkt einer antiepileptogenen Maßnahme voraussagen oder gar die Ent- wicklung neuer antiepileptogener Substanzen fördern (Engel, 2011, 2018; Jozwiak et al., 2017). Viel Forschung wurde in den letzten Jahren in bildgebende Verfahren, Elektrophysio- logie, sowie molekulare und zelluläre Abläufe im Gehirn als vielversprechende Biomarker investiert (Engel, 2011; Engel et al., 2013; Frauscher et al., 2017; Jozwiak et al., 2017).
Abbildung 1: Schematische Darstellung des zeitlichen Ablaufs der Epileptogenese und der Konzepte therapeutischer Interventionen
Nach Schidlitzki (2018) (modifiziert nach Löscher et al. [2008]).
2.1.6 Tiermodelle in der Epilepsieforschung
Da es sich bei Epilepsien um Erkrankungen hoher Komplexität im Hinblick auf ihren Patho- mechanismus handelt, sind Tierversuche als Modell für sowohl Human- als auch Veterinär- medizin in der Epilepsieforschung unerlässlich und bis heute nicht durch alternative Metho- den wie z.B. die Zellkultur zufriedenstellend ersetzbar (Raol & Brooks-Kayal, 2012; Stewart et al., 2012). Die Tiermodelle werden in Anfallsmodelle und Epilepsiemodelle unterteilt. Bei ersteren werden auf chemischem oder elektrischem Wege epileptische Anfälle provoziert, wodurch sich diese Modelle besonders für Screening-Verfahren von Substanzen auf ihre anti- konvulsive Wirkung in der pharmazeutischen Industrie eignen (Löscher, 2011). Hierzu zählen beispielsweise der Maximal-Elektroschock-Anfalls-Test, kurz MES-Test, und der Pentylen- tetrazol-Anfallsschwellentest, kurz PTZ-Test.
Die Epilepsiemodelle sind hingegen zur Untersuchung der Pathogenese der Epilepsie konzi- piert und sollen die Natur und die Ausprägung der Erkrankung möglichst realitätsnah abbil- den (Löscher, 1999; Pitkänen et al., 2007). Sie eignen sich zur Modellierung und Untersu- chung der (Anti-)Epileptogenese bei Mensch und Tier, da bei den Versuchstieren ein oder
mehrere Hirninsulte gesetzt werden, die im Laufe der Zeit zum Auftreten spontaner bzw. in- duzierbarer und in ihrer Intensität und Dauer progressiver Anfälle führen. Als Beispiele für diese Modelle lassen sich Kindling-Modelle, chemische und elektrische Post-SE-Modelle für TLE und Modelle für traumatische Hirninsulte, Schlaganfälle sowie Fieberkrämpfe aufführen (Löscher, 2002; Walker et al., 2002; Stables et al., 2003; Pitkänen et al., 2007; White &
Löscher, 2014). Aufgrund einer starken Heterogenität in der Krankheitsausprägung eignet sich nicht jedes dieser Modelle für die Validierung antiepileptogener bzw. krankheitsmodifi- zierender Therapien (Galanopoulou et al., 2012; White & Löscher, 2014). Von den National Institutes of Health/National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NIH/NINDS) werden daher nur das Kindling-Modell und die Post-SE-Modelle für antiepileptogene Studien empfohlen (Stables et al., 2003). Trotz einer breiten Anwendung des Kindling-Modells weicht dieses sukzessiv den Post-SE-Modellen, da sich bei letzteren das Auftreten einer Latenzzeit als mögliches Therapiefenster für antiepileptogene Maßnahmen besonders gut eignet (Stables et al., 2003; Löscher & Brandt, 2010; White & Löscher, 2014). In diesen Modellen fungiert der SE als initialer Hirninsult zur Induktion der Epileptogenese (Löscher & Brandt, 2010). Sie haben in der Epileptologie einen hohen Stellenwert, da die Krankheitsentwicklung, die Symp- tomatik und die neuropathologischen Gegebenheiten der TLE des Menschen sehr ähnlich sind (Löscher, 2002; Stables et al., 2003). Nichtsdestotrotz hat die Debatte um das adäquate Ver- suchsdesign und die Translationalität dieser Modelle auf die klinische Realität der Erkran- kung bei Mensch und Tier eine hohe Relevanz. Aspekte wie beispielsweise Varianz in SE- Dauer, -Intensität und seinem pharmakologischen Abbruch (Brandt et al., 2003, 2015), die langwierigen Versuchsdurchläufe mit möglicherweise zu kurzen oder zeitlich ungünstig lie- genden Detektionsmaßnahmen spontaner Anfälle (Löscher & Brandt, 2010; Galanopoulou et al., 2012) und die Schwierigkeit des Ermittelns des optimalen Zeitpunktes und der Dauer ei- ner antiepileptogenen Therapie (Sloviter, 2011) können oftmals zu falsch positiven oder falsch negativen Rückschlüssen auf das antiepileptogene Potential einer Substanz führen (Galanopoulou et al., 2012; Pitkänen et al., 2013). Im Hinblick auf die Translation gilt zu be- achten, dass die Latenzzeit im Versuchsmodell äußerst kurz andauert, während sie sich beim Menschen sehr variabel über Wochen bis Jahre erstrecken kann (French et al., 1993;
Englander et al., 2003). In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Post-SE-Modelle verwendet:
das chemische Li-Pilocarpin-Modell und ein Modell der langanhaltenden elektrischen Stimu- lation der basolateralen Amygdala, bezeichnet als BLA-Modell.
2.1.6.1 Das Lithium-Pilocarpin-Modell
Erstmals wurde das natürlich in den Blättern des Jaborandistrauchs (Pilocarpus jaborandi) vorkommende Alkaloid Pilocarpin im Jahr 1983 von Turski et al. zur Induktion eines SE bei Ratten, später im Jahr 1984 bei Mäusen beschrieben (Turski et al., 1983a, 1984). Es ist ein nichtselektiver ACh-Agonist an peripher und zentral vorkommenden muskarinergen ACh- Rezeptoren, die die parasympathomimetische Wirkung des Alkaloids vermitteln (Frey &
Löscher, 2010). Ursprünglich wurde es zur Glaukombehandlung beim Menschen eingesetzt.
In Studien mit Knockout-Mäusen verhinderte die Deaktivierung der Gene für den M1- Subtypen des muskarinergen Rezeptors im Gegensatz zu Wildtyp-Mäusen selbst bei hohen Dosierungen von Pilocarpin die Entwicklung eines SE. Somit scheint der M1-Rezeptor eine kritische Rolle in der SE-Induktion durch Pilocarpin zu spielen (Hamilton et al., 1997). Wei- tere Details zu pathophysiologischen Mechanismen im Li-Pilocarpin-Modell werden in Kapi- tel 2.3.1 beschrieben.
Die systemische Applikation des Pilocarpins kann entweder einmalig als Bolus (Turski et al., 1983a) oder auf fraktionierte Weise (Glien et al., 2001) stattfinden. Aufgrund der gängigen Verwendung hoher Dosierungen des Pilocarpins und seiner nicht zu unterschätzenden Toxizi- tät ist die fraktionierte Applikation zur Senkung der üblicherweise hohen Mortalität und zur Ermöglichung individueller Dosierungen bis zum Erreichen des SE zu bevorzugen (Glien et al., 2001; Gröticke et al., 2007). Eine weitere Strategie zur Senkung der Dosis des Pilocarpins bei gleichbleibender Effektivität stellt die Vorbehandlung der Ratten mit Li bis zu 24 h vor SE-Induktion dar, wodurch die konvulsive Wirkung des Pilocarpins potenziert wird (Honchar et al., 1983; Jope et al., 1986; Clifford et al., 1987; Cavalheiro et al., 2006; Curia et al., 2008).
Zwar ist die Wirkungsweise des Li nicht genau bekannt, allerdings beschrieben Marchi et al.
(2009) einen systemisch inflammatorischen Effekt und Schädigungen der Blut-Hirn-Schranke mit der vermeintlichen Folge einer Begünstigung der prokonvulsiven Wirkung des Pilocar- pins bei Ratten. Im Gegensatz dazu haben jedoch Dmowska et al. (2010) in einer Studie mit Ratten zeigen können, dass die Verabreichung proinflammatorischer Lipopolysaccharide 72 h vor der Applikation von Pilocarpin seine Wirkung nicht verstärken konnte. Interessanterweise konnte eine Potenzierung des prokonvulsiven Effekts von Pilocarpin durch Li bei Mäusen nicht nachgewiesen werden (Gröticke et al., 2007). Um die peripheren muskarinergen Wir- kungen des systemisch applizierten Pilocarpins zu unterbinden, wird zuvor Methylscopolamin
zur Antagonisierung appliziert (Curia et al., 2008). Aufgrund seiner Methylgruppe ist es nicht hirngängig und hindert daher nicht die zentrale Wirkung des Pilocarpins.
Über initiale Akinesie, Ataxie, Tremor, faziale Automatismen, stereotypes Verhalten und my- oklonische Bewegungen des Kopfes und der Gliedmaßen entstehen schließlich wiederkehren- de myoklonische fokale Anfälle, die sich zu bilateralen tonisch-klonischen Anfällen (früher:
sekundär generalisierte Anfälle) mit Aufbäumung, Salivation und schließlich Verlust der Stellreflexe mit der Folge eines mehrstündigen generalisiert konvulsiven SE entwickeln (Turski et al., 1983a, 1984, 1989). In der Regel wird der SE nach 60 - 90 min pharmakolo- gisch mit Antiepileptika und/oder Narkotika als weitere Maßnahme zur Senkung der Mortali- tät abgebrochen (Löscher & Brandt, 2010). Unterschiedliche Regimes bezüglich der Dauer des SE und seines Abbruchs führen jedoch zu variablen Inzidenzen in der Epilepsieentwick- lung bei den Versuchstieren. Klitgaard et al. (2002) konnten bereits spontane Anfälle nach dem Abbruch eines 30-minütigen SE mit Diazepam nachweisen, wenngleich nur wenige Rat- ten diesen entwickelten. Bei einem Abbruch nach einer SE-Dauer von 90 - 120 min durch Diazepam entwickeln mehr als 80 % der Ratten spontane Anfälle (Goodman, 1998;
Löscher, 1999). Es ist hierbei wichtig zu erwähnen, dass ein SE rasch an Pharmakoresistenz gewinnt und ein alleiniger Abbruch durch Benzodiazepine, Barbiturate oder andere An- tiepileptika lediglich die Schwere des SE senken kann, während sein tatsächlicher Fortbestand dadurch nur maskiert wird (Jones et al., 2002; Wasterlain et al., 2009; Brandt et al., 2015).
Dies kann häufig zu Missinterpretationen der gewählten Versuchsparameter hinsichtlich spä- terer Anfallsentwicklung und des Erfolgs antiepileptogener Maßnahmen führen. So traten in einer vergleichenden Studie nach dem kombinierten und effektiveren Abbruch mit Diazepam, Phenobarbital und Scopolamin sogar nach einem 60-minütigen SE keine spontanen Anfälle auf (Brandt et al., 2015). Nach einer SE-Dauer von 90 min entwickelten hingegen 73 % bzw.
nach 120 min 100 % der Ratten spontane Anfälle. Auch die Dauer der in der Regel nur Tage bis wenige Wochen andauernden Latenzzeit bei Ratten in diesem Modell (Rattka et al., 2011) kann von Versuchsparametern wie SE-Dauer und Qualität des Abbruchs beeinflusst werden (Curia et al., 2008).
2.1.6.2 Das BLA-Modell
Das BLA-Modell basiert auf der langanhaltenden elektrischen Stimulation des basolateralen Kerngebiets der Amygdala (BLA) und lässt sich als eine Modifikation des
Amygdala-Kindling-Modells der Ratte verstehen (Brandt et al., 2003). Im Gegensatz zu den kurzen, wiederholten und subkonvulsiven elektrischen Impulsen im Amygdala-Kindling- Modell wird beim BLA-Modell der Ratte die BLA einmalig und langanhaltend stimuliert mit der Folge der Induktion eines SE, der wiederum wie im Li-Pilocarpin-Modell als primärer Insult zur Einleitung der Epileptogenese mit einer Latenzzeit fungiert (Brandt et al., 2003, 2016). Bereits 1973 konnten Racine et al. zeigen, dass die einmalige langanhaltende Stimula- tion der BLA je nach Stimulationsparametern zu selbsterhaltenden Anfällen bei Ratten führen kann. Ergänzend zeigten McIntyre et al. (1982), dass eine langanhaltende Stimulation zu einer fokalen Form des SE führt. 1988 konnten Handforth & Ackermann vier SE-Typen mit spezi- fischen Verhaltensmustern differenzieren: Immobilität, Explorationsverhalten, Mastikation und schließlich Klonus. Im Gegensatz zu den vorangehenden Studien untersuchten schließlich Brandt et al. (2003) zum ersten Mal auch die Langzeitfolgen der SE-Induktion in Form von spontanen wiederkehrenden Anfällen, harmonisierten aus jenen Studien und eigenen Untersu- chungen die Stimulationsparameter (s. Kapitel 4.3.2) und schlugen das BLA-Modell als neues Post-SE-Modell vor. Weiterhin wurde eine Klassifizierung in drei SE-Typen mit ansteigender Intensität vorgenommen: Typ 1: Fokaler SE mit nichtkonvulsiver Anfallsaktivität und Stereo- typien (z.B. Schnuppern); Typ 2: Eine Mischform aus fokalem SE und generalisierten Anfäl- len, die die fokale Grundaktivität wiederkehrend unterbrechen; Typ 3: Generalisiert konvulsi- ver SE, der durch eine rein generalisierte Anfallsaktivität charakterisiert ist. Während nur 33 % der in jener Studie untersuchten Ratten spontane Anfälle nach einem Typ 1-SE entwi- ckelten, kam es beim Typ 2- und Typ 3-SE bei über 90 % der Ratten zu spontanen Anfällen.
Die Latenzzeit im BLA-Modell dauert etwas länger als zwei Wochen (Löscher, 2002; Brandt et al., 2016). Die auftretende Neurodegeneration spitzt sich mit der Intensität der SE-Typen zu und ist in Ähnlichkeit der TLE des Menschen besonders in der Amygdala, im piriformen Kor- tex, im endopiriformen Nucleus, im mediodorsalen Thalamus, im entorhinalen Kortex und im Hippokampus vertreten (Brandt et al., 2003). Bereits vor der Etablierung des BLA-Modells wurde die elektrische Stimulation weiterer Kerngebiete der Amygdala wie z.B. ihres lateralen Anteils als Post-SE-Modell verwendet, bei dem die Latenzzeit im Mittel etwa einen Monat beträgt (Nissinen et al., 2000).
Im Unterschied zu chemischen Modellen wie dem Pilocarpin- oder Kainat-Modell scheint der elektrisch induzierte SE schwächer ausgeprägt zu sein, da für eine ähnliche Ausbeute an Tie- ren mit künftigen spontanen Anfällen dieser länger andauern muss (Brandt et al., 2003;
Bankstahl & Löscher, 2008). Selbst für den Typ 3-SE, der nicht zu unterscheiden ist von
einem generalisiert konvulsiven Pilocarpin-SE, ist eine längere Dauer für die Entwicklung von spontanen Anfällen von Nöten. Dies lässt sich durch die kombinatorische Wirkung aus SE und der toxischen Wirkung des Konvulsivums in chemischen Modellen erklären, wodurch die kritische Wirkzeit des SE zur Induktion der Epileptogenese verkürzt wird und jene Model- le selbst nach SE-Abbruch nach 90 - 120 min mit einer höheren Mortalität gekennzeichnet sind als elektrische Modelle (Goodman, 1998; Löscher, 1999). Aus diesen Gründen wird bei Modellen mit elektrischer Induktion eines SE oftmals auf den pharmakologischen Abbruch verzichtet (Löscher, 2002), wobei speziell im BLA-Modell bei Sprague-Dawley-Ratten eine SE-Dauer von 4 h (inkulsive Stimulation von 25 min) als geeignet erachtet wird, um die Langzeitfolgen der verschiedenen SE-Typen zu erforschen und pharmakologische Studien zur Antiepileptogenese zu konzipieren (Brandt et al., 2003). Über 90 % der Ratten entwickeln nach einer Typ 2- bzw. Typ 3-SE-Dauer von 3 - 4 h spontane Anfälle (Brandt et al., 2003, 2016). Für Biomarker-Studien bieten sich 2,5 h SE-Dauer an, da hierbei etwa 50 % der Ratten spontane Anfälle entwickeln und Vergleiche potentieller Biomarker zwischen stimulierten Tieren mit und ohne spontanen Anfällen möglich sind (Brandt et al., 2016).
2.2 Das cholinerge System
In der ersten Hälfte des 20. Jahrhunderts wurde die bereits zuvor bekannte Substanz Acetyl- cholin (ACh) als erster Neurotransmitter identifiziert. Seine Entdecker Sir Henry Hallett Dale und Otto Loewi wurden 1936 mit dem Nobelpreis für Physiologie oder Medizin für die Ent- deckung der elektrochemischen Neurotransmission ausgezeichnet (Tansey, 2006). Heute weiß man, dass ACh eine wichtige Rolle in zahlreichen sowohl peripheren als auch zentralen neu- ronalen Prozessen bei Wirbeltieren spielt (Taylor & Brown, 1999). Zu seinem peripheren Wirkungsspektrum gehören die Übersetzung elektrischer Signale an den motorischen End- platten der gestreiften Muskulatur und in peripheren Ganglien sowie die Vermittlung para- sympathischer Aktivität des autonomen Nervensystems unmittelbar am Effektororgan. Die zahlreichen peripheren Funktionen des ACh stehen bei der vorliegenden Arbeit nicht im Fo- kus und werden daher lediglich marginal behandelt. Der Schwerpunkt wird auf das cholinerge System im zentralen Nervensystem (ZNS) gesetzt, wo ACh neben anderen Neurotransmittern wie Glutamat und GABA eine wichtige funktionelle Rolle einnimmt.
2.2.1 Das zentrale cholinerge System
Als das „zentrale cholinerge System“ wird das Netzwerk von Neuronen im ZNS bezeichnet, das in der Lage ist, mithilfe intrazellulär angesiedelter Cholinacetyltransferase ACh aus Cho- lin und Acetyl-Coenzym A mit dem Zweck der Neurotransmission zu synthetisieren (Mesulam et al., 1983a; Mufson et al., 1986; Woolf, 1991; Oda, 1999; Taylor & Brown, 1999). In vorwiegend drei Regionen des Gehirns von Säugetieren sind cholinerge Kerngebiete aufzufinden, die wiederum in Sektoren (Ch) unterteilt werden (Mesulam et al., 1983b;
Mesulam, 1988, 2013; Oda, 1999; Dani & Bertrand, 2007; Lebois et al., 2018). Zum choli- nergen System des basalen Vorderhirns zählen Sektoren im Nucleus septalis medialis (Ch1), im vertikalen Ast des Stria diagonalis (Ch2), im horizontalen Ast des Stria diagonalis (Ch3) und im Nucleus basalis (Ch4). Cholinerge Kerngebiete des Hirnstamms finden sich im Nu- cleus tegmentalis pedunculopontinus (Ch5), im Nucleus tegmentalis posterolateralis (Ch6), im Nucleus habenularis medialis (Ch7) und im Nucleus parabigeminalis (Ch8). Die dritte Po- pulation stellen einzelne Lokalisationen cholinerger Zellkörper wie z.B. cholinerge Interneu- rone des Striatums dar, deren Axone gebündelter verlaufen und nicht eine derartig diffuse Innervation aufweisen wie die oben erwähnten cholinergen Neurone (Woolf & Butcher, 1981;
Dani & Bertrand, 2007). Weiterhin treten kleinere Ansammlungen cholinerger Neurone in Kerngebieten einiger Kopfnerven sowie im Rückenmark auf (Mesulam, 1988; Oda, 1999).
Auch der Hippokampus enthält cholinerge Interneurone in geringem Ausmaß, deren Funktion noch nicht gänzlich verstanden ist (Yi et al., 2015). Für eine detaillierte Übersicht des zentra- len cholinergen Systems s. Abbildung 2.
Abbildung 2: Schematische Darstellung des zentralen cholinergen Systems anhand eines Sagittalschnitts eines Rattenhirns
Die drei Gebiete hohen Vorkommens cholinerger Zellkörper befinden sich im basalen Vorderhirn, im Hirnstamm und im Striatum (schwarze Felder). Cholinerge Nervenfasern innervieren weite Teile des Gehirns (schwarze Pfeile). Nach Woolf (1991).
Die Axone der zentralen cholinergen Neurone reichen diffus in zahlreiche Gebiete des Ge- hirns, sind stark verzweigt und weisen z.T. beträchtliche Längen auf (Woolf, 1991; Dani &
Bertrand, 2007; Picciotto et al., 2012; Wu et al., 2014; Lebois et al., 2018). Während ACh in der Peripherie in Ganglien und an der neuromuskulären Endplatte durch direkte Depolarisati- on der postsynaptischen Zelle exzitatorisch wirkt, wird ihm im ZNS eine vorwiegend modula- torische Rolle zugeschrieben (Picciotto et al., 2012). Dies äußert sich darin, dass cholinerge Rezeptoren nicht nur zur direkten synaptischen Signalübertragung durch ACh selbst bestimmt sind, sondern zusätzlich sowohl prä- als auch postsynaptisch auf zahlreichen weiteren neuro- nalen Zelltypen vorkommen und die Effekte des an diesen Synapsen hauptsächlich wirkenden Neurotransmitters je nach Rezeptortyp entweder abschwächen oder verstärken (Dani &
Bertrand, 2007; McKay et al., 2007; Picciotto et al., 2012; Lebois et al., 2018). Hiermit stellt sich die kontrovers diskutierte Frage, ob das ACh zu den nicht-cholinergen Synapsen aus- schließlich durch Ausschüttung aus einer in unmittelbarer Nähe liegenden cholinergen Synap- se gelangt (Picciotto et al., 2012). Die diffuse und extensive Verzweigung des cholinergen Systems bestärkt die Theorie, dass ACh vielmehr nach seiner Ausschüttung aus Varikositäten in den Extrazellularraum über gewisse Strecken zu den Wirkungsorten diffundieren könnte
(Volumentransmission), zumal Ort der Ausschüttung und der Rezeptorlokalisation nicht im- mer übereinstimmen und die Konzentration des extrazellulären ACh sich nicht immer mit der typischen Abbaurate eines synaptischen Neurotransmitters decken lässt (Wainer et al., 1984;
Vizi & Kiss, 1998; Zoli et al., 1999; Dani & Bertrand, 2007; Kawai et al., 2007; Picciotto et al., 2012). Dieser Theorie steht der Umstand entgegen, dass die im synaptischen Spalt lokali- sierte AChE ein effizientes System zum raschen extrazellulären ACh-Abbau darstellt (Picciotto et al., 2012). Wahrscheinlich sind beim zentralen cholinergen System beide Wege der Neurotransmission möglich.
Mit seiner hauptsächlich modulatorischen Wirkung, seinem Reichtum an differenzierten Re- zeptorsubtypen und seinem breiten und diffusen Einflussgebiet steckt das ACh funktionell einen breiten Bereich ab und ist für neuronale Prozesse prädestiniert, die mit Neuroplastizität einhergehen und sich in nachhaltigen Anpassungen an verschiedene Umwelteinflüsse wider- spiegeln (Cobb & Davies, 2005; Picciotto et al., 2012). Es ist daher u.a. an Lernen, Gedächt- nisbildung sowie Kognition beteiligt, beeinflusst das Sucht- und Belohnungszentrum, modu- liert die Beantwortung von Informationen des autonomen Nervensystems aus der Peripherie (Thermoregulation, Nahrungsaufnahme, verschiedene metabolische Prozesse), ist für die mo- torische Koordination von Bedeutung und spielt eine Rolle bei Aufmerksamkeit, Schlaf- Wach-Rhythmus und Orientierung (Woolf, 1991; Picciotto et al., 2012; Hrabovska & Krejci, 2014). Dysfunktionen des cholinergen Systems können mit Erkrankungen wie Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson, Schizophrenie, Chorea Huntington und Epilepsie in Zusam- menhang gebracht werden (Dani & Bertrand, 2007; Friedman et al., 2007; Terry, 2008;
Steinlein & Bertrand, 2010; Hrabovska & Krejci, 2014; Pepeu & Grazia Giovannini, 2017).
Die Vermittlung neuronaler Signale durch das ACh erfolgt in erster Linie über zwei Hauptre- zeptorgruppen, die als muskarinerge und nikotinerge Rezeptoren bezeichnet werden (Taylor
& Brown, 1999). Diese Namensgebung wurde durch eine erste grobe funktionelle Einteilung der cholinergen Rezeptoren durch ihre Agonisten Muskarin und Nikotin noch vor der Entde- ckung ihrer Involvierung im Nervensystem bedingt (Dale, 1914). Heute ist bekannt, dass die beiden cholinergen Rezeptorgruppen wiederum in zahlreiche strukturelle und funktionelle Untergruppen unterteilt werden können.
2.2.2 Der muskarinerge Acetylcholin-Rezeptor
Muskarinerge Rezeptoren stellen Proteinstrukturen in der Zellmembran dar, die zu den Sieben-Transmembrandomänen-Rezeptoren gehören und keinen Ionenkanal beinhalten (Taylor & Brown, 1999). Ihrer Natur nach wird das Signal des gebundenen Liganden ACh über Konformationsänderungen des Rezeptors ins Zellinnere geleitet und unter Beteiligung weiterer Proteine über eine fortschreitende Signalkaskade (Second-Messenger-Weg) weiter- vermittelt, die zu bestimmten Veränderungen in der Zelle führt (Taylor & Brown, 1999;
Lanzafame et al., 2003). Aufgrund dieser Art der Informationsweiterleitung werden die Re- zeptoren als „metabotrope Rezeptoren“ bezeichnet. Infolge der Involvierung makromolekulä- rer Mechanismen und der nur mittelbaren Beeinflussung des Membranpotentials findet die Signalübertragung der muskarinergen Rezeptoren im Vergleich zu Rezeptoren mit Ionenkanal (ionotrope Rezeptoren) vergleichsweise langsam mit einer Latenz von 100 - 250 ms statt (Taylor & Brown, 1999). Der Rezeptor befindet sich einerseits in der Peripherie in zahlrei- chen Organen wie z.B. Herz- und glatter Muskulatur und vermittelt dort parasympathische Effekte, andererseits ist er auch weit verbreitet im ZNS vertreten (Caulfield, 1993; Eglen, 2006). Es sind fünf Subtypen des Rezeptors bekannt (M1-M5), die alle zu unterschiedlichen Anteilen im Gehirn vorkommen (Hulme et al., 1990; Levey et al., 1991, 1995; Caulfield, 1993; GTEx Consortium, 2012; Alger et al., 2014; Lebois et al., 2018). Die Subtypen M1, M2 und M4 kommen im gesamten Gehirn am häufigsten vor, während die Subtypen M3 und M5 in geringerem Grad exprimiert werden. Unabhängig von ihrer Verteilung sind bestimmte Funktionsschemata der muskarinergen Rezeptoren in der Regel allgemeingültig und wurden in zahlreichen Studien an Nagern erforscht (Shirey et al., 2008, 2009; Dasari & Gulledge, 2011; Gigout et al., 2012a; Young & Thomas, 2014; Shen et al., 2015; Thorn et al., 2017;
Lebois et al., 2018). So kommen sie auf den synaptischen Membranen vieler verschiedener Neuronentypen vor und modulieren dort die Wirkung des primären Neurotransmitters der Synapse. Die M1-, M3- und M5-Subtypen sind exzitatorische Rezeptoren, die in der Regel postsynaptisch vorkommen. Durch ihre Aktivierung wird über den Second-Messenger-Weg die Konzentration intrazellulärer Calciumionen (Ca2+) erhöht, wodurch es zu einer erhöhten Exzitabilität der postsynaptischen Zelle kommt. Die Erregung der Zielzelle durch den pri- mären Neurotransmitter ist somit begünstigt bzw. im Falle einer inhibitorischen Synapse, wie z.B. einer GABAergen Synapse, ihre Inhibition erschwert. Bei M2- und M4-Subtypen handelt es sich um inhibitorische Rezeptoren, die in der Regel präsynaptisch auftreten. Durch ihre Aktivierung wird cyclisches Adenosinmonophosphat in der präsynaptischen Zelle reduziert,
