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1. Auflage 2007
© 2007 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen Printed in Germany
ISBN 978-3-939902-27-0
Verlag: DVG Service GmbH Frankfurter Straße 89
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www.dvg.net
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Immunhistochemische Untersuchungen zur Proliferation und Apoptose im fetalen ovinen Gehirn nach experimenteller intrauteriner Infektion mit dem
Virus der Bovinen Virusdiarrhoe
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
Vorgelegt von Claudia Anita Szentiks
aus Ibbenbüren
Hannover 2007
Wissenschaftliche Betreuung:
Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein
1. Gutachter: Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein 2. Gutachter: Prof. Dr. B. Grummer
Tag der mündlichen Prüfung: 08.03.2007
Meiner Mutter Edith Szentiks und
Uwe Blöbaum in Dankbarkeit gewidmet
INHALTSVERZEICHNIS
1 Einleitung ... 1
2 Schrifttumsübersicht ... 5
2.1 Folgen transplazentarer Pestivirusinfektionen... 5
2.2 Pestivirus induzierte Alterationen im ZNS von Schafen ... 8
2.2.1 Infektionen mit dem Border Disease Virus (BDV)... 9
2.2.1.1 Alterationen im Großhirn nach intrauteriner BDV Infektion... 11
2.2.1.2 Alterationen im Kleinhirn nach intrauteriner BDV Infektion ... 12
2.2.1.3 Sonstige Alterationen nach intrauteriner BDV Infektion... 12
2.2.2 Spontaninfektionen mit dem Virus der Bovinen Virusdiarrhoe (BVDV) beim Schaf... 13
2.2.3 Experimentelle Infektionen mit BVDV beim Schaf ... 14
2.2.3.1 Alterationen im Großhirn nach experimenteller, intrauteriner BVDV Infektion... 15
2.2.3.2 Alterationen im Kleinhirn nach experimenteller, intrauteriner BVDV Infektion... 16
2.2.3.3 Sonstige Alterationen nach experimenteller, intrauteriner BVDV Infektion... 16
2.3 Das Virus der Bovinen Virusdiarrhoe (BVDV)... 16
2.3.1 Das Virus... 16
2.3.1.1 Taxonomie... 17
2.3.1.2 Struktur und Morphologie ... 17
2.3.1.3 Eigenschaften des Virus... 18
2.3.2 Zytopathogene und nicht zytopathogene Biotypen des BVDV ... 18
2.3.3 BVDV induzierte Apoptose ... 20
2.3.3.1 Einführung in die Apoptose... 21
2.3.3.2 Apoptose in mit BVDV infizierten Zellkulturen ... 26
2.3.3.3 Apoptose bei BVD Virus Infektion in vivo ... 29
2.4 Gehirnentwicklung ... 30
2.4.1 Einführung in den Ventrikelzyklus... 31
2.4.2 Mensch und andere Säugetiere... 33
2.4.3 Besonderheiten der Gehirnentwicklung beim Schaf ... 35
2.4.4 Zellproliferation ... 37
2.4.4.1 Ki-67 Protein... 38
2.4.5 Apoptose im ZNS ... 39
2.4.5.1 Morphologische Kennzeichen der Apoptose ... 41
2.4.5.2 Vergleich: Apoptose versus Nekrose... 42
2.4.5.3 Caspase 3 ... 44
3 Material und Methoden ... 47
3.1 Untersuchungsmaterial... 47
3.1.1 Gehirne von nicht infizierten Schaffeten ... 47
3.1.2 Gehirne von mit nzp BVDV transplazentar infizierten Schaffeten... 49
3.1.3 Gehirne von mit zp BVDV transplazentar infizierten Schaffeten... 50
3.1.4 Gehirne von zusätzlich untersuchten Schaffeten... 52
3.2 Untersuchungsregionen ... 53
3.3 Anfertigung von Gewebeschnittpräparaten ... 57
3.4 Immunhistochemische Methoden... 57
3.4.1 Primäre Antikörper... 57
3.4.2 Sekundäre Antikörper... 58
3.4.3 Durchführung der immunhistochemischen Reaktion zum Nachweis von
aktivierter Caspase 3... 58
3.4.4 Durchführung der immunhistochemischen Reaktion zum Nachweis von Ki-67 Antigen ... 61
3.4.5 Durchführung der immunhistochemischen Reaktion zum Nachweis von BVDV Antigen... 62
3.4.6 Kontrollen zur Spezifität der Antikörper ... 63
3.4.7 Auswertung und Dokumentation... 64
3.4.7.1 Auszählung der Caspase 3 Reaktion ... 65
3.4.7.2 Semiquantitative Auswertung der Ki-67 Reaktion... 66
3.4.7.3 Semiquantitative Auswertung des BVDV Antigen Nachweises ... 67
3.4.7.4 Statistische Analyse ... 67
4 Ergebnisse ... 69
4.1 Histopathologische Veränderungen ... 69
4.2 Nachweis der aktivierten Caspase 3... 78
4.2.1 Caspase 3 Reaktion bei nicht infizierten Schaffeten... 79
4.2.2 Caspase 3 Reaktion bei mit nzp BVDV infizierten Schaffeten ... 81
4.2.3 Caspase 3 Reaktion bei mit zp BVDV infizierten Schaffeten... 84
4.2.4 Apoptotischer Index (AI) ... 88
4.2.5 Apoptotische Zellen pro Fläche ... 95
4.3 Nachweis von Ki-67 Antigen...102
4.3.1 Ki-67 Reaktion bei nicht infizierten Schaffeten ...103
4.3.2 Ki-67 Reaktion bei mit nzp BVDV infizierten Schaffeten...107
4.3.3 Ki-67 Reaktion bei mit zp BVDV infizierten Schaffeten...109
4.3.4 Semiquantitative Untersuchung der Ki-67 Expression...110
4.4 Nachweis von BVDV Antigen ...116
4.5 Korrelation zwischen dem Auftreten von aktivierter Caspase 3 und Ki-67 Expression ...119
4.6 Korrelation zwischen dem Auftreten von BVDV Antigen und aktivierter Caspase 3 und/oder Ki-67 Expression ...122
5 Diskussion ... 127
5.1 Apoptose im fetalen Schafgehirn...127
5.1.1 Apoptose im fetalen Schafgehirn bei nicht infizierten Schaffeten ...128
5.1.2 Apoptose im fetalen Schafgehirn bei mit nzp BVDV infizierten Schaffeten ...132
5.1.3 Apoptose im fetalen Schafgehirn bei mit zp BVDV infizierten Schaffeten ...134
5.1.4 Apoptose in mit Bouin´scher Lösung fixierten Gehirnen von Schaffeten ...139
5.1.5 Nachweis von aktivierter Caspase 3 in mit Schmechel´scher Lösung fixierten fetalen Gehirnen ...139
5.2 Ki-67 Expression ...140
5.2.1 Ki-67 Expression im Gehirn von nicht infizierten Schaffeten ...140
5.2.2 Ki-67 Expression im fetalen Schafgehirn nach Infektion mit nzp BVDV ...141
5.2.3 Ki-67 Expression im fetalen Schafgehirn nach Infektion mit zp BVDV ...141
5.2.4 Nachweis von Ki-67 in mit Bouin´scher Lösung fixierten fetalen Schafgehirnen ...142
5.2.5 Nachweis von Ki-67 in mit Schmechel´scher Lösung fixierten fetalen Schafgehirnen ...143
5.3 Zusammenhang zwischen der Expression von Ki-67 und dem Nachweis von aktivierter Caspase 3 bei nicht infizierten Schaffeten
...144
5.4 Zusammenhang zwischen der Expression von Ki-67, dem Nachweis von aktivierter Caspase 3 und BVDV antigenhaltigen Zellen sowie der Infiltration von Makrophagen...145
6 Zusammenfassung ... 151
7 Summary ... 155
8 Schrifttumsverzeichnis... 159
9 Anhang ... 189
9.1 Tabellen...189
9.2 Demaskierungs-, Puffer- und Färbelösungen ...205
9.2.1 Demaskierungslösungen ...205
9.2.1.1 Citratpuffer...205
9.2.1.2 Demaskierungslösung G ...205
9.2.1.3 Pronase E...205
9.2.1.4 Trypsin...206
9.2.2 Pufferlösungen ...206
9.2.2.1 Phosphatgepufferte Natriumchlorid-Lösung (PBS)...206
9.2.2.2 Phosphatgepufferte Natriumchlorid-Lösung mit 0,05% Tween...206
9.2.2.3 Avidin-Biotin-Komplex-Reagenz (ABC-Reagenz)...207
9.2.3 Färbelösungen...207
9.2.3.1 Diaminobenzidin-Tetrahydrochloriddihydrat (DAB)...207
9.2.3.2 Martius–Scarlet–Blue (MSB) Färbung ...208
9.2.3.2.1 Weigert´s Eisenhämatoxylin ...208
9.2.3.2.2 Martiusgelb ...209
9.2.3.2.3 Brilliant-crystal-scarlet 6R...209
9.2.3.2.4 Methylenblau ...209
9.3 Bezugsquellen ...210
9.3.1 Bezugsquellen für Chemikalien und Antikörper ...210
9.3.2 Bezugsquellen für Geräte und Einmalartikel...212
9.4 Verzeichnis der Abkürzungen ...214
1 Einleitung
Nach transplazentarer Infektion tragender Schafe verursacht eine Reihe von Viren Veränderungen im Zentralen Nervensystem (ZNS) des sich entwickelnden Fetus. Zu diesen Viren zählen auch Pestiviren, denen unter anderem das Virus der Bovinen Virusdiarrhoe (BVDV) angehört. Pestiviren treten weltweit auf und verursachen zum Teil erhebliche Verluste in landwirtschaftlichen Betrieben. Zu den Pestiviren gehören weiterhin das Virus der Border Disease (BDV) und das Virus der Klassischen Schweinepest. Das BVDV ist verantwortlich für das Krankheitsbild der Bovinen Virusdiarrhoe (BVD) und der Mucosal Disease (MD).
Beim Schaf können nach intrauterinen Pestivirusinfektionen diverse Veränderungen auftreten. Die immunologische Kompetenz und damit die Fähigkeit zu einer spezifischen Immunantwort gegenüber Pestiviren setzt bei Schaffeten zwischen dem 64. und 82. Tag der Trächtigkeit ein. Von diesem Zeitpunkt an kann der Fetus neutralisierende, virusspezifische Antikörper bilden. Feten, die vor dem Einsetzen der Immunkompetenz transplazentar mit einem Pestivirus infiziert werden, können eine virusspezifische Immuntoleranz und damit eine Viruspersistenz entwickeln ohne klinische Symptome zu zeigen. Wie beim Rinderfetus hängt die Ausprägung der pathomorphologischen Veränderungen beim Schaffetus nicht nur von der immunologischen Reife, sondern auch von dem Virusstamm, dem Biotyp des Virus, seinen Pathogenitätsfaktoren und den jeweils infizierten Zielzellen ab.
Bei der intrauterinen Infektion von Schafen mit dem Border Disease Virus (BDV) kann es zu Aborten, Wachstumsverminderung, Vliesanomalien und/oder einem missgestalteten Skelett kommen. Im Gehirn zeigt sich häufig eine Hypomyelinogenese, Porenzephalie, Hydranenzephalie und/oder Hydrozephalus.
Nach experimenteller, transplazentarer Infektion mit einem nicht zytopathogenen (nzp) Biotyp des BVDV traten bei Schaffeten im Gehirn Leukoenzephalomalazien auf
(HEWICKER-TRAUTWEIN et al. 1995 b). Nach experimenteller, intrauteriner Infektion mit einem zytopathogenen (zp) BVDV wurden unter anderem Porenzephalie, Hydranenzephalie und/oder Kleinhirnhypoplasie beobachtet (HEWICKER-TRAUTWEIN u. TRAUTWEIN 1994). Als histologische Veränderungen wurden bei diesen Feten Infiltrationen mit Makrophagen, Leukomalazien im Groß- und/oder Kleinhirn sowie Rarefikationen der äußeren Körnerschicht des Kleinhirns berichtet. In diesem Zusammenhang stellt sich die Frage, ob an der Entstehung der Gehirnveränderungen außer Zellnekrose auch durch BVDV induzierte Apoptose beteiligt ist, da das zp BVDV in vitro zur Apoptose führt.
Im Rahmen der normalen fetalen Gehirnentwicklung kommt es zu einem Zusammenspiel zwischen der Neubildung von Zellen und dem Abbau von Zellen durch programmierten Zelltod. Im Telenzephalon findet die Zellproliferation in der Ventrikular- (VZ) und Subventrikularzone (SVZ) statt. Die Zellen wandern von dort aus in die Intermediärzone (IZ) und die Kortikalplatte (KP). Im Kleinhirn findet die Zellproliferation bzw. die Mitose vor allem in der äußeren Körnerschicht statt, von wo aus die Zellen zur inneren Körnerschicht wandern. Während der aktiven Phasen der Mitose exprimieren die Zellen das Ki-67 Protein, nicht jedoch während der Ruhephasen. Das Pendant zur Mitose ist die Apoptose. Sie verkörpert im Gegensatz zur Nekrose den programmierten Zelltod und ist ein wichtiger Bestandteil der normalen embryonalen Entwicklung. Im Rahmen der normalen Gehirnentwicklung der Säugetiere kommt es zur Apoptose von Zellen, die beispielsweise keine synaptischen Verbindungen aufgebaut haben oder denen andere neurotrophe Faktoren fehlen. Apoptose wird durch verschiedene Mechanismen reguliert. Im fetalen Gehirn ist die Caspase 3 bzw. ihre aktivierte Form eine wichtige Schlüsselsubstanz in Bezug auf die Regulation der Apoptose.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Telenzephalon und das Kleinhirn von Schaffeten, welche experimentell, transplazentar mit einem nzp bzw. zp BVDV infiziert worden waren, immunhistochemisch mit spezifischen Antikörpern hinsichtlich des Auftretens von aktivierter Caspase 3 zu untersuchen. Weiterhin sollte mit Hilfe
von spezifischen Antikörpern für Ki-67 die Zellproliferation in den verschiedenen Schichten des Telenzephalons und Kleinhirns dieser Feten charakterisiert werden.
Die Befunde der infizierten Feten sollten mit denjenigen der nicht infizierten Kontrollfeten verglichen werden. Des Weiteren sollte das Auftreten von Apoptose mit den bei den infizierten Feten beobachteten histopathologischen Gehirnveränderungen und der Verteilung von BVD Virusantigen korreliert werden.
Die beiden infizierten Gruppen sollten ebenfalls miteinander verglichen werden.
2 Schrifttumsübersicht
2.1 Folgen transplazentarer Pestivirusinfektionen
Zu den Pestivirusinfektionen zählt die Infektion mit dem Virus der Bovinen Virusdiarrhoe (BVDV) und dem Virus der Border Disease (BDV) bei Wiederkäuern, aber auch die mit dem Virus der Klassischen Schweinepest bei Schweinen.
In experimentellen Studien zur Übertragung des BDV, in denen infizierte Schafe mit nicht infizierten Tieren gemeinsam aufgestallt wurden, fand man heraus, dass die Infektion dieses Pestivirus über den oralen, konjunktivalen oder trachealen Weg möglich ist (WINKLER et al. 1975). Beim Rind erfolgt die Infektion mit dem BVDV auf oralem und nasalem Weg (LIESS 1990). Wenn sich tragende Wiederkäuer mit Pestiviren (BVDV bzw. BDV) infizieren, so kann auch die Frucht transplazentar infiziert werden. Nach einer transplazentaren Pestivirusinfektion sind die Folgen für den einzelnen Fetus abhängig von dem Trächtigkeitsstadium, in dem der Fetus infiziert wurde. Die Infektion des Muttertieres verläuft zumeist subklinisch. LIESS (1990) berichtete von persistent infizierten (PI) Kälbern, die nach einer Impfung von tragenden Rindern mit Lebendimpfstoff geboren wurden.
Eine Infektion des Rinderfetus mit dem BVDV während des ersten Drittels der Trächtigkeit führt häufig zum embryonalen Fruchttod (MOENNIG u. LIESS 1995). Die Infektion eines immunkompetenten Rinderfetus mit dem BVDV führt hingegen zur Geburt eines Jungtieres, welches präkolostrale Antikörper gegen das BVDV aufweist (STÖBER 1983). Immunologisch unreife Feten wiesen vom Infektionszeitpunkt abhängige Veränderungen auf. So kamen Aborte und mumifizierte Feten vor, aber auch erniedrigte Geburtsgewichte oder zentralnervöse Störungen infolge von Fehlentwicklungen im ZNS (LIESS 1990; HEWICKER-TRAUTWEIN et al. 1995 a).
Perinatale Todesfälle und chronische Infektionen bei persistierender Virämie oder postnatale Todesfälle wurden ebenfalls beobachtet (LIESS 1985; WÖHRMANN
1989). Die PI Kälber haben, unabhängig davon ob sie Läsionen zeigen, eine besondere Bedeutung im Rahmen der Verbreitung von Pestiviren (LIESS 1985).
Diese Tiere besitzen nicht die Fähigkeit gegen das Virus, welches sie intrauterin befallen hat, Antikörper zu bilden, jedoch können sie Antikörper gegen heterologe Virusstämme bilden und damit bei einfachen Virusneutralisationstesten unerkannt bleiben (LIESS 1985). Die Virusausscheidung, egal ob bei PI Tieren oder postnatal infizierten Tieren, erfolgt mit den Ausscheidungen des Körpers, also mit Nasenschleim, Speichel, Sperma, Gebärmuttersekret, Fruchtwasser, Kot und/oder Harn, aber auch mit Blut und der Nachgeburt (STÖBER 1983).
Nach diaplazentarer Pestivirusinfektion in bestimmten Ontogenesephasen manifestieren sich die Läsionen beim Rinder- und Schaffetus in verschieden Organen (Lunge, Haut, Thymus, Augen und ZNS). Im Gehirn wurden vor allem Alterationen des Kleinhirns im Sinne einer Hypoplasie oder Dysplasie, Hydrocephalus internus, Hydranenzephalie, Mikroenzephalie, Porenzephalie sowie petechiale bis flächenhafte Blutungen gesehen (BISTNER et al. 1970; BROWN et al.
1974; CLARKE u. OSBURN 1978; BIELEFELDT OHMANN 1984). Im Kleinhirn wurde weiterhin eine Destruktion der äußeren Körnerschicht beschrieben (LIESS 1990). ROEDER et al. (1986) fanden bei Feldinfektionen von Kälbern mit BVDV eine Abflachung und Verkrümmung des Kleinhirnvermis. Weiterhin wurde von einer Hypoplasie des Rückenmarkes in zwei Fällen berichtet (DONE et al. 1980). Zudem wurden Augenveränderungen wie beispielsweise Katarakt, retinale Atrophie, retinale Dystrophie, Konjunktivitis oder Retinitis und Thymushypoplasie, Arthrogrypose, Brachygnathie, Anasarka sowie partielle Alopezie der Haut beobachtet (BISTNER et al. 1970; KENDRICK 1971; BROWN et al. 1975; BIELEFELDT OHMANN 1984).
LIESS (1990) hatte von nicht eitrigen, entzündlichen Veränderungen im Bronchialepithel, der Haut und der Meninx berichtet.
Nach verschiedenen BVDV Ausbrüchen wurden blinde und ataktische Kälber beschrieben, welche die oben genannten Augen- und Gehirnveränderungen aufwiesen (BISTNER et al. 1970; BIELEFELDT OHMANN 1984). Auch wurden
dorsale Abflachungen im Bereich des Frontallappens des Großhirns, bilaterale Hohlraumbildungen, großflächige neuronale Nekrosen im Kortex, Nekrosen der Purkinjeschen Zellen und Rarefikationen der inneren Körnerschicht des Kleinhirns ermittelt und dies sowohl bei Rinderfeten, die mit einem BDV als auch bei solchen, die mit BVDV infiziert waren (GIBBONS et al. 1974; ROEDER et al. 1986). Die Folgen einer intrauterinen BVDV Infektion sind nicht nur vom Stadium der Entwicklung abhängig, in dem sich der Fetus infiziert, sondern auch von dem jeweiligen Stamm und Biotyp (zytopathogen oder nicht zytopathogen) des Virus mit dem jeweiligen pathogenen Potential und der jeweiligen betroffenen Zielzellen bzw.
Geweben, s. 2.3.2 (MOENNIG u. LIESS 1995; HOFF u. DONIS 1997). Nur persistent mit dem nzp BVDV intrauterin infizierte Kälber entwickelten nach einer Superinfektion mit dem zp BVDV das Krankheitsbild der MD (ZHANG et al. 1996), worauf im Rahmen dieser Studie allerdings nicht näher eingegangen werden soll.
Bei Ziegen wurde eine sehr hohe Rate an fetalen Todesfällen und Aborten nach BDV Infektionen festgestellt (NETTLETON 1987). Experimentell intrauterin mit BDV infizierte Ziegen zeigten ein ähnliches klinisches und pathomorphologisches Bild wie Schafe mit Aborten, Totgeburten und Geburten von lebensschwachen Lämmern (LØKEN 1992). Nach experimenteller BVDV Infektion wiesen Ziegenfeten verminderte Wachstumsraten, subkutane Ödeme, Zysten und Vaskulitis in verschiedenen Organen sowie im Groß- und/oder Kleinhirn lympho-histiozytäre Infiltrationen, Hypergliosen, Leukomalazien, Hypomyelinosen sowie Vaskulitis auf, und es wurde weiterhin von Fruchtresorptionen berichtet (LØKEN 1987; WOHLSEIN et al. 1992). Die Inzidenz der neurologischen Veränderungen bei mit Pestiviren intrauterin infizierten Ziegenlämmern erschien niedriger als die bei Schaflämmern (LØKEN u. BJERKÅS 1991). Über das Vorkommen von lebensfähigen, persistent mit dem BVDV infizierten Ziegenlämmern, wie es bei Schafen und Rindern vielfach beobachtet wird, gibt es unterschiedliche Angaben. So beschrieben WOHLSEIN et al. (1992) keine lebensfähigen Lämmer. Hingegen trat in den von LØKEN und BJERKǺS (1991) durchgeführten Infektionsversuchen ein persistent mit dem BVDV infiziertes und lebensfähiges Ziegenlamm auf. Bei einem Border Disease (BD)
Ausbruch in Norwegen durch einen mit Pestiviren kontaminierten Impfstoff gegen ovine Parapoxviren wurden bei Ziegenlämmern keine der für die BD bei Schafen typischen klinischen Veränderungen wie z.B. Vliesanomalien ermittelt (LØKEN et al.
1991). Es wurden bei diesen Ziegen, ähnlich wie nach experimenteller Infektion, um 2 bis 3 Wochen verlängerte Tragezeiten, Aborte, mumifizierte Früchte sowie einige lebensschwache Lämmer mit Pneumonie und/oder Peritonitis beobachtet (LØKEN et al. 1991). Histologisch fanden sich im ZNS lymphozytäre Infiltrationen, zelluläre Desorganisationen im zerebellären Kortex und herabgesetzte Myelingehalte in der weißen Substanz des Großhirns (LØKEN et al. 1991).
In Infektionsexperimenten wurde nachgewiesen, dass das BDV von Schafen auf Rinder, im Kontakt der beiden Arten miteinander, übertragbar ist, und dass das BVDV den umgekehrten Übertragungsweg nehmen kann (BARLOW 1990). Auch Wildtiere wie afrikanische Büffel, Ellipsenwasserböcke, Giraffen, Gnus, verschiedene Hirscharten, chinesische Muntjaks, Nilgauantilopen, Rehe, Sumatra-Seraus und Zwergziegen können sich mit Pestiviren wie dem BVDV oder dem BDV infizieren und möglicherweise auch als Reservoir für diese Viren dienen, was in unseren Breiten bei verschiedenen in Zoos gehaltenen Wildwiederkäuern von Bedeutung ist (BARLOW 1990; NETTLETON 1990).
2.2 Pestivirus induzierte Alterationen im ZNS von Schafen
In der Schafpopulation kommen Infektionen mit dem BDV vor, aber auch Infektionen mit dem BVDV werden beobachtet. Bei Schaffeten setzt die immunologische Kompetenz und damit die Fähigkeit zu einer spezifischen Immunantwort gegenüber Pestiviren zwischen dem 64. und 82. Tag der Trächtigkeit ein (HEWICKER- TRAUTWEIN 1994). Von diesem Zeitpunkt an kann der Fetus also neutralisierende, virusspezifische Antikörper bilden (FAHEY u. MORRIS 1978). Schaffeten die diaplazentar vor dem Einsetzen der Immunkompetenz mit einem Pestivirus infiziert werden, entwickeln eine Viruspersistenz infolge der virusspezifischen Immuntoleranz
(BARLOW u. PATTERSON 1982; NETTLETON 1990; HEWICKER-TRAUTWEIN 1994). Genauer gesagt bedeutet dies, dass die Feten zu der Zeit noch nicht in der Lage sind das Virus als Fremdobjekt zu identifizieren (MOENNIG u. PLAGEMANN 1992). Da die Pestiviren wie z.B. das BVDV sich im Fetus replizieren, entstehen je nach dem, in welchem Entwicklungsstadium sich dieser befindet, an verschiedenen Organen auch unterschiedliche Läsionen (MOENNIG u. PLAGEMANN 1992). Die Pestiviren BDV und BVDV können also, wie oben beschrieben, sowohl unter natürlichen als auch unter experimentellen Bedingungen unter anderem zu Kleinhirnalterationen führen. Es wurden Kleinhirnveränderungen im Sinne von Hypoplasie oder Dysplasie sowie Hydrocephalus internus, Hydranenzephalie und Mikroenzephalie berichtet, und histologisch wurde häufig eine Hypomyelinogenese im ZNS beobachtet (TERPSTRA 1981; BARLOW u. PATTERSON 1982; JEFFREY et al. 1990; MOENNIG u. PLAGEMANN 1992; HEWICKER-TRAUTWEIN 1994;
HEWICKER-TRAUTWEIN et al. 1995 b).
2.2.1 Infektionen mit dem Border Disease Virus (BDV)
Das BDV wurde als pathogen für Schafe, Ziegen und Rinder beschrieben mit Plazentitis, vermehrtem Vorkommen von Aborten und Todgeburten sowie Geburten von schwachen Lämmern bzw. Kälbern (AMES et al. 1982; NETTLETON 1987).
Ihren Namen „Border Disease“ verdankt die Krankheit dem ersten Auftreten dieser Erkrankung an der Grenze von England und Wales (BARLOW u. DICKINSON 1965).
Es wurden jedoch auch andere Namen in anderen Regionen verwendet, wie „hairy shaker“ und „fuzzy-lamb“ (BARLOW u. PATTERSON 1982). Unter natürlichen Bedingungen fanden sich klinisch bei den mit BDV intrauterin infizierten Lämmern Tremor, Vliesanomalien, Wachstumsminderung, disproportionierte Unterkiefer und missgestaltete Skelette (BARLOW u. PATTERSON 1982; BARLOW 1990). Die Tiere zeigten zumeist Saugunlust und teilweise Blindheit (BARLOW 1990). Die Mehrheit der Lämmer überlebte die Stillzeit unter Feldbedingungen nicht (BARLOW u.
PATTERSON 1982). Bei dem Versuch einer experimentellen Infektion von
Schweinen mit dem BDV wurden bei den infizierten Sauen im Serum Antikörper gefunden, die mit dem BDV, dem BVDV und dem Virus der Klassischen Schweinepest reagierten bzw. kreuzreagierten (WRATHALL et al. 1978).
Pathologische Veränderungen wie bei der BD wurden bei den Schweinefeten nicht festgestellt, und es war auch kein Virus in den Feten nachweisbar (WRATHALL et al.
1978). Unter Feldbedingungen wurden dieselben Beobachtungen, also das Fehlen von pathomorphologischen Veränderungen, nach BVDV bzw. BDV Infektionen bei Schweinen gemacht, aber auch Läsionen wie bei der Schweinepest wurden berichtet (LIESS u. MOENNIG 1990). Bei einer experimentellen Infektion von tragenden Schafen mit BDV und damit verbundener intrauteriner Infektion der Feten entwickelte sich bei den neugeborenen Lämmern ebenso wie bei natürlich infizierten Tieren klinisch ein typisches Bild mit rhythmischem Zittern, haarigem und pigmentiertem Vlies und Kümmern sowie neurologischen Veränderungen wie Hypomyelinogenese (BARLOW u. DICKINSON 1965; AMES et al. 1982). Auch wurden vermindertes Körperwachstum und Konjunktivitis berichtet (WINKLER et al. 1975; TERPSTRA 1981). Eine experimentelle, intraperitoneale Infektion von tragenden Schafen mit Gehirnhomogenisaten aus BDV Stämmen enthaltenden Gewebekulturen führte zu extra- und intrakraniellen Missbildungen bei Feten und neugeborenen Lämmern mit dem bei der natürlichen Infektion beschriebenen typischen Bild (BARLOW 1980).
Wurden diese Lämmer aufgezogen, so verschwanden die neurologischen Symptome im ersten Lebensjahr, wohingegen die Vliesveränderungen blieben (TERPSTRA 1981). GARDINER (1980) untersuchte das Verteilungsmuster des Virus im Gehirn und fand heraus, dass vor allem in Neuronen Virusantigen nachweisbar war.
Weiterhin wurde es in der Germinalschicht und den ependymalen und subependymalen Schichten gefunden (GARDINER 1980). TERPSTRA (1978) fand BDV nicht nur im ZNS, sondern auch im Magen-Darm-Trakt, im respiratorischen System, in der Haut, den Hoden und den Nieren der kongenital infizierten Lämmer.
2.2.1.1 Alterationen im Großhirn nach intrauteriner BDV Infektion
Unter natürlichen Bedingungen intrauterin mit BDV infizierte Schaflämmer wiesen Veränderungen des Myelins und der Neuroglia im gesamten Gehirn und Rückenmark auf (BARLOW u. DICKINSON 1965). In der weißen Substanz des ZNS fanden sich vermehrt Gliazellen und die Nervenscheiden wiesen eine irreguläre Schwellung und verminderte Myelingehalte auf (BARLOW u. DICKINSON 1965).
BARLOW (1990) beschrieb außer Hypomyelinogenese weiterhin Infiltrate von Makrophagen sowie Porenzephalie, Hydranenzephalie und internen Hydrozephalus als Folge natürlicher BDV Infektionen vor dem 80. Tag der embryonalen Entwicklung.
Bei experimentellen Infektionen von Schaffeten mit einem Inokulat, welches aus dem Gehirn von Lämmern gewonnen wurde, die an der BD erkrankt waren, wurden makroskopisch flache und breite Gyri sowie seichte Sulci im Cerebrum festgestellt, und ein Fetus wies einen Hydrozephalus auf (CLARKE u. OSBURN 1978).
Histologisch wurden bei diesen Tieren vor allem lympho-histiozytäre Infiltrationen im Großhirnparenchym und in der Meninx sowie Mikrogliosen festgestellt (CLARKE u.
OSBURN 1978). Ähnlich der natürlichen Infektion wurden vor allem Hydranenzephalie, Porenzephalie und Zysten im Bereich des Septum pellucidum nach einer experimentellen Infektion mit einem BDV Stamm etwa zum 54. Tag der Entwicklung beobachtet (BARLOW 1980). Weiterhin wurden Hypomyelinogenese, abnormale Ansammlungen von hydrophilen Lipiden im interfaszikulären Neuropil der weißen Substanz und abnormale Ansammlungen von neuroglialen Zellen mit einem vesikulären Kern und wenig Zytoplasma in der Interfaszikularregion berichtet (BARLOW 1980; AMES et al. 1982). Auch bei natürlichen Infektionen wurden Hypomyelinogenesen und zystische Veränderungen in den Hemisphären des Großhirns beschrieben (JEFFREY et al. 1990).
2.2.1.2 Alterationen im Kleinhirn nach intrauteriner BDV Infektion
Im Cerebellum traten im Rahmen von experimentellen und spontanen Infektionen von tragenden Schafen Dysplasien, Hypoplasien und Hypomyelinogenesen in Erscheinung (BARLOW 1980; AMES et al. 1982). Eine inflammatorische Reaktion in der weißen Substanz des Kleinhirns wurde ebenfalls beschrieben (BARLOW 1980;
MOENNIG u. PLAGEMANN 1992). CLARKE und OSBURN (1978) berichteten von Mikrogliosen und mononukleären Infiltrationen im Bereich des Kleinhirnkortex.
Virusantigen wurde in den Zellen der Molekularschicht und der äußeren Körnerschicht ermittelt (GARDINER 1980).
2.2.1.3 Sonstige Alterationen nach intrauteriner BDV Infektion
Die Lämmer, die intrauterin um den 54. Tag der Trächtigkeit infiziert wurden, zeigten infolge der Gehirnalterationen einen rhythmischen Tremor (BARLOW 1980; AMES et al. 1982). Veränderungen des Haarkleides wurden ebenfalls berichtet und waren hervorgerufen durch eine Hypertrophie und eine vermehrte Anzahl der primären Follikel (AMES et al. 1982). Neugeborene wiesen häufig eine pigmentierte Haut und einen Kümmererhabitus auf, wobei die Pigmentierung mit zunehmendem Alter abnahm (AMES et al. 1982). Männliche Tiere, welche die Stillzeit überlebten, wiesen in der Pubertät kleinere und weichere Hoden mit schlechter Spermienqualität auf (BARLOW u. PATTERSON 1982). Weibliche Tiere zeigten eine geringere Reproduktionsrate (BARLOW u. PATTERSON 1982). Es wurden weiterhin Arthrogryposen und Skelettdeformationen berichtet (MOENNIG u. PLAGEMANN 1992).
In der Medulla oblongata wurde histologisch von mononukleären Infiltrationen und Gliosen, welche vor allem perivaskulär gelegen waren, berichtet (CLARKE u.
OSBURN 1978). Im Rückenmark fanden sich ebensolche lympho-histiozytären Infiltrationen und Mikrogliosen, vor allem im Bereich der Ventralhörner mit einer
perivaskulären und perineuralen Verteilung (CLARKE u. OSBURN 1978). Weiterhin wurde nicht nur im gesamten Groß- und Kleinhirn, sondern auch im Hirnstamm und im Rückenmark ein diffuser Verlust an färbbarem Myelin bei Schaffeten und neugeborenen Lämmern nach experimentellen, intrauterinen BDV Infektionen beobachtet (JEFFREY et al. 1990). Im Rückenmark waren die Ependymzellen um den Zentralkanal herum und Neuronen im dorsalen und ventralen Horn sowie die Schwannschen Zellen mit Virusantigen behaftet (GARDINER 1980).
2.2.2 Spontaninfektionen mit dem Virus der Bovinen Virusdiarrhoe (BVDV) beim Schaf
Durch den Nachweis von neutralisierenden Antikörpern gegen das BVDV und/oder das BDV in Schaf- und Ziegenseren wurde auf einen Übertritt des BVDV zwischen den Speziesbarrieren geschlossen (ZAGHAWA 1998). Mit Hilfe der RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction) Technik wurde sogar BVDV in Gewebe-, Serum- und Blutproben von Schafen mit BD Ausbrüchen festgestellt (WILLOUGHBY et al. 2006). Nicht nur Schafe und Ziegen, sondern auch Büffel und Kamele wurden als potentielle Reservate für das BVDV diskutiert, da auch bei ihnen neutralisierende Antikörper gegen das BVDV ermittelt wurden (ZAGHAWA 1998). Schafherden wiederum infizieren sich möglicherweise mit dem BVDV durch PI Kälber und infizierte Jungrinder. So wurden Fälle berichtet, in denen sich tragende Schafe infizierten, die gemeinsam mit PI Kälbern gehalten wurden bzw. weideten. Diese Schafe gebaren Lämmer mit dem klinischen Bild der BD mit Veränderungen des Vlieses, Tremor und ZNS Alterationen (CARLSSON 1991). FRENCH et al. (1974) berichteten von Schafen, die nicht experimentell infiziert wurden, sich jedoch durch andere Schafe infizierten, die in engem Kontakt mit ihnen gehalten wurden und experimentell mit BVDV infiziert worden waren. Auch BARLOW und PATTERSON (1982) wiesen auf verschiedene Veröffentlichungen von BD in Verbindung mit einer BVDV Infektion hin.
Ein Überlappen der pathomorphologischen Erscheinungen bei den Feten und Lämmern, welche mit dem BDV bzw. mit Stämmen des BVDV infiziert waren, wurde
beschrieben (BARLOW u. PATTERSON 1982). Im Zuge einer Genotypisierung von Pestivirusisolaten aus kleinen Wiederkäuern in Italien wurden ausschließlich BVDV Isolate, nicht jedoch BDV Isolate nachgewiesen (PRATELLI et al. 2001). Dies spricht dafür, dass Krankheitserscheinungen, welche durch Pestiviren verursacht werden, bei Schafen möglicherweise häufiger auf BVDV Infektionen zurückzuführen sind, als auf BDV Infektionen. Bei Schaffeten und Lämmern, welche mit dem BVDV unter natürlichen Bedingungen durch den Kontakt mit einem PI Rind infiziert wurden, zeigten sich, wie bei der Infektion mit dem BDV, Vliesanomalien sowie eine verminderte Wachstumsrate und Aborte (CARLSSON 1991).
2.2.3 Experimentelle Infektionen mit BVDV beim Schaf
Experimentelle diaplazentare Infektionen mit dem BVDV riefen bei Schaffeten Porenzephalie, Hydranenzephalie, Hydrozephalus und/oder Kleinhirnhypoplasie hervor; auch wurden Brachygnathia inferior, Arthrogryposen und Anasarka sowie Aborte beobachtet (BARLOW et al. 1980; HEWICKER-TRAUTWEIN 1994;
HEWICKER-TRAUTWEIN et al. 1994, 1995 b; SCHERER et al. 2001). Histologisch fanden sich destruktive Veränderungen in allen Schichten des Neokortex und des Kleinhirns mit Karyopyknose sowie durch Makrophagen dominierte Zellinfiltrationen in den Meningen und im Hirnparenchym (HEWICKER-TRAUTWEIN u. TRAUTWEIN 1994). Im Kleinhirn fanden sich Hinweise auf einen Tropismus des Virus für mitotisch aktive Zellen der äußeren Körnerschicht bei intrauterin infizierten Schaffeten, welche nach 10 bzw. 14 Tagen p.i. dem Muttertier entnommen wurden (HEWICKER- TRAUTWEIN 1994).
Experimentelle Infektionen von Schaflämmern mit einem BVDV Stamm führten bei diesen Tieren zu Symptomen, die der BD ähnlich waren (BAZ 1992). Auch zeigten Kälber und Lämmer, welche Kontakt zu den experimentell infizierten Tieren hatten, Symptome der BVD bzw. der BD (BAZ 1992). BARLOW et al. (1980) berichtete bei intraperitonealen Infektionen von tragenden Schafen am 54. Trächtigkeitstag mit
verschiedenen BVDV Stämmen von Mumifikationen und intrakraniellen Missbildungen bei den Feten und neugeborenen Lämmern, allerdings wiesen die Lämmer nicht die für die BD typischen Bilder von Tremor, Hypomyelinogenesen und Vliesveränderungen auf. TERLECKI et al. (1980) berichtete nach experimentellen Infektionen von tragenden Schafen mit einem zp BVDV Isolat über ein Krankheitsbild wie bei der BD, wobei der verwendete Stamm eine stärkere Pathogenität für Schaffeten aufwies, als dies zuvor bei Rinderfeten beobachtet wurde. Bei den Schafen waren wesentlich mehr Aborte zu verzeichnen (TERLECKI et al. 1980).
WARD (1971) berichtete ebenfalls von Aborten, Mumifikationen und Mazerationen sowie Missbildungen nach intrauterinen BVDV Infektionen mit zwei verschiedenen Virusstämmen zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Trächtigkeit. SWASDIPAN et al.
(2001) fanden bei tragenden Schafen, die experimentell mit einem BVDV Typ 1 Stamm intranasal im ersten Trächtigkeitsdrittel infiziert wurden, weder makroskopisch noch mikroskopisch im Bereich des Reproduktionstraktes der Schafe oder an den Feten pathomorphologische Veränderungen, obwohl Virusantigen in geringen Mengen im maternalen und in großen Mengen im fetalen Gewebe nachgewiesen wurde. Allerdings muss hier angemerkt werden, dass die Proben bereits vier Tage p.i. entnommen wurden, so dass das Virus zwar genug Zeit hatte, um sowohl das Muttertier als auch den Fetus zu infizieren, aber nicht um große Schäden bei Letzteren hervor zu rufen (SWASDIPAN et al. 2001).
2.2.3.1 Alterationen im Großhirn nach experimenteller, intrauteriner BVDV Infektion
Im Großhirn wurden vor allem Hydrozephalus, Hydranenzephalie und Porenzephalie nach einer intraperitonealen Infektion von tragenden Schafen bei den Feten und Lämmern beobachtet (WARD 1971; BARLOW et al. 1980). Sowohl im Telenzephalon als auch im Cerebellum wurde bei den infizierten Schaffeten im Vergleich zu den nicht infizierten Feten gleichen Alters ein deutlich verminderter Gehalt an Myelin gefunden (TERLECKI et al. 1980).
2.2.3.2 Alterationen im Kleinhirn nach experimenteller, intrauteriner BVDV Infektion
Das Kleinhirn wies nach intrauteriner Infektion von Schafen bei den Feten und Lämmern vor allem Kleinhirnhypoplasien und –dysplasien auf (WARD 1971;
BARLOW et al 1980). In einer Studie mit dreißig mit einem zp BVDV Stamm infizierten Schafen konnten TERLECKI et al. (1980) jedoch nur bei einem Fetus eine Kleinhirnhypoplasie beobachten.
2.2.3.3 Sonstige Alterationen nach experimenteller, intrauteriner BVDV Infektion
Des Weiteren berichteten TERLECKI et al. (1980) von einer generellen Wachstumsverminderung des gesamten Körpers, aber auch der einzelnen Organe bei intrauterin mit BVDV infizierten Schaffeten im Vergleich zu nicht infizierten Feten der gleichen Entwicklungsstufe. Missbildungen der Gliedmaßen wurden ebenfalls erwähnt (WARD 1971).
2.3 Das Virus der Bovinen Virusdiarrhoe (BVDV)
2.3.1 Das Virus
Die Bovine Virusdiarrhoe (BVD) wurde als akute übertragbare Erkrankung erstmals 1946 von OLAFSON et al. mit hohem Fieber, Leukopenie, teils verstärktem Speichelfluss, mukopurulentem Nasenausfluss, Husten, Pneumonien, Ulzerationen in Maul, Nase, Pharynx, Larynx und/oder Ösophagus, gastro-intestinalen Ulzerationen und Blutungen, starker Diarrhoe sowie Aborten beschrieben. Die einheitliche Virusätiologie der verschiedenen Ausbrüche sowie der verschiedenen
Verlaufsformen der Bovinen Virusdiarrhoe wurde jedoch erst sehr viel später nachgewiesen (GILLESPIE u. BAKER 1959). Die gemeinsame Virusätiologie mit der MD wurde ebenfalls erst wesentlich später vermutet (KNIAZEFF et al. 1961) und ausführlich als Virusdiarrhoe-Mucosal-Disease-Komplex von PRITCHARD (1963) dargestellt, wobei auch hier noch immer der Zusammenhang zwischen der MD und der intrauterinen Infektion der Feten unklar blieb.
2.3.1.1 Taxonomie
Das Virus der Bovinen Virusdiarrhoe entstammt der Familie der Flaviviridae. Diese wird unterteilt in die drei Genera Flavivirus, Pestivirus und Hepacivirus (WENGLER et al. 1995; MURPHY et al. 1999; THIEL et al. 2005). Das Genus Pestivirus beinhaltet das BVDV, das BDV sowie das Virus der Klassischen Schweinepest. Das BVDV kommt in zwei Biotypen vor: zytopathogen und nicht zytopathogen. Definiert wird der Biotyp über die Eigenschaft des Virus in Zellkulturen einen zytopathogenen Effekt hervor zu rufen. Weiterhin werden verschiedene Genotypen unterschieden (WENGLER et al. 1995).
2.3.1.2 Struktur und Morphologie
Pestiviren sind 40 bis 60 nm im Durchmesser groß, behüllt und sphärisch. Ihre Hülle besitzt oberflächliche, 10 bis 12 nm große ringartige Strukturen. Fünf Strukturproteine sind vorhanden, das Kapsidprotein C (core protein), drei Hüll- Glykoproteine Erns (Envelope RNase), E1 und E2 sowie ein kleines Protein p7 mit noch unbekannter Funktion (BOULANGER et al. 1991; HARADA et al. 2000; THIEL et al. 2005). Zu den fünf Nichtstrukturproteinen gehören NS2-3, auf das im Kapitel 2.3.3.2 näher eingegangen wird, Npro, NS4A/B, NS5A und NS5B (THIEL et al. 2005).
Das Genom besteht aus einer positiven Einzelstrang RNA, welche aus 12,5 kb aufgebaut ist (MURPHY et al. 1999; THIEL et al. 2005).
2.3.1.3 Eigenschaften des Virus
Das Virus besitzt eine hohe Stabilität bei pH-Werten von 5,7 bis 9,3. Seine Stabilität lässt erst bei Temperaturen von über 40°C nach. Gegenübe r Lösungs- und Reinigungsmitteln ist das Virus empfindlich, besonders gegenüber Äthyläther, Chloroform und Trypsin. Die Dichte, in Cäsiumchlorid gemessen, beträgt 1,22 bis 1,24 g/cm³ (WENGLER et al. 1995). Für seine Hüll-Glykoprotein Biogenese, die genomische Replikation und die Partikelmontage verwendet das BVDV das endoplasmatische Retikulum (ER) der infizierten Zelle (JORDAN et al. 2002).
2.3.2 Zytopathogene und nicht zytopathogene Biotypen des BVDV
Aufgrund von Beobachtungen von Veränderungen in Zellkulturen werden, wie bereits in Kapitel 2.3.1.1 erwähnt, zwei Biotypen des BVDV unterschieden. Der Erstere, das nzp BVDV, verursacht in den Zellkulturen keine sichtbaren zytopathogenen Effekte, der Andere hingegen, das zp BVDV, verursacht den Zelltod von infizierten Wiederkäuerzellen (MOENNIG u. LIESS 1995; HOFF u. DONIS 1997). Es wurde berichtet, dass das zp Virus durch Punktmutation in dem NS2 Gen aus dem nzp Virus oder aber über RNA Rekombinationen entsteht (KÜMMERER et al. 2000).
DONIS und DUBOVI (1987) fanden heraus, dass beide Biotypen ein unterschiedliches Muster von Polypeptiden besitzen, wobei das 80 K Polypeptid nur bei dem zp Biotyp ermittelt wurde. Ein weiterer Unterschied bezüglich der Expression von Proteinen wird in Kapitel 2.3.3.2 erläutert. Die beiden Biotypen des BVDV sind in ihren Folgen für die einzelnen infizierten Zellen, aber auch für den fetalen Organismus recht unterschiedlich. So wurde bei intrauterin mit BVDV infizierten Schaffeten mittels PCR Analysen festgestellt, dass nur die Infektion mit einem zytopathogenen Biotyp des BVDV starke pathomorphologische Veränderungen im ZNS verursachte, wobei aber eine Interaktion zwischen den beiden Biotypen nicht gänzlich ausgeschlossen werden konnte (GRUBER et al. 1995). Nach Angaben einiger Autoren kann jedoch nur der nzp Biotyp des BVDV zur Geburt eines PI
Kalbes bzw. Lammes führen (BROWNLIE et al. 1989; BAIGENT et al. 2004). Die mit dem zp BVDV infizierten Feten weisen demnach wahrscheinlich so schwerwiegende pathomorphologische Veränderungen auf, dass diese mit dem Leben des Kalbes bzw. Lammes nicht vereinbar sind. Auch der Arbeitsgruppe um HARDING et al.
(2002) gelang es nicht, eine intrauterine Infektion mit zp BVDV beim Rind zu induzieren. KENDRICK (1971) verwendete bei seinen Inokulationsversuchen einen Virusstamm, der in der Zellkultur Plaques aufwies und erreichte eine diaplazentare Infektion von Rinderfeten, wobei allerdings die Reisolierung des Virus aus den Organproben der Kälber nicht gelang. DONE et al. (1980) verwendeten ebenfalls zp BVDV Stämme zur Infektion von tragenden Rindern und konnten bei den neugeborenen Kälbern nzp BVDV reisolieren, aus dem abortierten Material wurde jedoch kein Virus reisoliert.
Im Zusammenhang mit den verschiedenen Biotypen des BVDV wurde diskutiert, dass der Zelltod, der im Rahmen der Apoptose stattfindet, nur durch das zp nicht jedoch durch das nzp BVDV induziert wird und dass das nzp BVDV die durch das zp BVDV ausgelöste Apoptose nicht verhindern kann (ZHANG et al. 1996; JORDAN et al. 2002; BAIGENT et al. 2004). Andere Autoren hingegen beschrieben eine Inhibition der Apoptose durch das nzp BVDV, die im Zusammenhang mit Interferon (IFN) stand (SCHWEIZER u. PETERHANS 2001). BENDFELDT et al. (2003) wiesen nach, dass in Zellkulturen, welche mit einem nzp BVDV infiziert waren, verstärkt Bcl-2, ein antiapoptotisches Protein (s. 2.3.3.1), auftrat und damit erst eine persistente Infektion in vitro ermöglicht wurde. Für den fetalen Organismus traten nach experimenteller Infektion mit dem zp BVDV erheblich schwerwiegendere pathomorphologische Veränderungen im Bereich des ZNS auf, als sie bei einer Infektion mit dem nzp BVDV gesehen wurden (HEWICKER-TRAUTWEIN u.
TRAUTWEIN 1994; HEWICKER-TRAUTWEIN et al. 1994, 1995 b). Wie bereits erwähnt, sollen nur bei einer intrauterinen Infektion mit dem nzp BVDV lebensfähige, PI Nachkommen entstehen (BROWNLIE et al. 1989; BAIGENT et al. 2004). Der Einfluss durch das BVDV auf die Interfonproduktion, wie er im Kapitel 2.3.3.2 näher beschrieben wird, scheint wichtig im Zusammenhang mit der Entstehung von PI
Kälbern und Lämmern bzw. für die Auslösung der Apoptose zu sein (ADLER et al.
1997; SCHULTZ u. HARRINGTON, Jr. 2003; BAIGENT et al. 2004). CHARLESTON et al. (2001) gaben an, dass IFN in vivo nur bei einer Infektion mit einem zp BVDV, nicht jedoch bei der mit einem nzp BVDV in den fetalen Organen feststellbar war, und dass das IFN die Entwicklung der Immuntoleranz bei der Infektion mit dem zp Virus verhinderte. Weiterhin wurde spekuliert, dass die Fähigkeit zur Induktion von IFN erst dem Pestivirus ermöglicht, eine persistierende Infektion bei dem Fetus zu etablieren (CHARLESTON et al. 2001). Von anderen Autoren wurde im Gegensatz dazu beschrieben, dass das nzp BVDV die IFN Expression verhindern kann und damit auch die Induktion der Apoptose über diesen Weg verhindert (SCHWEIZER u.
PETERHANS 2001).
2.3.3 BVDV induzierte Apoptose
Viele Viren verursachen bei Zellen den so genannten „Selbstmord der Zelle“ oder auch den als programmierten Zelltod bezeichneten Prozess der Apoptose. Zu den Viren, von denen bekannt ist, dass sie Apoptose induzieren, gehören unter anderem das Masernvirus, das Humane Immundefizienzvirus (HIV), das Influenzavirus, das Hühner-Anämie-Virus, das Vesikulärstomatitis-Virus, das Sindbis-Virus sowie das Hepatitis C Virus (ZHANG et al. 1996; HOFF u. DONIS 1997). Die einzelnen Viren haben verschiedene Mechanismen, um regulatorisch in den Vorgang der Apoptose einzugreifen. So gibt es auch Viren, die antiapoptotische Mechanismen besitzen bzw. die Apoptose blockieren, wie z.B. Adenoviren, das Epstein-Barr-Virus, das Kuhpocken-Virus oder das Baculovirus (ZHANG et al. 1996; SCHULTZ u.
HARRINGTON, Jr. 2003). Der zp Biotyp des BVDV wird verdächtigt, Mechanismen zu besitzen, welche bei Zellen zur Induktion der Apoptose führen. Der nzp Biotyp hingegen induziert keine Apoptose (ZHANG et al. 1996; JORDAN et al. 2002;
BAIGENT et al. 2004). Daher wurde eine Reihe von Studien an Zellkulturen durchgeführt, um die unterschiedlichen Mechanismen beider Biotypen in Bezug auf die die Apoptose durchlaufenden, infizierten Zellen darzustellen.
2.3.3.1 Einführung in die Apoptose
Apoptose stellt im Gegensatz zur Nekrose den programmierten bzw. regulierten Tod der einzelnen Zelle dar. Sie ist ein wichtiger Vorgang bei der normalen Entwicklung der verschiedenen Organe eines Embryos, kommt aber auch bei physiologischen Atrophien von Organen, beim Alterungsprozess und verschiedenen Krankheiten inklusive Tumorerkrankungen und viralen Infektionen vor (KERR et al. 1972; OLANO et al. 1996). Die Apoptose spielt damit die entgegengesetzte Rolle zur Mitose in der Regulation der Zellpopulation eines Organismus (KERR et al. 1972) und ist phylogenetisch gesehen wahrscheinlich ein ebenso alter Prozess. Schon 1966 wurde der Tod von Zellen während der Entwicklung des Hühnerembryos beschrieben, dies allerdings als posterior nekrotische Zone, z.B. bei der physiologischen Gliedmaßenentwicklung oder auch nach Heraustrennen der Augenanlage in den zu ihr korrespondierenden Gehirnanlagen (SAUNDERS, Jr.
1966). Bei Rattenembryos soll ein Verhältnis von etwa 1:2,8 zwischen dem Vorkommen von Mitose und Apoptose im ZNS vorliegen (THOMAIDOU et al. 1997).
Die Mechanismen und Wege wie es zur Apoptose kommt sind sehr komplex und verzweigt. Weiterhin hatte in der Vergangenheit eine sehr stark variierende Nomenklatur in Bezug auf die an der Apoptose beteiligten Gene, Rezeptoren und Substanzen für große Verwirrung bei dem Verständnis der Zusammenhänge der Abläufe gesorgt. An dieser Stelle soll nur ein grober Abriss dessen gegeben werden, was über den komplexen Vorgang der Apoptose bekannt ist.
In dem Fadenwurm Caenorhabditis elegans wurde das Gen ced-9 beschrieben, welches bei der Apoptose bei diesem Wurm eine Rolle spielt (RUDIN u. THOMPSON 1997). Bei anderen Nematoden und Insekten, aber auch bei Säugetieren und beim Menschen wurden weitere verwandte Gene entdeckt. Das Homolog zu ced-9 beim Säugetier ist das bcl-2 (RUDIN u. THOMPSON 1997). Diese beiden Gene kodieren verschiedene pro- und antiapoptotische Substanzen. So kodiert ced-9 das Protein CED-9, welches eine antiapoptotische Wirkung besitzt (HENGARTNER 2000). Das Homolog zu CED-9 beim Säugetier ist das Bcl-2 Protein (CRYNS u. YUAN 2006).
Weiterhin wurden in diesem Fadenwurm die Gene ced-3 und ced-4 beschrieben;
beide induzieren den Zelltod, wobei aber die durch ced-4 vermittelte Apoptose ced-3 benötigt, ced-3 jedoch unabhängig von ced-4 agiert (CRYNS u. YUAN 2006).
Das CED-3 Protein dieses Nematoden ist verwandt mit dem Interleukin-1β Converting Enzyme (ICE) von Säugetieren (KUIDA et al. 1996; RUDIN u.
THOMPSON 1997). Ein Mitglied der ICE Familie, die Caspase 3, welche früher auch CPP32, Apopain oder Yama genannt wurde, spielt eine wichtige Rolle während der embryonalen Entwicklung im Gehirn, so dass Mäuse, die einen genetischen Mangel daran haben, verminderte Apoptoseraten im Gehirn zeigen und nach 1 bis 3 Lebenswochen sterben (KUIDA et al. 1996; NICHOLSON u. THORNBERRY 1997).
Caspasen sind also essentielle Komponenten bei der Apoptose bei Säugetieren (KUIDA et al. 1998). Das Wort „Caspase“ stellt die Kurzform von „Cystein enthaltende, Aspartat-spezifische Protease“ dar und bezeichnet damit jene Proteine, welche bei der Apoptose mitwirken (KUIDA et al. 1998). Derzeit sind 14 Caspasen beim Säugetier und beim Menschen identifiziert worden (PORTER u. JÄNICKE 1999;
STRASSER et al. 2000). Caspasen liegen in den Zellen als inaktivierte Proenzyme vor und werden durch Spaltung aktiviert (KUIDA et al. 1998).
Bei Mäusen, die keine Caspase 9 besitzen wird ein ähnliches Phänomen, allerdings mit massiven Gehirnmissbildungen infolge der verminderten Apoptose und frühem Versterben der Tiere beobachtet, wie bei denen die keine Caspase 3 besitzen (KUIDA et al. 1998). Dies ist vermutlich so, da das Fehlen der Caspase 9 die Aktivierung der Caspase 3 im Gehirn verhindert (KUIDA et al. 1998). Die Missbildungen erstrecken sich sowohl auf das Vorhirn als auch auf das Mittelhirn, wobei die proliferativen Zonen stark ausgedehnt sind (KUIDA et al. 1998). Das Rückenmark und die anderen Organe der Caspase 9 defizienten Mäuse sind normal entwickelt (KUIDA et al. 1998). Aufgrund der Tatsache, dass Caspase 9 die Caspase 3 aktiviert, zählt erstere zu den Initiatorcaspasen und letztere zu den Effektorcaspasen (KUIDA et al. 1998). Da die Veränderungen in den Caspase 9 negativen Mäusen stärker sind, als in den Caspase 3 negativen, wurde diskutiert,
dass Caspase 9 auch andere Caspasen wie z.B. Caspase 7 aktiviert (KUIDA et al.
1998).
Es wurden drei große Wege der Apoptoseinduktion nachgewiesen. Der Erste läuft über Rezeptoren mit FasL (Fas-Ligand) oder andere Liganden der Tumor Nekrose Faktor-Familie (TNF-Familie), welche zur Aktivierung des jeweiligen Zelloberflächenrezeptors für den programmierten Zelltod führen, wobei schließlich Caspase 8 aktiviert wird (KUIDA et al. 1998; SCHULTZ u. HARRINGTON, Jr. 2003).
Dieses wiederum resultiert letzt endlich in der Spaltung und damit der Aktivierung der Effektorcaspasen Caspase 3 und Caspase 7 (ST-LOUIS et al. 2005). TNF (tumor necrosis factor) wird von verschiedenen Zellen exprimiert, so auch von Makrophagen und Lymphozyten (TRENT, II. et al. 1996). Das Zytokin TNF ist ein wichtiger Mediator bei entzündlichen Reaktionen und ist fähig Apoptose zu induzieren (KUMAR et al. 2005). Eine Verbindung von TNF mit TNFR1 (tumor necrosis factor receptor-1) führt zur Bindung eines Adapterproteins, das TRADD (TNF receptor- associated death domain containing protein) (KUMAR et al. 2005). TRADD wiederum bindet an FADD (Fas-associated death domain) und führt so zur Apoptose über die Aktivierung von Caspase (KUMAR et al. 2005). Die Hauptfunktion von TNF ist jedoch die Aktivierung von NF-κB (transcription factor nuclear factor-κB) (KUMAR et al.
2005). Der zweite Weg der Apoptoseinduktion ist mitochondrienabhängig und steht im Zusammenhang mit der Freisetzung von Cytochrom C (Cyt. C) von den Mitochondrien sowie eines der Apoptose fördernden Proteine, wobei wiederum andere Caspasen aktiviert werden (KUIDA et al. 1998; SCHULTZ u. HARRINGTON, Jr. 2003). Allgemeiner gesagt läuft dieser Weg über ein durch Stress induziertes Signal innerhalb der Zelle und wird reguliert über die Proteine der Bcl-2 Familie, wobei Caspase 9 und Apaf-1 (apoptotic protease activating factor-1) mit involviert sind (STRASSER et al. 2000). Cyt. C bindet im Zytoplasma an Apaf-1 und dieser Komplex aktiviert nachfolgend Caspase 9, welche Effektorcaspasen aktiviert (KUMAR et al. 2005). Der dritte Weg wird durch das ER vermittelt und läuft über die Aktivierung von Caspase 12 (JORDAN et al. 2002; ST-LOUIS et al. 2005).
Das homologe Protein zu dem Apaf-1 des Säugetiers bei C. elegans ist das CED-4 (CRYNS u. YUAN 2006). Die einzigen proapoptotischen Mitglieder der Bcl-2 Familie, die bis dato identifiziert wurden, sind Bim, Bid (STRASSER et al. 2000) und Bax, welches die Permeabilität der Mitochondrienwand erhöht und damit die Cyt. C Freisetzung stimuliert (DEVERAUX et al. 1997; ROSSÉ et al. 1998), worauf allerdings nicht näher eingegangen werden soll. In Zellkulturen wurde ermittelt, dass auch die Cyt. C abhängige Spaltung der Caspase 3 bei Zellen, die Caspase 9 defizient sind, fehlt (KUIDA et al. 1998). Dies ist wahrscheinlich darauf zurück zu führen, dass erst die Freisetzung von Cyt. C einen Komplex aus Apaf-1 und Caspase 9 aktiviert (PORTER u. JÄNICKE 1999), was weiter unten genauer erklärt wird.
Mitochondrien assoziierte Apoptose findet im fetalen und adulten Gehirn beispielsweise nach hypoxischen und ischämischen Insulten statt (BLOMGREN et al.
2003). Die innere Mitochondrienmembran wird dabei unspezifisch durchlässiger, sie beginnt zu schwellen und führt zeitgleich zum Absinken des Membranpotentials und nachfolgend zur Ruptur der äußeren Membran (BLOMGREN et al. 2003). Ein anderes Protein, das p53, scheint eine entscheidende Rolle bei der Inhibition der Apoptose, besonders bei Tumoren, zu spielen (RUDIN u. THOMPSON 1997). Bei der Regulation vom natürlichen Zelltod haben Mitochondrien durch ihre Rolle auf dem Gebiet der Energieproduktion und der Calcium-Homöostase sowie der Freisetzung von proapoptotischen Proteinen und der Produktion von reaktiven Sauerstoffverbindungen eine entscheidende Schlüsselfunktion (BLOMGREN et al.
2003). Mitochondrien können sowohl die Apoptose hemmen als auch über oxidative Prozesse die Apoptose einleiten (BLOMGREN et al. 2003). Zu den Apoptose fördernden Proteinen gehört, wie schon erwähnt, das Cyt. C, aber auch der Apoptose Induzierende Faktor (AIF), welcher ebenfalls in den Intermembranraum der Mitochondrien freigesetzt werden kann, was wiederum die Aktivierung von Caspasen nach sich zieht (BLOMGREN et al. 2003; SCHULTZ u. HARRINGTON, Jr. 2003).
Caspasen, die aus drei Untereinheiten bestehen (N-Terminale Prodomäne, p20 und p10 Domäne), liegen in den Zellen in inaktiver Form vor (HENGARTNER 2000). Sie können aktiviert werden durch eine proteolytische Spaltung z.B. beim Ablauf der
Caspase-Kaskade oder durch eine der Initiatorcaspasen wie Caspase 8 über „death domains“, (DD) oder „Todes-Domänen“, welche auch „death-effector domain“ (DED) genannt werden (HENGARTNER 2000).
Über andere Initiatorcaspasen, wie Caspase 9 verläuft die Kaskade über den CARD- Weg, der für „caspase activation and recruitment domain“ steht, zu Deutsch die Caspase Aktivierungs- und Verstärkungs-Domäne (HENGARTNER 2000). Cyt. C Freisetzung wurde ebenso beobachtet bei der nicht mitochondrialen Apoptose, bei der die Mitglieder der Bcl-2 Familie involviert sind (BLOMGREN et al. 2003). Über eine Rezeptor vermittelte Apoptose sind Mitglieder der TNF-Familie in Verbindung mit bestimmten Rezeptoren involviert, so genannten DD, wie z.B. TNFR1 oder Fas (fibroblast associated) (SCHULTZ u. HARRINGTON, Jr. 2003). Cyt. C hingegen bindet Apaf-1 in Anwesenheit von dATP/ATP (Desoxyadenosin-5´-Triphosphat / Adenosin Triphosphat), danach interagiert Apaf-1 mit Caspase 9 bzw. Apaf-3 über deren CARD, was schließlich in einer Aktivierung von Procaspase-3 zu Caspase 3 resultiert (KUIDA et al. 1998; BLOMGREN et al. 2003). Sowohl Caspase 9 als auch Apaf-1 besitzen eine CARD, wohingegen Caspase 3 keine CARD besitzt und daher nicht an Apaf-1 binden kann (KUIDA et al. 1998). Freigesetztes Cyt. C wurde in der Literatur häufig auch als Apaf-2 bezeichnet (KUIDA et al. 1998). Im Gegensatz zu Cyt. C führt AIF zu einer Caspase unabhängigen Form der Apoptose (BLOMGREN et al. 2003). Poly ADP-Ribose Polymerase 1 (PARP1) vermittelt die Freisetzung von AIF (BLOMGREN et al. 2003). Die Apoptose wird aber auch durch verschiedene Mechanismen inhibiert, so z.B. durch die Gene bcl-2 oder bcl-xL, welche die Proteine Bcl-2 und Bcl-xL kodieren (RUDIN u. THOMPSON 1997). Eine Reihe von Molekülen, wie das Tumor Suppressorgen p53, besitzen nicht nur eine Funktion im Ablauf der Apoptose, sondern auch bei der Zellproliferation (THOMAIDOU et al. 1997).
2.3.3.2 Apoptose in mit BVDV infizierten Zellkulturen
Bei dem Ablauf der durch BVDV induzierten Apoptose finden sich die gleichen Veränderungen wie bei Apoptosen, die durch andere Mechanismen eingeleitet werden. Typischer Weise sind morphologische und biochemische Veränderungen an den Zellen festzustellen, wie z.B. die Kondensation des Chromatins, die Ansammlung von Chromatin an der Kernperipherie, also Kernwandhyperchromasie, das Abtrennen von kleinen runden Blasen mit Kernteilen oder das Auftreten von so genannten „Apoptotic bodies“, also kleinen Membran gebundenen Fragmenten der Zelle (KERR et al. 1972; HOFF u. DONIS 1997), worauf im Kapitel 2.4.5.1 nochmals genauer eingegangen wird. Apoptose kann durch das zp BVDV über das ER induziert werden, wobei der Auslöser noch unbekannt ist (JORDAN et al. 2002). Das Virus verwendet, wie bereits oben kurz erwähnt, das ER der infizierten Zelle zur genomischen Replikation und zur Bildung seiner Glykoproteine und verursacht somit
„ER-Stress“, also einen Zustand bei dem die Homöostase des ERs aus dem Gleichgewicht gerät (JORDAN et al. 2002). Dies hat zur Folge, dass die Apoptose aktiviert wird, allerdings über den Caspase 12-Weg (JORDAN et al. 2002). Es handelt sich hierbei um einen aktiven Prozess der Induktion, der nicht durch das nzp BVDV inhibiert werden kann (ZHANG et al. 1996; BAIGENT et al. 2004). Caspase 12 kann ihrerseits Caspase 8 aktivieren, welche über Bid die Cyt. C Freilassung stimuliert (ST-LOUIS et al. 2005). Weiterhin induziert das BVDV eine Abnahme des Apoptose inhibierenden Faktors Bcl-2 (JORDAN et al. 2002). ZHANG et al. (1996) und GRUMMER et al. (1998) zeigten, dass nur Kälber-Nieren-Zellkulturen, welche mit einem zp Biotyp infiziert wurden, die für die Apoptose typischen DNA Fragmente aufwiesen. Das gleiche Muster wurde auch beobachtet in mit nzp BVDV persistent und mit zp BVDV über infizierten Zellkulturen (ZHANG et al. 1996). Allerdings zeigten GRUMMER et al. (1998), dass eine Interaktion zwischen beiden Biotypen nicht nötig war, um die Apoptose zu induzieren. War die Zellzerstörung weiter fortgeschritten, so fanden sich mittels TUNEL-Methode (terminal-deoxynucleotidyl-transferase-(TdT)- mediated dUTP-biotin nick end labeling) keine derartigen DNA Bruchstücke mehr (GRUMMER et al. 1998). Bovine Zellen die mit dem zp Biotyp infiziert wurden
zeigten eine wesentlich höhere virale RNA Synthese als jene, die mit dem nzp Biotypen infiziert wurden (VASSILEV u. DONIS 2000). Die virale Proteinsynthese war jedoch bei beiden gleichstark ausgeprägt (VASSILEV u. DONIS 2000). Es wurde nachgewiesen, dass die Expression von NS3 Protein nötig ist für das zp BVDV, um bei Zellen die Apoptose zu induzieren (VASSILEV u. DONIS 2000). Die NS3 Expression wurde nur bei dem zp BVDV beobachtet, wohingegen das nzp BVDV nur eine NS2-3 Protein Expression bei infizierten Zellen zeigte (HOFF u. DONIS 1997).
Die Spaltung von NS2-3 an der NS2/NS3 Verbindung wurde nicht im nzp Biotyp beobachtet (MENDEZ et al. 1998). RISATTI et al. (2003) gaben an, dass der entscheidende Unterschied zwischen dem nzp und dem zp BVDV in dieser Spaltung von NS2-3 liegt, was dann auch in einem Anstieg von NS3 beim zp BVDV resultiert.
Hierfür scheint eine Mutation im NS2 Gen verantwortlich zu sein, da dieses Gen letztendlich festlegt, ob NS2-3 gespalten wird oder nicht (KÜMMERER et al. 2000).
In vitro fungiert NS3 als ATPase, Helicase und Serinprotease (HOFF u. DONIS 1997). GRUMMER et al. (2001) wiesen nach, dass die beiden Proteine NS3 und NS2-3 an intrazelluläre Membranen gebunden oder mit ihnen assoziiert vorkommen.
Später wurde NS3 dargestellt als ein Protein, welches assoziiert ist mit der dem Zytoplasma anliegenden Seite des ERs (JORDAN et al. 2002). Es ist an der Spaltung von Proteinen beteiligt (JORDAN et al. 2002). MENDEZ et al. (1998) gingen noch einen Schritt weiter und führten die Hypothese an, dass die Pathogenese der MD mit der Produktion von NS3 verbunden ist. In mit nzp und zp BVDV infizierten Zellkulturen wurde beschrieben, dass das Virus die Funktion vom Interferon regulierenden Faktor 3 inhibiert (BAIGENT et al. 2002, 2004). Auch Zellen die mit dem zp BVDV vorbehandelt wurden, wiesen keinen Interferon regulierenden Faktor 3-DNA-Komplex in den Kernextrakten auf (BAIGENT et al. 2004). Das zp BVDV hat die Fähigkeit in Makrophagen Interferon-α/β (IFN-α/β) zu aktivieren und in allen Zellen, die mit dem zp BVDV infiziert wurden, ist der Transkriptionsfaktor NF-κB, welcher in inaktiver Form im Zytoplasma vorkommt, aktiviert (GLEW et al.
2003; SCHULTZ u. HARRINGTON, Jr. 2003; BAIGENT et al. 2004). SCHWEIZER und PETERHANS (2001) zeigten, dass das nzp BVDV die Expression von IFN-α/β
inhibiert und damit auch die Induktion der Apoptose über diesen Weg verhindert. Von NF-κB ist bekannt, dass es ein wichtiger antiapoptotischer Faktor bei Tumoren ist und eine Blockade dieses Faktors bewirkt Apoptose (SCHULTZ u. HARRINGTON, Jr. 2003). Auch wurde eine Aktivierung von PKR (ds RNA-activating protein kinase) durch virale RNA diskutiert, was wiederum über die Aktivierung von NF-κB zur Apoptose durch den Fas-Weg führt (VASSILEV u. DONIS 2000). Die Aktivierung von PKR soll auch durch die Inaktivierung von eIF2α (eukaryotic initiation factor 2α) zur Apoptose führen (VASSILEV u. DONIS 2000). Mit nzp BVDV infizierte Zellkulturen wiesen keine Zunahme der in der c-Jun Phosphorylierung auf, welche über Caspasen vermittelt wird, mit zp BVDV war jedoch eine Zunahme dieser Phosphorylierung ermittelbar (BAIGENT et al. 2004). GRUMMER et al. (2002) stellten fest, dass fetale Kälber-Nieren-Zellen, welche mit dem zp Biotyp infiziert waren, eine verstärkte Expression von Apaf-1 aufwiesen. Wie bereits erwähnt steht diese Substanz mit Caspase 9 und der Cyt. C Freisetzung aus den Mitochondrien im Zusammenhang mit dem mitochondrialen Weg der Apoptoseinduktion. Die aktivierte Caspase 9 war in mit zp BVDV infizierten fetalen Kälber-Nieren-Zellen ebenfalls erhöht (GRUMMER et al. 2002). Die Verteilung von Cyt. C war bei diesen Zellen bereits 48 Stunden nach der Infektion der Zellen gleich stark im Zytoplasma und im Mitochondrium, im Gegensatz zu den nicht infizierten Zellen, bei denen Cyt. C nur in den Mitochondrien gefunden wurde (GRUMMER et al. 2002).
In vitro konnte in Makrophagen, welche mit einem zp BVDV infiziert wurden, die Apoptose aktiviert werden (ADLER et al. 1997). Nach verschiedenen Versuchen wurde ermittelt, dass in nicht infizierten Makrophagen, welche mit IFN-α vorbehandelt wurden, ebenso wie in welchen, die mit zp BVDV infiziert wurden, eine Lipopolysaccharid (LPS) induzierte Apoptose aktiviert wurde (ADLER et al. 1997).
Dieses fand auch bei den nicht infizierten Nachbarzellen statt (ADLER et al. 1997).
Der daraus resultierende Zelltod wurde begleitet von einer Abnahme der Bildung von Stickstoffmonoxid (NO), welche von LPS induziert wurde (ADLER et al. 1997). Bei den mit nzp BVDV infizierten Makrophagen wurde kein Einfluss auf LPS festgestellt (ADLER et al. 1997). ADLER et al. (1997) schlossen daraus, dass das zp BVDV
einen antiviralen IFN-α abhängigen Effekt auslöst, welcher zum Zelltod der infizierten Zellen führt und welcher verantwortlich dafür ist, dass das zp BVDV keine persistenten Infektionen beim Fetus etablieren kann. In Zellkulturen wird die Interferonproduktion durch das nzp BVDV inhibiert (SCHWEIZER u. PETERHANS 2001; BAIGENT et al. 2004). Bei Infektionen von Zellkulturen mit dem zp BVDV, wobei u.a. Makrophagen und dendritische Zellen verwendet wurden, wurde ebenfalls eine IFN-α/β Produktion festgestellt (GLEW et al. 2003), wie bereits oben erwähnt wurde. SCHWEIZER und PETERHANS (2001) machten deutlich, dass nur die Apoptose über den IFN-Weg durch das nzp BVDV verhindert wurde, nicht jedoch die Apoptose, die durch andere Faktoren eingeleitet wurde.
Auch wenn noch nicht alle Zusammenhänge eindeutig geklärt sind, so zeigen ST-LOUIS et al. (2005), dass das NS3 Protein des zp BVDV bei Zellen eine vermehrte Freisetzung von Cyt. C hervorruft und dass die via NS3 ausgelöste Apoptose durch spezifische Inhibitoren von Caspase 8 und Caspase 9 inhibiert wird.
2.3.3.3 Apoptose bei BVD Virus Infektion in vivo
Nicht nur in der Zellkultur, sondern auch in vivo soll das zp BVDV die Apoptose induzieren, was vor allem an MD erkrankte Tiere betrifft. Unklar in diesem Zusammenhang ist jedoch, ob die Apoptose ausgelöst wird durch den zp Biotyp oder aber durch die Entzündungszellen, welche in Gewebeläsionen einwandern und ebenfalls von dem BVDV Virus infiziert werden können (SOPP et al. 1994). Bereits bekannt war, dass CD4+ T-Lymphozyten die Apoptose über den rezeptorvermittelten Weg, also über Fas, induzieren (STALDER et al. 1994). MARSDEN und STRASSER (2003) beschrieben, dass in Lymphozyten und myeloiden Zellen die Apoptose über den Rezeptorweg nicht von Mitgliedern der Bcl-2 Familie kontrolliert wird; dies stimmt somit mit dem bereits oben beschriebenen überein. Ein Bcl-2 vermittelter Weg der Apoptose in lymphatischen Geweben ist ebenfalls existent, da ein Mangel an Bcl-2 eine verminderte Überlebensrate bei lymphoiden und myeloiden Zellen verursacht
