Aus dem Institut für Virologie Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Detektion und Charakterisierung möglicher zellulärer Rezeptoren für das
Virus der Bovinen Virusdiarrhoe
INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Frauke-Regina Busse
aus München
Hannover 2004
Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. Irene Greiser-Wilke
1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. Irene Greiser-Wilke 2. Gutachter: PD Dr. Martin Groschup
Tag der mündlichen Prüfung: 2. Dezember 2004
Gefördert durch die DFG im Rahmen des Graduiertenkollegs 745
„Mucosal Host-Pathogen Interactions“.
Meiner Familie in Dankbarkeit
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG ... 1
2 LITERATURÜBERSICHT... 3
2.1DAS VIRUS DER BOVINEN VIRUSDIARRHOE... 3
2.1.1 Ätiologie ... 3
2.1.1.1 Taxonomie... 3
2.1.1.2 Spezies, Subgruppen und Biotypen... 4
2.1.1.3 Morphologie und Genomorganisation ... 4
2.1.1.4 Proteine... 5
2.1.1.5 Lipide ... 7
2.1.2 Infektionsbiologie und Erkrankungen ... 7
2.2VIRUS–ZELLMEMBRAN INTERAKTIONEN... 9
2.2.1 Virusrezeptoren ... 10
2.2.2 Viruseintritt in die Zelle ... 14
2.3ZELLULÄRE REZEPTOREN FÜR DAS BVD-VIRUS... 16
3 MATERIAL UND METHODEN ... 21
3.1MATERIAL... 21
3.1.1 Zelllinien... 21
3.1.2 Bovine Leukozyten... 23
3.1.3 Viren ... 23
3.1.4 Antikörper, Antiseren und Konjugate... 25
3.1.4.1 Antikörper des Third International Workshop on Ruminant Leukocyte Antigens... 25
3.1.4.2 Sonstige Antikörper... 25
3.1.5 Weitere Materialien... 27
3.2METHODEN... 27
3.2.1 Anzucht und Passage von Zellkulturen ... 27
3.2.2 Gewinnung von Leukozyten aus EDTA-Blut ... 28
3.2.3 Virusvermehrung und Ernte ... 28
3.2.4 Virustitration ... 29
3.2.5 Nachweis von viralem Antigen in BVD-virusinfizierten Zellen ... 29
3.2.5.1 Direkte Immunfärbung... 29
3.2.5.2 Immunfluoreszenz... 30
3.2.6 Durchflusszytometrie... 31
3.2.7 ELISA zur Bestimmung der Inhibitionseffizienz monoklonaler Antikörper ... 32
3.2.8 Plaque-Reduktionstest zur Bestimmung der Inhibitionseffizienz monoklonaler Antikörper... 34
3.2.9 Untersuchungen zur Abhängigkeit der Virusbindung von Glykosaminoglykanen.. 35
3.2.10 Kompetitions-Test... 36
3.2.11 Zellfraktionierung... 37
3.2.12 Herstellung von Lysaten für die Westernblot-Analyse und Immunpräzipitation .. 38
3.2.13 Proteinbestimmung... 38
3.2.14 Darstellung der Proteine mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese... 39
3.2.15 Detektion von Proteinen in Polyacrylamidgelen ... 39
3.2.15.1 Silberfärbung... 39
3.2.15.2 Emerald Färbung zum Nachweis von Glykoproteinen ... 40
3.2.15.3 Sypro Ruby Proteinfärbung... 40
3.2.16 Westernblot-Analyse... 40
3.2.17 Immunchemische Detektion von Proteinen in der Westernblot-Analyse ... 41
3.2.18 Immunpräzipitation Biotin-markierter Antigene... 41
3.2.19 Radioimmunpräzipitation... 43
3.2.20 Autoradiographische Darstellung von Proteinen ... 44
3.2.21 Immunaffinitätschromatographie... 44
3.2.21.1 Herstellung der Affinitätsmatrix ... 45
3.2.21.2 Extraktion der Antigene aus Rinderleukozyten ... 45
3.2.21.3 Beladung der Säule... 46
3.2.21.4 Elution ... 46
3.2.21.5 Konzentrierung der Antigene in der Elutionsfraktion... 46
3.2.21.6 Darstellung der eluierten Antigene in der SDS-PAGE ... 46
3.2.22 Identifizierung der eluierten Antigene... 47
3.2.22.1 In-Gel Spaltung ... 47
3.2.22.2 Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation-Time of Flight Massenspektrometrie... 49
3.2.22.3 Bestimmung interner Aminosäuresequenzen... 49
3.2.23 Literaturrecherche und Datenbanksuche... 50
3.2.24 RNA-Isolierung... 50
3.2.25 Messung der RNA-Konzentration... 50
3.2.26 mRNA-Isolierung... 51
3.2.27 Reverse Transkription ... 51
3.2.28 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)... 52
3.2.29 Agarose-Gelelektrophorese... 53
4 ERGEBNISSE ... 55
4.1CHARAKTERISIERUNG DER ZELLLINIEN... 55
4.1.1 Permissivität... 55
4.1.2 CD46-Expression ... 56
4.1.2.1 Immunphänotypisierung... 56
4.1.2.1.1 Fluoreszenzmikroskopie... 56
4.1.2.1.2 Durchflusszytometrie ... 58
4.1.2.2 CD46-Nachweis mittels RT-Polymerase-Kettenreaktion ... 59
4.2CHARAKTERISIERUNG VON BVD-VIRUSSTÄMMEN UND –ISOLATEN... 62
4.2.1 Beschreibung des Replikationsverlaufs anhand des Virusgehalts im Zellkulturüberstand ... 62
4.2.2 Charakterisierung anhand der Infektionsrate mittels direkter Immunfärbung... 66
4.2.3 Abhängigkeit der Infektion von dem Glykosaminoglykan Heparansulfat (HS) ... 69
4.2.4 Abhängigkeit der Infektion von der Expression des Low density lipoprotein Rezeptors (LDLR)... 70
4.2.5 Abhängigkeit der Infektion von der CD46-Expression ... 70
4.3IDENTIFIZIERUNG VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN, DIE DIE BVD-VIRUSINFEKTION HEMMEN... 71
4.3.1 Auswahl von monoklonalen Antikörpern für die Neutralisationstests mittels Durchflusszytometrie... 71
4.3.2 ELISAs zur Bestimmung der Inhibition der Virusinfektion... 72
4.3.2.1 Inhibition der Virusinfektion durch die Third Workshop-Antikörper in Kombination mit BVD/CA27 ... 72
4.3.2.2 Inhibition der Virusinfektion durch einzelne 3W-mAk ... 73
4.3.3 Plaque-Reduktionstest zur Bestimmung der Inhibitionseffizienz ... 77
4.4CHARAKTERISIERUNG DER ANTIGENE... 80
4.4.1 Eigenschaften der für die Charakterisierung mutmaßlicher Rezeptoren zur Verfügung stehenden Antikörper... 80
4.4.1.1 Bindung an FKN-Zellen... 82
4.4.1.2 Kompetitions-Tests ... 82
4.4.1.3 Inhibition der Virusinfektion... 85
4.4.2 Darstellung der Antigene im Immunoblot nach Immunpräzipitation von biotinylierten Oberflächenproteinen ... 89
4.4.3. Darstellung der Antigene mittels Radioimmunpräzipitation ... 90
4.5ISOLIERUNG UND IDENTIFIZIERUNG DER MUTMAßLICHEN REZEPTORPROTEINE... 97
4.5.1 Immunaffinitätschromatographie und Darstellung der eluierten Antigene... 98
4.5.2 MALDI-ToF-MS und Datenbanksuche ... 99
4.5.3 Bestimmung interner Aminosäuresequenzen ... 100
4.6LITERATURRECHERCHE... 100
4.6.1 Literaturrecherche zu CD9 ... 103
4.6.2 Literaturrecherche zum Rho-GDP dissociation inhibitor und zum Melanocortin-1 Rezeptor... 104
5 DISKUSSION ... 107
5.1EINLEITUNG... 107
5.2CHARAKTERISIERUNG VON ZELLLINIEN UND BVD-VIRUSSTÄMMEN UND –ISOLATEN.. 109
5.3DETEKTION UND CHARAKTERISIERUNG MONOKLONALER ANTIKÖRPER MIT INFEKTIONSHEMMENDER WIRKUNG... 114
5.4ISOLIERUNG UND IDENTIFIZIERUNG DER MUTMAßLICHEN REZEPTORPROTEINE... 118
5.5SCHLUSSFOLGERUNG UND AUSBLICK... 123
6 ZUSAMMENFASSUNG ... 125
7 SUMMARY... 127
8 LITERATURVERZEICHNIS ... 129
9 ANLAGEN... 161
9.1MEDIEN UND LÖSUNGEN FÜR DIE ZELLKULTUR... 161
9.2SONSTIGE PUFFER UND LÖSUNGEN... 164
9.3CHEMIKALIEN... 171
9.4KOMMERZIELL ERHÄLTLICHE ANTIKÖRPER... 173
9.5MARKER... 173
9.6KOMMERZIELL ERHÄLTLICHE KITS... 174
9.7PRIMERSEQUENZEN... 175
9.8PCR-MASTERMIXANSÄTZE... 176
9.9GERÄTE UND VERBRAUCHSMITTEL... 177
9.10LISTE DER 3W-MAK... 182
9.11DER EIN-BUCHSTABEN-CODE DER AMINOSÄUREN... 191
9.12SEQUENZ DES BOCD9 FÜR DEN PMF-VERGLEICH... 192
9.13ABBILDUNGSVERZEICHNIS... 192
9.14TABELLENVERZEICHNIS... 193
9.15GLEICHUNGEN... 194
Abkürzungsverzeichnis
A Adenin
Abb. Abbildung
ABTS 2,2‘-Azino-di-[3-ethylbenzthiazolinsulfonat (6)]
AEC 3-Amino-9-Ethylcarbazol
al. alii, lat.: andere
APS Ammoniumpersulfat
ATCC American Type Culture Collection
BCA Bicinchoninic acid
bp Basenpaare
BSA Bovines Serumalbumin
BVD Bovine Virusdiarrhoe
BVDV Virus der Bovinen Virusdiarrhoe
bzw. beziehungsweise
ca. circa
CD cluster of differentiation
cDNA complementary DNA, (komplementäre, synthetische DNA)
CNBr Cyanbromid
CO2 Kohlenstoffdioxid
CSF Classical swine fever, Europäische Schweinepest CSFV Classical swine fever virus
d.h. das heißt
d Tage
Da Dalton (Molmasseneinheit)
ddH2O zweifach destilliertes Wasser
DEPC Diethylpyrocarbonat
DIF direkte Immunfärbung
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA deoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure dNTPs Didesoxynukleotidtriphosphate
DTT Dithiothreitol
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EDulb EMEM, modifiziert nach DULBECCO und FREEMAN ELISA enzyme linked immuno sorbent assay
EMEM Eagle‘s Minimum Essential Medium
EtBr Ethidiumbromid
Fa. Firma
FACS Fluorescence activated cell sorter
FITC Fluoresceinisothiocyanat
FKN Fetale Kälbernieren
FKS fetales Kälberserum
FPLC Fast Performance Liquid Chromatography g Erdanziehungskonstante
GAG Glykosaminoglykan
gam goat-anti-mouse, Ziege-anti-Maus
GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
gp Glykoprotein
h Stunde
HCl Salzsäure
H2O2 Wasserstoffperoxid
HRPO horseraddish peroxidase, Meerrettich Peroxidase
HS Heparansulfat
ICAM intercellular adhesion molecule
IF Immunfluoreszenz
Ig Immunglobulin
IP Immunpräzipitation
IU International Unit (Enzymeinheit)
K Kalium
Kat. Katalog
kb Kilobasen
kDa Kilodalton
KH-R embryonale bovine Herzzellen
KHO bovine Hodenzellen
KID50 mittlere kulturinfektiöse Dosis KLU-R1 embryonale bovine Lungenzellen KMU-R embryonale bovine Muskelzellen
KOP-R bovine Oesopharynxzellen
KTR-R fetale bovine Trachealschleimhautzellen l Liter
LDL low density lipoproteins
log 10 Logarithmus zur Basis 10
µ mikro (x 10-6)
m milli (x 10-3)
M Molarität (mol/l)
mA Milliampère
mAk monoklonaler Antikörper
MALDI-ToF Matrix assisted laser desorption/ionisation-time of flight
MD Mucosal Disease
MDBK Madin Darby bovine kidney MDCK Madin Darby canine kidney
min Minuten
ml Milliliter
M-MLV-RT Moloney-Mausleukämievirus-Reverse-Transkriptase m.o.i. multiplicity of infection
mRNA messenger-RNA
MS Massenspektrometrie
MW Molmasse
n nano (x 10-9)
NADC National Animal Disease Center
NHS N-Hydroxysuccinimid
Nr. Nummer
NS-Protein Nichtstrukturprotein NTR nicht translatierte Region
nzp nichtzytopathogen
OD optische Dichte
ORF open reading frame, offenes Leseraster PAGE Polyacrylamidgel-Elektrophorese PBS Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung PBSM PBS ohne Kalzium und Magnesium
PCR Polymerase chain reaction, Polymerase-Kettenreaktion
p.i. post infectionem
PI persistent infiziert
PK porcine kidney
PMF peptide mass fingerprint
PO Peroxidase
Prod. Produkt
PT bovine Nierenzellen
PVDF Polyvinylidendifluorid
RIP Radioimmunpräzipitation
RIPA radio-immunoprecipitation assay RNA ribonucleic acid, Ribonukleinsäure
rRNA ribosomale RNA
RS Rinderserum
RT Reverse Transkription
s. siehe
sam sheep-anti-mouse, Schaf-anti-Maus SCR short consensus repeat
SDS Sodiumdodecylsulfat
SK swine kidney
Tab. Tabelle
TBE Tris-Borat-EDTA
TBS Tris-gepufferte Kochsalzlösung TEK embryonale bovine Thymuszellen TEMED N,N,N‘,N‘-Tetramethylethylendiamin
TFA Trifluoressigsäure
TNF Tumornekrosefaktor
Tris Trishydroxymethylaminomethan
tRNA transfer-RNA
Tth Thermus thermophilus
u.a. unter anderem
UTR untranslated region, nichttranslatierte Region
V Volt
vgl. vergleiche
3W-mAk monoklonaler Antikörper des Third Workshop on Ruminant Leukocyte Antigens
WB Westernblot
z.B. zum Beispiel
ZKÜ Zellkulturüberstand
zp zytopathogen
ZPE zytopathischer Effekt
1 Einleitung
Das Virus der Bovinen Virusdiarrhoe (BVD-Virus) gehört zum Genus Pestivirus innerhalb der Familie Flaviviridae. Anhand des Verhaltens in der Zellkultur lassen sich ein nicht- zytopathogener (nzp) und ein zytopathogener (zp) Biotyp unterscheiden. Letzterer ruft cha- rakteristische morphologische und strukturelle Veränderungen in infizierten Zellen hervor.
Die Infektion mit dem BVD-Virus gilt weltweit als wirtschaftlich bedeutsamste endemische Virusinfektion der Rinder. Sie kann sich in einer Vielzahl von Krankheitsbildern äußern, die wesentlich vom Immunstatus des infizierten Tieres abhängen. Die postnatale Infektion mit dem BVD-Virus erfolgt oronasal, wobei nach einer ersten Vermehrung im lymphoretikulären Gewebe des Oropharynx die Ausbreitung über die regionalen Lymphknoten mit Virusver- mehrung und Virämie erfolgt. Bei der transplazentaren Infektion vor dem 120. Trächtigkeits- tag kann sich beim Fetus eine spezifische Immuntoleranz entwickeln, in deren Folge es zu ei- ner lebenslangen Persistenz des Virus kommt und bei der nzp BVD-Virus aus allen Geweben isoliert werden kann. Nur diese persistent infizierten (PI) Tiere können an der tödlichen Mu- cosal Disease (MD) erkranken. In diesen Tieren kann auch stets ein zu dem nzp BVD-Virus serologisch identischer zp Biotyp isoliert werden, der vor allem in den Epithelzellen des Re- spirations- und Digestionstrakts lokalisiert ist.
Für das Verständnis des Zelltropismus und der Pathogenese ist die Kenntnis der an der Virus- bindung und dem Viruseintritt beteiligten zellulären Strukturen von herausragender Bedeu- tung. Für BVD-Viren wurden mehrere zelluläre Rezeptoren postuliert. Am besten charakteri- siert wurde dabei das bovine Homolog des CD46 (boCD46). Es gibt jedoch Hinweise darauf, dass insbesondere dieser Rezeptor vermutlich nicht alleine die Infektion vermitteln kann.
Vielmehr scheint es sich auch bei der Infektion mit BVD-Viren um einen mehrschrittigen Prozess zu handeln, an dem mehrere zelluläre Faktoren beteiligt sind.
In der vorliegenden Arbeit sollte die Beteiligung von bereits identifizierten Rezeptoren an Vi- rusbindung oder -eintritt für unterschiedliche BVD-Virusisolate und -Laborstämme unter- sucht, sowie weitere zelluläre Rezeptoren ermittelt, charakterisiert und identifiziert werden.
Die Untersuchungen wurden an bovinen Kulturzellen sowie an Leukozyten durchgeführt. Zu-
nächst wurden gegen bovine Leukozytenoberflächenantigene gerichtete monoklonale Anti- körper (mAk) auf ihre Kreuzreaktivität mit bovinen Kulturzellen untersucht. Anschließend wurden die kreuzreagierenden Antikörper auf ihre Fähigkeit hin getestet, die Infektion mit ausgewählten, charakterisierten BVD-Virusisolaten und -Laborstämmen zu hemmen. Es wur- de gezeigt, dass drei monoklonale Antikörper mit bisher unbekannter Spezifität die Infektion spezifisch und konzentrationsabhängig inhibieren. Mit zwei der Antikörper konnten Proteine mit Molmassen von ca. 23 kDa in verschiedenen Zelltypen nachgewiesen werden. Mas- senspektrometrische Untersuchungen und die Analyse interner Aminosäuresequenzen liefer- ten weitere Hinweise auf die Identität des möglichen Rezeptors. Der experimentelle Ablauf ist in Abbildung 1 zusammengefaßt.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des experimentellen Vorgehens
Untersuchung der kreuzreaktiven mAk auf infektionshemmende Wirkung
im ELISA und im Plaque-Reduktionstest
• Charakterisierung von bovinen Zellen und BVD-Virusisolaten und Laborstämmen
• Untersuchung der Abhängigkeit der Infektion von:
Heparansulfat
Low density lipoprotein Rezeptor boCD46
Charakterisierung der Zielantigene mittels
Kompetition, (Radio-) Immunpräzipitation
und Westernblot-Analyse
Präparative Isolierung der Antigene mittels
Immunaffinitätschromatographie
Identifizierung der Antigene mittels Massenspektrometrie
Bestimmung interner Aminosäuresequenzen Datenbanksuche
Literaturrecherche
Auswahl geeigneter Zellen und BVD-Viren Durchflusszytometrische Untersuchung von
279 mAk des 3rd International Workshop on Ruminant Leukocyte Antigens auf Kreuzreaktivität mit bovinen Kulturzellen
2 Literaturübersicht
2.1 Das Virus der Bovinen Virusdiarrhoe
Die Infektion mit BVD-Viren gilt weltweit, insbesondere in Regionen mit intensiver Tierhal- tung, als wirtschaftlich bedeutsamste endemische Virusinfektion der Rinder (HOUE, 2003).
Die Prävalenz von persistent infizierten Tieren, die für die Verbreitung und Aufrechterhaltung des Infektionsgeschehens von herausragender Bedeutung sind, liegt zwischen 1-2 % (FREY et al., 1996; MOENNIG und GREISER-WILKE, 2003). Neben Rindern sind auch alle ande- ren Paarhuferarten für das BVD-Virus empfänglich (DOYLE und HEUSCHELE, 1983;
TERPSTRA und WENSVOORT, 1988; NETTLETON, 1992). In vitro läßt sich ein breites Spektrum von Zelllinien auch von Nicht-Paarhuferarten, u.a. von Kaninchen und Katzen, mit dem BVD-Virus infizieren (BOLIN et al., 1994). Außerdem konnte, nach Haltung in mit BVD-viruskontaminierten Seren versetztem Medium, BVD-Virus in Primaten-, Hamster- und Kaninchennieren-Zellen, sowie in einer humanen Zelllinie nachgewiesen werden (AGNELLO et al., 1999; AUDET et al., 2000).
2.1.1 Ätiologie
2.1.1.1 Taxonomie
Innerhalb der BVD-Viren können zwei Spezies, BVD-Virus 1 und BVD-Virus 2, unterschie- den werden. Zusammen mit dem Virus der Europäischen Schweinepest (Classical Swine Fe- ver Virus, CSFV) und den Border Disease-Viren (BDV) sowie einer weiteren möglichen Spezies, Giraffe-1, werden sie dem Genus Pestivirus innerhalb der Familie Flaviviridae zuge- ordnet (VAN REGENMORTEL, 2000; THIEL et al., 2003). Darüberhinaus umfaßt die Fami- lie Flaviviridae das Genus Hepacivirus mit dem einzigen Vertreter Hepatitis C-Virus (HCV), sowie das Genus Flavivirus. Das Genus Flavivirus beinhaltet zahlreiche von Arthropoden ü- bertragene Viren von veterinärmedizinischer Bedeutung, wie das Louping Ill-Virus und das Wesselsbron Disease-Virus der Schafe. Wichtige humanpathogene Erreger sind u.a. Dengue- viren, das Gelbfieber-Virus und das Virus der Frühsommermeningoenzephalitis (FSMEV).
2.1.1.2 Spezies, Subgruppen und Biotypen
BVD-Virusisolate wurden zunächst aufgrund von Unterschieden in der nichttranslatierten Region am 5‘-Ende charakterisiert. Dies führte zu einer Einteilung in zwei Genotypen, BVD- Virus I und II (RIDPATH et al., 1994; HARPIN et al., 1995). Weiterführende phylogeneti- sche Analysen auf der Basis der Nukleinsäuresequenz des gesamten Npro- und des E2-Gens erlaubten eine weitere statistisch signifikante Unterscheidung, so dass im Jahr 2000 zwei Vi- russpezies, BVD-Virus 1 und BVD-Virus 2 definiert wurden. Darüberhinaus können Sub- gruppen innerhalb dieser Spezies unterschieden werden (BECHER et al., 1999; VAN REGENMORTEL et al., 2000; KÖNIG et al., 2002). Für das sehr heterogene BVD-Virus 1 sind bis zu elf Subgruppen beschrieben worden (VILCEK et al., 2001, TAJIMA, 2004). Im Gegensatz dazu sind alle bisher in Deutschland isolierten BVD-Virus 2 Isolate eng miteinan- der verwandt (KÖNIG et al., 2003).
Unabhängig von der Spezieszugehörigkeit lassen sich anhand ihres unterschiedlichen Verhal- tens in der Zellkultur ein zytopathogener (zp) und ein nichtzytopathogener (nzp) Biotyp un- terscheiden. Nicht-zytopathogene BVD-Virusisolate vermehren sich in permissiven Zellen, ohne makroskopisch oder mikroskopisch sichtbare Veränderungen zu induzieren (BAKER et al., 1954). Dagegen kommt es im Zuge der Replikation des zp Biotyps zu einer Vakuolisie- rung des Zytoplasmas, Kernpyknose, Abkugelung und schließlich zum Absterben der Zellen durch Apoptose (LEE und GILLESPIE, 1957; UNDERDAHL et al., 1957; GILLESPIE et al., 1960; LIESS, 1967; ZHANG et al., 1996; GRUMMER et al., 1998).
2.1.1.3 Morphologie und Genomorganisation
Die behüllten Viruspartikel der Pestiviren weisen eine kubische Symmetrie (HAFEZ, 1967;
MOENNIG, 1971) bei einen Durchmesser von 40 bis 60 nm auf (WENGLER, 1991;
MOENNIG und PLAGEMANN, 1992). Eine elektronendichte, hexagonale Core-Struktur mit einem Durchmesser von 20 bis 25 nm wird von einer 8 nm starken lipidhaltigen bilaminaren Hülle umschlossen, die unregelmäßig gestaltete Projektionen aufweist (HORZINEK et al., 1967 und 1971; ENZMANN und WEILAND, 1978; BIELEFELDT-OHMANN, 1990).
Das virale Genom liegt in Form einer einzelsträngigen, linearen Ribonukleinsäure in Plus- strangorientierung vor. Die durchschnittliche Größe des Genoms beträgt ca. 12,5 kb, jedoch sind aufgrund von Insertionen bei dem zp Biotyp auch größere Genome möglich (BECHER et
al., 1998). Dabei wird ein einziges offenes Leseraster (open reading frame, ORF) von einer ca. 385 Basen umfassenden nicht–translatierten Region (UTR) am 5‘-Ende sowie einer ca.
220 Basen langen UTR am 3‘-Ende flankiert (COLLETT et al., 1988c; DONIS, 1995). In dem ORF codiert das Genom für ein hypothetisches Polyprotein von ca. 449 kDa aus etwa 4000 Aminosäuren (COLLETT et al., 1988a und b, WENGLER et al., 1995). In Abbildung 2 sind die Genomorganisation des BVD-Virus und die Bezeichnungen der entsprechenden Pro- teine mit ihren Molmassen (MW) schematisch dargestellt.
Abbildung 2: Darstellung der Genomorganisation und der resultierenden Proteine (nach COLLETT, 1994)
2.1.1.4 Proteine
Im N-terminalen Drittel des hypothetischen Polyproteins sind mit Ausnahme des Nichtstruk- turproteins Npro, die vier Strukturproteine C, Erns, E1 und E2 lokalisiert, an welche sich im C-terminalen Bereich die Nichtstrukturproteine NS2-3, NS4A, NS4B, NS5A und NS5B an- schließen. Sowohl ko- als auch posttranslational werden mit Hilfe zellulärer und viraler Pro- teasen in Abhängigkeit vom Biotyp elf bzw. zwölf virale Proteine prozessiert (COLLETT et al., 1991; WISKERCHEN et al., 1991; WISKERCHEN und COLLETT, 1991; RÜMENAPF et al., 1993; STARK et al., 1993).
Das erste, für Pestiviren charakteristische Proteinprodukt des offenen Leserasters ist die Au- toprotease Npro (WISKERCHEN et al., 1991; RÜMENAPF et al., 1993), die jedoch für die Replikation nicht essentiell zu sein scheint (TRATSCHIN et al., 1998). Durch ihre Abspal-
5‘ UTR 3‘ UTR
Npro C Erns E1
NS2 NS3
NS4A
NS4B NS5A NS5B E2
p7
NS2-3
Strukturproteine Nichtstrukturproteine
NS
Molmassen in kDa
20 14 48 25 53
125
54 80
10 30 58 75
tung von dem Polyprotein wird der N-Terminus des Nukleokapsidproteins C freigesetzt (RÜMENAPF et al., 1993). Die übrigen Strukturproteine sind glykosyliert (COLLETT et al., 1988b), wobei ihre Prozessierung ausschließlich durch zelluläre Proteasen erfolgt; sie sind mit der lipidhaltigen Hülle assoziiert (THIEL et al., 1991). Die Glykoproteine liegen als Dimere vor, die über Disulfid-Brücken verbunden sind. Bisher wurden sowohl in infizierten Zellen als auch in den Virionen Erns-Homodimere, E1/E2-Heterodimere und E2-Homodimere nachge- wiesen (STARK et al., 1990; WEILAND et al., 1990), wobei das hydrophobe E1 wahrschein- lich als Membrananker für E2 fungiert (RÜMENAPF et al., 1993). Die Induktion neutralisie- render Antikörper erfolgt durch die Glykoproteine Erns und E2, wobei das E2 immundominant ist (BOLIN et al., 1988; DONIS et al., 1988). Das Protein p7 wurde bislang nur in infizierten Zellen, jedoch nicht in Virionen nachgewiesen. Da die proteolytische Spaltung zwischen dem E2 und p7 nicht immer vollständig ist, können E2p7 Mischprodukte auftreten, über deren Einfluß auf das Infektionsgeschehen bisher nichts bekannt ist (ELBERS et al., 1996).
Im Gegensatz zu den Strukturproteinen sind die Prozessierungsstellen der Nicht- Strukturproteine auf dem hypothetischen Polyprotein nur ungenau festgelegt. Dem ersten Genprodukt NS2-3 kommt beim BVD-Virus eine besondere Bedeutung zu, da anhand seiner Prozessierung zwischen den beiden Biotypen unterschieden werden kann. Während das NS2-3 mit einer Molmasse von 125 kDa von allen BVD-virusinfizierten Zellen exprimiert wird, ist in Zellen, welche mit dem zp Biotyp infiziert sind, zusätzlich das 80 kDa große Pro- tein NS3 nachweisbar, das kolinear mit dem C-terminalen Ende des NS2-3-Proteins ist (GREISER-WILKE et al., 1992). Wie das NS2-3 verfügt auch das NS3 über eine Serin- Protease-, RNA-Helikase- und RNA-abhängige NTPase-Aktivität (WISKERCHEN und COLLETT, 1991; TAMURA et al., 1993; WARRENER und COLLETT, 1995). Die Entste- hung des NS3 hat verschiedene Ursachen, unter anderem konnte für die zp BVD-Viren Osloss und CP14 eine Ubiquitin-Insertion nachgewiesen werden (MEYERS et al., 1991). Duplikati- onen des NS3, wie bei CP1 (QI et al., 1992), Deletionen und Punktmutationen (zp BVD-Virus Oregon) im Bereich des NS2-3 haben ebenfalls die Expression des NS3-Proteins zur Folge.
Bisher ist die für die Spaltung verantwortliche Protease jedoch unbekannt. Über die Funktion des NS2 gibt nur sehr geringe Erkenntnisse. Wahrscheinlich hat dieses hydrophobe Protein mit einer Molmasse von 54 kDa eine regulatorische Funktion während der Replikation (MOSER et al., 1999) und möglicherweise besteht eine Verbindung zur Apoptoseinduktion (KÜMMERER und MEYERS, 2000).
Die sich an das NS2-3 anschließenden Nichtstrukturproteine sind am besten bei HCV unter- sucht. Das NS4 wird durch die Proteaseaktivität des NS2-3 abgespalten und in NS4A und NS4B prozessiert (COLLETT et al., 1991). Untersuchungen des NS4A von HCV lassen ver- muten, dass NS4A als Kofaktor der Protease NS3 fungiert und mit ihr sowie NS5B einen möglicherweise für die Virusreplikation bedeutsamen, stabilisierenden Komplex bildet (HAHM et al., 1995; TANJI et al., 1995; NEDDERMANN et al., 1997; ISHIDO et al., 1998;
SALI et al., 1998; TAUTZ et al., 2000). NS5 wird ebenfalls durch NS2-3 in die beiden Prote- ine NS5A und NS5B prozessiert (COLLETT et al., 1988b; COLLETT et al., 1991). Während für NS5B eine RNA-abhängige RNA-Polymerase-Aktivität gezeigt werden konnte (WARRILOW et al., 2000), ist die Funktion des NS5A unbekannt, jedoch scheint es aufgrund seiner geringen Halbwertszeit einen limitierenden Faktor der Virusreplikation darzustellen.
2.1.1.5 Lipide
Aufgrund seiner lipidhaltigen Hülle ist das BVD-Virus empfindlich gegenüber organischen Lösungsmitteln und Detergenzien (HAFEZ und LIESS, 1972). Die genaue Zusammensetzung der Lipidhülle ist jedoch unbekannt (WENGLER, 1991). Sie stammt jedoch vermutlich vom budding in die Zisternae des Endoplasmatischen Retikulums (GRUMMER et al., 2001).
2.1.2 Infektionsbiologie und Erkrankungen
Die postnatale Infektion mit dem BVD-Virus erfolgt oronasal. Nach einer ersten Vermehrung im lymphoretikulären Gewebe des Oropharynx (LIESS, 1967) kommt es zur Ausbreitung ü- ber die regionalen Lymphknoten mit Virusvermehrung und Virämie, während der das Virus in der Leukozytenfraktion (LIESS et al., 1974; CORIA und McCLURKIN, 1978; VON HEESEN 1984; BOLIN et al., 1985; BIELEFELDT-OHMANN et al., 1987; LOPEZ et al., 1994; SOPP et al., 1994) und, bis zur Bildung neutralisierender Antikörper, auch frei im Plasma nachweisbar ist (LIESS, 1967). Die Infektion mit dem BVD-Virus kann sich in einer Vielzahl von sehr verschiedenartigen Krankheitsbildern äußern, die wesentlich vom Immun- status des infizierten Tieres abhängen (BAKER, 1995).
Bei immunkompetenten Tieren verläuft eine Infektion mit dem BVD-Virus transient und in 70-90% der Fälle subklinisch oder mild (LIESS et al., 1982; AMES, 1986). Milde Verläufe
können mit einer Erhöhung der Körpertemperatur oder serösem Nasenausfluß (BAKER et al., 1954; BOLIN, 1993) und in einigen Fällen auch mit Diarrhoe und Erosionen der Schleimhäu- te des Digestionstraktes (DUFFELL und HARKNESS, 1985) verbunden sein. Da die Infekti- on neben Neutropenie und Lymphopenie auch eine Reduktion der TNFα-Produktion in Makrophagen verursacht, die sich in einer allgemeinen Immunsuppression äußern (ROTH et al., 1981; BOLIN et al., 1985a; ELLIS et al., 1988; ADLER et al., 1996), können jedoch be- sonders Infektionen des Respirationstraktes mit Sekundärerregern wie dem Bovinen Respira- torischen Synzytialvirus (BRSV), dem Bovinen Herpesvirus-1 (BHV-1) und Mannheimia haemolytica begünstigt werden (LEHMKUHL und GOUGH, 1977; POTGIETER et al., 1984;
TRIGO et al., 1984; BRODERSEN et al., 1999).
Ein als hämorrhagisches Syndrom bezeichnetes Krankheitsbild wird durch stark virulente Iso- late der BVD-Virus 2-Spezies ausgelöst (BOLIN und RIDPATH, 1992; LIEBLER- TENORIO et al., 1995). Es ist gekennzeichnet durch hohes Fieber, blutige oder wäßrige Di- arrhoe, Leukopenie, Thrombozytopenie und ausgedehnte petechiale bis ekchymatöse Hä- morrhagien unter anderem in der Subkutis, in den Schleimhäuten, in Lymphknoten, Kehlkopf und Herz (REBHUN et al., 1989; CORAPI et al., 1989; BOLIN und RIDPATH, 1992;
LIEBLER-TENORIO et al., 1995; RIDPATH et al., 2000; KELLING et al., 2002; LIEBLER- TENORIO et al., 2003).
Besondere Relevanz erlangt eine Infektion mit dem BVD-Virus jedoch bei tragenden Tieren.
Neben einem allgemeinen negativen Einfluß auf die Reproduktionsleistung, wahrscheinlich durch ovarielle Dysfunktion (McGOWAN et al., 1993 und 2003; FRAY et al., 2000) kommt es bei einer transplazentaren Infektion im ersten Drittel der Trächtigkeit häufig zur Resorpti- on, Mumifizierung oder zum Abort der Frucht. Daneben wird eine Vielzahl von fetalen Miss- bildungen, u.a. des zentralen Nervensystems und der Augen, mit einer intrauterinen Infektion insbesondere zwischen dem 90. bis etwa 160. Trächtigkeitstag in Verbindung gebracht (CASARO et al., 1971; LIESS et al., 1987; FREY et al., 1996). Mit fortschreitender Trächtig- keitsdauer reift das Immunsystem des Fetus und ist etwa ab dem 120. Gestationstag in der Lage, neutralisierende Antikörper gegen das BVD-Virus zu bilden und es zu eliminieren (LIESS et al., 1984).
Erfolgt die Erstinfektion eines tragenden Tieres vor dem 120. Trächtigkeitstag, so kann daraus infolge der immunologischen Toleranz eine persistierende Virämie ohne Bildung von Anti-
körpern gegen das Virus entstehen (BROWNLIE et al., 1984; BOLIN et al., 1985b; BAKER, 1995). Persistent infizierte Kälber können nach ihrer Geburt klinisch unauffällig bleiben, wei- sen aber z.T. einen Wachstumsrückstand („Kümmerer“) und eine erhöhte Anfälligkeit für Se- kundärinfektionen auf (FREY et al., 1996). Ausschließlich diese PI-Tiere erkranken meist in- nerhalb von 24 Monaten an der Mucosal Disease (MD) (BROWNLIE et al., 1984; BOLIN et al., 1985b).
Die MD manifestiert sich als akut oder protrahiert verlaufende Erkrankung. Sie ist gekenn- zeichnet durch Fieber, eine katarrhalische, diffuse und bei der subakuten Verlaufsform auch erosiv-ulzerative Stomatitis und Pharyngitis sowie Entzündungen des Flotzmauls, des Kron- saums und des Interdigitalspalts. Ähnliche Veränderungen findet man in Pansen und Psalter sowie im gesamten Darmkanal, wo es auch zu einer Zerstörung des lymphatischen Gewebes kommt. Unstillbare, fibrinös-hämorrhagische Durchfälle führen zu Exsikkose und Abmage- rung (POHLENZ und LIEBLER, 1987; LIEBLER et al., 1991; LIEBLER-TENORIO et al., 1997). Die Tiere verenden meist innerhalb von ein bis zwei Wochen (RAMSEY und CHIVERS, 1953; PRITCHARD, 1963).
Während bei PI Tieren aus allen Geweben nur der nzp Biotyp isoliert werden kann (BIELEFELDT-OHMANN, 1988; FREDRIKSEN et al., 1999), kann in an MD erkrankten Tieren stets auch ein serologisch identischer zp Biotyp nachgewiesen werden (BROWNLIE et al., 1987; CORAPI et al., 1988; BROWNLIE, 1990; BROWN et al., 1991; BROWNLIE und CLARKE, 1993a und b).
2.2 Virus–Zellmembran Interaktionen
Viren besitzen als obligate Parasiten keinen eigenen Stoffwechsel und sind deshalb darauf an- gewiesen, die Stoffwechselmaschinerie der Zelle für ihre Replikation zu nutzen. Der Replika- tionszyklus läßt sich in die Phasen Adsorption (attachment), Penetration, Freisetzung des Vi- rusgenoms (uncoating), Genomvermehrung und Genomexpression, Morphogenese (assembly) und schließlich die Freisetzung der neugebildeten Viruspartikel untergliedern. Der Eintritt in die Zelle besteht in drei Ereignissen, (a) der Anlagerung der Virionen an die Plasmamembran (attachment), (b) der Penetration der zellulären Membran, wobei (c) das virale Genom entwe-
der als nackte Nukleinsäuremoleküle oder in Form von Nukleoproteinkomplexen in die Zelle verbracht wird (YOUNG, 2001).
2.2.1 Virusrezeptoren
Als Virusrezeptoren werden zelluläre Oberflächenstrukturen bezeichnet, die in der initialen Phase der Infektion, d.h. während der Anlagerung an und des Eintritts in die Zelle mit viralen Strukturen interagieren (TARDIEU et al., 1982). Prinzipiell kann jeder „normale“ Bestandteil der Zellmembran als potentieller Virusrezeptor fungieren (LENTZ, 1995). Dabei kann es sich neben Proteinen auch um Lipide oder Oligosaccharide handeln (MARSH und HELENIUS, 1989). Häufig fungieren integrale Membranproteine als Virusrezeptoren, viele davon gehören zur Immunglobulin-Superfamilie (WHITE und LITTMANN, 1998), stellen in ihrer physiolo- gischen Funktion Rezeptoren für Neurotransmitter oder Hormone dar (LENTZ, 1995) oder haben Funktionen im Rahmen der Zelladhäsion und Signaltransduktion (YOUNG, 2001). Als nicht-proteinartige Virusrezeptoren werden beispielsweise Sialinsäuren unter anderem von In- fluenzaviren (Orthomyxoviridae) (KLENK et al., 1955; GOTTSCHALK et al., 1958;
ROGERS et al., 1986), dem Sendai Virus (Paramyxoviridae) (MARKWELL et al., 1981) und dem Transmissiblen Gastroenteritis Virus (Coronaviridae) (SCHWEGMANN-WESSELS et al., 2003) genutzt.
In vielen Fällen kommt dem Virusrezeptor auch eine Bedeutung für Wirtsspezifität, Pathoge- nität sowie für den Zell- und Organtropismus zu (MARSH und HELENIUS, 1989;
SCHNEIDER-SCHAULIES, 2000). Allerdings müssen nicht zwangsweise alle Gewebe, die einen bestimmten Virusrezeptor exprimieren, auch infizierbar sein. Ein Beispiel für die Be- deutung von Rezeptoren für die Speziesbarriere, nicht aber für den Organ- bzw. Gewebetro- pismus, stellt der Poliovirusrezeptor CD155 dar. CD155 wird beim Menschen auch in Herz, Leber und Lunge exprimiert, in denen das Poliovirus jedoch nicht repliziert (NOMOTO et al., 1994).
Zahlreiche Viren sind in der Lage, auf verschiedenen Zellen alternative Rezeptoren zu nutzen, wodurch eine größere Verteilung im Organismus ermöglicht wird. So konnte für das Humane Immundefizienzvirus (HIV) nachgewiesen werden, dass nach der Bindung an den Hauptre- zeptor CD4 (KLATZMANN et al., 1984) die weitere Interaktion mit alternativen Korezepto- ren erfolgen kann. T-Zell-trope HIV-Stämme nutzen dabei den Chemokinrezeptor CXCR4
(BERSON et al., 1996) während Makrophagen- und TH-Zell-trope Stämme mit CCR5 inter- agieren (DENG et al., 1996). Vermittelt wird die Fähigkeit zur Nutzung alternativer Rezepto- ren im Allgemeinen meist durch Mutationen der Hüllproteine. Hohe Replikations- und Muta- tionsraten, insbesondere bei RNA-Viren, sowie die häufige Passage und Adaptation an Zell- kulturbedingungen fördern dabei die Selektion von Nachkommenviren, welche alternative (Ko-) Rezeptoren nutzen können (BARANOWSKI et al., 2001). Besonders für die Bindung an nicht-proteinartige, geladene Oberflächenstrukturen wie Glykosaminoglykane (GAG), bei- spielsweise Heparansulfat (HS), konnte dieser Zusammenhang gezeigt werden (SA- CARVALHO et al., 1997; KLIMSTRA et al., 1998; HULST et al., 2000 und 2001). Für das CSFV wird angenommen, dass nach Adaptation an Zellkulturzellen HS als „attachment“- Rezeptor fungiert, wobei die Virus-HS-Interaktion im wesentlichen auf einer unspezifischen, elektrostatischen Interaktion basiert. Dadurch kommt es zu einer Anreicherung von Virionen auf der Zelloberfläche (HAYWOOD, 1994). Für den Zelleintritt aber sind weitere Interaktio- nen mit (einem) spezifischen Rezeptor(en) notwendig (HULST et al., 2000 und 2001). Auch für das Dengue-Virus und das Sindbis-Virus liegen Untersuchungen vor, die diese Vermutung stützen (PUTNAK et al., 1997; BYRNES und GRIFFIN, 1998; HUNG et al., 1999). Die Bin- dung an HS kann aber durchaus auch spezifisch sein, d.h. sie muß nicht allein auf elektrostati- schen Interaktionen beruhen (KJELLEN und LINDAHL, 1991; SHUKLA et al., 1999).
In einigen Fällen sind alternative Rezeptoren auch alleine in der Lage, die Infektion zu ermög- lichen, wie es z.B. für das Masern Virus (MV) beschrieben wurde. In diesem Fall hatte die Adaptation des MV-Stammes Edmonston an die Zellkultur die Selektion von Mutanten zur Folge, die, bedingt durch einen einzigen Aminosäureaustausch im Hämagglutinin, die Fähig- keit besaßen, an CD46 zu binden (HSU et al., 1998). Inzwischen wurde jedoch gezeigt, dass für zahlreiche Feldisolate nicht CD46, sondern das signalling lymphocyte-activation molecule (SLAM/CDw150) als Rezeptor fungiert (TATSUO et al., 2000; ERLENHOFER et al., 2002).
Auf Endothelzellen wird sogar noch ein weiterer, bisher nicht identifizierter Rezeptor vermu- tet, da diese kein SLAM exprimieren und auch in Gegenwart von anti-CD46-Antikörpern in- fizierbar sind (ANDRES et al., 2003).
Dieselben Strukturen können dabei durchaus unterschiedlichen Viren als Rezeptor dienen.
Dies wird auch aus Tabelle 1 ersichtlich, in welcher einige bereits identifizierte Virusrezepto- ren aufgeführt sind. Eine mögliche Erklärung, weshalb relativ häufig dieselben Strukturen von unterschiedlichen Viren genutzt werden, könnte laut YOUNG (2001) darin liegen, dass
diese aufgrund ihrer Art eine besondere Nähe zwischen viralen attachment- und/oder Fusi- onsproteinen und der Plasmamembran ermöglichen (BUCHHOLZ et al., 1996), durch ihre Lokalisation in bestimmten Mikrodomänen ein für den Viruseintritt günstiges Umfeld schaf- fen (PARTON et al., 1999) oder aufgrund ihrer natürlichen Funktion in der Signaltransdukti- on einen positiven Einfluss auf die weitere Replikation ausüben (STUPACK et al., 1996).
Tabelle 1: Beispiele bereits identifizierter zellulärer Rezeptoren und Korezeptoren von Viren
Familie Virus Rezeptor Referenz
behüllte Viren Paramyxo- viridae
Masernvirus CD46 SLAM/CDw150
NANICHE et al.,1993 DÖRIG et al., 1993 TATSUO et al., 2000 Sendai Virus N-Acetylneuraminsäure
(Neu5Ac)
PAULSON et al., 1979
Orthomyxo- viridae
Influenza-A, und -B-Viren
Neu5Ac KLENK et al.,1955
GOTTSCHALK et al., 1958
Influenza-C-Virus N-Acetyl-9-O-
Acetylneuraminsäure
ROGERS et al., 1986
Togaviridae Sindbisvirus High affinity laminin Rezeptor
Heparansulfat
WANG et al., 1992
BYRNES und GRIFFIN, 1998 Rhabdoviri-
dae
Tollwutvirus Acetylcholinrezeptor LENTZ et al., 1982
Coronaviri- dae
Transmissible Gastroenteritis Vi- rus
Porzine Aminopeptidase N N-Glycolylneuraminsäure
DELMAS et al., 1992 SCHWEGMANN- WESSELS et al., 2003 Herpesviridae Herpes-simplex-
Virus
Heparansulfat WUDUNN und SPEAR, 1989
Humanes Herpes Virus (HHV)-7
CD4 LUSSO et al., 1994
HHV-6 CD46 SANTORO et al., 1999 Epstein-Barr-Virus CD21 FINGEROTH et al.,
1984
Flaviviridae HCV CD81
Low density lipoprotein Rezeptor
PILERI et al.,1998 AGNELLO et al., 1999
Poxviridae Vacciniavirus EGF Heparansulfat
EPPSTEIN et al., 1985 CHUNG et al, 1998
Retroviridae HIV-1 CD4
CCR5 CXCR4
KLATZMANN et al., 1984
ALKHATIB et al., 1996;
DENG et al., 1996 BERSON et al., 1996 unbehüllte
Viren Picornaviri- dae
Poliovirus CD155 CD44
MENDELSOHN et al., 1989
SHEPLEY und RACANIELLO, 1994 Adenoviridae Adenovirus 11,
Spezies B
CD46 SEGERMAN et al.,
2003
Angesichts der Komplexität viraler Invasionsmechanismen kann man jedoch nur schwerlich von „dem Virusrezeptor“ als einem Molekül sprechen. Vielmehr handelt es sich wohl in den überwiegenden Fällen um einen mehrschrittigen, dynamischen Prozess, in den mehrere zellu- läre Faktoren additiv oder alternativ involviert sind. Schon die initiale Rezeptor-Virus- Interaktion kann mehrere Teilschritte beeinhalten (SCHNEIDER-SCHAULIES, 2000).
Die Identifizierung von Virusrezeptoren wird häufig dadurch erschwert, dass die Affinität des viralen Proteins zu dem Virusrezeptor nur gering ist (HARRISON, 2001) und zudem Virusre- zeptoren in sehr geringer Dichte auf Zellen vorkommen können (MARSH und HELENIUS, 1989). Im Hinblick auf eine Adaptation von Viren an die Zellkultur und die schwierige Unter- scheidung zwischen spezifischer und unspezifischer Interaktion (SA-CARVALHO et al.,
1997; HULST et al., 2000) muß bei in vitro Studien auch immer die tatsächliche biologische Relevanz hinterfragt werden.
2.2.2 Viruseintritt in die Zelle
Nachdem das Virus an seinen zellulären Rezeptor gebunden hat, muß es die Plasmamembran der Zelle überwinden, um an seinen Replikationsort zu gelangen. Für viele behüllte Viren ist dieser Vorgang bereits gut untersucht. Da behüllte Viren über eine Lipiddoppelmembran ver- fügen, kann die Internalisierung mittels Fusion der viralen mit einer zellulären Membran von- statten gehen. Dieser Vorgang findet entweder direkt an der Zelloberfläche mit der Plasma- membran statt oder aber das Virus wird zunächst internalisiert und die Virusmembran ver- schmilzt mit inneren Membranen (SIECZKARSKI und WHITTAKER, 2003). Für nicht- behüllte Viren hingegen ist der Internalisierungsprozess zum größten Teil noch nicht unter- sucht. Möglicherweise penetrieren diese Viren die Zellmembran durch Bildung von Poren o- der Lyse der zellulären inneren oder äußeren Membran (HARRISON, 2001).
Die Fusion mit zellulären Membranen kann pH-unabhängig verlaufen, beispielsweise über Konformationsänderungen durch Rezeptorinteraktionen, wie bei dem HIV-1. Hier kommt es durch die Bindung der Untereinheit des HIV-Spikeproteins gp120 an das zelluläre CD4 zu ei- ner Konformationsänderung, durch die eine Bindung an den Korezeptor CCR5 ermöglicht wird, welche wiederum die Umwandlung des Transmembranproteins gp41 zu einer fusions- aktiven Form bewirkt (LIU et al., 2003).
Bei sehr vielen Viren können die für die Fusion notwendigen Konformationsänderungen je- doch nur bei niedrigem pH vollzogen werden. Dieser pH-abhängige Weg setzt ein Verbringen der Viruspartikel in reifende Endosomen mittels Endozytose voraus. Als Endozytose wird all- gemein ein Prozess bezeichnet, durch den kleine Partikel, Moleküle oder Flüssigkeiten in die Zelle aufgenommen werden. Am besten erforscht ist dieser Weg bei behüllten Viren, wie dem Semliki Forest Virus (MARSH und HELENIUS, 1980), Influenza Viren (KRIZANOVA et al., 1982) und dem Vesicular Stomatitis Virus (HELENIUS und MARSH, 1982). Auch die unbehüllten Adenoviren werden auf diese Weise internalisiert (MARSH und PELCHEN- MATTHEWS, 2000), allerdings kommt es hier nicht zur Fusion mit, sondern vielmehr zur Lyse der endosomalen Membran (KNIPE, 1991). Die Vorteile dieses Eintrittmechanismus, der schließlich auch mit dem Risiko der Hydrolyse und Inaktivierung behaftet ist, dürften dar-
in bestehen, dass auf diese Weise das kortikale Zytoskelett einfacher überwunden werden kann und der Transport zu spezifischen Zelllokalisationen erleichtert wird (SIECZARSKI und WHITTAKER, 2002). Außerdem werden virusinfizierte Zellen nicht schon zu Beginn der In- fektion durch integrierte Virusmembranproteine dem Immunsystem als solche kenntlich ge- macht (KNIPE, 1991).
Vermutlich sind Viren in der Lage, alle Arten der Endozytose zu nutzen. Bei der rezeptor- vermittelten Endozytose wird die Aufnahme des Liganden durch eine spezifische Rezeptor- interaktion initiiert. Am besten erforscht ist hierbei der Weg über clathrin-coated pits und ve- sicles (SIECZKARSKI und WHITTAKER, 2002). Inzwischen sind neben dem Clathrin zahl- reiche weitere Proteine bekannt, die in diesen Prozess involviert sind, u.a Aktin und die GTPase Dynamin (LAMAZE et al., 1997; SEVER, 2002). Neben der Clathrin-vermittelten Endozytose sind in den letzten Jahren insbesondere die Internalisierung von Viren über Cave- olae, z.B. bei dem Simian Virus type 40 (SV40) (PELKMANS et al., 2001), sowie Clathrin/Caveolae-unabhängige Wege über Makro- (500-2000 nm Durchmesser) und Mikro- pinosomen (95-100 nm Durchmesser) in das Blickfeld der Forschung gerückt (BISHOP, 1997; SIECZKARSKI und WHITTAKER, 2002). Bei den Caveolae handelt es sich um Inva- ginationen der Plasmamembran, die sich durch eine hohe Dichte u.a. an Glykosphingolipiden, Cholesterol, den namengebenden integralen Membranproteinen Caveolin 1 und 2 sowie Mo- lekülen der Signaltransduktion auszeichnen (PIKE et al., 2002). Zusammen mit den sog.
GEM (glycosphingolipid enriched membranes) und den PIP2 (phosphoinositol rich rafts) ge- hören sie zu den lipid rafts, denen Funktionen im Bereich des Cholesteroltransports, der En- dozytose und der Signaltransduktion zugeschrieben werden (SIMONS und VAN MEER, 1988; SIMONS und IKONEN, 1997). Es gibt jedoch auch Untersuchungen, die darauf hin- weisen, dass Caveolae eher starre Strukturen sind, die zumindest nicht konstitutiv der Endo- zytose dienen (THOMPSEN et al., 2002). Bei der Makropinozytose scheint es sich um einen Mechanismus der Internalisierung zu handeln, der auch Rezeptor-unabhängig ablaufen kann (SIECZKARSKI und WHITTAKER; 2002). Die genauen Mechanismen sind noch weitge- hend ungeklärt; das Virus scheint eine Signalwirkung auf die Zelle zu haben, welche die In- ternalisierung induziert. Für Adenoviren konnte gezeigt werden, dass es sich dabei vermutlich um einen alternativen Weg der Infektion handelt (MEIER und GREBER, 2003).
Einen Sonderfall stellt die Aufnahme von Viruspartikeln durch antibody-dependent enhance- ment (ADE) dar. Dieser von HALSTEAD und O’ROURKE (1977) geprägte Begriff be-
schreibt die Antikörper-vermittelte Aufnahme von Viren über den Fc-Rezeptor. Entscheidend scheint dabei zu sein, dass die Antikörper nicht neutralisieren, bzw. in subneutralisierender Konzentration vorhanden sind (HALSTEAD, 1994; TIRADO und YOON, 2003). In vitro konnte ADE für zahlreiche Viren gezeigt werden, z.B. für Hantaviren (YAO et al., 1992), für das Caprine Arthritis-Enzephalitis Virus (JOLLY et al., 1989) und für das Feline infektiöse Peritonitis Virus (CORAPI et al., 1992).
2.3 Zelluläre Rezeptoren für das BVD-Virus
Es wurde bereits dargestellt, dass die frühen Phasen der Virusinfektion von besonderer Be- deutung für das Verständnis der Pathogenese sind, und das Vorkommen von Rezeptoren aus- schlaggebend für den Tropismus eines Virus sein kann. Für Pestiviren allgemein ist bisher re- lativ wenig über die Mechanismen des Eintritts und die darin involvierten zellulären wie auch viralen Faktoren bekannt.
Inzwischen wurde die langjährige Annahme, dass die Infektion der Zelle mit dem BVD-Virus als rezeptorvermittelte Endozytose abläuft, gefolgt von einem pH-abhängigen Schritt (FLORES und DONIS, 1995; FLORES et al., 1996), bestätigt. So konnte die Infektion durch verschiedene Endozytoseinhibitoren und Inhibitoren der endosomalen Ansäuerung geblockt werden (AGNELLO et al., 1999; KREY, 2004). Das Membranglykoprotein E2 von Pestiviren wurde darüberhinaus mittels computergestützter Proteom-Analyse den Klasse-II Fusionspro- teinen zugeordnet (GARRY und DASH, 2003), welche sich dadurch auszeichnen, dass eine für die Fusion notwendige Konformationsänderung nur unter sauren Bedingungen ablaufen kann (HEINZ et al., 1994; STIASNY et al., 2003). Die Tatsache, dass eine dominant-negative Dynamin-Mutante nicht infizierbar war, spricht zudem für die Beteiligung von clathrin- coated pits (KREY, 2004).
Dass ein von BVD-Viren genutzter Rezeptor Proteincharakter besitzen muß, zeigten Untersu- chungen, denen zufolge zwar eine Proteinasebehandlung der Zellen, nicht jedoch die Behand- lung mit Phospholipasen, Glykosidasen oder Neuraminidase zu einer Reduktion der Infekti- onsrate führten (XUE et al., 1997). Mit Hilfe von anti-idiotypischen Antikörpern (anti-ids) wurde zunächst ein Protein von 50 kDa als möglicher zellulärer Rezeptor postuliert (XUE und MINOCHA, 1993). Unter der Annahme, dass das E2 als immundominantes Hüllglykoprotein
eine wichtige Rolle für attachment und/oder Penetration spielt (DONIS und DUBOVI, 1987) und vermutlich den rezeptorbindenden Liganden des BVD-Virus darstellt, wurden die anti-ids gegen für das E2-spezifische, neutralisierende Antikörper hergestellt. Die Paratope dieser an- ti-ids imitieren folglich die neutralisierten Epitope des E2, die potentiell die rezeptorbindende Region darstellen können und binden somit theoretisch an dieselben Zelloberflächenstruktu- ren wie das Virus (XUE et al., 1991). Dephosphorylierung und Deglykosylierung der Zellen hatten keinen Einfluß auf die Bindung der anti-ids, wodurch der Proteincharakter des mögli- chen Rezeptors bekräftigt wurde (MINOCHA et al., 1997).
Durch die anti-ids konnte eine Infektion von permissiven bovinen Zellen jedoch nur teilweise inhibiert werden. Bei den meisten Isolaten lag die Reduktion der Infektionsrate zwischen 30 und 60 %. Bei Isolaten, die nur in geringem Maße mit den neutralisierenden Antikörpern, ge- gen welche die anti-ids gerichtet waren, reagierten, lag die Inhibition sogar unter 20 % (XUE und MINOCHA, 1993). Daher wurde vermutet, dass diese Isolate entweder mit anderen Re- zeptoren, zumindest aber mit anderen Rezeptordeterminanten interagieren. Untersuchungen zur Verteilung des mutmaßlichen Rezeptors in vivo ergaben in Rinderfeten eine starke Ex- pression für Enterozyten, kortikale Tubulusepithelien der Niere, das respiratorische Epithel der Trachea und der Ösophagusmukosa. Hingegen war das Protein in Kleinhirn, Thymus, Milz, Leber, Großhirn und Lunge nur in geringen Mengen und in Herzgewebe gar nicht nachweisbar (ZHENG et al., 1998). Andereseits exprimierten aber auch diverse Affenzellli- nien das 50 kDa Protein ohne permissiv für das BVD-Virus zu sein (XUE und MINOCHA, 1996). Die Schlußfolgerung dieser Untersuchungen war, dass neben dem 50 kDa-Protein wahrscheinlich auch noch andere (Ko-) Rezeptoren für das BVD-Virus existieren.
Des weiteren wurde auch für BVD-Viren zumindest in vitro die Möglichkeit des Eintritts mit- tels ADE beschrieben. Dabei wurden Antikörper-opsonisierte Virionen über den Fc-Rezeptor internalisiert (FLORES et al., 2002).
Hinweise auf eine Beteiligung des Low density lipoprotein Rezeptors (LDLR) lieferten Unter- suchungen zur rezeptorvermittelten Endozytose bei HCV, wobei auch Experimente mit dem verwandten BVD-Virus durchgeführt wurden. Bei einer normalerweise nicht-permissiven, humanen Zelllinie, die nach Haltung in mit BVD-Virus kontaminiertem Rinderserum positiv in der Immunfluoreszenz und in der PCR (polymerase chain reaction, Polymerase- Kettenreaktion) reagierte, konnte mit einem gegen den LDLR gerichteten monoklonalen An-
tikörper eine vollständige Infektionshemmung erreicht werden. Für eine Beteiligung des LDLR sprach auch die Abwesenheit von LDLR auf der Oberfläche von sog. „cells restistant to BVD-virus infection“ (CRIB-Zellen), einer MDBK (Madin Darby bovine kidney) – Mutante, die mit Pestiviren nicht infizierbar ist (FLORES und DONIS, 1995). Bei einer per- missiven bovinen Zelllinie hatte die Inkubation mit einem anti-LDLR-mAk allerdings ledig- lich einen verzögerten zytopathogenen Effekt (ZPE) zur Folge. Hieraus wurde gefolgert, dass es sich bei dem LDLR um einen wesentlichen, nicht aber um den ausschließlichen Rezeptor handelt (AGNELLO et al., 2000).
Darüberhinaus gibt es Untersuchungen zur Bindung sowohl von BVD-Viren (IQBAL et al., 2000; IQBAL und MCCAULEY, 2002) als auch von CSFV (HULST et al., 2000) an GAGs.
Für das CSFV wurde die Bindung als eine unspezifische elektrostatische Interaktion zwischen den negativ geladenen Sulfatgruppen des HS mit positiv geladenen Aminosäureresten des Hüllglykoproteins Erns beschrieben, die erst infolge Selektion HS-bindender Varianten durch Zellkulturpassage auftritt (HULST et al., 2000). Hingegen konnte für die Aminosäuresequenz des BVD-Virus Erns ein hoch-konserviertes Heparin-Bindungsmotiv nachgewiesen werden (IQBAL und McCAULEY, 2002). Außer Frage steht jedoch, dass der von Erns vermittelten Bindung an HS eine spezifische Interaktion folgt, an welcher E2 beteiligt ist (HULST und MOORMANN, 1997; IQBAL et al., 2000; HULST et al., 2000). E2 wird dabei auch die Schlüsselrolle für den viral determinierten Zelltropismus zugeschrieben (LIANG et al., 2003).
Einen ersten Hinweis auf einen weiteren möglichen Rezeptor des BVD-Virus lieferten die Untersuchungen mit drei monoklonalen Antikörpern (mAk) BVD/CA17, BVD/CA26 und BVD/CA27, welche die Infektion mit verschiedenen BVD-Virusisolaten spezifisch und kon- zentrationsabhängig inhibierten (MOENNIG et al., 1988; SCHELP et al., 1995). Die Charak- terisierung der von den Antikörpern präzipitierten Proteine von ca. 60 und 93 kDa (SCHELP et al., 2000) mündete schließlich in ihrer Identifizierung als bovines Homolog des CD46 (boCD46) (MAURER et al., 2004).
Das humane CD46 (hCD46) wurde bereits als zellulärer Rezeptor für das humane Herpesvi- rus 6 (HHV-6) (SANTORO et al., 1999), für das Adenovirus 11, Spezies B (SEGERMAN et al., 2003) und den bereits beschriebenen MV Laborstamm Edmonston (DÖRIG et al., 1993;
NANICHE et al., 1995) identifiziert. CD46 ist gut charakterisiert und wird auch als membra- ne cofactor protein (MCP) bezeichnet. In seiner Funktion als Regulator der Komplementakti-
vierung bindet es die aktivierten Komplementkomponenten C3b und C4b, wodurch die Zelle vor einer überschießenden autologen Komplementreaktion geschützt wird (LISZEWSKI und ATKINSON, 1992). Als Typ I-Membranprotein besitzt CD46 eine hydrophobe Trans- membranregion, welche eine kurze C-terminale Zytoplasmadomäne mit dem N-terminalen extrazellulären Teil verbindet. Dieser besteht aus vier SCR (short consensus repeat)- Domänen, jeweils 60-70 Aminosäuren lang (REID et al., 1986), die jeweils vier hoch konser- vierte Cysteine und ein ebenso konserviertes Tryptophan enthalten (HOURCADE et al., 1989), einer Serin-, Threonin- und Prolin-reichen Domäne (STP-Domäne) und einer kurzen Region mit unbekannter Funktion (U-Region). Entsprechend ihrer Funktion werden die SCR- Domänen auch als CCP (complement control protein) –Module bezeichnet (LISZEWSKI et al., 2001). Das heterogene Erscheinungsbild von CD46 nach elektrophoretischer Auftrennung ist auf die gleichzeitige Expression verschiedener Isoformen zurückzuführen. Diese resultie- ren aus der variablen Transkription verschiedener Exons in der STP-Region, verbunden mit der Wahl einer von drei verschiedenen zytoplasmatischen Domänen (Cyt1, Cyt2 und Cyt3) (POST et al., 1991; PURCELL et al., 1991; RUSSEL et al., 1992). Der Größenunterschied der einzelnen Banden beruht auf der extensiven O-Glykosylierung im Bereich der STP- Region (LISZEWSKI und ATKINSON, 1992). Auf bovinen FKN (Fetale Kälbernieren) - Zellen (SCHELP et al., 1995), MDBK-Zellen, sowie in zahlreichen Organen (MAURER, 2002) bestand boCD46 aus zwei sehr breiten, unscharfen Proteinbanden von ca. 50-58 und ca.
80-93 kDa, welche die unterschiedlichen Isoformen darstellen (POST et al., 1991; MAURER et al., 2004). Die Rezeptorfunktion für das BVD-Virus wurde untermauert durch den Nach- weis, dass radioaktiv markiertes Virus an SK6 (swine kidney) -Zellen, die stabil mit einem das boCD46-Gen enthaltenden Vektor transfiziert waren, im Vergleich zu den parentalen SK6- Zellen mit einer um das drei- bis vierfache höheren Effizienz binden konnte. Gleichzeitig wiesen die boCD46 exprimierenden Zellen eine Steigerung der Empfänglichkeit für das BVD-Virus um das 50-100-fache auf (HIMMELREICH, 2003).
Allerdings existieren Hinweise darauf, dass boCD46 wahrscheinlich nicht den einzigen Re- zeptor für das BVD-Virus darstellt. Zum einen war auch nach Behandlung von FKN-Zellen mit hohen Konzentrationen der gegen boCD46 gerichteten mAk stets eine geringe Restinfek- tiosität beobachtet worden. Die heterologe Expression des boCD46 auf porzinen PK(15)- Zellen (porcine kidney), die durch eine ca. 100-fach geringere Empfänglichkeit für das BVD- Virus gekennzeichnet sind, hatte lediglich eine Steigerung der Infektionsrate um das 90-fache zur Folge. Diese Steigerung ließ sich wieder mit den gegen boCD46 gerichteten Antikörpern
hemmen (MAURER et al., 2004). Die Restinfektiosität in MDBK-Zellen und die geringe Ba- salinfektiosität in PK(15)-Zellen könnten ein Hinweis auf einen von diesen Zellen exprimier- ten alternativen Rezeptor sein. Weitere Untersuchungen des Zelleintritts über boCD46 zeig- ten, dass nicht-permissive, aber mit viraler RNA transfizierbare (d.h. die intrazellulären Be- dingungen für die Replikation waren gegeben), Zelllinien verschiedener Spezies, u.a. BHK- (baby hamster kidney), HeLa- (humanes Zervixkarzinom) und Vero-Zellen (Grüne Meerkat- ze) auch nach stabiler Expression des boCD46 nicht für das BVD-Virus empfänglich wurden.
Für diese transfizierten Zellen konnte lediglich eine Adsorption von 3H-markiertem BVD- Virus an die Zellen nachgewiesen werden, die sich durch Präinkubation mit den mAk BVD/CA17, BVD/CA26 und BVD/CA27 inhibieren ließ (MAURER et al., 2004). Diese Er- gebnisse weisen darauf hin, dass auch dort, wo boCD46 als Rezeptor fungiert, wahrscheinlich noch weitere (Ko-) Faktoren vorhanden sein müssen.
3 Material und Methoden
3.1 Material 3.1.1 Zelllinien
Für die Durchführung der Versuche wurden insgesamt neun Zelllinien boviner sowie eine Zelllinie porziner Herkunft verwendet (Tabelle 2):
Tabelle 2: In dieser Arbeit verwendete Zellinien
Zelllinie Spezies Herkunft Zelltyp Kata-
log-Nr.
FKN Rind Niere, Fetus
primäre Zellkultur;
frühe Passagen epitheloide Anteile;
ab 7. Passage überwiegend fi- broblastoide Zellen (GRUMMER, 2000)
/
PT* Rind Niere, Kalb permanente Zelllinie;
epitheloid RIE 11
KLU-R1* Rind Lunge, Embryo bis zur 80.-90. Passage;
fibroblastoid RIE 091
KOP-R* Rind Oesopharynx- gewebe, Kalb
Lebensdauer unbekannt;
epitheloid-polymorph,
späte Passagen fibroblastoid RIE 244
TEK* Rind Thymus, Embryo permanente Zelllinie;
epitheloid RIE 63
KTR-R* Rind Trachealschleimhaut,
Fetus bis zur 60.-70. Passage
fibroblastoid RIE 060
KH-R* Rind Herz, Embryo bis zur 70.-80. Passage
fibroblastoid RIE 090
KHO Rind Hoden, Kalb primärnah
fibroblastoid RIE 11
KMU-R* Rind Muskulatur, Embryo Lebensende 60.-70. Passage
fibroblastoid RIE 098
PK(15)A Schwein Niere, Adult
permanente Zelllinie;
(Klon von PK(15), ATCC**- Nr. CCL-33)
epitheloid
/
* die Zellen wurden von der Zellbank für Zelllinien in der Veterinärmedizin (ZBV) der Bundesfor- schungsanstalt (BFA) für Viruskrankheiten der Tiere, Insel Riems von Dr. R. Riebe bezogen. Die An- gaben zu den Zelllinien sind den Linienpässen entnommen.
** American Type Culture Collection
Fetale Kälbernieren-Zellen (FKN-Zellen)
Die Primärkultur aus fetalen Kälbernieren wurde am Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover nach Standardmethoden hergestellt (FREY und LIESS, 1971) und bei –80 °C kryokonserviert. Während in frühen Passagen neben fibroblastoid wachsenden Zellen auch Inseln mit epitheloider Morphologie zu beobachten sind, dominieren mit zunehmender Subkultivierung fibroblastoide Zellen (GRUMMER, 2000). Im Rahmen dieser Arbeit fanden die für das BVD-Virus permissiven FKN-Zellen der zweiten bis max. vierten Passage Ver- wendung für die Virusvermehrung, die Charakterisierung der BVD-Virusstämme und – isolate, sowie Zellen der zweiten bis dritten Passage in der Durchflusszytometrie und bei den Inhibitionsstudien.
PK(15)A
Die permanente epitheloide porzine Nierenzelllinie wurde 1974 durch Einzelzellklonierung gewonnen und wird im Europäischen Referenzlabor für Klassische Schweinepest, Tierärztli- che Hochschule Hannover, als Referenzzelllinie in der Schweinepest-Diagnostik und CSFV- Vermehrung eingesetzt. Die Zellen weisen eine etwa 10 bis 100-fach geringere Permissivität für Infektionen mit dem BVD-Virus auf als FKN-Zellen (GREISER-WILKE, 2001).
PT (RIE 11)
Die permanente Zelllinie wurde aus einer Kälberniere angezüchtet. Die Zellen weisen eine epitheloide Morphologie auf und sind für das BVD-Virus permissiv.
KLU-R1, KOP-R, TEK, KTR-R, KH-R, KHO, KMU-R
Die bovinen Zelllinien wurden von der Zellbank für Zelllinien in der Veterinärmedizin (ZBV) der Bundesforschungsanstalt (BFA) für Viruskrankheiten der Tiere, Insel Riems, bezogen. Sie wurden über Explantatkultur (KTR-R, KMU-R) oder (fraktionierte) Trypsinierung (KLU-R1, KOP-R, KH-R, KHO) gewonnen (RIEBE, Zelllinienpässe).
3.1.2 Bovine Leukozyten
Das Rinderblut, aus dem die Gewinnung der Leukozytenfraktion erfolgte, wurde vom Schlachthof Gleidingen (Vosding GmbH), zur Verfügung gestellt. Es stammt von sieben Jungbullen (< 2 Jahre) und war auf das Freisein von BVD-Virus und -Antikörpern getestet worden. Die bovinen Leukozyten wurden in der Durchflusszytometrie, der Westernblot- Analyse und für die präparative Isolierung des möglichen Rezeptors in der Immunaffinitäts- chromatographie verwendet.
3.1.3 Viren
Die verwendeten BVD-Virusstämme und -isolate wurden aufgrund ihrer unterschiedlichen Anzahl an Zellkulturpassagen und der damit verbundenen möglichen Adaptation (SA- CARVALHO et al., 1997; BARANOWSKI et al., 2001), unabhängig von ihrer Spezieszuge- hörigkeit in drei Gruppen eingeteilt: „Laborstämme“ (Tabelle 3), mehrfach passagierte Isolate (Tabelle 4) und Feldisolate (Tabelle 5). Als reine Laborstämme wurden dabei die BVD-Viren 7443, Auburn und TGAN bezeichnet, die 1989 vom NADC (National Animal Disease Cen- ter), Ames, Iowa, bezogen worden waren und seitdem sowohl in MDBK- als auch in FKN- Zellen mindestens 20 Mal subkultiviert wurden. Die Feldisolate hingegen stammen aus den Jahren 2000 bis 2002 und wurden nach der Anzucht aus Organmaterial nur weitere ein- bis zwei Mal passagiert. Die Isolate 61/120/01, 61/152/01 und 339/3/01 wurden aus Rinderfeten, 13411/00 aus einem Kalb und Tru20 und 8901/01 aus adulten Rindern isoliert und stammen aus der Diagnostik des Instituts für Virologie, Tierärztliche Hochschule Hannover. Die mehr- fach passagierten Isolate 5569 und 104/98 nehmen eine Zwischenstellung bezüglich der Häu-
figkeit der Passagierung in Zellkultur ein. Es handelt sich hierbei um Feldisolate, die bereits sechs bis acht Mal in Zellkultur subkultiviert wurden. Unter den untersuchten BVD-Viren be- fanden sich Vertreter beider Spezies, die alle dem nzp Biotyp angehören.
Tabelle 3: Laborstämme
Stamm Spezies Biotyp Herkunft/Referenz Passage 7443 BVD-Virus 1 nzp
NADC, Ames/Iowa, USA
BOLIN et al., 1985 unbekannt TGAN BVD-Virus 1 nzp NADC, Ames/Iowa,
USA
RIDPATH et al., 1991
unbekannt
Auburn BVD-Virus 1 nzp
NADC, Ames/Iowa, USA
GUTEKUNST und MALMQUIST, 1963
unbekannt
Tabelle 4: mehrfach passagierte Feldisolate
Isolat Spezies Biotyp Referenz Passage
104/98 BVD-Virus 2 nzp TAJIMA et al., 2001 5.-6.
5569 BVD-Virus 1 nzp ? 5.-6.
Tabelle 5: Feldisolate
Isolat Spezies Biotyp Herkunft Jahr Passage
61/152/01 BVD-Virus 1 nzp Rinderfetus
Niedersachsen 2001 3.
61/120/01 BVD-Virus 2 nzp Rinderfetus,
Niedersachsen 2001 3.
339/3/01 BVD-Virus 2 nzp Rinderfetus,
Niedersachsen 2001 3.
13411/00 BVD-Virus 2 nzp Kalb,
Niedersachsen 2000 3.
8902/00 BVD-Virus 2 nzp Rind,
Niedersachsen 2000 3.
Tru 20 BVD-Virus 1 nzp Rind,
Niedersachsen 2002 3.
3.1.4 Antikörper, Antiseren und Konjugate
3.1.4.1 Antikörper des Third International Workshop on Ruminant Leukocyte Antigens Für die Bindungs- und Inhibitionsstudien wurden die monoklonalen Antikörper des Third In- ternational Workshop on Ruminant Leukocyte Antigens (1996), im folgenden 3W-mAk ge- nannt, eingesetzt. Diese teils als Aszites, teils als Zellkulturüberstand vorliegenden Antikörper stammen aus verschiedenen Labors weltweit und wurden im Rahmen des Third International Workshop untersucht. Dadurch konnten bereits zahlreiche Antikörper aufgrund ihrer Homo- logie zu humanen CD (Cluster of differentiation) -Antigenen den entsprechenden bovinen CD-Antigenen (boCD) zugeordnet werden. Voraussetzung für eine derartige Gleichsetzung ist, dass die Antikörper entweder eine Interspezies-Kreuzreaktivität zeigen, eine Sequenzho- mologie zwischen den Antigenen besteht oder die Antigene eine Übereinstimmung spezifi- scher oder charakteristischer, funktionaler und biochemischer Eigenschaften aufweisen (NAESSENS et al., 1997). Darüberhinaus wurden Antikörper, für die eine derartige Zuord- nung nicht möglich war, in sog. Workshop cluster (WC) eingeteilt. Diese werden anhand ei- ner statistischen Auswertung durchflusszytometrischer Daten (Cluster-Analyse) ermittelt, wobei die Antikörper zunächst in provisorische Cluster zusammengefasst werden, die nur für die Dauer des Workshops gültig sind (SOPP, 1996). Die endgültige Zuordnung zu einem WC erfolgt, wenn zusätzlich eine der folgenden Bedingungen erfüllt ist: a) die mAk präzipitieren Proteine mit der gleichen Molmasse, b) die mAk inhibieren einander oder c) die mAk binden an eine mit demselben Gen transfizierten Zelllinie (NAESSENS, 1993; NAESSENS und HOPKINS, 1996). Eine Übersicht der Antikörper, deren Antigene bisher zu CDs und WCs zugeordnet werden konnten, geben NAESSENS et al. (1997). Für den Workshop war jedem Antikörper zur Vereinfachung neben der Abkürzung „3W“ für Third Workshop eine fortlau- fende Nummer zugeteilt worden. Im Anhang unter 9.10 sind die Bezeichnungen der 3W-mAk aufgeführt.
3.1.4.2 Sonstige Antikörper
Eine Übersicht über die weiteren, in dieser Arbeit verwendeten monoklonalen Antikörper, Antiseren und Konjugate gibt Tabelle 6. Die Artikelnummern der kommerziell erhältlichen Antikörper sind im Anhang unter 9.4 genannt.
