Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchungen zum Invasions- und Kolonisationsverhalten von
Campylobacter-jejuni- und Campylobacter-coli-Stämmen unterschiedlicher Herkunft beim Göttinger Minipig
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Gesche Nommensen
Köln
Hannover 2014
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Karl-Heinz Waldmann
Klinik für kleine Klauentiere, forensische Medizin und Ambulatorische Klinik, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Karl-Heinz Waldmann
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Peter Valentin-Weigand
Tag der mündlichen Prüfung: 22. Mai 2014
Meinem Vater Dr. Ove Nommensen
„Man braucht nichts im Leben zu fürchten, man muss nur alles verstehen.“
Marie Curie
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 13
2 LITERATUR 14
2.1 Historie von Campylobacter spp. 14
2.2 Eigenschaften von Campylobacter spp. 16
2.2.1 Taxonomie und Bedeutung 16
2.2.2 Bakterienmorphologie 17
2.2.3 Koloniemorphologie 17
2.2.4 Wachstumsbedingungen 18
2.2.5 Tenazität 18
2.2.6 Stoffwechsel 19
2.2.7 Anzucht 20
2.2.8 Differenzierung 21
2.2.8.1 Phänotypische Differenzierung 22
2.2.8.2 Genotypische Differenzierung 23
2.2.8.2.1 Amplified-Fragment-Length-Polymorphism (AFLP) 24
2.2.8.2.2 Multi-Locus-Sequence-Typing (MLST) 25
2.2.9 Genetische Diversität 27
2.2.10 Empfindlichkeit gegenüber antibakteriellen Substanzen 29
2.3 Pathogenese und Pathologie der Campylobacteriose 32
2.3.1 Pathogenitätsfaktoren 32
2.3.1.1 Motilität und Chemotaxis 33
2.3.1.2 Adhäsion 33
2.3.1.3 Invasion 34
2.3.1.4 Toxine 35
2.4 Verteilung, Kolonisation- und Ausscheidung von Campylobacter spp. 36
2.4.1 Kolonisation des Magen-Darm-Traktes 36
2.4.2 Dissemination im Wirt 39
2.4.3 Ausscheidung mit den Fäzes 40
INHALTSVERZEICHNIS
2.5 Reservoire und Übertragungswege von Campylobacter spp. 41
2.6 Vorkommen von Campylobacter spp. beim Schwein 43
2.7 Vorkommen von Campylobacter spp. beim Menschen 44
2.7.1 Klinische Manifestation beim Menschen 44
2.7.2 Pathologie der Campylobacter-Enteritis des Menschen 45 2.7.3 Alter- und Geschlechterverteilung, Saisonalität 46
2.8 Wirtsassoziation von Campylobacter spp. 47
2.9 Koexistenz verschiedener Campylobacter-Arten und -Stämme im Wirt 49
2.10 In-vivo- und In-vitro-Infektionsmodelle 51
3 MATERIAL UND METHODEN 53
3.1 Methodenübersicht 53
3.2 Versuchstiere 54
3.2.1 Tierauswahl 54
3.2.2 Haltung 54
3.3 Bakterienstämme 55
3.3.1 Herkunft und Eigenschaften 55
3.3.2 Differenzierung 56
3.3.3 Nährmedien und Anzucht 57
3.3.4 Keimzahlbestimmung 58
3.3.5 Anzucht von antibiotikaresistenten Mutanten-Stämmen 59
3.3.6 Herstellung der Infektionssuspension 61
3.4 Versuchsaufbau 62
3.4.1 Versuchsgruppen und Infektionsschema 62
3.4.2 Untersuchungssabläufe 63
3.4.2.1 Untersuchung der Tiere während der Aufstallungszeit 64
3.4.2.1.1 Allgemeinuntersuchung 64
3.4.2.1.2 Kotprobenentnahme 64
3.4.2.1.3 Blutuntersuchung 64
3.4.2.2 Untersuchung bei der Sektion 66
3.4.3 Mikrobiologische Untersuchung 67
INHALTSVERZEICHNIS
3.4.3.1 Quantitative Methode 67
3.4.3.2 Semiquantitative Methode 68
3.4.3.3 Auswertung der Ergebnisse 68
3.4.3.4 Qualitativer Nachweis von Campylobacter spp. in den Organen 70
3.4.3.5 Reisolierung der Stämme 70
3.5 Histologische Untersuchung 71
3.6 Genotypische Differenzierung ausgewählter Isolate mittels fAFLP 73
3.6.1 DNA-Extraktion 74
3.6.2 Fluorescent Amplified Fragment Length Polymorphism 74
3.6.2.1 Restriktion der DNA 74
3.6.2.2 Ligation der Adapter 75
3.6.2.3 Präselektive PCR 76
3.6.2.4 Selektive PCR 76
3.6.2.5 Auswertung 77
3.7 Gentamicin-Protection-Assay 79
3.7.1 Vorbereitung der T84-Zellen 80
3.7.2 Vorbereitung der Campylobacter-Stämme 80
3.7.3 Invasion in T84-Zellen 82
3.8 Swarm-Plate-Assay 83
4 ERGEBNISSE 84
4.1 Ergebnisse der klinischen Untersuchung 84
4.1.1 Allgemeinuntersuchung 84
4.1.2 Blutwerte 84
4.2 Ergebnisse der pathologisch-anatomischen Untersuchung 85 4.3 Ergebnisse der pathologisch-histologischen Untersuchung 85
4.4 Ergebnisse der Untersuchung des Raumklimas 85
4.5 Resistenz und Mutationsrate der Campylobacter-Stämme 86
4.6 Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchung 87
4.6.1 Quantitativer und semiquantitativer Nachweis im Kot 87
4.6.1.1 Gruppe 1 – C. coli ST-854 (Monoinfektion) 88
INHALTSVERZEICHNIS
4.6.1.2 Gruppe 2 – C. coli ST-5777 (Monoinfektion) 90 4.6.1.3 Gruppe 3 – C. jejuni ST-122 (Monoinfektion) 92 4.6.1.4 Gruppe 4 – C. coli ST-5777 und C. jejuni ST-122 (Koinfektion) 94 4.6.1.5 Gruppe 5 – C. jejuni ST-122 und C. coli ST-5777 (Koinfektion) 96 4.6.1.6 Gruppe 6 – C. lanienae (natürlicher Besiedlung) 98 4.6.2 Quantitativer und semiquantitativer Nachweis in der Ingesta 100 4.6.2.1 Gruppe 1 – C. coli ST-854 (Monoinfektion) 100 4.6.2.2 Gruppe 2 – C. coli ST-5777 (Monoinfektion) 102 4.6.2.3 Gruppe 3 – C. jejuni ST-122 (Monoinfektion) 104 4.6.2.4 Gruppe 4 – C. coli ST-5777 und C. jejuni ST-122 (Koinfektion) 106 4.6.2.5 Gruppe 5 – C. jejuni ST-122 und C. coli ST-5777 (Koinfektion) 108 4.6.2.6 Gruppe 6 – C. lanienae (natürlicher Besiedlung) 110 4.6.3 Vergleichende Evaluation der quantitativen und semiquantitativen Methode 112
4.6.4 Qualitativer Nachweis in den Organen 113
4.7 Ergebnisse der Analyse der Infektionsstämme mittels fAFLP 115 4.8 Invasionsrate der Infektionsstämme und C. lanienae in T-84-Zellen 117
4.9 Motilität der Infektionsstämme sowie C. lanienae 118
5 DISKUSSION 119
5.1 Infektionsversuch mit Campylobacter spp. am Göttinger Minipig als Tiermodell 120 5.2 In-vivo-Kolonisations- und In-vitro-Invasionsverhalten von C. lanienae 122 5.3 In-vivo-Kolonisationsverhalten der Infektionsstämme 125 5.3.1 In-vivo-Kolonisationsverhalten des porzinen C.-coli-Stammes ST-854 125 5.3.2 In-vivo-Kolonisationsverhalten des aviären C.-coli-Stammes ST-5777 127 5.3.3 In-vivo-Kolonisationsverhalten des aviären C.-jejuni-Stammes ST-122 128 5.3.4 Koinfektion mit C. coli ST-5777 und C. jejuni ST-122 129 5.4 Verteilung der Infektionsstämme in den Intestinalsegmenten 133 5.5 Einfluss der Infektionsdosis auf das Kolonisationsverhalten 135 5.6 Genetische Stabilität von C. coli ST-5777 und C. jejuni ST-122 136 5.7 Vergleichende Evaluation der quantitativen und semiquantitativen Methode 137
5.8 In-vitro-Invasionsverhalten der Infektionsstämme 139
INHALTSVERZEICHNIS
6 ZUSAMMENFASSUNG 142
7 SUMMARY 145
8 LITERATURVERZEICHNIS 147
9 ANHANG 189
9.1 Zusammensetzung und Herstellung der verwendeten Nährmedien 189 9.2 Ergebnisse der quantitativen und semiquantitativen Methode 196
9.3 Ergebnisse der Blutwertanalyse 198
9.4 Ergebnisse der Untersuchung der Rektaltemperatur 201
9.5 Ergebnisse der Untersuchung des Raumklima 202
9.6 Ergebnisse der ermittelten Körpergewichte 203
9.7 Zusammensetzung des Futtermittels 203
ABKÜRZUNGEN
ABKÜRZUNGEN
AB Antibiotikum
ABC ATP Binding Cassette
APH Aminoglykosid-Phospohotransferase ANT Aminoglykosid-Adenyltransferase
aspA aspartase A
Ca Calcium
CC Klonaler Komplex (Clonal Complex) CCDA Cefalozin Charcoal Deoxycholate Agar Cia Campylobacter invasion antigen
mCCDA modified Cefoperazon Charcoal Deoxycholate Agar CDT Cytolethal Distending Toxin
CFP Charcoal, Ferrous salts, sodium Pyruvate CSM Charcoal based Selective Medium
ECDC European Centre for Disease Prevention and Control EFSA European Food Safety Authority
(f)AFLP (fluorescent) Amplified-Fragment-Length-Polymorphism
GGT Gamma-Glutamyl-Transferase
glnA glutamine synthetase gltA citrate synthase
glyA serine hydroxyl methyl transferase
HE Hämatoxylin-Eosin-Färbung
KbE Kolonie bildende Einheit LOS Lipooligosaccharide
LPS Lipopolysaccharide
ME metabolische Energie
MLEE Multi-Locus-Enzyme-Electrophoresis MLST Multi-Locus-Sequence-Typing
Na Natrium
OD Optische Dichte
ABKÜRZUNGEN
OMP Outer Membrane Protein p. inf. post infectionem
PFGE Pulsed-Field-Gel-Electrophoresis
pgm phospho glucomutase
P Phosphor
RAPD Random-Amplified-Polymorphic-DNA
Rfa Rohfaser
RFLP Restriction-Fragment-Length-Polymorphism
RP Rohprotein
RTQ-PCR Real-Time-Quantitative-PCR
spp. Spezies (Pl.)
subsp. Subspezies
ST Sequenztypen (Sequence Type)
tkt transketolase
uncA ATP synthase alpha subunit
EINLEITUNG
13
1 EINLEITUNG
Campylobacter (C.) spp. gehören zu den bedeutendsten Verursachern bakterieller Enteritiden des Menschen. Mit fast 200.000 gemeldeten Campylobacteriose-Fällen im Jahre 2009 ist sie die am häufigsten gemeldete Zoonose in der EU. Die Hauptverursacher der Campylobacteriose des Menschen sind die thermophilen Spezies C. jejuni, C. coli und C. lari.
Sie leben vor allem als Kommensalen im Intestinaltrakt von Tieren und können so über Lebensmittel tierischen Ursprungs auf den Menschen übertragen werden (EFSA u. ECDC 2011). Obwohl Campylobacter spp. als bedeutende Zoonoseerreger schon lange bekannt sind, bleiben viele Fragen bezüglich der Wirtsadaptation, Pathogenese und des Kolonisationsvermögens offen. So zeigen einige Stämme ein hohes Kolonisationspotenzial bei einer Vielzahl von Wirten, andere hingegen scheinen selektiver an Wirte adaptiert zu sein (COLLES et al. 2003; GRIPP et al. 2011). Tiere sind in der Regel symptomlose Träger, wohingegen eine Infektion des Menschen meist zu einer Erkrankung führt. Als Ursache wird ein komplexes Zusammenspiel von Wirts- und Bakterienfaktoren vermutet, wobei diesbezügliche Forschungen durch die hohe genetische Vielfalt von Campylobacter spp.
erheblich erschwert werden (HAVELAAR et al. 2009; DASTI et al. 2010; GRIPP et al.
2011). Hierdurch werden auch epidemiologische Studien erschwert, weswegen für einen großen Anteil der Campylobacteriose-Fälle keine Ansteckungsquelle ausfindig gemacht werden kann (EFSA u. ECDC 2011). Studien über Kolonisationsverhalten, Wirtsadaptation sowie Pathogenität definierter Campylobacter-Stämme sind somit notwendig zur weiteren Erforschung dieser Spezies.
Im folgenden Versuch wurden Schweine mit humanmedizinisch relevanten C.-jejuni- und C.- coli-Stämmen unterschiedlicher Herkunft infiziert. Ziel war es, das Kolonisationsverhalten der einzelnen Stämme sowie eine mögliche Wechselwirkung bei der Besiedlung zu analysieren. Des Weiteren sollte untersucht werden, inwieweit es nach der Passage durch das Schwein zu einer genetischen Veränderung der Stämme kommt. Um die Pathogenität der Stämme zu untersuchen, wurden ihre Motilität und ihre Invasionsfähigkeit in humane Epithelzellen bestimmt.
LITERATUR
14
2 LITERATUR
2.1 Historie von Campylobacter spp.
Bereits 1886 wurden spiralförmige, nicht kultivierbare Bakterien im Zusammenhang mit Darmerkrankungen bei Kindern und Katzen entdeckt und als Vibrio felinus beschrieben (ESCHERICH 1886). Aufgrund der Beschreibung des Erregers wird davon ausgegangen, dass es sich hierbei um die uns heute bekannte Gattung Campylobacter gehandelt hat (KIST 1986).
1906 wurde ebenfalls ein Vibrio-ähnlicher Organismus aus einem abortierten Schaffetus isoliert und beschrieben (MCFADYEAN 1913), wobei es sich mit hoher Wahrscheinlichkeit um die Gattung C. fetus subsp. fetus handelte (SKIRROW 2006).
Abgesehen von der Arbeit von ESCHERICH (1886), der Campylobacter bereits mit Durchfallerkrankungen assoziierte, konzentrierten sich die meisten frühen Arbeiten auf das Vorkommen von Aborten, die durch C. fetus ausgelöst worden waren. Dies lag vorwiegend daran, dass Campylobacter spp. bei Isolation aus den Fäzes und mit Standardanzucht auf Agar durch andere darmbesiedelnde Keime überwuchert wurden (BUTZLER et al. 1973;
SKIRROW 1977). So war ein sicherer, routinierter Nachweis lange nicht möglich, und Forschungen über Campylobacter als Darmerreger unterblieben zunächst.
Die Isolierung eines darmassoziierten Vibrios gelang jedoch 1931 aus tiefen Mukosaschichten des Dünndarms von Kühen und Kälbern, der den Namen Vibrio jejuni erhielt (JONES et al.
1931). 1943 erfolgte die Isolierung eines Vibrios aus der Mukosa des Kolons eines Schweines, das an Dysenterie erkrankt war (DOYLE 1944); für ihn wurde der Name Vibrio coli vorgeschlagen (DOYLE 1948). 1946 wurde dann erstmals ein Zusammenhang zwischen dem bei Rindern gefundenen V. jejuni und Durchfallerkrankungen beim Menschen vermutet. Untersuchungen eines akuten Ausbruchs in der Bevölkerung und die Entdeckung von Erregern in Blut und Fäzes durch Direktausstrich, die große Ähnlichkeit zu dem bei Rindern beschriebenen V. jejuni zeigten, legten diesen Zusammenhang nahe (LEVY 1946).
Die erste große Studie über mit Vibrios assoziierte Durchfallerkrankungen des Menschen wurde 1957 veröffentlicht (KING 1957). KING fand Bakterien im Blut von erkrankten
LITERATUR
15
Patienten, die sich vor allem durch eine hohe Wachstumstemperatur von anderen Vibrios unterschieden, und nannte diese vorübergehend „related-vibrios“. Es wird angenommen, dass es sich hierbei um die heute bekannten thermophilen Campylobacter spp. handelte (VÉRON u. CHATELAIN 1973).
Der Name Campylobacter und eine Abgrenzung zu den Vibrios wurden 1963 von SEBALD und VÉRON aufgrund eines geringen Cytosin- und Guanin-Gehaltes, eines nicht fermentativen Metabolismus und mikroaerophiler Wachstumsbedingungen vorgeschlagen. Es erfolgte die Umbenennung der ehemaligen V. jejuni und V. coli in C. jejuni und C. coli (SEBALD u. VERON 1963).
BUTZLER et al. gelang im Jahre 1973 erstmals die Kultivierung von Campylobacter-Isolaten aus menschlichen Stuhlproben. Diese erfolgte durch Verwendung eines Filtersystems, welches größere Bakterien von den kleineren Campylobacter trennte (DEKEYSER et al.
1972; BUTZLER et al. 1973). Dadurch wurde die Überwucherung von Campylobacter durch andere Darmkeime verhindert und der Weg für den Beweis der Campylobacter-assoziierten Enteritis beim Menschen geebnet (SKIRROW 1977). Durch weitere Optimierung in der Anzucht und Forschung konnte die Bedeutsamkeit des Bakteriums als Zoonoseerreger überhaupt erst festgestellt werden.
Heute ist bekannt, dass C. jejuni und C. coli zu den häufigsten zoonosebedingten Durchfallerregern beim Menschen gehören (EFSA u. ECDC 2011).
LITERATUR
16 2.2 Eigenschaften von Campylobacter spp.
2.2.1 Taxonomie und Bedeutung
VANDAMME et al. machten 1991 eine große phylogenetische Studie mit allen bis dahin bekannten Campylobacter spp. und möglichen Verwandten (VANDAMME et al. 1991).
Aufgrund phänotypischer und genotypischer Gemeinsamkeiten einiger der untersuchten Spezies kam es zu einer gemeinsamen Einordnung in die Familie der Campylobacteraceae (VANDAMME u. DE LEY 1991), für die 1994 Minimalstandards festgelegt wurden (URSING et al. 1994). Die Familie der Campylobacteraceae sind gramnegative, nicht saccharolytische mikroaerophile Bakterien mit einem geringen Cytosin- und Guanin-Gehalt.
Zu ihnen werden die Spezies Campylobacter, Arcobacter und Sulfurospirillum gezählt.
Campylobacter spp. kommen vorwiegend als Kommensale oder Krankheitserreger bei Menschen und Tieren vor. Nach heutigem Stand existieren 18 Campylobacter-Arten:
C. fetus, C. hyointestinalis, C. lanienae, C. sputorum, C. mucosalis, C. concisus, C. curvus, C. rectus, C. gracilis, C. showae, C. hominis, C. jejuni, C. coli, C. lari, C. insulaenigrae, C. canadensis, C. upsaliensis, C. helveticus (DEBRUYNE et al. 2008).
Die thermophilen Campylobacter spp., Verursacher der Campylobacteriose des Menschen, unterscheiden sich vor allem durch ihre hohe Wachstumstemperatur von anderen Campylobacter spp. Zu ihnen werden die Spezies C. jejuni, C. coli, C. lari, C. upsaliensis, C. helveticus und C. canadensis gezählt.
C. lanienae wurde erstmals im Jahre 2000 bei einer Routineuntersuchung aus Stuhlproben von gesunden Schlachthofmitarbeitern isoliert und besitzt eine verwandtschaftliche Nähe zu C. hyointestinalis und C. mucosalis. Eine Pathogenität für den Menschen ist bislang unbekannt (LOGAN et al. 2000).
LITERATUR
17 2.2.2 Bakterienmorphologie
Es handelt sich um spiral-, S-, V- oder kommaförmige, selten gerade, sporenlose Stäbchen (Abbildung 1), die sich unter dem Mikroskop in kurzen oder langen Ketten darstellen. Sie sind 0,2 bis 0,8 μm breit und 0,5 bis 5 μm lang, mono- oder bipolar begeißelt und zeigen eine typische korkenzieherartige Bewegung (SEBALD u. VERON 1963; VANDAMME u. DE LEY 1991; URSING et al. 1994). Werden Campylobacter spp. einem Milieu ausgesetzt, an das sie nicht adaptiert sind, z.B. bei Kontakt mit Luft, degenerieren sie zu kokkoiden Formen (KARMALI et al. 1981; JONES et al. 1991; CHAVEERACH et al. 2003).
Abb. 1: Elektronenmikroskopische Aufnahme von C.-jejuni-Zellen auf einem 0,65-µm- Membranfilter (aus ALTEKRUSE et al., 1999)
2.2.3 Koloniemorphologie
C. jejuni und C. coli wachsen auf Agar als kleine, flache bis schwach konvexe, glänzende, unregelmäßig abgegrenzte und oft schwärmende Kolonien. Nach 24 h Wachstum zeigen sie sich eher transparent, und nach weiterem Wachstum kommt es zu einer Vergrößerung der Kolonien, die eine dunkelgelbe Farbe annehmen. Ältere C.- jejuni-Kolonien können sich auch metallisch glänzend darstellen, was bei C. coli eher selten zu beobachten ist (SKIRROW u.
BENJAMIN 1980).
LITERATUR
18 2.2.4 Wachstumsbedingungen
Campylobacter spp. benötigen zum Wachstum eine mikroaerophile Atmosphäre mit einer optimalen Zusammensetzung aus 5 % O2, 10 % CO2 und 85 % N2 (SKIRROW 1977;
TANNER u. BULLIN 1977; BOLTON u. COATES 1983b; THOMPSON et al. 1990).
Thermophile Campylobacter spp. wachsen bei ungewöhnlich hohen Temperaturen (KING 1957). Ihr Temperaturoptimum liegt zwischen 37 °C und 43 °C (BOLTON et al. 1988;
SKIRROW 1994). Auch innerhalb der Spezies C. jejuni und C. coli kann das Wachstumsoptimum variieren (SCATES et al. 2003). Das pH-Optimum liegt bei 6,5 bis 7,5 (DOYLE u. ROMAN 1981).
2.2.5 Tenazität
Campylobacter spp. gelten als sehr empfindlich gegenüber Umwelteinflüssen (PARK 2002), was möglicherweise an der hochgradigen Anpassung an das Mikromilieu des Intestinaltraktes, insbesondere der Mukosa des Wirts liegt (ALEMKA et al. 2012).
Da sie eine hohe Empfindlichkeit gegenüber Sauerstoffradikalen und Superoxiden aufweisen, besitzen die Bakterien eine geringe Sauerstofftoleranz (PARK 2002). Eine Empfindlichkeit besteht außerdem gegenüber Austrocknung (DOYLE u. ROMAN 1982b) und erhöhtem Salzgehalt (DOYLE u. ROMAN 1982a). Das pH-Minimum beträgt 4,9, das pH-Maximum 9- 9,5 (DOYLE u. ROMAN 1981). Campylobacter spp. können allerdings in einer suboptimalen pH- und Sauerstoffumgebung eine Toleranz entwickeln (adaptive tolerance response), was eine entscheidende Überlebensstrategie der ansonsten sehr empfindlichen Bakterien darstellt (MURPHY et al. 2003). Auch Stressabwehrsysteme wurden beschrieben und ermöglichen ein besseres Überleben unter suboptimalen Sauerstoffbedigungen (PESCI et al. 1994; PURDY u.
PARK 1994; GRANT u. PARK 1995). Die mangelnde Fähigkeit zur Produktion von Kälteschockproteinen führt zu einer Empfindlichkeit gegenüber niedrigen Temperaturen (PARKHILL et al. 2000). Unterhalb von 30 °C sind die Keime nicht vermehrungsfähig
LITERATUR
19
(PARK 2002), allerdings ist ein Überleben bei 4 °C und sogar bei Gefriertemperaturen von bis zu -20°C noch möglich (FERNANDEZ u. PISON 1996; HAZELEGER et al. 1998).
Campylobacter spp. besitzen die Fähigkeit zur Synthese von Hitzeschockproteinen (KONKEL et al. 1998; PARKHILL et al. 2000; PARK 2002), wodurch sie auch bei Temperaturen oberhalb ihres Temperaturoptimums überleben können. Vermehrungsfähig bleiben Campylobacter spp. bis zu Temperaturen von 47 °C; bei Temperaturen von 70 °C kommt es allerdings zu einem Absterben der Bakterien (STERN u. KOTULA 1982).
Bemerkenswert ist, dass es bei Raumtemperatur zu einer höheren Absterberate als bei 4 °C kommt (BLASER et al. 1980).
Werden Campylobacter spp. suboptimalen Bedingungen ausgesetzt, degenerieren sie zu kokkoiden Formen (KARMALI et al. 1981; JONES et al. 1991; CHAVEERACH et al. 2003).
In dieser Form sind sie zwar überlebensfähig und damit pathogen, jedoch nicht mit Kultur- basierten Methoden nachweisbar (ROLLINS u. COLWELL 1986; SAHA et al. 1991). Die Umwandlung in diese sogenannten viable but non-culturable (VBNC) Formen stellen also eine besondere Überlebensstrategie von Campylobacter spp. dar (JONES et al. 1931).
2.2.6 Stoffwechsel
Es wird im Allgemeinen angenommen, dass Campylobacter nicht in der Lage sind, Kohlenhydrate zur Energiegewinnung zu nutzen, da sie eine mangelnde Verwertung der üblichen Kohlenhydrate aufweisen (PARK 2002). Neuere Untersuchungen lassen jedoch vermuten, dass bestimmte C.-jejuni-Stämme Kohlenhydrate, im speziellen L-Fucose, verwerten (MURAOKA u. ZHANG 2011; STAHL et al. 2011). Dessen ungeachtet verwenden Campylobacter spp. vorwiegend Aminosäuren oder Metaboliten aus dem Zitronensäurezyklus als Energiequelle (KIGGINS u. PLASTRIDGE 1958; WESTFALL et al.
1986). C. jejuni und C. coli sind in der Lage, Format, L-Laktat, Cystein, Glutamin und Serin und stammabhängig auch α-Ketoglutarat, Succinat, Fumarat und Aspartat zu verwenden (MOHAMMED et al. 2004). Hämin und Hämoglobin dienen als Eisenquelle für Campylobacter spp. und sind essenziell für ihr Wachstum (PARK 2002).
LITERATUR
20 2.2.7 Anzucht
Die Bedeutsamkeit der Campylobacteriose des Menschen wurde erst Mitte der 1970er-Jahre erkannt, nachdem geeignete Methoden zur Anzucht aus Fäzes entdeckt wurden. Nicht nur die hohen Wachstumsansprüche, sondern auch die fehlende Möglichkeit zur selektiven Anzucht aus Fäzes stellten eine Herausforderung dar, da andere Darmbakterien, -pilze und -hefen Campylobacter spp. auf Agar für gewöhnlich überwucherten (DEKEYSER et al. 1972;
BUTZLER et al. 1973; SKIRROW 1977).
Der Durchbruch gelang mit einem Filtersystem, das die Begleitflora vor der Anzucht auf Agar aufgrund ihrer Größe herausfilterte (DEKEYSER et al. 1972). Kurze Zeit später gelang die erste Anzucht auf einem Selektivnährmedium, dem Vancomycin, Polymyxin B und Trimethoprim zur Unterdrückung der Begleitflora zugesetzt war. Diese selektive Anzucht war dem Filtersystem vor allem bezüglich des Aufwandes überlegen (SKIRROW 1977). Es folgte die Entwicklung weiterer Selektivnährmedien für Campylobacter spp. Den ersten Selektivnährmedien wurden entweder lysiertes Pferdeblut oder Schafblut zugesetzt, da dies zu einer Absorption von Radikalen und Peroxiden führt, die eine hemmende Wirkung auf Campylobacter spp. haben. Eine Alternative zu dem Zusatz von Blut lieferten BOLTON et al.
(1984a) mit dem Charcoal Based Selective Medium (CSM) Agar auf Basis eines Columbia- Agars mit CFP-Zusatz bestehend aus Kohle, Eisen(II)-sulfat und Natriumpyruvat (BOLTON u. COATES 1983a). Als Antibiotikumzusatz gegen Pseudomonaden und Enterobacteriaceae wurde kurz darauf Cefalozin hinzugefügt. Somit entstand der Cefalozin Charcoal Deoxycholate Agar (CCDA) (BOLTON et al. 1984b). Durch den Austausch von Cefalozin durch das besser wirksame Cefoperazon entstand der heute übliche modifizierte CCD-Agar (mCCDA) (HUTCHINSON u. BOLTON 1984). Bezüglich der Hemmung der fäkalen Begleitflora erwies sich der mCCDA-Agar im Vergleich zu den bluthaltigen Agar als überlegen (GUN-MUNRO et al. 1987).
Aufgrund der anspruchsvollen und zum Teil unterschiedlichen Ansprüche von Campylobacter spp. sind verschiedene Supplementierungen zur Unterdrückung der Begleitflora und zur Wachstumsförderung von Campylobacter spp. erhältlich.
LITERATUR
21
Zu beachten ist, dass es antibiotikasensible Campylobacter spp. gibt, die unter Umständen nicht auf einem Selektivnährmedium wachsen. Außerdem muss berücksichtigt werden, dass nach abgeklungener Akutinfektion oder beim Nachweis aus symptomlosen Trägern bzw.
allgemein bei Proben, in denen geringe Campylobacter-Zahlen erwartet werden, eine vorherige Anreicherung der Proben ratsam ist. Hierfür gibt es verschiedene Anreicherungsbouillons, die sich jedoch von der Grundzusammensetzung nicht von den festen Medien unterscheiden (CORRY et al. 1995). Der Vergleich dreier verschiedener Anreicherungsbouillons (Campylobacter-Enrichment-Broth, Preston-Bouillon, Bolton- Bouillon) ergab, dass die Anzucht in Bolton-Bouillon einen guten Kompromiss zwischen der Isolationsrate von Campylobacter spp. und der Unterdrückung der Begleitflora bietet (BAYLIS et al. 2000).
Bei dem Nachweis von Campylobacter spp. kann jedoch auch die Verwendung mehrerer verschiedener Medien und Temperaturen bei der Anzucht vorteilhaft sein, da die Wachstumsansprüche sich auch innerhalb der Arten unterscheiden können und somit eine Selektion bestimmter Stämme möglich ist (SCATES et al. 2003; OYARZABAL et al. 2005).
2.2.8 Differenzierung
Verschiedene phäno- und genotypische Methoden wurden entwickelt, um Campylobacter spp. zu identifizieren und zu differenzieren. Dies spielt vor allem für phylogenetische und epidemiologische Studien eine wichtige Rolle. Die Beschränkung einiger Methoden auf die Analyse einer oder weniger Merkmale in Kombination mit einer sehr heterogenen Ausprägung von Campylobacter spp. erschweren Studien dieser Art jedoch erheblich. Daher wurden eine Kombination aus phänotypischen und genotypischen Methoden oder allgemein die Anwendung verschiedener Techniken mehrfach vorgeschlagen (FAYOS et al. 1993;
NIELSEN et al. 2000; WASSENAAR u. NEWELL 2000).
LITERATUR
22 2.2.8.1 Phänotypische Differenzierung
Anhand der typischen Morphologie, den biochemischen und physiologischen Eigenschaften, wie der Wachstumstemperatur und der Toleranz gegenüber bestimmten Substanzen, kann eine Identifizierung auf Spezies und Subspeziesebene vorgenommen werden (SKIRROW u.
BENJAMIN 1980). Diese Methode hat jedoch den Nachteil, dass eine Fehlidentifizierung aufgrund möglicher fehlender oder zusätzlicher Eigenschaften bestimmter atypischer Stämme oder Mutanten stattfinden kann (ON 1996). Die meisten Campylobacter spp. sind Katalase- und Oxidase-positiv, wie auch die allermeisten C.-jejuni- und C.-coli-Stämme (SKIRROW u.
BENJAMIN 1980; ROOP et al. 1984). Als wichtiges Unterscheidungsmerkmal zwischen C. jejuni und C. coli gilt die Fähigkeit von C. jejuni zur Hippurathydrolyse (HARVEY 1980).
In einem Versuch hat sich jedoch gezeigt, dass 32 % der hippuratnegativen C. coli durch PCR als C. jejuni identifiziert werden konnten (NAKARI et al. 2008). Eine Gefahr der Fehlidentifizierung besteht außerdem bei komplett unbekannten Spezies (ON 1996). Dennoch werden vor allem biochemische Tests aufgrund ihrer einfachen und günstigen Anwendung als Routinemethoden in Labors verwendet (VANDAMME u. GOOSSENS 1992).
Systeme zur Serotypisierung wurden auf der Basis hitzestabiler (HS) Antigene (Penner- Serotypen) (PENNER u. HENNESSY 1980; PENNER et al. 1983) und hitzelabiler (HL) Antigene (Lior-Serotypen) (LIOR et al. 1981) entwickelt. Aufgrund der Kreuzreaktivität vieler Antikörper besitzen solche Systeme zur Identifizierung von Campylobacter spp. zwar eine geringe Spezifität, ihre Schnelligkeit ist jedoch besonders in der Diagnostik zur Absicherung einer Campylobacteriose von Vorteil (ON 1996). Es wurde vorgeschlagen, eine Kombination beider Schemata vor allem für epidemiologische Studien zu verwenden, da die Nutzung eines Schemas als unsicher bewertet wurde (MILLS et al. 1992; WOODWARD u.
RODGERS 2002).
Auch Methoden zur Phagen- (SALAMA et al. 1990) und Biotypisierung (BOLTON et al.
1984a) wurden beschrieben und finden Anwendung in der Differenzierung von Campylobacter spp.
LITERATUR
23 2.2.8.2 Genotypische Differenzierung
Eine Reihe genotypischer Methoden zur Identifizierung und Differenzierung von Campylobacter spp. wurden bereits entwickelt. Dabei werden entweder das ganze Genom oder einzelne Gene oder Loki analysiert (LATURNUS u. WIELER 2007). Zum Einsatz kommen unter anderem die RFLP (Restriction-Fragment-Length-Polymorphism), RAPD (Random-Amplified-Polymorphic-DNA), RT-PCR (Reverse-Transcription-Polymerase- Chain-Reaction), PFGE (Pulsed-Field-Gel-Electrophoresis), Plasmidanalyse, DNA- Hybridisierung und Ribotypisierung (MAZURIER et al. 1992; FAYOS et al. 1993; OWEN et al. 1993; TENOVER et al. 1995; WINTERS u. SLAVIK 1995; FITZGERALD et al. 1996;
STERN et al. 1997). Allerdings sind viele Methoden aufgrund der hohen genetischen Diversität von Campylobacter spp. je nach Fragestellung nur beschränkt aussagekräftig. Die Flagellin-RFLP detektiert zum Beispiel nur einen einzigen genomischen Lokus, in dem frequente Rekombinationen nachgewiesen werden konnten. Somit werden genetisch verwandte Stämme mit verschiedenen Flagellingenen nicht als solche erkannt (WASSENAAR et al. 1995; HARRINGTON et al. 1997). Bei der PFGE handelt es sich um eine Methode, die das gesamte Genom analysiert. Sie ist sensibler und reproduzierbarer als RAPD, die Ergebnisse variieren aber trotzdem erheblich aufgrund der genetischen Variabilität von Campylobacter und sind daher nicht geeignet für epidemiologische Langzeitstudien (ON 1998; WASSENAAR et al. 1998).
Zur Klärung epidemiologischer Zusammenhänge und für phylogenetische Studien ist vor allem die AFLP geeignet, bei der die gesamte genomische DNA analysiert wird (SIEMER et al. 2005; WIELAND et al. 2005). Für epidemiologische Langzeitstudien erwies sich insbesondere die MLST als vorteilhaft, die bei einem hohen Diskriminationspotenzial wenig anfällig für kurzfristige Veränderungen des Genoms ist, da sie sich auf hochkonservierte Loki beschränkt (DINGLE et al. 2001a). Typisierung und Clusteranalysen anhand dieser beiden Methoden werden als methodisch gleichwertig beschrieben. Hierbei ist die Anwendung der AFLP günstiger; der Datenaustausch zwischen verschiedenen Labors ist, da PCR-basiert, jedoch erschwert. Die MLST ist teurer, bietet jedoch den Vorteil international vergleichbarer Daten (SCHOULS et al. 2003).
LITERATUR
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2.2.8.2.1 Amplified-Fragment-Length-Polymorphism (AFLP)
AFLP ist eine Methode, bei der die Verwandtschaft von Organismen anhand eines genetischen Fingerabdrucks analysiert werden kann. Die chromosomale DNA eines Organismus wird mit Restriktionsenzymen in Fragmente zerschnitten (Restriktion) und es werden enzymspezifische Adapter an die „sticky ends“ der DNA-Fragmente ligiert (Ligation).
Die verschieden langen Adapter-DNA-Fragmente werden dann in zwei Schritten mit adapterspezifischen Primern in der PCR vervielfältigt (Amplifikation). Bei der ersten, präselektiven PCR erkennt der adapterspezifische Primer den Adapter, und die Adapter- DNA-Fragmente werden amplifiziert. Der bei der zweiten, selektiven PCR verwendete Primer besitzt eine oder mehrere zusätzliche Basen, bindet also nur an Adapter-DNA-Fragmente, deren DNA-Teile die zusätzlichen komplementären Basen besitzen. Dies führt zu einer Selektion und somit Verringerung der Fragmente, die darauffolgend amplifiziert werden. Die Fragmente werden auf ein Gel aufgetragen und ein individuelles Bandenmuster entsteht (VOS et al. 1995; JANSSEN et al. 1996). Anhand des Bandenmusters und mittels spezieller Software kann unter Verwendung des Pearson-Korrelationskoeffizienten und der
„Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean“-Methode (UPGMA) die genetische Ähnlichkeit bestimmt und ein Dendogramm erstellt werden (VAUTERIN u. VAUTERIN 1992).
Die Methode wurde von DUIM et al. (1999) für C. jejuni und C. coli durch Verwendung der Endonukleasen HindIII und HhaI angepasst (DUIM et al. 1999). Es können auch fluorenszenzmarkierte Primer verwendet werden. Trägt man die PCR-Produkte auf eine Acrylamidgelsäule auf, wird das Fluoreszenzsignal anhand der Laufgeschwindigkeit detektiert (DESAI et al. 2001; DUIM et al. 2001).
Die AFLP erlaubt eine Identifizierung von Campylobacter auf Spezies- und Stammebene und ermöglicht die Bestimmung des Verwandtschaftsgrades verschiedener Isolate (DUIM et al.
2001). Bei einer Homologie von 90-100 % werden Stämme als identisch betrachtet und eine Homologie von 60-90 % deutet auf verschiedene Stämme der gleichen Spezies hin. Besitzen die AFLP-Muster eine Übereinstimmung von 40-60% ist davon auszugehen, dass es sich um
LITERATUR
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verschiedene Spezies der gleichen Gattung handelt (SAVELKOUL et al., 1999). DUIM et al.
(1999) fanden jedoch auch verschiedene Campylobacter spp. die eine Ähnlichkeit von lediglich 22% aufwiesen.
Da das gesamte Genom analysiert wird, ist die Gefahr, dass Punktmutationen oder Rekombinationen an einzelnen Loki miss- oder überinterpretiert werden, gering (DUIM et al.
1999). Die Methode eignet sich daher besonders gut für epidemiologische und phylogenetische Untersuchungen (WASSENAAR u. NEWELL 2000). In mehreren Studien konnte die Brauchbarkeit dieser Methode zur Bestimmung der genetischen Verwandtschaft zwischen und innerhalb von C.-jejuni- und C.-coli-Stämmen nachgewiesen werden (KOKOTOVIC u. ON 1999; DUIM et al. 2000; ON u. HARRINGTON 2000; DUIM et al.
2001).
2.2.8.2.2 Multi-Locus-Sequence-Typing (MLST)
Auf Basis der Multilokus-Enzym-Elektrophorese (MLEE) (SELANDER et al. 1986) wurde 1998 die MLST mit dem Vorteil entwickelt, verlässliche, reproduzierbare und transportable Daten zu produzieren. Die Methode basiert auf der Analyse von Nucleotidsequenzen bestimmter Gene eines Bakteriums, der sogenannten Housekeeping-Gene (MAIDEN et al.
1998). Housekeeping-Gene sind chromosomale Gene, die hochkonserviert sind, da sie für Proteine codieren, die von der Zelle lebensnotwendig sind, nicht jedoch für Funktionen der Wirtsadaptation (MAIDEN et al. 1998; DINGLE et al. 2001a). Die Ergebnisse der MLST können via Internet weltweit zugänglich gemacht werden (http://www.mlst.net) (CHAN et al.
2001; JOLLEY et al. 2004) und entsprechende Hilfsprogramme ermöglichen die Anfertigung von Clusteranalysen (FEIL et al. 1999; JOLLEY et al. 2001; FEIL et al. 2004; DIDELOT u.
FALUSH 2007).
Für C. jejuni und C. coli wurden sieben Housekeeping-Gene festgelegt (DINGLE et al.
2001a; DINGLE et al. 2005): aspartase A (aspA), glutamine synthetase (glnA), citrate
LITERATUR
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synthase (gltA), serine hydroxymethyltransferase (glyA), phosphoglucomutase (pgm), transketolase (tkt) und ATP synthase alpha subunit (uncA).
Für jedes Allel, d.h. für jede Ausprägung des Genabschnitts des jeweiligen Lokus, wurde in der Reihenfolge ihrer Entdeckung eine Allelnummer vergeben. Die daraus zusammengesetzte siebenstellige Nummer ergibt ein Allelprofil, welches einem Sequenztypen (ST) zugeordnet werden kann. Ein ST erhält zur Beschreibung und Vergleichbarkeit ebenfalls eine individuelle Nummer.
STs können in weitere Gruppen eingeteilt werden, die sogenannten klonalen Komplexe (CCs). Nach DINGLE et. al (2001) werden STs mit vier identischen Loki zu einem Komplex gezählt. Sie werden nach dem zuerst entdeckten ST der CC-Gruppe benannt, gefolgt von dem Wort „complex“.
Die Vergabe der Allelnummern, STs und CCs erfolgt über die Onlinedatenbank pubMLST.
Daten der MLST-Methode zeigen trotz der hohen genetischen Vielfalt zuverlässig die Verwandtschaft verschiedener Stämme an, da sie sich auf konservierte Gene beschränkt. Auf der Internetseite (http://pubmlst.org/campylobacter/) können STs und CCs gesucht und neu typisierte eingegeben werden. Die jeweiligen Isolate sind mit Angaben über ihre Bezeichnung (id), Isolatname und eventuelle Alternativbezeichnungen versehen. Des Weiteren enthält die Datenbank Angaben über das Land und das Jahr, in dem der Stamm isoliert wurde, sowie assoziierte Erkrankungen, Herkunft bzw. Material, aus dem der Stamm gewonnen wurde, und epidemiologische Daten. Zusätzlich können Angaben zu Veröffentlichungen gemacht werden, in denen die Isolate beschrieben wurden, womit studienübergreifende Analysen bestimmter Isolate ermöglicht werden.
In Studien konnte bereits eine Adaptation von CCs an bestimmte Wirte und Nischen (DINGLE et al. 2002; MILLER et al. 2006; THAKUR et al. 2006) belegt werden. Außerdem konnten bestimmte CCs mit dem Guillain-Barré-Syndrom, dem Miller-Fisher-Syndrom (DINGLE et al. 2001b) und mit dem Alter des Menschen bei Ersterkrankung assoziiert werden (DINGLE et al. 2005; KARENLAMPI et al. 2007), was die Bedeutung der MLST für epidemiologische Studien hervorhebt.
LITERATUR
27 2.2.9 Genetische Diversität
Die hohe genetische Diversität von Campylobacter spp. (OWEN et al. 1997; HANNINEN et al. 1998; WASSENAAR et al. 1998; DORRELL et al. 2001) erschwert phylogenetische und epidemiologische Studien, stellt für die Bakterien jedoch eine wichtige Überlebensstrategie dar. Als Ursache für die genetische Instabilität gelten hohe Raten an Intra- und Interspezies- Genaustausch, Rekombination sowie Mutation (ON 1998; DINGLE et al. 2001a;
SUERBAUM et al. 2001; DE BOER et al. 2002; SCHOULS et al. 2003; LITRUP et al.
2007). Aber auch Transformation, das heißt die Aufnahme fremder DNA aus der Umgebung, ist möglich (WANG u. TAYLOR 1990; RICHARDSON u. PARK 1997).
Je nach Typisierungsverfahren wird die Vielfalt der Campylobacter spp. besonders deutlich.
Es existieren allein für C. jejuni 60 hitzestabile Oberflächenantigene zur Differenzierung nach Penner und 100 hitzelabile Antigene zur Serotypisierung nach Lior (PENNER u. HENNESSY 1980; LIOR et al. 1981). Das Verfahren der fla-Typisierung (WASSENAAR et al. 1995;
HARRINGTON et al. 1997) sowie PFGE-Untersuchungen (WASSENAAR et al. 1998) und RFLP-Untersuchungen (WEIJTENS et al. 1993) verdeutlichen die genetische Vielfalt, machen diese Verfahren jedoch nahezu unbrauchbar für epidemiologische Studien. Aber sogar Untersuchungen mit der MLST-Methode, basierend auf Genen, die als hochkonserviert gelten, zeigen eine hohe Anzahl möglicher STs und bestätigen somit die hohe Diversität der Bakterien (DINGLE et al. 2001a; SUERBAUM et al. 2001). MLST- und AFLP- Untersuchungen ergaben eine geringere Diversität für C.-coli- als für C.-jejuni-Stämme (DUIM et al. 1999; DINGLE et al. 2005). Allerdings sind die Ergebnisse der Studien diesbezüglich nicht einheitlich, da auch für C.-coli-Stämme hohe Rekombinationsraten und eine ebenfalls sehr hohe genetische Diversität belegt werden konnten (THAKUR u.
GEBREYES 2005; LITRUP et al. 2007). Es wird vermutet, dass es sich um eine geringe Anzahl variabler Regionen im Genom handelt, die durch Rekombination einer stetigen Änderung unterliegen (TABOADA et al. 2004). Auch sogenannte Mutator-Mutanten in der Spezies Campylobacter werden diskutiert (LITRUP et al. 2007). Hierbei handelt es sich um Bakterienklone, die eine Störung im Mismatch-Repair-System besitzen und so einer höheren Mutation unterliegen (TOWNSEND et al. 2003).
LITERATUR
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Aufgrund der genetischen Vielfalt bei einer nachgewiesen schwachen klonalen Populationsstruktur von C.-jejuni- und C.-coli-Stämmen, kann von einer frequenten Intraspeziesrekombination ausgegangen werden (DINGLE et al. 2001a; SUERBAUM et al.
2001; FEARNHEAD et al. 2005; THAKUR u. GEBREYES 2005). Aber auch Interspeziesrekombinationen wurden beschrieben, wonach es zu einem genetischen Austausch zwischen C.-jejuni- und C.-coli-Stämmen kommen kann (SCHOULS et al. 2003;
DINGLE et al. 2005; FEARNHEAD et al. 2005; MILLER et al. 2006; LITRUP et al. 2007).
In-vivo- und In-vitro-Passage-Versuche zur Untersuchung der genetischen Stabilität von C.-jejuni- und C.-coli-Stämmen lieferten unterschiedliche Ergebnisse. So konnten sowohl genetische Stabilität (HANNINEN et al. 1999) als auch Instabilität (WASSENAAR et al.
1998; RIDLEY et al. 2008; HÄNEL et al. 2009; LEBLANC-MARIDOR et al. 2011) in vivo nachgewiesen werden. Entsprechend unterschiedliche Ergebnisse ergaben auch In-vitro- Passage-Versuche (ON 1998; NIELSEN et al. 2001; RITMEESTER et al. 2003; LEBLANC- MARIDOR et al. 2011). Als Ursache für das häufige Vorkommen genetischer Instabilität in vivo wird ein hoher Selektionsdruck im Gastrointestinaltrakt des Wirts vermutet (NUIJTEN et al. 2000; RIDLEY et al. 2008). Das Potenzial zur genetischen Veränderung scheint jedoch auch vom Stamm abhängig zu sein. So konnte einerseits für C.-jejuni-Stämme aus klonaler Herkunft eine hohe genetische Diversität nachgewiesen werden (WASSENAAR et al. 1998), während andererseits auch von der Existenz bestimmter C.-jejuni-Klone berichtet wurde, die über lange Zeit in verschiedenen Umgebungen und geografischen Entfernungen genetisch stabil blieben (MANNING et al. 2001).
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2.2.10 Empfindlichkeit gegenüber antibakteriellen Substanzen
Das Vorkommen von Antibiotikaresistenzen in Campylobacter spp. nimmt, wie bei vielen Bakterienarten, stetig zu (EFSA u. ECDC 2012), und die fortschreitende Bildung von Resistenzen wird unter anderem auf den vermehrten Einsatz von Antibiotika in der Nutztierhaltung zurückgeführt (ENDTZ et al. 1991; MOORE et al. 1996; AARESTRUP u.
ENGBERG 2001). Entsprechend weisen Campylobacter spp. länderabhängig und auch tierartabhängig unterschiedliche Resistenzmuster auf (ENGBERG et al. 2001; DE JONG et al. 2009; EFSA u. ECDC 2012). Eine solche Entwicklung ist problematisch für die Behandlung therapiebedürftiger Campylobacteriose-Fälle des Menschen. Zudem wird angenommen, dass antibiotikaresistente Campylobacter-Stämme eine höhere Virulenz besitzen als antibiotikaempfindliche (TRAVERS u. BARZA 2002; MOLBAK 2005). Es wurden außerdem Bedenken geäußert, da Campylobacter spp. aufgrund ihrer Fähigkeit zum horizontalen Gentransfer anderen Bakterienarten als mögliches Reservoir von Resistenzgenen dienen könnten (PAYOT et al. 2004). C. coli trägt insgesamt häufiger Resistenzen als C. jejuni (PAYOT et al. 2004; DE JONG et al. 2009; EFSA u. ECDC 2012). Auch multiresistente Campylobacter-Stämme wurden beschrieben und können insbesondere aus Schweinen isoliert werden (PAYOT et al. 2004; DE JONG et al. 2009). Zu den wesentlichen Resistenzmechanismen gehören die Synthese von Antibiotika inaktivierenden/modifizierenden Enzymen, die die Änderung oder den Schutz der Ziele des Antibiotikums in der Bakterienzelle haben, z.B. durch den aktiven Transport des Antibiotikums aus der Bakterienzelle durch Effluxpumpen und die reduzierte Permeabilität der Zellmembranen durch veränderte Strukturen (QUIJING u. PAUL. J. 2008; ZHANG u.
PLUMMER 2008).
Im Falle einer therapiebedürftigen Campylobacteriose werden Makrolide, insbesondere Erythromycin, als Mittel der Wahl angesehen (SNYDMAN 1982; SALAZAR-LINDO et al.
1986; MCNULTY 1987). Erythromycinresistenzen werden vor allem in aus Schweinen isolierten C.-coli-Stämmen nachgewiesen (ENGBERG et al. 2001; EFSA u. ECDC 2012).
Dies wird auf den hohen Einsatz dieses Antibiotikums in der Schweinehaltung zurückgeführt (MOORE et al. 1996). Auch C. jejuni bildet in zunehmendem Maße Resistenzen gegen
LITERATUR
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Erythromycin aus. Makrolide binden an die 50S-Untereinheit der Ribosomen von Bakterien und wirken somit bakteriostatisch. Diese Untereinheit des Ribosoms wird durch die 23S- rRNA-Gene kodiert. Eine Punktmutation in der 23S-RNA, die zu einer Modifikation der Bindungsstelle führt, stellt den häufigsten Mechanismus von Campylobacter spp. zur Resistenzbildung gegen Makrolide dar (CORCORAN et al. 2006; GIBREEL u. TAYLOR 2006; PAYOT et al. 2006). Diese Makrolidresistenz kann zudem durch Transformation übertragen werden (GIBREEL u. TAYLOR 2006). Synergistisch zu den genannten Mechanismen führt die Expression von CmeABC-Effluxpumpen zu einer Verminderung der Konzentration von Makroliden in der Bakterienzelle, indem das Antibiotikum unter ATP- Verbrauch aktiv ausgeschleust wird (CAGLIERO et al. 2006; GIBREEL et al. 2007). ABC- (ATP binding cassette)-Effluxpumpen gehören zu einer der am weitesten verbreiteten Effluxpumpen unter prokaryotischen Zellen und können für ein oder auch mehrere Substrate gleichzeitig Wirksamkeit zeigen (WEBBER u. PIDDOCK 2003).
Fluorchinolone werden als Mittel zweiter Wahl bei Campylobacteriose und allgemein bei undiagnostizierten Durchfällen empfohlen (GOODMAN et al. 1990; ADACHI et al. 2000).
Resistenzen gegen diese Wirkstoffgruppe werden von C. jejuni und C. coli ausgebildet (CHUMA et al. 2001) und sind chromosomal kodiert (LUANGTONGKUM et al. 2009).
Fluorchinolone wirken bakterizid, indem sie an den Gyrase-DNA-Komplex der bakteriellen Zelle binden und somit die DNA-Replikation und -Transkription hemmen. Eine einzige Punktmutation in der DNA der GyraseA von Campylobacter spp. kann zu der Ausbildung einer Resistenz gegen Fluorchinolonen führen (PAYOT et al. 2006). Synergistisch hierzu werden CmeABC-Effluxpumpen gebildet (LUO et al. 2003). Bei Gabe von Fluorchinolonen in vivo kann eine Resistenz sehr rasch ausgebildet werden (ADLER-MOSCA et al. 1991).
Daher ist es nicht verwunderlich, dass der vielfache Einsatz von Fluorchinolonen zu einem gehäuften Vorkommen dieser Resistenz geführt hat (REINA et al. 1992). Sogar bei Abwesenheit des Antibiotikums weisen fluorchinolonresistente Campylobacter-Stämme einen Selektionsvorteil gegenüber empfindlichen Stämmen auf (LUO et al. 2005).
Tetrazykline wirken bakteriostatisch, indem sie an die 30S-Untereinheit am Ribosom des Bakteriums binden und die Proteinsynthese inhibieren. Eine Resistenz gegen dieses
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Antibiotikum ist in aus Tieren isolierten Campylobacter spp. weit verbreitet (MOORE et al.
2006; EFSA u. ECDC 2012). Durch Synthese eines Tet(O)-kodierten Proteins, das wie das Antibiotikum an das Ribosom bindet, kommt es zu einer Konformationsänderung des Ribosoms und die Bindung des Antibiotikums wird gelöst (CONNELL et al. 2003). Das Tet(O)-Protein ist meist plasmid selten chromosomal kodiert. Es gibt Hinweise dafür, dass die Fähigkeit zur Synthese des Tet(O)-Proteins sowohl über horizontalen Gentransfer von anderen Bakterienarten als auch innerhalb der Spezies Campylobacter übertragen werden kann (TAYLOR et al. 1983; BATCHELOR et al. 2004; DASTI et al. 2007). Das Exprimieren von CmeABC-Effluxpumpen ist ein weiterer Resistenzmechanismus gegen Tetrazykline (LIN et al. 2002; GIBREEL et al. 2007). Tetrazyklinresistenzen werden vermehrt in C.-coli- Isolaten aus Schweinen gefunden, was auch auf einen hohen Gebrauch dieses Antibiotikums in der Schweinehaltung zurückgeführt wird (PAYOT et al. 2004).
β-Lactam-Antibiotika binden an das Penicillin-Bindeprotein und hemmen somit die Synthese von Murein, einem wichtigen Bestandteil der Zellwand von Bakterien. Es kommt nachfolgend zu Permeabilitätsstörungen und einer Lyse der Zelle (SIU 2002; MARTIN u.
KAYE 2004). Campylobacter spp. können chromosomal oder plasmid kodierte β-Lactamasen produzieren, die zu einer Inaktivierung des Antibiotikums führen (LI et al. 2007). Diese Resistenz scheint weit verbreitet zu sein in C.-jejuni- und C.-coli-Stämmen (WRIGHT u.
KNOWLES 1980; LACHANCE et al. 1991; LI et al. 2007). Aufgrund relativ kleiner Porine in der Membran von Campylobacter spp. besitzen sie, im Gegensatz zu einigen anderen gram-negativen Bakterien, eine natürlich herabgesetzte Empfindlichkeit gegenüber β-Lactam- Antibiotika (PAGE et al. 1989).
Aminoglycosid-Resistenzen von Bakterien basieren auf der Produktion von Enzymen, die das Antibiotikum modifizieren und ihre Wirksamkeit somit herabsetzen (SHAW et al. 1993). Zu diesen Enzymen gehören Aminoglykosid-Phosphotransferase (APH) und Aminoglykosid- Adenyltransferase (ANT). Beide konnten in Campylobacter spp. nachgewiesen werden (PINTO-ALPHANDARY et al. 1990). Es wird angenommen, dass durch einen Gentransfer zwischen Campylobacter spp. und anderen Bakterienarten die Fähigkeit zur Produktion dieser Enzyme übertragen wird (O'HALLORAN et al. 2004).
LITERATUR
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2.3 Pathogenese und Pathologie der Campylobacteriose
In der EU konnten im Jahr 2009 90 % der Campylobacteriose-Fälle, die auf Speziesebene untersucht wurden, auf C. jejuni und 2,5 % auf C. coli zurückgeführt werden (EFSA u. ECDC 2011). Demnach kommt C. coli eine weitaus geringere Bedeutung als C. jejuni zu. Jedoch wird auch die Möglichkeit diskutiert, dass die Häufigkeit von C. coli als Verursacher einer Erkrankung unterschätzt wird (TAM et al. 2003). Zwar sind eine Vielzahl der Pathogenitätsfaktoren, die an der Entstehung der Campylobacteriose beteiligt sind, bereits beschrieben worden; für die Diskrepanz im Ausgang einer Infektion mit Campylobacter spp.
zwischen Mensch und Tier existieren bislang jedoch nur Erklärungsansätze, die zu der Annahme führen, dass es sich hierbei um ein komplexes Zusammenspiel zwischen Wirts- und Bakterienfaktoren handelt (HAVELAAR et al. 2009; DASTI et al.). Besonders aufgrund der genetischen Vielfalt von Campylobacter spp., einer nur geringen Expression von klassischen Virulenzfaktoren und ihrer fehlenden Pathogenität in den meisten Tierarten, und somit fehlenden Tiermodellen zur Erforschung der Campylobacteriose, ist die Suche nach den wesentlich beteiligten Faktoren zusätzlich erschwert (HAVELAAR et al. 2009). Zudem scheinen selbst innerhalb der Spezies C. jejuni unterschiedliche Mechanismen an der Entstehung einer Erkrankung beteiligt zu sein (BACON et al. 2000), aber auch die angeborene und erworbene Immunität spielen eine tragende Rolle bei der Ausprägung der Campylobacteriose (HAVELAAR et al. 2009). Einige Studien konzentrieren sich auf die Zusammensetzung der Mukosa von Mensch und Tier, im Speziellen die der Mukusschicht des Darms. Ihre Ergebnisse lassen vermuten, dass dies einen entscheidenden Einfluss auf das Kolonisationsverhalten von Campylobacter spp. hat (ALEMKA et al. 2012).
2.3.1 Pathogenitätsfaktoren
Zu den wesentlichen Pathogenitätsfaktoren von Campylobacter spp. gehören ihre Motilität, die chemotaktische Orientierung im Wirt, die Fähigkeit zu Adhäsion und Invasion in die Wirtszelle und die Toxinproduktion (VAN VLIET u. KETLEY 2001).
LITERATUR
33 2.3.1.1 Motilität und Chemotaxis
Um den Darm zu kolonisieren, müssen sich Camyplobacter spp. durch die Mukusschicht und entgegen der Peristaltik des Darms bewegen. Wesentliche Voraussetzung hierfür ist die Motilität des Erregers (MOROOKA et al. 1985), die sie durch ihre Begeißelung (flaA und flaB) und eine korkenzieherartige Form erhalten (LEE et al. 1986; SZYMANSKI et al. 1995).
Durch chemotaktische Stoffe des Wirts, z.B. Muzine, Kohlenhydrate (L-Fucose), Aminosäuren, Salze organischer Säuren und Galle, wird Campylobacter spp. von den Darmepithelzellen angelockt (HUGDAHL et al. 1988; TAKATA et al. 1992). Es konnte gezeigt werden, dass die Invasionsfähigkeit von Campylobacter mit der Motilität assoziiert ist (NEWELL et al. 1985; WASSENAAR et al. 1991) und dabei nicht der Besitz eines Flagellums, sondern die tatsächliche Beweglichkeit des Erregers entscheidend ist (YAO et al.
1994). Zur Bestimmung der Motilität von Bakterien können halbfeste Medien beimpft werden, in denen es bei vorhandener Motilität zu einem sichtbaren Ausschwärmen kommt (JORDAN et al. 1934; TITTSLER u. SANDHOLZER 1936). Für Campylobacter wird der sogenannte Swarm Plate Assay verwendet, bei dem eine Brucella-Broth-Softagarplatte mit einer definierten Menge Bakterien beimpft wird und der Durchmesser des Schwarmhofs nach Bebrütung gemessen wird (NOVIK et al. 2010).
2.3.1.2 Adhäsion
Campylobacter spp. können nach Erreichen der Darmschleimhaut an die Wirtszelle adhärieren. Hierbei sind vor allem Outer Membrane Proteins (OMPs) und Lipooligo- bzw.
Lipopolysaccharide (LPS/LOS) und auch das Flagellum beteiligt (NEWELL et al. 1985;
MCSWEEGAN u. WALKER 1986; PEI u. BLASER 1993; KONKEL et al. 1997). Zu den von Campylobacter spp. synthetisierten OMPs gehören unter anderem PEB1 (PEI u.
BLASER 1993), CadF (KONKEL et al. 1997), jlpA (JIN et al. 2001) und CapA (ASHGAR et al. 2007). Die Adhäsion ist für die darauf folgende Invasion in die Wirtszelle erforderlich (KONKEL u. CIEPLAK 1992).
LITERATUR
34 2.3.1.3 Invasion
Die Fähigkeit zur Invasion in die Epithelzellen des Darms soll entscheidend zur Entzündungsreaktion beitragen (EVEREST et al. 1993; HICKEY et al. 1999) und ist bei verschiedenen Stämmen unterschiedlich stark ausgeprägt (KONKEL u. JOENS 1989;
EVEREST et al. 1992; KONKEL et al. 1992).
Sowohl Erreger- als auch Wirtszellfaktoren spielen bei der Invasion eine Rolle (WOOLDRIDGE et al. 1996; KONKEL et al. 1999). Beschrieben wurde das Campylobacter invasion antigen (Cia) (KONKEL et al. 1999), dessen Sekretion abhängig von einem funktionalen Flagellum ist, da das Protein durch einen Flagellum-Export-Apparat sezerniert wird. Durch Adhäsion an die Wirtszelle wird das Protein an die Wirtszelle weitergeleitet, woraufhin es zu einer Signaltransduktion der Wirtszelle kommt (EUCKER u. KONKEL 2012; NEAL-MCKINNEY u. KONKEL 2012). Eine hierdurch ausgelöste Veränderung des Zytoskeletts bewirkt die nachfolgende Aufnahme des Bakteriums durch Endozytose und somit eine Invasion von Campylobacter spp. (FAUCHERE et al. 1986; OELSCHLAEGER et al. 1993; HU u. KOPECKO 2008). Die Invasion kann sowohl von der apikalen als auch der basolateralen Zelloberfläche stattfinden (MONTEVILLE u. KONKEL 2002). Es wird angenommen, dass eine Translokation von Campylobacter spp. zur Lamina propria der Mukosa entweder intrazellulär durch Transzytose (BRAS u. KETLEY 1999; HU et al. 2008) oder parazellulär durch Passage durch die Tight Junctions der Epithelzellen stattfindet (MONTEVILLE u. KONKEL 2002; VAN ALPHEN et al. 2008). Eine Hypothese besagt, dass intrazellulär gelangte Bakterien die Lockerung der Tight Junctions induzieren und nachfolgenden Bakterien somit eine parazelluläre Translokation ermöglicht wird (CHEN et al. 2006). Eine phänotypabhängige Präferenz dieser zwei Wege wird ebenfalls diskutiert (HARVEY et al. 1999).
Zu diesen Erkenntnissen gelangte man überwiegend durch In-vitro-Infektionsversuche an bestimmten Zelllinien. Hierbei kommen zum Beispiel humane Kolon-Epithelzelllinien wie Caco-2 (EVEREST et al. 1992) und T-84 (MONTEVILLE u. KONKEL 2002) sowie Schweinezelllinien (BABAKHANI u. JOENS 1993) wie IPEC-1 (ABNER et al. 2002;
LITERATUR
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MURPHY et al. 2011) zum Einsatz. Als besondere Schwäche dieser In-vitro- Infektionsversuche wird das Fehlen einer Mukusschicht angesehen, da es zwischen dieser und Campylobacter spp. zu einer Reihe von Interaktionen kommt, wozu unter anderem auch eine mögliche Steigerung der Pathogenität gehört. Daher werden für In-vitro-Infektionsversuche E12-Zelllinien vorgeschlagen, die eine adhärente Mukusschicht besitzen (BEHRENS et al.
2001; ALEMKA et al. 2010a).
Eine recht einfache Methode, um die Invasionsfähigkeit von Bakterien zu bestimmen, ist der sogenannte Gentamicin Protection Assay (ELSINGHORST 1994), der auch für Campylobacter spp. erfolgreich eingesetzt wird (OELSCHLAEGER et al. 1993; NOVIK et al. 2010). Er basiert auf der Erkenntnis, dass Gentamicin extrazelluläre Bakterien abtötet, intrazelluläre Bakterien jedoch aufgrund mangelnder Penetration eukaryotischer Zellen nicht (MANDELL 1973; VAUDAUX u. WALDVOGEL 1979). Durch Bestimmung der inokulierten und nach Lyse der Zellen freigesetzten Bakterienmenge kann dann die Invasionsrate bestimmt werden und das Ergebnis als Hinweis auf die Pathogenität eines Stammes dienen (KONKEL u. JOENS 1989).
2.3.1.4 Toxine
Sowohl Cytotoxine als auch Enterotoxine werden in unterschiedlichem Ausmaß von Campylobacter spp. produziert und wirken zellschädigend (WASSENAAR 1997). Das Cytolethal Distending Toxin (CDT) wurde als wichtiges Toxin identifiziert. Dabei produziert C. jejuni dieses Toxin in größeren Mengen als C. coli (PICKETT et al. 1996; EYIGOR et al.
1999). Lipopolysaccharide (LPS) und Lipooligosaccharide (LOS) werden als Oberflächenproteine von Campylobacter spp. synthetisiert. LOS werden im Gegensatz zu LPS von C. jejuni immer gebildet und spielen eine entscheidende Rolle in der Entstehung des Guillain-Barré-Syndroms (FRY et al. 1998; GODSCHALK et al. 2004).
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2.4 Verteilung, Kolonisation- und Ausscheidung von Campylobacter spp.
2.4.1 Kolonisation des Magen-Darm-Traktes
Da eine kleine Infektionsdosis schon ausreichend sein kann, um den Wirt zu kolonisieren (BLACK et al. 1988; CAWTHRAW et al. 1996), wird davon ausgegangen, dass Campylobacter spp. Mechanismen besitzten, den niedrigen pH-Werten des Magens standzuhalten (AXELSSON-OLSSON et al. 2010). Es wird angenommen, dass es bei zu niedrigen pH-Werten zu einer Migration in die Mukosa des Magens kommt, bis der pH durch Nahrungsaufnahme wieder erhöht wird. Auch die Invasion in Amöben als Schutz vor den niedrigen pH-Werten des Magens wird diskutiert (AXELSSON-OLSSON et al. 2010). Von einer dauerhaften Besiedlung des Magens kann jedoch aufgrund der niedrigen pH-Werte nicht ausgegangen werden. So zeigte eine Studie, in der 85 % der Kotproben von Schweinen positiv für Campylobacter spp. waren, dass lediglich 11 % der positiven Proben aus dem Magen stammten (WEIJTENS et al. 1993).
Im Darm kommt es in der Regel zu einer Kolonisation von Campylobacter spp. Vor der Kolonisation stellt jedoch zuerst die Mukusschicht des Darms eine Barrierefunktion des Wirts dar, welche die darunter liegende Epithelschicht vor Schädigung schützen soll (LINDEN et al.
2008). Ihr chemotaktisches Verhalten und ihre Motilität in Kombination mit einer korkenzieherartigen Form stellen für Campylobacter spp. eines der wesentlichen Strategien dar, um in die Mukusschicht einzudringen, sie zu kolonisieren und sich zu vermehren (MOROOKA et al. 1985; TAKATA et al. 1992; YOUNG et al. 2007). Es konnte gezeigt werden, dass sowohl Motilität als auch Proliferation von Campylobacter spp. zunehmen, wenn sie sich in einer mukusähnlichen Umgebung befinden, was für eine hohe Adaptation an die Mukusschicht des Darms spricht (FERRERO u. LEE 1988; SZYMANSKI et al. 1995).
Zudem konnte nachgewiesen werden, dass die Anwesenheit von MUC2, eines der Hauptmuzine der Mukusschicht, zu einer Hochregulation von Genen, die an Motilität, Adhäsion, Invasion und Toxinproduktion beteiligt sind, führt (TU et al. 2008). Muzine können zudem von Campylobacter spp. als Substrat verwendet werden (BEERY et al. 1988).
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Eine kurzfristige Invasion und Evasion in die Wirtszellen wird als Mechanismus für Campylobacter spp. diskutiert, um der mukosalen Clearance des Darms zu entgehen (VAN DEUN et al. 2008).
In der Mukusschicht kolonisieren Campylobacter spp. oberflächliche oder tiefe Schichten, wobei Letztgenanntes bevorzugt die Krypten des Darms betrifft. Des Weiteren können die Bakterien an das Epithel angeheftet sein, sich subepithelial oder intraepithelial befinden (LEE et al. 1986; BRATZ et al. 2012). Die Invasion und Adhäsion von Campylobacter spp. an die Epithelzellen des Darms stellen einen wichtigen Kolonisationsfaktor dar (HERMANS et al.
2011).
Es wird auch angenommen, dass nicht das Vorhandensein von Wirtszellrezeptoren dafür entscheidend ist, ob es zu einer Invasion ins Epithel kommt, sondern die Zusammensetzung der Mukusschicht (BYRNE et al. 2007; VAN DEUN et al. 2008; ALEMKA et al. 2012). So adhärieren und invadieren Campylobacter spp. in vivo nicht in die Darmepithelzellen von Hühnern (BEERY et al. 1988), in vitro hingegen findet sowohl eine Adhäsion als auch Invasion statt (BYRNE et al. 2007). Zudem konnte gezeigt werden, dass in vitro die Zugabe von Mukusschicht des Huhns die Invasivität von C. jejuni reduziert, humane Mukusschicht hingegen die Invasivität von C. jejuni erhöht. Dies führt zu der Annahme, dass die Muzine wesentlich an dem Verlauf einer Infektion beteiligt sind (BYRNE et al. 2007; ALEMKA et al.
2012). Die Fähigkeit zur Verwertung von L-Fucose, das in hohen Mengen in der Mukusschicht vorkommt, scheint ein bedeutender Kolonisationsfaktor für C. jejuni in der Mukusschicht des Schweins zu sein, jedoch deutlich weniger Auswirkung auf die Kolonisation der Mukusschicht des Huhns zu haben. Vermutet wird, dass L-Fucose in einer für Campylobacter spp. nicht verwertbaren Form in der Mukosa des Huhns vorkommt, was dafür spricht, dass die Fähigkeit zur Verwertung des Substrats in diesem Wirt auch keinen Kolonisationsfaktor darstellt (STAHL et al. 2011).
Abgesehen von der allgemein hohen Adaptation an die Mukusschicht des Darms scheinen verschiedene Campylobacter-Arten und möglicherweise auch -Stämme in Abhängigkeit des besiedelten Wirts bevorzugt bestimmte Darmsegmente zu kolonisieren (BEERY et al. 1988;
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HU u. KOPECKO 2000; INGLIS et al. 2005; MADDEN et al. 2007). Es wird angenommen, dass die bevorzugte Kolonisation aus den unterschiedlichen Milieus der Darmsegmente resultiert, abhängig z.B. vom Sauerstoffgehalt, vom pH-Wert und von der Präsenz bestimmter Wirtszellrezeptoren (HU u. KOPECKO 2000), jedoch existieren hierzu bislang nur wenige Daten. Doch zeigten Untersuchungen der Mukosa verschiedener Darmsegmente des Huhns, dass die Invasivität von C. jejuni abhängig vom jeweiligen Darmabschnitt in unterschiedlichem Ausmaß beeinflusst wird (ALEMKA et al. 2010b).
Eine Studie ergab, dass C. jejuni in Rindern vorwiegend das Duodenum und Jejunum besiedelt, in ihrer Ingesta akkumulieren sie jedoch auch im Kolon der Tiere (INGLIS et al.
2005). In Menschen besiedelt C. jejuni vorwiegend das Ileum und Kolon (HU u. KOPECKO 2000). Im Geflügel befinden sich C. jejuni und C. coli vorwiegend in der Ingesta des Zäkums, aber auch in der Ingesta des Kolons und der Kloake kann eine hohe Besiedlung stattfinden (BEERY et al. 1988; ACHEN et al. 1998; ZIPRIN et al. 2002). Bei Schweinen konnte C. jejuni im Zäkuminhalt detektiert werden (OOSTEROM et al. 1985), während C. coli in der Ingesta des Ileums, Zäkums und Kolons gefunden werden kann (WEIJTENS et al. 1993;
LEBLANC MARIDOR et al. 2008). Es wird vermutet, dass sogar bestimmte C.-coli- Genotypen verschiedene Regionen im Darm des Schweins bevorzugt kolonisieren (MADDEN et al. 2007).
Es hat sich gezeigt, dass die die alleinige Untersuchung von Ingesta suboptimal ist, um den Kolonisationsort von Campylobacter spp. in der Mukosa des Intestinaltraktes zu bestimmen.
Durch die Vermehrung der in der Mukosa befindlichen Campylobacter spp. werden diese auch in die Ingesta freigesetzt. Als Folge des Transports durch die Darmperistaltik sind sie auch in distaleren Darmabschnitten aufzufinden als die tatsächlich an den Darm assoziierten Bakterien. So korrelieren die Ergebnisse von Ingestaproben also nicht zwingend mit dem tatsächlichen Kolonisationsort, was in einer Vielzahl von Studien nicht berücksichtigt wird (INGLIS et al. 2005).
LITERATUR
39 2.4.2 Dissemination im Wirt
Campylobacter spp. können außer den Intestinaltrakt auch weitere Organe ihres Wirtes besiedeln (FITZGEORGE et al. 1981). Eine Dissemination von im Darm befindlichen Bakterien in den Körper des Wirts setzt die Translokation des Bakteriums durch die Lamina epithelialis der Mukosa voraus (BERG 1995). Von hier aus können sie auf lymphatischem Weg extraintestinale Organe erreichen (HU u. KOPECKO 2000). Von den extraintestinalen Organen sind bei Tieren vor allem die Milz, Gallenblase, Leber und Lymphknoten von einer Kolonisation durch Campylobacter spp. betroffen (GÖRGEN et al. 1983; COX et al. 2006;
ENOKIMOTO et al. 2007; BRATZ et al. 2012), wobei ein stammabhängiger Gewebetropismus vermutet wird. Im Huhn zeigten verschiedene C.-jejuni-Isolate ein unterschiedliches Potenzial in der Kolonisation von Zäkum und Leber (YOUNG et al. 1999).
In Mäusen konnte ein Zusammenhang zwischen der Verwertung bestimmter Substanzen und einer bevorzugten Besiedlung des Intestinaltrakts und der Leber festgestellt werden (HOFREUTER et al. 2008).
In Schweinen wurden zum Zeitpunkt der Schlachtung in 6 % der Leberproben Campylobacter spp. nachgewiesen. (MOORE u. MADDEN 1998). Tupferproben von der Oberfläche von Schweinelebern zum Zeitpunkt der Schlachtung waren zu 9,8 % positiv für Campylobacter spp. (VON ALTROCK et al. 2013). In einer weiteren Untersuchung waren sogar 42,2 % der Leberproben vom Schwein, die sich als Lebensmittel im Einzelhandel befanden, Campylobacter-positiv (KRAMER et al. 2000). Auch ein Nachweis von Camyplobacter spp.
in den Lymphknoten von Schweinen ist möglich (OOSTEROM et al. 1985). Nachweisraten in den Mesenteriallymphknoten variierten je nach Studie zwischen 1 % (OOSTEROM et al.
1985), 29 % (NESBAKKEN et al. 2003) und 45 % (LEUE 2005). Aber auch in der Milz und Gallenblase von Schweinen konnten bereits Campylobacter spp. detektiert werden (GÖRGEN et al. 1983; BRATZ et al. 2012).
