Einfluss der Infektionsdosis auf das Kolonisationsverhalten

Durch die Verwendung unterschiedlicher Infektionsdosen mit C. coli und C. jejuni bei den mono- und koinfizierten Tieren konnten Unterschiede im Zeitpunkt der Wiederausscheidung und in den Isolierungsraten aus dem Kot festgestellt werden.

Bei Gruppe 4, die an Tag 0 mit dem C. coli ST-5777 mit einer Infektionsdosis von 1,3 × 10⁹ infiziert wurde, konnte der Stamm an den Tagen 2 (Tier 4-1) und 4 (Tier 4-2) p. inf. aus dem Kot der Tiere reisoliert werden. Bei den Schweinen von Gruppe 5, die an Tag 7 p. inf. mit dem C. coli ST-5777 mit einer Dosis von 6,6 × 10⁸ koinfiziert wurden, kam es vier Tage darauf (Tag 11 p. inf.) zum Nachweis des Stammes aus dem Kot. Im Gegensatz dazu konnte C. coli ST-5777 bei den Tieren (Gruppe 2), die mit einer Dosis von 6,1 × 10⁷ monoinifiziert wurden, das erste Mal an Tag 7 nachgewiesen werden. Dies lässt vermuten, dass es bei einer höheren Infektionsdosis von 10⁸-10⁹ KbE, im Gegensatz zu ca. 10⁷ KbE bei den monoinfizierten Tieren, auch zu einer schnelleren Wiederausscheidung des Stammes kommt.

Auch C. jejuni ST-122 konnte aus dem Kot aller koinfizierten Tiere, die mit ca. 10⁸ KbE eine um ca. zwei Log-Stufen höhere Infektionsdosis erhielten als die monoinfizierten Tiere, früher reisoliert werden. Die mit 4,2 × 10⁶ KbE monoinfizierten Tiere schieden an den Tagen 7 und 14 p. inf. den Stamm wieder aus. Die mit einer Dosis von 3,5 × 10⁸ KbE koinfizierten Tiere der Gruppe 5 zeigten eine Wiederausscheidung an den Tagen 2 (Tier 5-2) und 11 (Tier 5-1) p.

inf. Bei den an Tag 7 mit diesem Stamm koinfizierten Tieren kam es am Tag der nächsten Beprobung (Tag 11 p. inf., Tier 4-1) und 7 Tage nach der Infektion (Tag 21 p. inf., Tier 4-2) zu einem Nachweis des Stammes im Kot.

Die Ergebnisse lassen vermuten, dass eine höhere Infektionsdosis von Campylobacter spp. zu einer schnelleren Ausscheidung mit dem Kot führen, wie es bei C. coli ST-5777 beobachtet wurde. Auch Jensen et al. (2006) konnten zeigen, dass eine erhöhte Exposition von Schweinen mit C. jejuni auch zu einer höheren Ausscheidung führt (JENSEN et al. 2006).

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5.6 Genetische Stabilität von C. coli ST-5777 und C. jejuni ST-122

Die untersuchten C.-jejuni- und C.-coli-Stämme zeigen mit einer Homologie von 36,3 % deutliche genetische Unterschiede, was darauf hindeutet, dass es nicht zu einem Genaustausch größerer DNA-Fragmente zwischen den beiden Stämmen während einer Koinfektion gekommen ist. Zwar wurde von Interspeziesrekombination zwischen C. jejuni und C. coli berichtet, jedoch scheint diese eher eine Ausnahme dazustellen (SCHOULS et al. 2003;

DINGLE et al. 2005; FEARNHEAD et al. 2005; MILLER et al. 2006; LITRUP et al. 2007).

Bei einem Cut-off von 85 % konnten die C.-jejuni-Stämme in sechs und die C.-coli-Stämme in zwei Cluster eingeteilt werden. Dies deutet darauf hin, dass es innerhalb der Arten während der Passage durch das Schwein zu einer deutlichen genetischen Veränderung kam. Die hohe genetische Veränderung zeigt sich am deutlichsten bei Isolaten von Tier 5-1, dessen C.-jejuni-Isolate sich in Cluster 1 und 5 mit einer Homologie von gerade einmal 72,1 % befinden, und den C.-coli-Isolaten, die sich in Cluster 1 und 2 mit einer Homologie von 82,9 % befinden.

Nach In-vivo-Passagen konnten sowohl genetische Stabilität (HANNINEN et al. 1999) als auch Instabilität (WASSENAAR et al. 1998; RIDLEY et al. 2008; HÄNEL et al. 2009;

LEBLANC-MARIDOR et al. 2011) nachgewiesen werden. Eine mögliche Ursache ist der Selektionsdruck im Gastrointestinaltrakt des Wirts (NUIJTEN et al. 2000; RIDLEY et al.

2008). Eine minimale Homologie von 72,1 % der untersuchten C.-jejuni-Stämme aus der Ingesta der Tiere deutet darauf hin, dass dieser Stamm sich nach Passage durch das Schwein genetisch stärker differenziert hat als der C.-coli-Stamm, bei dem die analysierten Stämme eine minimale Homologie von 82,9 % aufweisen. Dies unterstützen Ergebnisse aus MLST- und AFLP-Untersuchungen, die zeigten, dass C.-coli-Stämme eine geringere Diversität besitzen als C.-jejuni-Stämme (DUIM et al. 1999; DINGLE et al. 2005). Vermutet wird außerdem ein stammabhängiges Potenzial zur genetischen Veränderung (WASSENAAR et al.

1998; MANNING et al. 2001). Es ist zu erwarten, dass größere genetische Veränderungen wie bei den C.-jejuni-Isolaten bei einer Versuchsdauer von 25 Tage auch aus Rekombination und nicht nur durch Mutation entstanden sind. Anhand eines AFLP-Dendogramms kann dies jedoch nicht mit Sicherheit gedeutet werden. Das Dendogramm liefert keine Hinweise darauf, dass Isolate aus bestimmten Darmsegmenten hohe genetische Ähnlichkeiten aufweisen.

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5.7 Vergleichende Evaluation der quantitativen und semiquantitativen Methode

Um Isolierungsraten von Campylobacter spp. im Kot und der Ingesta der Tiere zu bestimmen, wurde sowohl eine quantitative als auch die semiquantitative Methode verwendet. Ziel war es, beide Methoden vergleichend zu bewerten, um mögliche Vor- und Nachteile zu evaluieren.

Um eine Vergleichbarkeit zu gewährleisten, wurden dieselben Proben und Verdünnungsreihen verwendet.

In 46,2 % der mit beiden Methoden positiv bewerteten Kot- und Ingestaproben kam es zu übereinstimmenden Ergebnissen der Isolierungsraten von Campylobacter spp. Das semiquantitative Verfahren brachte in 37,4 % der Proben ein höheres und in 16,5 % der Proben ein geringeres Ergebnis, wobei die Abweichungen in Abhängigkeit der untersuchten Campylobacter-Stämme variierten.

Beim C.-coli-Stamm ST-854 ergaben 53,8 % der mit beiden Methoden positiv bewerteten Proben identische Log10-Stufenbereiche, die semiquantitative Methode erzielte in 38,5% der Proben ein höheres und in 7,7 % ein niedrigeres Ergebnis. Der C.-coli-Stamm ST-5777 wurde mit beiden Methoden in 38,7 % der Fälle gleich bewertet, die semiquantitative Methode erzielte in 45,2 % der Proben ein höheres und in 16,1 % ein niedrigeres Ergebnis. 57,6 % der mit beiden Methoden als positiv bewerteten Proben ergaben für den C.-jejuni-Stamm ST-122 identische Log10-Stufenbereiche. Die semiquantitative Methode ergab in 39,4 % der Fälle ein höheres und in lediglich 3 % ein niedrigeres Ergebnis. Dies zeigt, dass die semiquantitative Methode bei allen Infektionsstämmen häufiger eine höhere Keimzahlbestimmung ermöglichte als die quantitative Methode. Für C. lanienae ergaben beide Methoden in lediglich 28,6 % der Proben identische Log₁₀-Stufenbereiche. Im Gegensatz zu den Infektionsstämmen ergab die quantitative Methode (57,1 %) häufiger höhere Log₁₀-Stufenbereiche als die semiquantitative Methode (14,3 %).

Da bei beiden Methoden dieselben Proben (Verdünnungsreihen) verwendet wurden, ist anzunehmen, dass es in Abhängigkeit von der verwendeten Methode zu einer unterschiedlichen Förderung des Wachstums der Stämme kam. Die aus den Proben

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angefertigten Verdünnungsreihen wurden bei der quantitativen Methode direkt auf mCCDA aufgebracht und 48 h lang bei 37 °C inkubiert. Für die semiquantitative Methode wurden die angefertigten Verdünnungsreihen hingegen erst 48 h lang bei 37 °C inkubiert, danach auf mCCDA-Platten aufgebracht und weitere 48 h bei 37 °C inkubiert. Die Verdünnungsreihen wurden in Bolton-Bouillon angefertigt, deren Zusammensetzung wahrscheinlich Einfluss auf das Wachstum hatte. Hierbei lässt sich schlussfolgern, dass Bolton-Bouillon das Wachstum der Infektionsstämme fördert, das von C. lanienae hingegen hemmt. Dass es zu methodischen Fehlern durch Wachstumsförderung oder -hemmung bestimmter Campylobacter-Stämme bei deren Anzucht kommen kann, wurde in der Literatur bereits beschrieben (MADDEN et al.

2000; JENSEN et al. 2005). Eine Anreicherung vor dem Aufbringen auf Agar wurde als Methode beschrieben, die zu höheren Nachweisraten von Campylobacter spp. führt (ATABAY u. CORRY 1998). Eine andere Untersuchung ergab hingegen, dass ein direktes Aufbringen auf Agar zu höheren Nachweisraten führt als eine vorherige Anreicherung, da Campylobacter spp. während der Inkubationszeit absterben können, dies jedoch speziesabhängige Unterschiede aufweist (MADDEN et al. 2000).

Um methodische Fehler zu vermeiden, die aus der Anzucht von Campylobacter spp. in Medien resultieren können, wurde die Anwendung der RT-PCR vorgeschlagen (MADDEN et al. 2000; JENSEN et al. 2005), die auch zur Quantifizierung von C. lanienae erfolgreich eingesetzt wurde (INGLIS et al. 2005). Nachteil dieser Methode ist jedoch, dass auch tote Bakterien und VBNC-Formen nachgewiesen werden, wodurch die Ergebnisse nicht die tatsächliche Anzahl vermehrungsfähiger Keime im Intestinaltrakt wiedergeben, was als Ursache für die Diskrepanz der beiden Methoden angesehen wird (YANG et al. 2003).

Von allen Kot- und Ingestaproben (n=156) wurden in 91 Proben positive Ergebnisse mit beiden Methoden für Campylobacter spp. erzielt und in 55 Proben negative Ergebnisse. Fünf Proben wurden lediglich mit der quantitativen und weitere fünf mit der semiquantitativen Methode positiv beurteilt. Die semiquantitative Methode erzielte beim Nachweis des C. coli ST-854 in einer Probe (Tier 1-1, Ileum) als einzige von beiden Methoden ein positives Ergebnis. Der C. coli ST-5777 hingegen wurde in zwei Fällen nur mit der quantitativen (Tier 4-1, Kolon, Tier 4-2, Zäkum) und in zwei Fällen nur mit der semiquantitativen (Tier 2-2, Tag

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14 p. inf., Tier 4-2, Tag 2 p. inf.) positiv beurteilt. C. jejuni ST-122 konnte bei Tier 3-1 an Tag 14 p. inf. und aus der Ingesta des Kolons lediglich mit der semiquantitativen Methode nachgewiesen werden. Der Stamm wurde nur mit der quantitativen Methode bei Tier 5-2 an Tag 2 p. inf. aus dem Kot reisoliert. C. lanienae konnte aus der Ingesta des Ileums der Tiere 6-1 und 6-2 ebenfalls nur mit der quantitativen Methode isoliert werden. Insgesamt erbrachten beide Methoden in gleich vielen Fällen einen fehlenden Nachweis. Hierbei wurden die Infektionsstämme jedoch häufiger nur mit der semiquantitativen Methode nachgewiesen, C.

lanienae hingegen wurde mit der quantitativen Methode häufiger als positiv beurteilt.

Für Infektionsversuche wäre demnach zu empfehlen, vor Versuchsbeginn die jeweils eingesetzten Campylobacter-Stämme auf ihr Wachstum in verschiedenen Medien zu überprüfen, um Fehlerquoten zu minimieren. Die C.-coli- und C.-jejuni-Stämme im vorliegenden Versuch scheinen durch eine Anreicherung in Bolton-Bouillon im Wachstum gefördert zu werden, was dafür spricht, der semiquantitativen Methode den Vorzug zu geben.

C. lanienae hingegen scheint durch den Anreicherungsschritt im Wachstum gehemmt zu werden; daher würde sich für C. lanienae besser die quantitative Methode eignen.