Untersuchungen zur Reduktion von Campylobacter beim Broiler durch den Einsatz von Bakteriophagen unter Berücksichtigung von Resistenzentwicklungen

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ISBN 978-3-86345-193-6

Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH 35392 Gießen · Friedrichstraße 17 · Tel. 0641 / 24466 · Fax: 0641 / 25375

E-Mail: info@dvg.de · Internet: www.dvg.de

Nadine Polascheck Hannover 2013

Tierärztliche Hochschule Hannover

Untersuchungen zur Reduktion von Campylobacter beim Broiler durch den Einsatz von Bakteriophagen unter

Berücksichtigung von Resistenzentwicklungen

INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. )

vorgelegt von Samuel Fischer

Halberstadt

Hannover 2013

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Deutschen Nationalbibliografie;

Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.

1. Auflage 2013

Printed in Germany

ISBN 978-3-86345-193-6

Verlag: DVG Service GmbH Friedrichstraße 17

35392 Gießen 0641/24466

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Tierärztliche Hochschule Hannover

Untersuchungen zur Reduktion von Campylobacter beim Broiler durch den Einsatz von Bakteriophagen unter

Berücksichtigung von Resistenzentwicklungen

INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. )

vorgelegt von Samuel Fischer

Halberstadt

Hannover 2013

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2. Univ. Prof. Dr. med. vet. Günter Klein Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit

1. Gutachter: 1. PD Dr. med. vet. Gerhard Glünder Klinik für Geflügel

2. Univ. Prof. Dr. med. vet. Günter Klein Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit

2. Gutachterin: Apl. Prof. Dr. med. vet. Beatrice Grummer Hannover Graduate School for Veterinary Pathobiology, Neuroinfectiology and Translational Medicine (HGNI)

Tag der mündlichen Prüfung: 01.11.2013

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Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis ... I Abbildungsverzeichnis ...III Tabellenverzeichnis ...III Abkürzungsverzeichnis...III

1. Einleitung ... 1

2. Literatur ... 3

2.1. Campylobacter ... 3

2.2. Bakteriophagen ... 5

2.2.1. Definition und Vorkommen ... 5

2.2.2. Taxonomie und Morphologie ... 7

2.2.3. Vermehrungszyklus ... 8

2.2.4. Phage-Wirt-Interaktion und Resistenzen ... 9

2.2.5. Entdeckung und Nutzung der Phagen ...11

2.3. Untersuchungen zum natürlichen Vorkommen von Campylobacter-Phagen ...15

2.3.1. Isolationsquellen ...15

2.3.2. Vorkommen beim Geflügel ...16

2.4. Untersuchungen zum Einsatz von Bakteriophagen gegen Campylobacter ...18

2.4.1. Schwerpunkte bisheriger Untersuchungen ...18

2.4.2. Campylobacter-Stämme ...19

2.4.3. Kolonisationsmodelle ...19

2.4.4. Phagen ...20

2.4.5. Bisher gewonnene Erkenntnisse ...20

2.4.5.1. Campylobacter ...20

2.4.5.2. Phagen ...21

2.4.5.3. Resistenz ...22

3. Problemstellung und Ziel der Arbeit ...24

3.1. Problemstellung ...24

3.2. Ziel der Arbeit ...25

4. Publikationen ...27

4.1. Zur Dissertation gehörige Fachartikel ...27

4.2. Weitere Publikationen ...28

5. Eigene Untersuchungen ...31

5.1. Vereinfachung des Phagen-Empfänglichkeitstest ...31

5.2. Einsatz von Phagen gegen Campylobacter im Broiler ...34

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5.2.4. Empfänglichkeit und Resistenz ...38

5.2.4.1. Untersuchungsumfang und Testverfahren...38

5.2.4.2. Resistenzen gegen die Einzel-Phagen und den Phagen-Cocktail ...39

5.2.4.3. Entwicklung der Empfänglichkeit von Campylobacter im zeitlichen Verlauf 40 5.2.4.4. Einfluss der Resistenzbildung auf den Campylobacter-Gehalt im Blinddarm 42 6. Diskussion ...44

6.1. Vereinfachung des Phagen-Empfänglichkeitstests ...44

6.1.1. Validität des Mikrotiterplatten-Testverfahrens ...44

6.1.2. Die Anwendung der korrekten “Multipicity of Infection” (MOI) ...45

6.1.3. Nutzen und Grenzen des Mikrotiterplatten-Tests ...46

6.2. Einsatz von Phagen gegen Campylobacter im Broiler ...47

6.2.1. Phagen ...47

6.2.2. Campylobacter ...50

6.2.3. Empfänglichkeit und Resistenz ...52

6.2.3.1. Resistenzen gegen die Einzelphagen und den Cocktail ...52

6.2.3.2. Spontan und Kreuzresistenzen ...54

6.2.3.3. Einfluss der Resistenzentwicklung auf das Reduktionspotenzial der Phagen 56 7. Zusammenfassung ...60

8. Summary ...63

9. Literaturverzeichnis ...66

10. Anhang ...92

11. Danksagung ...95

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Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1 Die Einteilung der Lyse in Stufen für die Auswertung des Mikrotiterplatten- Tests……….……….32 Abbildung 2 Versuchsdesign……….………..35

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1 Daten je Tier – Campylobacter-Gehalt, Phagen-Gehalt und SMean….…………..92

Abkürzungsverzeichnis C. Campylobacter CFU colony forming units

dpa days post application, Tage nach Behandlung dpi days post infection, Tage nach Infektion

EOP Efficiency of plating (Verhältnis gebildeter Plaques zu zugegeben PBE) FDA Food and Drug Administration, eine Lebensmittelüberwachungs-

behörde in den Vereinigten Staaten von Amerika

g Gramm

KBE Kolonie bildende Einheit log10 dekadischer Logarithmus

LT Lebenstag

MOI Multiplicity of infection, Multiplizität der Infektion (=Verhältnis der Zahl infektiöser Viruspartikel zur Zahl von Zellen in einer Kultur)

NCTC National Collection of Type Cultures, britische Phagenstammsammlung PBE Plaque bildende Einheit

PFU plaque forming unit

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1.Einleitung

1. Einleitung

Die Campylobacteriose des Menschen ist eine anzeigepflichtige Erkrankung (IfSG §7 2001). Campylobacter (C.) spp. verursachen derzeit in Deutschland die meisten lebensmittelbedingten Erkrankungen des Menschen und stellen damit noch vor den Salmonellen die häufigsten Zoonoseerreger dar (BFR 2009, 2011). An erster Stelle stehen dabei die thermophilen Spezies C. jejuni und C. coli (EFSA 2011, 2013). Die Erkrankung verläuft in den meisten Fällen selbstlimitierend und mild, gilt dennoch aufgrund ihrer Zunahme in den vergangenen Jahren als eine ernst zu nehmende Gesundheitsbedrohung (KAPPERUD et al. 2003). Selten können eine akute Polyneuropathie oder eine reaktive Arthritis als Langzeitfolge auftreten (SMITH 1995).

In etwa die Hälfte der Erkrankungen wird durch Hähnchenfleisch verursacht (EFSA 2011), wobei für eine Übertragung die Kontamination der Schlachtkörper während des Schlachtprozesses eine wichtige Rolle spielt (HUMPHREY et al. 2012). Circa 70 % der Broilerherden an deutschen Schlachthöfen sind Campylobacter -positiv (REICH et al. 2008). Der Mensch infiziert sich in erster Linie durch Hand zu Mund Kontakt bei der Zubereitung oder durch den Verzehr roher kontaminierter Lebens- mittel (KAPPERUD et al. 2003). Die minimale infektiöse Dosis von ca. 500 KBE unterstreicht die Wichtigkeit des Kontaminationsgrades (ROBINSON 1981; MEDEMA et al. 1996; PEBODY et al. 1997). Daher zählen Bemühungen, die Konzentration thermophiler Campylobacter in schlachtreifen Broilerherden zu senken, zu den wich- tigsten Bekämpfungsmaßnahmen. Eine Verminderung der intestinalen Kolonisation beim Broiler würde zu einem deutlichen Rückgang der Campylobacteriosefälle beim Menschen führen (LAMMERDING u. FAZIL 2000).

Eine Einschleppung von Campylobacter in die Betriebe kann durch Verbesserung der Biosecurity aufgrund des ubiquitären Vorkommens von Campylobacter und der vielen Einschleppungswege häufig nur hinausgezögert werden. Bisherige Bekämpfungsansätze, wie der Einsatz von verschiedenen Trinkwasserzusätzen oder der „Competetive Exclusion“ zeigten allein keinen ausreichenden Erfolg (MEAD 2000; CHEN u. STERN 2001; EFSA 2011).

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In den Ländern der ehemaligen Sowjetunion werden Bakteriophagen (Phagen) seit ihrer Entdeckung umfangreich zur Bekämpfung bakterieller Erkrankungen eingesetzt (KUTATELADZE u. ADAMIA 2010). Phagen können sehr spezifisch ihre Wirts- stämme infizieren und zerstören. In den letzten Jahren ist das Interesse am Einsatz Phagen als alternative Methode in vielen Bereichen auch in der westlichen Welt wieder erwacht. In jüngerer Zeit wurden bereits mehrere Versuche zur Reduktion der Kolonisation von thermophilen Campylobacter bei Broilern in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben. In diesen Versuchen ließ sich zeigen, dass Phagen in der Lage sind, die Keimlast im Hühnerdarm signifikant zu senken (LOC CARRILLO et al.

2005; WAGENAAR et al. 2005; EL-SHIBINY et al. 2009b; CARVALHO et al. 2010).

Zu kontroverser Diskussion führte dabei die Bedeutung der Resistenzentwicklung von Campylobacter gegen Phagen.

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2.1.Campylobacter

2. Literatur

2.1. Campylobacter

Die Gattung Campylobacter bildet mit der Gattung Arcobacter die Familie der Campylobacteraceae innerhalb der Klasse Epsilonproteobacteria. Bakterien der Gattung Campylobacter sind gramnegative, sporenlose, gerade bis schrauben- förmige 0,2-0,9 x 0,5-5,0 µm große Stäbchen, wachsen mikroaerob bei 30-42°C und sind dank ihrer uni- oder bipolaren monotrichen Begeißelung beweglich. Die Spezies C. jejuni, C. coli, C. lari und C. upsaliensis werden wegen ihres Wachstumsoptimums bei 42°C als thermophile Campylobacter bezeichnet. Campylobacter sind Oxidase positiv und nicht in der Lage Kohlenhydrate zu verwerten. Der Erreger vermehrt sich ausschließlich in warmblütigen Tieren, kann aber auch in der Außenwelt kurz überleben. Er ist empfindlich gegenüber Sauerstoff, Austrocknung, Salz und Säure.

Campylobacter lässt sich durch Erhitzen abtöten, während Tiefgefrieren nur zu einer Reduktion der Keimzahlen führt (ROLLE u. MAYR 2007).

Der derzeit bedeutendste Vertreter aus dieser Gattung ist C. jejuni. Seit dem Rück- gang der Salmonelleninfektionen ist C. jejuni der häufigste Erreger bakterieller Lebensmittelinfektionen in vielen Industrie- und Entwicklungsländern und verursacht hohe Kosten für das Gesundheitssystem (EFSA 2012).

Die Ansteckung des Menschen erfolgt über den Verzehr kontaminierter Lebensmittel sowie durch den Kontakt zu betroffenen Einzeltieren oder Beständen. Dabei sind geringe Infektionsdosen von ungefähr 500 Keimen ausreichend (ROBINSON 1981;

BLACK et al. 1988; ALTER et al. 2011). Der Erreger verursacht in der Regel eine selbstlimitierende Enteritis, die selten zur Hospitalisierung führt. Dabei treten in Abhängigkeit von der aufgenommenen Erregermenge zwei bis fünf Tage nach der Infektion erste Symptome wie Durchfall, Bauchschmerzen, Unwohlsein, Fieber und manchmal Erbrechen auf. Selten kann Blut oder Schleim im flüssigen Stuhl festgestellt werden (SKIRROW 1977; BLASER et al. 1979). Die Genesung tritt innerhalb von ein bis zwei Wochen ein. Selten, aber schwerwiegender sind die mit der Campylobacteriose assoziierten Folgeerkrankungen, zu denen unter anderem

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reaktive Arthritis, Meningitis, Endokarditis und das Guillain-Barre Syndrom gehören (SMITH 1995; NACHAMKIN et al. 1998). Der Erregernachweis erfolgt aus dem Stuhl, bei Sepsis aus der Blutkultur (ARMSTRONG u. MURPHY 1995; SKIRROW u.

BLASER 2000). Der Nachweis des Erregers sowie Erkrankungen des Menschen sind gemäß §§ 6 und 7 des Infektionsschutzgesetzes meldepflichtig.

Bei Tieren spielt C. jejuni als Krankheitserreger eine untergeordnete Rolle. Eine klinische Bedeutung als Hepatitis-Erreger beim Huhn wird diskutiert. Weiterhin kann C. jejuni am Abortgeschehen beim Schaf sowie an Diarrhoeen bei Rind, Hund und Katze beteiligt sein. Von großer Bedeutung dagegen sind klinisch unauffällige Infek- tionen, die mit einer Erregerausscheidung und Kontamination der Umgebung einhergehen (ROLLE u. MAYR 2007). Die Bedeutung der Wildvögel als Reservoir für die Einschleppung des Erregers in Nutztierbestände wird kontrovers diskutiert (FERNANDEZ et al. 1996; CRAVEN et al. 2000; PETERSEN et al. 2001).

Geflügel ist häufig betroffen, in Deutschland sind derzeit bis zu 60% der Proben aus dem Geflügelbereich mit Campylobacter belastet (BFR 2009; EFSA 2012). Ein wichtigen Vektor für die Einschleppung des Erregers in geschlossene Bestände sind Fliegen (HALD et al. 2004). Die Einschleppung konnte durch verbesserte Bio- sicherheitsmaßnahmen verringert, aber nicht verhindert werden (HALD et al. 2007).

Freilandhaltungen können grundsätzlich nicht vor einem Erregereintrag geschützt werden.

Der Schlachtprozess führt beim Geflügel zu einer Kontamination der Schlachtkörper mit den Erregern aus dem Darm (BERRANG u. DICKENS 2004; REICH et al. 2008).

Mithilfe einer guten Schlachtlogistik lässt sich die Kreuzkontamination Campylobacter-freier Herden verringern (WAGENAAR et al. 2006). Da der Erreger in den Follikeln der Hühnerhaut vor schädlichen Einflüssen geschützt ist (LEE et al.

1998; CHANTARAPANONT et al. 2004), sinkt die Belastung Endprodukte durch die übliche Kühlung der Schlachtkörper auf 4°C bis zur Zubereitung zum Verzehr nur geringfügig (CHAN et al. 2001; EL-SHIBINY et al. 2009a).

Weitere Ansteckungsquellen für den Menschen sind Rohmilch, Rind- und Schweinefleisch. Bei Rind und Schwein sind auch bei hoher Belastung der lebenden Tiere nach der Trocknung der Schlachtkörper in kühler Luft nur geringe Keimzahlen

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2.2.Bakteriophagen

nachweisbar (KWIATEK et al. 1990). In Milchproben lässt sich der Erreger verhältnismäßig häufig nachweisen (ORMECI u. OZDEMIR 2007). Weitere weniger häufige Erkrankungsursachen sind der Verzehr von unbehandeltem Trinkwasser, rohem Gemüse oder Schalentieren sowie der Kontakt zu betroffenen Haustieren und das Baden in kontaminierten Oberflächengewässern (ALTER et al. 2011).

Damit gilt das Geflügel als Hauptansteckungsquelle für den Menschen (SHEPPARD et al. 2009). Circa 30% der Erkrankungsfälle beim Menschen werden auf den Verzehr von Geflügelfleisch, 80% auf die Geflügelhaltung insgesamt zurückgeführt (EFSA 2011). Um das Risiko einer Ansteckung für die in der Geflügelhaltung und –verarbeitung beschäftigten Personen und den Verbraucher zu senken, wird eine Minimierung der positiven Herden sowie einer Reduktion des Erregers in belasteten Herden angestrebt (LAMMERDING u. FAZIL 2000).

Die EFSA hat die Risikofaktoren für die Geflügelproduktion in der Primärproduktion, während des Transports und während der weiteren Verarbeitung in einem Bericht zusammengefasst und die möglichen Kontrollmaßnahmen beschrieben (EFSA 2011). Dazu gehören in der Primärproduktion Biosicherheitsmaßnahmen, Trink- wasserbehandlungen, Verringerung des Schlachtalters und der Besatzdichte, der Einsatz von Bacteriocinen, Phagen, kompetetiven Mikroorganismen und Impfstoffen, sowie Futter- und Wasseradditiven oder eine selektive Zucht (HUMPHREY et al.

2012). Im Schlacht und Verarbeitungsprozess lässt sich die Campylobacter- Kontamination durch Verbesserung der Schlachttechnologie, durch Dekontamination oder gezielte Weiterbehandlung Campylobacter-positiver Schlachtkörper und durch logistische Schlachtung kontrollieren (CORRY u. ATABAY 2001).

2.2. Bakteriophagen 2.2.1. Definition und Vorkommen

Bakteriophagen sind definiert als Viren, die Prokaryoten infizieren, zur Vermehrung nutzen und schließlich abtöten können. Sie sind sehr wirtsspezifisch; jeder Phagen- Stamm ist auf eine oder wenige Bakterienarten spezialisiert oder kann nur bestimmte

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Stämme zur Vermehrung nutzen. Sie kommen ubiquitär in der Umwelt vor. In der Regel können sie überall dort gefunden werden, wo ihre Wirtsbakterien leben. Die Menge an Phagen in der Biosphäre wurde auf insgesamt 10³¹ bis 10³² Partikel geschätzt (HENDRIX et al. 1999; BRUSSOW u. KUTTER 2005). Damit kommen sie in der Umwelt insgesamt zehnfach häufiger vor als Bakterien.

Der weitaus größte Anteil der Phagen ist in den Ozeanen zu finden. Der Vergleich unterschiedlicher Gewässerproben eignet sich daher sehr gut zur Erforschung des Zusammenspiels von Phagen, Bakterien und Umweltbedingungen. So wurden Phagen-Konzentrationen von etwa 10⁷ Plaque bildenden Einheiten je Milliliter (PBE/ml) zusammen mit Bakterienkonzentrationen von 10⁵-10⁶ KBE/ml gefunden.

Die oberen Schichten von Meeressedimenten, die eine sehr hohe Nährstoff- und Bakterienkonzentration von 10⁸-10⁹ Zellen je Milliliter aufweisen können, enthielten verhältnismäßig geringe Phage-Bakterien Quotienten zwischen etwa 0,1 – 2,0 (DANOVARO et al. 2002), wenngleich auch von sehr hohen Phagen- Konzentrationen von über 10¹⁰ PBE/g berichtet wurde (DANOVARO et al. 2001).

Dem Virioplankton wird eine wichtige Rolle beim Erhalt der Bakterienvielfalt zugeschrieben (WOMMACK et al. 1999).

Das Vorkommen von Phagen im Erdboden ist kulturell häufig erst nach Anreicherung nachweisbar. In verschiedenen Untersuchungen wurden dabei Konzentrationen zwischen 0 und 10⁴ PBE/g ermittelt (CASIDA u. LIU 1974; GERMIDA u. CASIDA 1981; LANNING u. WILLIAMS 1982; STEPHENS et al. 1987; MARSH u.

WELLINGTON 1994; CAMPBELL et al. 1995; ASHELFORD et al. 1999). Bei einer Untersuchung von Zuckerrübenwurzeln unter dem Transmissionselektronen- mikroskop konnte eine tatsächliche Phagen-Konzentration von etwa 10⁸ Phagen- Partikeln je Gramm Mutterboden errechnet werden (ASHELFORD et al. 2003).

Phagen befinden sich ebenso auf vielen Lebensmitteln. Dies betrifft insbesondere Lebensmittel, die mit Hilfe von Bakterien hergestellt werden. In Käsereien wurden bis zu 10⁹ PBE/ml Molke und bis zu 10⁵ PBE/m³ Luft gemessen (NEVE et al. 1994).

Auch Tiere und hier insbesondere die Wiederkäuer mit ihren großen Fermentationskammern zur bakteriellen Zelluloseverdauung, bieten vielen Phagen ideale Vermehrungsbedingungen (OSAWA et al. 1981b).

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2.2.Bakteriophagen

Der Mensch beherbergt ebenso eine Vielzahl an Phagen (MONTES et al. 1966;

CALCI et al. 1998). Bei metagenomischen Untersuchungen des Darminhalts vom Menschen wurden mehr als 1200 virale Genotypen detektiert, der Großteil der natürlich vorhandenen Phagen gehörte zur Familie der Siphoviridae (BREITBART et al. 2003). Bei kulturellen Untersuchungen ließen sich Escherichia coli-Phagen sehr häufig nachweisen, Salmonella- und Bacteroides-Phagen kamen seltener vor (FURUSE et al. 1983; KAI et al. 1985; CORNAX et al. 1994; GANTZER et al. 2002).

Temperente Phagen korrelierten mit niedrigen, virulente mit hohen Phagen-Titern (FURUSE et al. 1983). Ein Einfluss von Alter und Geschlecht der Probanden auf die Zusammensetzung und Höhe der Phagen-Population war nicht zu erkennen (GANTZER et al. 2002). Allerdings beeinflusste in Untersuchungen zum Vorkommen von RNA-Phagen in Japan und Korea die geographische Herkunft der Bevölkerung die Zusammensetzung der Phagen-Population (FURUSE et al. 1979; OSAWA et al.

1981a).

2.2.2. Taxonomie und Morphologie

Der Name Bakteriophagen leitet sich aus dem Griechischen von βακτήριον (baktérion) „Stäbchen“ und φαγεῖν (phageín) „fressen“ ab und bedeutet somit „Stäb- chenfresser“. Als Bakteriophagen, auch kurz Phagen genannt, wird eine Gruppe von Viren bezeichnet, die auf Archäeen und Bakterien als Wirte spezialisiert ist. Phagen lassen sich nach der internationalen Virus Taxonomie ordnen. Entsprechend ihrer Wirtsspezifität werden sie taxonomisch in z.B. Salmonella- oder Campylobacter- Phagen eingeteilt. Sie bilden eigene Familien innerhalb der einzelsträngigen und doppelsträngigen DNA- und seltener der RNA-Viren. Damit einher geht eine Vielfalt der morphologischen Erscheinungsformen. Dennoch sind für viele Phagen folgende Merkmale typisch: Der Kopf, auch Kapsid genannt, besteht aus einem Proteinmantel und enthält das Erbmaterial. Häufig ist er ikosaedrisch aufgebaut. Der daran an- schließende Schwanz kann kontraktil sein und besitzt gewöhnlich sechs Schwanz-

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fasern an deren Spitze sich Rezeptoren für die Anhaftung an die Zielzelle befinden (KUTTER u. SULAKVELIDZE 2005).

2.2.3. Vermehrungszyklus

Als Viren nutzen Phagen für die eigene Vermehrung den Stoffwechsel eines passen- den Wirtes. Die Reproduktion findet in fünf Schritten statt. Der Phage erkennt mithilfe seiner Schwanzfasern die Oberflächenrezeptoren des richtigen Wirtes und lagert sich an die Wirtszelle an (VINGA et al. 2012). Als Rezeptoren dienen unter anderem Zellwandbestandteile wie Lipopolysaccaride, die Teichonsäure und Proteine oder die Geißel (ZORZOPULOS et al. 1982; RAKHUBA et al. 2010).

Für Phagen der Familie Myoviridae, zu der viele Campylobacter-Phagen gehören, ist bekannt, dass auf die erste Anhaftung eine noch reversible Annäherung der Basalplatte an die Wirtszelloberfläche durch ein Abknicken der Schwanzfasern folgt.

Sobald die Basalplatte vollständig angelagert ist, wird die Bindung irreversibel, die Schwanzscheide kontrahiert sich und durchdringt die Bakterienwand. Anschließend wird das Genom ins Zellinnere eingeschleust (GABASHVILI u. GROSBERG 1992).

Phagen, die keinen kontraktilen Schwanz besitzen, lösen die Zellwand enzymatisch auf, bevor sie ihr Genom einschleusen (XIANG et al. 2008).

Es folgt die Latenzphase. Durch Transkription viraler Gene in mRNA und Translation werden die Bausteine für neue Viruspartikel sowie Proteine, die dem Zusammenbau und der Freisetzung der neuen Viruspartikel dienen, produziert und durch Replikation das gesamte Genom vermehrt (BRESCH 1962; ADLER u. POOTJES 1972;

GREENSTEIN u. SKALKA 1975; KREUZER u. BRISTER 2010; MUESER et al.

2010; SECO et al. 2013). Die wirtsspezifische chemische Modifikation des Genoms sorgt dafür, dass das Phagen-Genom bei Infektion eines homlogen Wirtes nicht von dessen Restriktionsenzymen erkannt wird. Die Produktionsphase geht schließlich in die Reifephase über, in der die Viruspartikel in einer genau festgelegten Reihenfolge zusammengebaut werden. Das Genom wird platzsparend im Kapsid verpackt (SCHWUDKE et al. 2008). Die Freisetzung erfolgt entweder durch das die bakterielle

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2.2.Bakteriophagen

Mureinzellwand auflösende Lysozym oder durch den Einbau von Porinen, die Löcher in der Zellwand bilden (YOUNG et al. 2000; FISCHETTI 2005; SMITH 2008; TANG et al. 2011).

Phagen, die diesen Zyklus ohne Unterbrechung durchlaufen, werden als lytisch bezeichnet (LENSKI 1988). Diese Phagen eignen sich für den Einsatz zur Bekämpfung pathogener Mikroorganismen, da sie schnell zu einer Abtötung und Bereitstellung neuer infektiöser Phagen-Partikel führen. Temperente Phagen hingegen sind in der Lage, den Zyklus zu unterbrechen (lysogener Zyklus) und über mehrere Bakterien- generationen als Prophage in ihrem Wirt zu überdauern, bevor wieder ein lytischer Zyklus mit der Freisetzung infektiöser Partikel erfolgt (RANQUET et al. 2005). Diese Phagen können zur Immunität der Bakterien gegen weitere Phagen-Infektionen führen und sind als Überträger von Genen zwischen den Bakterien bekannt, wobei auch Speziesgrenzen überschritten werden können. Damit sind sie auch potentielle Überträger von bakteriellen Virulenz- und Resistenzgenen, weshalb sie für den Ein- satz in der Phagen-Therapie als ungeeignet bewertet werden müssen (BRUSSOW et al. 2004).

2.2.4. Phage-Wirt-Interaktion und Resistenzen

Auf der einen Seite stellen bakterielle Abwehrmechanismen gegen Phagen eine Gefahr für den Erfolg von Phagen-Therapien dar. Auf der anderen Seite erhofft man sich von ihnen einen Nutzen für Prozesse, in denen erwünschte bakterielle Aktivität durch Phagen gestört wird. Um die Bedeutung und Auswirkung bakterieller Resis- tenzbildung richtig einschätzen zu können, ist es wichtig ihre Funktion im natürlichen Zusammenspiel von Phagen und Bakterien zu verstehen.

Phagen tragen auf zwei Wegen entscheidend zum Erhalt der bakteriellen Vielfalt bei.

Da die Infektionshäufigkeit sich aus der Konzentration der beiden Reaktionspartner ergibt, werden sich stark vermehrende Bakterienstämme häufiger infiziert und so durch die Phagen ein Gleichgewicht zwischen den Bakterienstämmen gehalten.

Außerdem sorgen Phagen durch Gentransfer für eine sich ständig erneuernde

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Vielfalt an bakteriellen Genomen (THOMSON et al. 2004; WEINBAUER u.

RASSOULZADEGAN 2004). Damit es dabei nicht zur Ausrottung einzelner Bakterienstämme kommt, besitzen die Bakterien unterschiedlichste Mechanismen, um sich zur Wehr zu setzen. Phagen wiederum sind in der Lage, diese Abwehrmechanismen zu überwinden (CHIBANI-CHENNOUFI et al. 2004).

Schon zu Beginn des 20. Jahrhunderts war bekannt, dass Veränderungen im Genom einer Zelle deren Antigenität und infolgedessen Resistenzen gegen Virusinfektionen hervorrufen können (WEBSTER 1937; HOLMES 1938; STEVENSON et al. 1939).

Luria und Delbrück konnten 1943 zeigen, dass diese Veränderungen im Genom mit einer bestimmten Frequenz ohne die Einwirkung eines Virus spontan entstehen (LURIA u. DELBRUCK 1943). Die damals beobachteten Resistenzen blieben meist über viele Generationen erhalten, waren in der Regel spezifisch für einen Phagen und konnten mit Veränderungen der Bakterienmorphologie, des Bakterien- metabolismus, der Koloniemorphologie oder des Serotyps einhergehen. Aufgrund dieser Beobachtungen wurde vermutet, dass es verschiedene Mechanismen geben muss, die zur Resistenz gegen eine Virusinfektion führen.

Heute sind viele dieser Mechanismen, mit denen sich Bakterien gegen Phagen zur Wehr setzen und die weit über einfache Spontanmutationen hinausgehen, bekannt.

Im Jahr 2012 verglich Abedon (ABEDON 2012) die bakteriellen Abwehr- mechanismen mit dem Immunsystem von Wirbeltieren, angefangen bei einfachen Resistenzen durch Veränderung oder Blockade der Rezeptorstellen als anatomisch- physiologischer Barriere bis hin zu den 1987 erstmalig beschriebenen „Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats“ (CRISPR), einem System aus Abschnitten sich wiederholender DNA im Erbgut vieler Bakterien, dessen adaptive Immunfunktion erst kürzlich erkannt wurde (HAFT et al. 2005; BARRANGOU et al.

2007; JORE et al. 2012).

Die Ausbildung der verschiedenen Resistenzmechanismen ist dabei immer eng mit dem Infektionszyklus der Phagen verbunden. Zu Beginn des Zyklus kann die Erkennung des Rezeptors an der richtigen Wirtszelle durch extrazelluläre polymerische Substanzen, wie sie etwa in Biofilmen vorkommen, verhindert werden.

Einen ähnlichen Effekt erzielt die Veränderung der Rezeptorstruktur oder der

(23)

2.2.Bakteriophagen

Verzicht auf die Ausprägung des Rezeptors, woraufhin die Bindung des Phagen fehlschlägt. Hat der Phage an seine Zielzelle gebunden, kann die Einschleusung des Genoms in das Zytoplasma verhindert werden. Nach der Einschleusung des Genoms kann es zur Restriktion des Fremdgenoms kommen oder die infizierte Zelle geht vor der Freisetzung neuer Viruspartikel in die Apoptose über, wodurch die übrige Bakterienpopulation geschützt wird. Während eines lysogenen Zyklus kann der integrierte Prophage vor Infektionen durch Phagen der gleichen Art schützen.

Abhängig vom Verlauf der Begegnung zwischen Bakterium und Phage überleben am Ende entweder nur der Phage oder das Bakterium, beide oder keiner (HYMAN u.

ABEDON 2010; ABEDON 2012).

2.2.5. Entdeckung und Nutzung der Phagen

Bevor das Penicillin entdeckt wurde, wurden Phagen bereits ein Jahrzehnt erfolgreich zur Behandlung bakterieller Infektionskrankheiten eingesetzt. Frederic Twort und Felix d´Hérelle gelten heute beide als Entdecker der Phagen. In der westlichen Welt führte die Entdeckung der Antibiotika weitestgehend zu einer Einstellung der bis dahin weltweit zunehmenden Erforschung der Phagen-Therapie, da führende Wis- senschaftler die Phagen nicht länger für konkurrenz- und zukunftsfähig hielten (EATON u. BAYNE-JONES 1934; STENT u. DOHM 2012). Dennoch konnte man bis in die 1970er Jahre noch therapeutische Phagen-Präparate von den Pasteur Instituten in Paris und Lyon beziehen (DUBLANCHET u. FRUCIANO 2008).

Mehr Aufmerksamkeit wurde der Phagen-Therapie in den Ländern des ehemaligen Ostblocks geschenkt. Am Eliava Institut für Phagen-Forschung, das gemeinsam von d´Hérelle und einem seiner ehemaligen Schüler Georgi Eliava im Jahre 1933 in Tiflis gegründet wurde, überdauerte die Phagen-Forschung und Produktion von therapeu- tischen Phagen-Produkten bis in die Gegenwart. Die dabei gewonnenen, umfang- reichen Erfahrungen wurden im Westen lange Zeit nicht bekannt, da Veröffentlichun- gen nur in lokalen Zeitschriften, hauptsächlich in georgischer oder ukrainischer Sprache stattfanden und die politische Situation den Wissensaustausch zwischen

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Ost und West nahezu vollständig unterband. Eine Übersicht über die am Eliava Institut gesammelten Erfahrungen und die alte Literatur wurde kürzlich von Chanishvili in englischer Sprache veröffentlicht (CHANISHVILI et al. 2001;

CHANISHVILI 2009). Auch in Polen wurde am 1952 gegründeten Institut für Immunologie und experimentelle Therapie die Forschung an Phagen weiter betrieben und die klinischen Erfahrungen in einer Serie englisch sprachiger Veröffentlichungen zusammengefasst (SLOPEK et al. 1983b, a; SLOPEK et al. 1984;

SLOPEK et al. 1985b, c, a; CISLO et al. 1987; SLOPEK et al. 1987).

Nachdem man bereits dachte, das Kapitel der mikrobiologischen Forschung mit der Entdeckung der Antibiotika schließen zu können, ist seit dem Auftreten multiresistenter Keime, im Rahmen der Suche nach neuen Bekämpfungsstrategien, das Interesse an den Phagen neu erwacht (ALISKY et al. 1998). Hanlon (HANLON 2007) fasst die Vorteile der Phagen in fünf Punkten zusammen:

(25)

2.2.Bakteriophagen

I. Phagen bekämpfen nur die entsprechend ausgewählten pathogenen Keime, während die Normalflora nicht betroffen ist. Zwar ist eine präzise Diagnostik zur Bestimmung eines wirksamen Therapie-Phagen notwendig, dafür gerät die Normalflora nicht aus dem Gleichgewicht und verhindert somit eine mögliche Überwucherung durch sekundäre Pathogene.

II. Der Wirkmechanismus der Phagen ist grundlegend verschieden von dem aller verfügbaren Antibiotika. Damit können Phagen auch multiresistente Keime bekämpfen. Auch wenn Phagen nicht das Mittel der Wahl sein werden, um bakterielle Erkrankungen zu bekämpfen, so haben sie dennoch das Potenzial ein letztes Sicherheitsnetz zu bilden.

III. Pharmakokinetisch besitzen Phagen zwei Besonderheiten: sie sind selbst- replizierend und selbstlimitierend. Nach einer initialen Behandlung steigt die Dosis exponentiell während das Virus in empfänglichen Wirtszellen vermehrt und freigesetzt wird. Häufig ist keine Mehrfachbehandlung notwendig.

IV. Die umfangreiche klinische Erfahrung aus der früheren Sowjetunion und Osteuropa zeigt, dass es nur äußerst selten zu Nebenwirkungen oder allergischen Reaktionen kam. Welche immunologischen Folgen eine Mehrfachbehandlung haben kann, bleibt jedoch unsicher.

V. Phagen sind auf den ersten Blick günstig und verhältnismäßig einfach zu produzieren. Trotzdem bleibt es eine Herausforderung hoch virulente, obligatorisch lytische, keine Fremdgene übertragende und breit wirksame Phagen-Produkte für eine erfolgreiche Therapie zu entwickeln.

Inzwischen haben die Phagen eine breite Aufmerksamkeit wiedererlangt. In vielen Bereichen wird ihr Potential neu erforscht und bewertet. Zur Verbesserung der Lebensmittelsicherheit wurde der Einsatz von Phagen gegen Listerien auf Honig- melonen, Lachs, Wels, Schmierkäse, Fertigprodukten und in Biofilmen untersucht (LEVERENTZ et al. 2003; LEVERENTZ et al. 2004; ANONYMUS 2006; HONG et al.

2006; SCHELLEKENS et al. 2007; GUENTHER et al. 2009; SONI u. NANNAPANENI 2010a, b; SONI et al. 2010; BIGOT et al. 2011; ROSSI et al. 2011; MONTANEZ- IZQUIERDO et al. 2012). Im Jahr 2006 erteilte die US-amerikanische Behörde FDA

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erstmalig einer mehrere Phagen enthaltenden Zubereitung zur Bekämpfung von Listerien in Käse die sogenannte GRAS-Zulassung (BREN 2007). Der GRAS - Generally Recognised as Safe - Status wird allgemein als sicher angesehenen Stoffen oder Produkten verliehen. Diese Zulassung wurde später auf alle Listerien-anfälligen Lebensmittel, darunter Pflanzen, Fertigfleischprodukte und Fisch, ausgedehnt.

Mehrere Untersuchungen beschäftigen sich mit den Möglichkeiten und Perspektiven, die Lebensmittelsicherheit durch den Einsatz von Phagen zu verbessern (HUDSON et al. 2005; WAGENAAR et al. 2006; BIGWOOD et al. 2009; COFFEY et al. 2010;

HAGENS u. LOESSNER 2010; NIU et al. 2012). Die lebensmittelübertragenen Zoonoseerreger Samonella und Campylobacter bilden die Schnittstelle zwischen der lebensmitteltechnischen und veterinärmedizinischen Phagen-Forschung (PONTI et al. 1996; HUDSON et al. 2005; BORIE et al. 2008a; BORIE et al. 2008b; ROBESON et al. 2008; COX u. PAVIC 2010). Durch Escherichia coli verursachte Sepsis oder Gastroenteritiden konnten bei Kälbern, Schweinen, Lämmern und Geflügel mithilfe von Phagen bekämpft werden (SMITH et al. 1987b, a; BARROW et al. 1998). Zur Verbesserung der Wirksamkeit wurden Phagen in Polymer-Kapseln verabreicht (STANFORD et al. 2010).

Im Pflanzenbau wurde der Einsatz von Phagen gegen Erwinia spp. (SCHNABEL et al. 1999; KIM et al. 2004; SALM et al. 2006), den Erreger der Schwarzbeinigkeit bei Kartoffeln sowie des Feuerbrandes bei Rosengewächsen, gegen Ralstonia solanacearum (OZAWA et al. 2001; YAMADA 2009), den Erreger der Schleimkrankheit bei Kartoffeln sowie gegen Xanthomonas campestris (MOSS et al.

2007), einen Schädling zahlreicher höherer Pflanzen, darunter Weizen, Kohl und Walnuss, erforscht. Hier steht das Bio-Kontroll-Produkt „AgriPhage“ der US-Firma Omnilytics zur Verfügung. Die Behandlung erfolgt, indem die in einer z.B. mit Magermilch angereicherten Flüssigkeit suspendierten Phagen über die Pflanzen gesprüht werden (OBRADOVIC et al. 2004; JONES et al. 2007). Eine aktuelle Übersicht über weitere kommerziell erhältliche Phagen-basierte Produkte für die Bereiche Landwirtschaft und Lebensmittelsicherheit wurde von Monk et al.

zusammengestellt (MONK et al. 2010).

(27)

2.3.Untersuchungen zum natürlichen Vorkommen von Campylobacter-Phagen

Wurden Phagen beim Menschen früher hauptsächlich gegen Erkrankungen des Magen-Darm-Trakts, verursacht durch Escherichia coli, Shigella spp. oder Campylobacter spp. sowie gegen fakultativ pathogene Wunderreger wie Staphylokokken und Streptokokken eingesetzt, richtet sich die neuere Phagen- Forschung auf dem Gebiet der Humanmedizin zusätzlich auch gegen systemische und intrazelluläre Infektionen. Dabei sind auch nicht replizierende Phagen, isolierte Phagen-Enzyme sowie Lysine Gegenstand der Forschung (BORYSOWSKI et al.

2006). Eine weitere Möglichkeit der Phagen-Anwendung besteht darin, sich ihre Wirtsspezifität für den gezielten Transport von konventionellen Antibiotika oder Antitumor-Wirkstoffen zu Nutze zu machen (YACOBY et al. 2006; YACOBY et al.

2007; BAR et al. 2008).

Trotz vieler erfolgversprechender Ansätze und Forschungsergebnisse verhindert bisher die fehlende behördliche Zulassung die Anwendung in der Schulmedizin (SOOTHILL 1994; ABEDON u. THOMAS-ABEDON 2010; KUTTER et al. 2010).

Auch für die Umwelttechnik ist die Phagen-Forschung interessant, da sich bestimmte Phagen nach der Ausscheidung aus dem Tier oder Mensch relativ lange im Ab- wasser halten. Damit könnten sie zur Beurteilung der hygienischen Wasserqualität herangezogen werden (FURUSE et al. 1981; TARTERA u. JOFRE 1987; WOLF 2005). Bestimmte Phagen-Stämme eignen sich dabei sogar zur Unterscheidung, ob die Kontamination eines Gewässers vom Menschen oder Tier stammt (GRABOW et al. 1984; HAVELAAR et al. 1990; GRABOW et al. 1993; GRABOW et al. 1995).

2.3. Untersuchungen zum natürlichen Vorkommen von Campylobacter- Phagen

2.3.1. Isolationsquellen

Die sich im Laufe der Zeit verändernde Nomenklatur erschwert die korrekte Zu- ordnung der frühen Isolationen von Campylobacter-Phagen (CONNERTON et al.

2011). Bereits während der 1960er Jahre wurden Campylobacter-Phagen aus Rindern und Schweinen isoliert. Diese waren gegen C. coli und C. fetus, die damals

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noch unter dem Namen „Vibrio coli“ und „Vibrio fetus“ bekannt waren, wirksam (FLETCHER u. BERTSCHINGER 1964; FLETCHER 1965; FIREHAMMER u.

BORDER 1968). Später wurden Campylobacter-Phagen gemeinsam mit ihrem Wirt

„Vibrio fetus“ aus abortierten Schafföten isoliert (BRYNER et al. 1982). Bryner et al.

beschrieben 1973 das Lysespektrum von sieben „Vibrio fetus“ Phagen, die aus Rindern stammten. Weiterhin wurde berichtet, dass Campylobacter-Phagen eine Rolle bei der die Serotypisierung von Campylobacter beeinträchtigenden Auto- Agglutination der Bakterienzellen spielten (RITCHIE et al. 1983). Grundsätzlich konnten Campylobacter-Phagen aus allen Quellen isoliert werden, in denen ihre Wirte vorkamen. Darunter fanden sich die bereits erwähnten Ausscheidungen von Schweinen, Rindern und Schafen (FIREHAMMER u. BORDER 1968; BRYNER et al.

1970; BRYNER et al. 1973). Etliche Berichte liegen außerdem zur Isolation von Phagen aus Schlachtabfällen, Abwässern, Dung und Ausscheidungen von Broilern und Legehennen (GRAJEWSKI et al. 1985; SALAMA et al. 1989; KHAKHRIA u.

LIOR 1992; SAILS et al. 1998; CONNERTON et al. 2004; ATTERBURY et al. 2005;

EL-SHIBINY et al. 2005; LOC CARRILLO et al. 2007) sowie von Geflügelfleisch (ATTERBURY et al. 2003b; TSUEI et al. 2007) vor.

2.3.2. Vorkommen beim Geflügel

Die meisten Daten zum Vorkommen von Campylobacter-Phagen beim Geflügel wurden in England erhoben. Die Inzidenz betrug bei 205 untersuchten Hühnern aus 90 kommerziell gehaltenen Herden im Jahr 2002 annähernd 20% (ATTERBURY et al. 2005). Das Vorkommen von Phagen korrelierte mit einer um log10 1,8 KBE/g statistisch signifikant verminderten Keimlast im Blinddarm dieser Tiere. Bei Tieren aus Bio-Haltungen war die Inzidenz mit 51% deutlich höher (EL-SHIBINY et al.

2005). Als Ursache dafür könnten die größere Exposition im Freiland gehaltener Tiere und die längere Mastdauer angesehen werden, die die Kolonialisierung mit mehreren verschiedenen Campylobacter-Stämmen und deren Phagen erleichtert (VAN OVERBEKE et al. 2006; ANONYMUS 2007; ALLEN et al. 2011). Tiere aus

(29)

2.3.Untersuchungen zum natürlichen Vorkommen von Campylobacter-Phagen

Freilandhaltungen sind zu annähernd 100% Campylobacter-positiv (HEUER et al.

2001; LUANGTONGKUM et al. 2006). In einer Studie aus Dänemark konnten lediglich aus 3% der untersuchten Proben vom Broiler Phagen isoliert werden. Die in der selben Studie untersuchten Proben von Enten waren dagegen zu 50% positiv (HANSEN et al. 2007). In einer Studie aus Korea waren 20% der untersuchten Proben aus dem Darm von Broilern Phagen-positiv (HWANG et al. 2009).

Während in Dänemark Phagen auch aus Schlachthofproben isoliert werden konnten, gelang dies in Korea nicht. In Neuseeland wurde die Haut von Broilern aus dem Einzelhandel untersucht. Gut 90% wiesen Campylobacter coli-Phagen auf, C. jejuni- Phagen konnten nicht isoliert werden. Um zu untersuchen, ob die C. jejuni-Phagen den Verabeitungsprozess in der Schlachterei nicht überstehen, wurden ganze Schlachtkörper direkt nach dem Blutentzug äußerlich gründlich gewaschen und das Waschwasser erneut auf C. jejuni-Phagen untersucht. Dabei konnten aus 28% der Proben C. jejuni-Phagen nachgewiesen werden (TSUEI et al. 2007). In einer anderen Studie ließen sich Campylobacter-Phagen von 11% der gekühlten, nicht jedoch der gefrorenen Geflügelprodukten aus dem Einzelhandel isolieren. Dabei stammten 79% der positiven Proben von Tieren aus Freilandhaltung (ATTERBURY et al. 2003b).

Es wurde gezeigt, das bestimmte flA Typen von Campylobacter den Schlachtprozess besser überstehen als andere (NEWELL et al. 2001). Die Vermutung liegt nahe, dass dies auch Folgen für die Stabilität der entsprechenden Phagen hat (ATTERBURY et al. 2003b). Da Campylobacter spp. sich nur im Tier vermehren, wird davon ausgegangen, dass die Phagen auf den Einzelhandelsprodukten ursprünglich aus dem Darm der Tiere stammen. Der Nachweis einer Kontamination des Produkts mit Campylobacter während des Schlachtprozesses gelang mehrfach (JORGENSEN et al. 2002; ALLEN et al. 2007; ELLERBROEK et al. 2010).

(30)

2.4. Untersuchungen zum Einsatz von Bakteriophagen gegen Campylobacter

2.4.1. Schwerpunkte bisheriger Untersuchungen

Bisher liegen nur wenige Ergebnisse über den Einsatz von Phagen zur Reduktion von Campylobacter beim Broiler vor. Alle bekannten Untersuchungen fanden innerhalb des letzten Jahrzehnts statt. Die erste Studie zum Einsatz von Phagen gegen Campylobacter im Broiler wurde im Jahr 2005 von Wagenaar et al. veröffentlicht. Die Autoren verglichen bei jungen Broilern den präventiven und den kurativen Phagen- Einsatz miteinander und testeten bei Tieren im Schlachtalter den Einsatz eines Zwei- Phagen-Cocktails. In der nur wenige Tage später veröffentlichten Studie von Loc Carillo et al. (2005) wurden I) der Vergleich dreier Behandlungsdosen, II) das Reduktionspotenzial zwei verschiedener Phagen für ein Campylobacter-Isolat, III) das Reduktionspotenzial eines Phagen gegen zwei verschiedene Campy- lobacter-Isolate, IV) das Ausmaß der Resistenzentwicklung sowie die Stabilität der resistenten Isolate in-vivo und in-vitro beschrieben. Im Jahr 2009 wurde eine weitere Studie zur experimentellen Phagen-Therapie von El Shibiny et al. (2009b) veröffentlicht die sich mit dem Einsatz eines Phagen befasst, der sowohl gegen C. jejuni als auch C. coli wirksam ist. Die von Carvalho et al. (2010) veröffentlichte Studie aus dem Jahr 2010 vergleicht die Effektivität eines Drei-Phagen-Cocktails gegen C. coli und C. jejuni nach einmaliger Verabreichung in den Kropf und nach kontinuierlicher Aufnahme über das Futter. Anders als in den vorherigen Studien wurde der Bakterien- und Phagen-Gehalt in dieser Studie lediglich mit Hilfe von Kloakentupfern bestimmt, um die benötigten Tierzahlen gering zu halten. Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist, dass die Höhe der Ausscheidung von Campy- lobacter erfasst und für jedes einzelne Tier im zeitlichen Verlauf verfolgt werden kann. Zusätzlich wurde der Grad der Resistenzentwicklung bestimmt und die Stabilität der Resistenz bei wiederholter Darmpassage ohne den Selektions- druck der Phagen für einige Isolate untersucht.

(31)

2.4.Untersuchungen zum Einsatz von Bakteriophagen gegen Campylobacter

2.4.2. Campylobacter-Stämme

In den beschriebenen Studien kamen verschiedene C. jejuni und C. coli Stämme zum Einsatz. Wagenaar et al. (2005) verwendeten den 1991 in den Niederlanden isolierten C. jejuni Stamm C356 (JACOBS-REITSMA et al. 1995). In zwei weiteren Studien wurde das C. jejuni Isolat HPC5 verwendet (LOC CARRILLO et al. 2005; EL- SHIBINY et al. 2009b). Weiterhin kamen die Isolate C. jejuni GIIC 8 (LOC CARRILLO et al. 2005) und C. jejuni 2140CD1 (CARVALHO et al. 2010) zum Einsatz. Alle C. jejuni Isolate stammen aus kommerziellen Broilerherden. Die ausgewählten C. coli Isolate stammten aus einer Biohühnerhaltung (C. coli OR12)(EL-SHIBINY et al.

2009b) sowie aus einer kommerziellen Broilerherde (C. coli A11)(CARVALHO et al.

2010).

2.4.3. Kolonisationsmodelle

Im Vorfeld der Untersuchungen zur Phagen-Therapie wurden Kolonisationsmodelle für Campylobacter im Broiler etabliert (LOC CARRILLO et al. 2005; CARVALHO et al. 2010). Dafür wurden im ersten Schritt Broiler im Alter von 20-22 Tagen mit unterschiedlichen Dosen von Campylobacter infiziert und der Erreger nach 48 Stunden aus Dünndarm und Blinddarm reisoliert. Die hohe Gabe von log10 7,9 KBE/Tier ergab reproduzierbare Ergebnisse. Im nächsten Schritt wurden zwei Campylobacter-Isolate in einer Dosis von log10 8 KBE/Tier an 20 Tage alte Broiler verabreicht und die Erregerkonzentration nachfolgend täglich über einen Zeitraum von 7 Tagen wie zuvor bestimmt.

Campylobacter war in der Regel nach 24 Stunden, maximal jedoch nach 48 Stunden im gesamten Darm nachweisbar. Die Kolonisation hielt über den gesamten Unter- suchungszeitraum an. Der Erreger konnte nicht in Leber, Pankreas, Herz und Niere nachgewiesen werden. Die erhobenen Daten wurden bei der Erstellung der Phagen- Therapie-Versuche berücksichtigt (LOC CARRILLO et al. 2005).

(32)

2.4.4. Phagen

Alle verwendeten Phagen wiesen die für die Familie der Myoviridae typischen Merk- male auf. Dies ist von Bedeutung, da die meisten Angehörigen der Myoviridae den für die Phagen-Therapie gewünschten lytischen Infektionszyklus induzieren (SAILS et al. 1998; COFFEY et al. 2010). Zum Einsatz kamen sowohl bekannte Phagen (NCTC 12671 und 12669), als auch aus Geflügelexkrementen oder von Geflügel- karkassen isolierte Phagen (WAGENAAR et al. 2005; CARVALHO et al. 2010). Aus- gewählt wurden Phagen mit einem breiten Lysespektrum gegen C. jejuni und/oder C. coli-Isolate, die unter anderem von infizierten Menschen oder aus Broilerherden stammten. Weitere Auswahlkriterien waren die pH-Stabilität, die Haltbarkeit während der Lagerung, eine leichte Vermehrbarkeit (LOC CARRILLO et al. 2005), sowie bei der Zusammenstellung eines Cocktails ein sich gegenseitig ergänzendes Lyse- spektrum (WAGENAAR et al. 2005). Da bei in-vitro Untersuchungen ein niedriger pH-Wert innerhalb von 24 Stunden entweder zu einem starken Konzentrationsabfall der Phagen führte oder keine Phagen mehr nachgewiesen werden konnten, wurde der Phagen-Suspension vor Verabreichung an die Tiere zum Ausgleich des sauren Magen pH 30% CaCO3 zugesetzt (EL-SHIBINY et al. 2009b). Die Verabreichung von CaCO3 hatte in Vorversuchen keinen Effekt auf den Campylobacter-Gehalt im Darm der Tiere (LOC CARRILLO et al. 2005).

2.4.5. Bisher gewonnene Erkenntnisse

2.4.5.1. Campylobacter

Der Campylobacter-Gehalt im Darm der Tiere schwankte tierindividuell beachtlich (EL-SHIBINY et al. 2009b). Die Behandlung der Tiere mit Phagen führte im Vergleich zur Kontrolle entweder zu einer dauerhaften Senkung (CARVALHO et al. 2010) oder lediglich zu einem initialen Abfall des Keimgehaltes um log10 2,1 KBE/g bis log10 5,6 KBE/g Darminhalt (LOC CARRILLO et al. 2005; WAGENAAR et al. 2005;

EL-SHIBINY et al. 2009b). Nachfolgend stieg der Keimgehalt wieder an, sodass sich

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ein langfristiges Reduktionspotenzial von etwa einer Log-Stufe abzeichnete (WAGENAAR et al. 2005; EL-SHIBINY et al. 2009b) oder sogar kein Unterschied zwischen Versuchs- und Kontrollgruppe mehr festgestellt werden konnte (LOC CARRILLO et al. 2005). Ein abwechselndes Auf und Ab des Bakterien- und Phagen- Gehaltes im Blinddarm wurde von den Autoren als alternierende Vermehrung von Bakterien und Phagen interpretiert (WAGENAAR et al. 2005).

Die Auswahl des richtigen Phagen hatte einen entscheidenden Einfluss auf die Höhe der erzielbaren Campylobacter-Reduktion (LOC CARRILLO et al. 2005).

Eine präventive Behandlung mit Phagen konnte die Kolonisation von Campylobacter nicht verhindern, aber verglichen mit der kurativen Behandlung herauszögern (WAGENAAR et al. 2005).

Der Vergleich verschiedener Behandlungsdosen ergab, dass die mittlere Dosis von log10 7 PBE/Tier im Schnitt die besten Ergebnisse erzielte. Höhere Dosen von log10 9 PBE/Tier führten nur zu kurzfristigen Reduktionen, niedrigere Dosen von log10 5 PBE/Tier führten durchaus vereinzelt zu hohen Reduktionen, waren jedoch langfristig weniger effektiv als die mittlere Behandlungsdosis von log10 7 PBE/Tier (LOC CARRILLO et al. 2005; EL-SHIBINY et al. 2009b).

Auch das unterschiedliche Siedlungsverhalten der verwendeten Campylobacter- Stämme in den einzelnen Darmabschnitten hatte einen Einfluss auf den Erfolg der Phagentherapie, wobei Campylobacter-Stämme die auch den oberen Dünndarm erfolgreich besiedeln möglicherweise einen förderlichen Effekt auf ein Angehen der Phagen-Infektion haben (EL-SHIBINY et al. 2009b).

Die Verabreichung der Phagen über das Futter anstelle der manuellen Ver- abreichung direkt in den Kropf der Tiere verbesserte die Wirksamkeit der eingesetzten Phagen (CARVALHO et al. 2010).

2.4.5.2. Phagen

Die Phagen waren in der Lage, sich im Blinddarm Campylobacter-positiver Tiere stabil zu erhalten und zu vermehren. In den Ausscheidungen Campylobacter-freier Tiere waren die Phagen maximal noch 24 Stunden nach Verabreichung nachweis-

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bar, konnten sich aber nicht langfristig im Darmtrakt der Tiere festsetzen (LOC CARRILLO et al. 2005; WAGENAAR et al. 2005). Die gemessenen Konzentrationen der Phagen im Darm korrelierten nicht mit einfachen Verdünnungen der Behand- lungsdosis durch das Volumen der Darmingesta, was bedeutet, dass innerhalb der ersten 24 Stunden bereits eine Vermehrung der Phagen stattgefunden hatte (LOC CARRILLO et al. 2005; EL-SHIBINY et al. 2009b). Weiterhin bewegten sich die Phagen-Konzentrationen auf einem stabilen Niveau zwischen 10⁴ und 10⁵ PBE/g Darminhalt (WAGENAAR et al. 2005; EL-SHIBINY et al. 2009b; CARVALHO et al.

2010). Einen starken Einfluss auf die Höhe der Phagen-Konzentration hatte die ver- wendete Campylobacter-Phagen-Kombination (CARVALHO et al. 2010). Bei keinem der Tiere wurde ein gesundheitlich nachteiliger Effekt aufgrund der Phagen- Behandlung festgestellt (WAGENAAR et al. 2005). Ein Nachweis der oral ver- abreichten Phagen aus Herz, Leber, Milz und Niere gelang nicht (LOC CARRILLO et al. 2005).

2.4.5.3. Resistenz

Das Ausmaß der Resistenzbildung gegen die eingesetzten Phagen und die Stabilität der Resistenzen wurde für Campylobacter-Isolate aus mehreren in-vivo und in-vitro Untersuchungen ermittelt. Dabei stellte sich heraus, dass derselbe Campylobacter- Stamm unterschiedlich stark auf verschiedene Phagen-Stämme mit Resistenzbildung reagieren kann (LOC CARRILLO et al. 2005; EL-SHIBINY et al. 2009b). Resistente Isolate aus in-vitro Untersuchungen behielten ihre Resistenz auch nach fünfmaliger Subkultivierung (LOC CARRILLO et al. 2005). Einmalig konnte schon vor der Behandlung 6% spontan resistente Isolate aus den Tieren gewonnen werden (CARVALHO et al. 2010), anderweitig gelang der Nachweis spontan resistenter Isolate aus unbehandelten Tieren nicht (LOC CARRILLO et al. 2005). Bei behandelten Tieren betrug der Anteil der Isolate, die eine Resistenz entwickelt hatten, 2% bis 13% (LOC CARRILLO et al. 2005; EL-SHIBINY et al. 2009b;

CARVALHO et al. 2010). Sowohl spontan resistente Isolate, als auch Isolate, die ihre Resistenz erst nach der Phagen-Behandlung erworben hatten, wurden im

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Kolonisationsmodell getestet. Die zur Resistenz führenden Veränderungen können, müssen aber nicht zu einer Verminderung der Kolonisationsfähigkeit führen (LOC CARRILLO et al. 2005; CARVALHO et al. 2010). Ebenso gehen die Angaben über den Erhalt der Resistenz während einer erneuten Darmpassage ohne den Selektionsdruck durch die Phagen weit auseinander. Zwischen 54% und 97% der resistenten Isolate wurden wieder empfänglich für eine Phagen-Infektion (LOC CARRILLO et al. 2005; CARVALHO et al. 2010). Interessanterweise wurden dabei in einer Untersuchung der Isolate von den Tieren, die mit einem schon vor Behandlung resistenten Isolat besiedelt wurden, zu etwa 86% wieder empfänglich. Dagegen wurden nur 54% der Campylobacter-Population in den Tieren, die mit Isolaten be- siedelt waren, die ihre Resistenz erst durch die Behandlung erworben hatten, an- schließend wieder empfänglich (CARVALHO et al. 2010). Die vor der Behandlung bereits bestehende Resistenz und die durch die Behandlung erworbene Resistenz waren also unterschiedlich stabil, was vermuten lässt, dass verschiedene bakterielle Abwehrmechanismen zur Resistenz geführt hatten.

(36)

3. Problemstellung und Ziel der Arbeit

3.1. Problemstellung

Weder die Prävalenz von Campylobacter in Geflügelfleisch noch die dadurch ver- ursachten Erkrankungsfälle des Menschen konnten in den letzten Jahren vermindert werden (MORAN et al. 2009; EFSA 2012). Es ist schwierig die Einschleppung von Campylobacter in Geflügelherden zu verhindern, da bereits eine sehr geringe Anzahl von 40 KBE/Tier der ubiquitär vorkommenden und sehr gut ans Geflügel adaptierten Erreger ausreicht, um den Darm der Tiere zu kolonisieren (CAWTHRAW et al. 1996;

OGDEN et al. 2009). An vielen Stellen der Produktionskette „from farm to fork“ kann es zu einer Kontamination der Lebensmittel mit Campylobacter kommen (ROSENQUIST et al. 2003; REICH et al. 2008; ELLERBROEK et al. 2010). Daher wurde entlang der gesamten Kette, angefangen bei den Biosicherheitsmaßnahmen bis hin zur Aufklärung des Verbrauchers nach möglichen Kontrollpunkten gesucht, um das Risiko des Verbrauchers zu minimieren an Campylobacteriose zu erkranken (LAMMERDING u. FAZIL 2000; ROSENQUIST et al. 2003; WAGENAAR et al. 2006;

HAVELAAR et al. 2007; KLEIN 2010; HERMANS et al. 2011; OSIRIPHUN et al.

2011; PASQUALI et al. 2011; GHAREEB et al. 2013). Die Reduktion der Campylobacter-Besiedlung wurde dabei zwar als effiziente Maßnahme bewertet, jedoch wird ein deutlicher Abfall der Infektionsraten auf Herdenebene in näherer Zukunft nicht erwartet (HAVELAAR et al. 2007), da noch keine effektiven, zuverlässigen und praxis-geeigneten Maßnahmen zur Verfügung stehen, um die Besiedlung der Herden mit Campylobacter zu verhindern oder zu reduzieren (LIN 2009; GHAREEB et al. 2013). Es wurden drei grundlegende Ansätze vorgeschlagen, mit denen Campylobacter-Infektionen auf Herdenebene begegnet werden soll:

I) die Reduktion des Eintrags von Campylobacter aus der Umwelt, II) die Steigerung der Immunität des Geflügels gegen den Erreger, und III) der Gebrauch alternativer antimikrobieller Wirkstoffe, um Campylobacter

aus dem Geflügel zu eliminieren oder die Besiedlung zu minimieren (LIN 2009).

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3.2.Ziel der Arbeit

Angesichts der zunehmenden Zahl von Tieren, die im Freiland gehalten werden und die damit direkt den in der Umwelt vorkommenden Erregern ausgesetzt sind (NATHER et al. 2009), sowie angesichts des direkten Zusammenhangs zwischen intestinaler Kolonisation und daraus folgender Kontamination der Schlachtkörper (BERRANG et al. 2004) gewinnen die Maßnahmen, die den Campylobacter-Gehalt in den Tieren vermindern, zunehmend an Bedeutung. Das Potenzial der Phagen, Campylobacter im Blinddarm zumindest kurzfristig um etwa zwei Zehnerpotenzen zu reduzieren wurde bereits erkannt, über das Ausmaß und insbesondere den zeitlichen Verlauf der Resistenzbildung ist hingegen sehr wenig bekannt und ihre Bedeutung wird unterschiedlich bewertet.

3.2. Ziel der Arbeit

In vorausgegangenen Untersuchungen zur Wirksamkeit von Phagen gegen 11 Campylobacter-Feldisolate wurden in einer in-vitro Studie aus insgesamt 16 Phagen die vier wirksamsten Phagen ausgewählt und zu einem Cocktail zusam- mengefügt (HIRSCH 2010). Der Cocktail aus vier Phagen erwies sich in diesen Untersuchungen im Vergleich zu einem Cocktail aus allen 16 Phagen als wirksamer.

Da in-vivo Untersuchungen bisher nicht erfolgt waren sollte im Rahmen dieser Dissertation die Wirksamkeit des „kleinen Cocktails“ aus vier Phagen im Vergleich zu einem Einzel-Phagen an experimentell mit einem empfänglichen C. jejuni Feldstamm inokulierten Broilern unter kontrollierten Bedingungen in-vivo getestet werden. Ins- besondere soll der zeitliche Verlauf von Erhalt und Verlust der Empfänglichkeit von Campylobacter für die eingesetzten Phagen berücksichtigt werden. Dafür sollte zuerst ein vereinfachter Empfänglichkeitstest erprobt werden, der einen hohen Probendurchsatz ermöglicht.

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Folgende Fragestellungen liegen dieser Arbeit zugrunde:

I) Vereinfachung des Phagen-Empfänglichkeitstest

• Lässt sich der konventionelle Test zur Bestimmung der Empfänglichkeit bzw.

Resistenz eines Campylobacter-Stammes gegen einen Phagen-Stamm vereinfachen?

• Welche Aussagekraft besitzt dieser vereinfachte Empfänglichkeitstest?

II) Einsatz von Phagen gegen Campylobacter im Broiler IIa) Phagen

• Sind die eingesetzten Phagen in der Lage sich im Darm der Broiler zu halten und zu vermehren? Welche Konzentrationen erreichen sie dabei?

IIb) Campylobacter

• Führt eine Behandlung mit den in-vitro wirksamen Phagen auch im Broilerdarm zu einer Reduktion von Campylobacter?

• Bringt der Cocktail im Vergleich mit dem Einzel-Phagen einen Vorteil hinsichtlich der Reduktion von Campylobacter?

IIc) Empfänglichkeit und Resistenz

• Entwickelt Campylobacter Resistenzen gegen die eingesetzten Phagen und sind alle Phagen sowie der Cocktail gleich stark von der Resistenzbildung betroffen?

• Wie stellt sich die Resistenzentwicklung im zeitlichen Verlauf dar?

• Hat die Entstehung von Resistenzen Auswirkungen auf die Wirksamkeit der Phagen im Tier und bringt der Cocktail im Vergleich mit dem Einzel-Phagen einen Vorteil hinsichtlich der Resistenzbildung von Campylobacter gegen die eingesetzten Phagen?

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4.1.Zur Dissertation gehörige Fachartikel

4. Publikationen

4.1. Zur Dissertation gehörige Fachartikel Dieser Dissertation liegen zwei Publikationen zugrunde.

Der erste Fachartikel befasst sich mit der Anpassung einer konventionellen Methode zur Feststellung der Empfänglichkeit oder Resistenz eines Bakterien-Stammes für einen Phagen-Stamm an das Mikrotiterplatten-Format. Ziel dieser Anpassung war, eine einfachere, schnellere und Material-sparende Methode zu etablieren.

Der zweite Fachartikel beschäftigt sich mit den Fragen, die den Einsatz von Phagen im Broiler betreffen.

Fachartikel 1:

FISCHER, S., S. KITTLER, G. KLEIN u. G. GLÜNDER (2013):

Microplate-test for the rapid determination of bacteriophage-susceptibility of Campylobacter isolates-development and validation.

PLoS One 8, e53899

Fachartikel 2:

Impact of a single phage and a phage cocktail application in broilers on reduction of Campylobacter jejuni and development of resistance.

PLoS ONE 8(10), e78543

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4.2. Weitere Publikationen

Die Erstellung dieser Dissertation erfolgte im Rahmen eines längerfristig angelegten Projektes zur Etablierung von Strategien für den Einsatz von Phagen zur Verbesserung der Verbrauchersicherheit in Bezug auf die Zoonoseerreger C. jejuni und C. coli. Aus diesem Projekt entstanden u.a. folgende weitere Publikationen:

Fachartikel

HIRSCH, K. (2010):

Development of strategies for minimizing Campylobacter in poultry by utilizing bacteriophages.

Dissertation an der TiHo Hannover, Hannover

SOPHIE KITTLER; SAMUEL FISCHER, AMIR ABDULMAJWOOD; GERHARD GLÜNDER; GÜNTER KLEIN (2013):

Effect of bacteriophage application on Campylobacter jejuni loads in commercial broiler flocks.

Applied Environmental Micobiology 79, 7525-7533

SOPHIE KITTLER; SAMUEL FISCHER, AMIR ABDULMAJWOOD; GERHARD GLÜNDER; GÜNTER KLEIN (2013):

Colonisation of a phage susceptible Campylobacter jejuni population in two phage positive broiler flocks.

Manuskript eingereicht

Poster

Schnell-Test zum Nachweis Bakteriophagen-resistenter Campylobacter-Isolate.

Zentrumstag des Zentrums für Infektionsmedizin der TiHo Hannover, Hannover

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4.2.Weitere Publikationen

Einsatz von Bakteriophagen zur Reduzierung von Campylobacter in der Broilermast.

Zentrumstag des Zentrums für Infektionsmedizin der TiHo Hannover, Hannover

The potential of phage therapy to reduce Campylobacter colonization in broilers under consideration of bacterial resistance.

Zentrumstag des Zentrums für Infektionsmedizin der TiHo Hannover, Hannover FISCHER, S., S. KITTLER, G. KLEIN u. G. GLÜNDER (2013):

The potential of phage therapy to reduce Campylobacter colonization in broilers under consideration of bacterial resistance.

CHRO 17^th International Workshop on Campylobacter, Helicobacter and Related Organisms, Aberdeen

Vorträge

FISCHER, S. (2011):

Entwicklung komplementärer Minimierungsstrategien für Campylobacter im Geflügel durch die Anwendung von Bakteriophagen unter besonderer Berücksichtigung der Resistenzentwicklung von Campylobacter gegen Bakteriophagen.

Projektvorstellung.

Klinikseminar an der Klinik für Geflügel der TiHo Hannover, Hannover FISCHER, S. (2011):

Entwicklung komplementärer Minimierungsstrategien für Campylobacter im Geflügel durch die Anwendung von Bakteriophagen unter besonderer Berücksichtigung der Resistenzentwicklung von Campylobacter gegen Bakteriophagen.

Ergebnispräsentation

Klinikseminar an der Klinik für Geflügel der TiHo Hannover, Hannover

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Untersuchungen zur Campylobacter-Reduktion beim Broiler durch den Einsatz von Phagen und zum Einfluss der bakteriellen Phagen-Abwehr über die Dauer einer Mastperiode.

83. Fachgespräch über Geflügelkrankheiten, Hannover

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5.1.Vereinfachung des Phagen-Empfänglichkeitstest

5. Eigene Untersuchungen

5.1. Vereinfachung des Phagen-Empfänglichkeitstest

Campylobacter kann seine Empfänglichkeit für eine Phagen-Infektion mithilfe ver- schiedener Mechanismen verringern bis hin zur vollständigen Resistenz. Die ver- bleibende Empfänglichkeit wird als „Efficiency of plating“ (EOP) angegeben. Die EOP beschreibt, wie viele Phagen benötigt werden, damit ein Plaque entsteht. Sie ist damit ein Maß für die Effizienz einer Phagen-Infektion oder von der anderen Seite betrachtet ein Maß für die Empfänglichkeit einer Bakterienpopulation für einen bestimmten Phagen-Stamm. Diese Empfänglichkeit wird ins Verhältnis zur Empfänglichkeit des Referenzstammes gesetzt und dementsprechend in Prozent angegeben.

Für den herkömmlichen Nachweis der Empfänglichkeit oder der Resistenz eines Campylobacter-Isolates für einen Phagen wird eine Bakteriensuspension in ein durch Wärme verflüssigtes Nährmedium eingebracht und nach gründlicher Durchmischung zur Bebrütung in eine Petrischale gegossen, sodass eine dünne, von Bakterien gleichmäßig durchsetzte Nährmediumschicht entsteht. Diese Schicht verfestigt sich bei Abkühlung. Die Phagen können in diesem Prozess an zwei unterschiedlichen Punkten zugegeben werden: entweder wird die Phagen-Suspension bereits zusammen mit der Bakteriensuspension im verflüssigten Nährmedium gemischt, oder die Phagen-Suspension wird erst nach Verfestigung des Nährbodens auf die darin ent- haltene Bakterienkultur aufgetropft. Die wachsende Bakterienkultur trübt den Nähr- boden. Die Aktivität der Phagen wird daran erkannt, dass die Trübung durch die Phagen-bedingte Lyse der Bakterien ausbleibt. In Abhängigkeit der zugegebenen Phagen-Konzentration und der Empfänglichkeit der Bakterien entstehen dabei einzelne Plaques oder es kommt zur vollständigen Lyse der Bakterienkultur.

Diese konventionellen Verfahren benötigen einen hohen Einsatz an Material und Arbeitszeit. Deshalb wurde für diese Arbeit das erste oben genannte Verfahren, in dem die Phagen bereits dem Nährmedium zugegeben werden, an das Mikrotiter- platten-Format adaptiert.

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Insgesamt 800 unterschiedlich empfängliche Campylobacter-Isolate wurden an acht Terminen von Broilern gewonnen, die mit einem Campylobacter-Stamm infiziert und mit einem Phagen-Cocktail aus vier Phagen behandelt worden waren (Publikation 1, Tabelle 2) Jedes Campylobacter-Isolat wurde gegen jeden Phagen einzeln und zu- sätzlich gegen den Cocktail im Mikrotiterplatten-Test getestet. Die makroskopische Auswertung der Untersuchung dieser Isolate im neuen Testsystem erfolgte in vier Stufen: 0 = konfluente Lyse, 1 = semikonfluente Lyse, 2 = einzelne Plaques, 3 = kein Plaque (Abbildung1).

Stufe 0, konfluente Lyse Stufe 1, semikonfluente Lyse

Stufe 2, einzelne Plaques Stufe 3, kein Plaque

Abbildung 1 Die Einteilung der Lyse in Stufen für die Auswertung des Mikrotiterplatten-Tests

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5.1.Vereinfachung des Phagen-Empfänglichkeitstest

Zur Evaluierung der Aussagekraft wurde aus jeder Stufe eine Anzahl an Isolaten mit dem herkömmlichen Verfahren getestet und die EOP bestimmt. Die Ergebnisse sind für jede Stufe als Boxplot in der ersten Publikation dargestellt (Abbildung 3A-D). Die vier Stufen entsprachen erwartungsgemäß einer von Stufe 0 über die Stufen 1 und 2 hin zur Stufe 3 abnehmenden Empfänglichkeit. Für die Phagen 1 und 2 waren die Unterschiede in der EOP zwischen allen vier Stufen signifikant, für den Phagen 5 war die Anzahl der untersuchten Isolate zu gering, um einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den Stufen 0 und 1 bzw. 1 und 2 feststellen zu können. Für die Phagen 1, 2 und 5 enthielten die Stufen 0 bis 2 in feinen Abstufungen die hoch empfänglichen Isolate, in Stufe 3 befanden sich deutlich vermindert empfängliche und resistente Isolate. Dagegen konnte für Phage 13 im Mikrotiterplatten-Test kein Unterschied in der EOP der Stufen 0 bis 2 erkannt werden. Eine Unterscheidung war nur zwischen hoch empfänglich (Stufe 0-2) und vermindert empfänglich bis resistent (Stufe 3) möglich.

Im Mikrotiterplatten-Test konnten resistente Isolate mit einer Sensitivität von 100%

der Stufe 3 zugeordnet werden. Die Spezifität, dass ein in Stufe 3 eingeordnetes Isolat tatsächlich resistent war betrug für die Phagen 1, 2, 5 und 13 entsprechend 17%, 30%, 50% und 36%. Nimmt man anstelle von 0 Plaques einen Grenzwert von 20 Plaques im konventionellen Verfahren, der in früheren Studien als „Effektivi- tätsgrenzwert“ (FROST et al. 1999; LOC CARRILLO et al. 2005; LOC CARRILLO et al. 2007; EL-SHIBINY et al. 2009b) bei der Bestimmung von Lysisprofilen zugrunde gelegt wurde, so verbessert sich die Spezifität für Phage 1 und Phage 2 auf 50% und 60%.

Alle Isolate des Referenzstammes wurden in die Stufen 0-2 eingeordnet. Daher er- scheint eine Zusammenfassung dieser Stufen als „so empfänglich wie der Referenz- stamm“ in Abgrenzung zur Stufe 3 als „weniger empfänglich als der Referenzstamm oder resistent“ sinnvoll.

Abschließend kann festgehalten werden, dass sich die konventionelle Methode zur Ermittlung der Empfänglichkeit oder Resistenz eines Campylobacter-Isolates für