Cl. perfringens beim Broiler
– ein Beitrag zum Vorkommen in der kommerziellen Mast sowie experimentelle Untersuchungen zur Tenazität
des Erregers und seine Beeinflussung durch Kokzidieninfektionen –
INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Antje Walther aus Magdeburg
Hannover 2009
wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. G. Glünder Klinik für Geflügel
1. Gutachter: PD Dr. G. Glünder
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. J. Kamphues
Tag der mündlichen Prüfung: 13.05.2009
Meiner Familie
1 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG ...13
2 LITERATURÜBERSICHT ...14
2.1 Clostridien...14
2.1.1 Taxonomie und Eigenschaften der Gattung Clostridium...14
2.1.2 Toxine...15
2.1.3 Tenazität von Cl. perfringens...21
2.2 Clostridium perfringens beim Huhn...25
2.2.1 Epidemiologie ...25
2.2.2 Erkrankungen durch Cl. perfringens beim Huhn...30
2.2.2.1 Ätiologie und Pathogenese...30
2.2.3 Klinische Nekrotisierende Enteritis (NE) ...30
2.2.3.1 Prädisponierende Faktoren ...30
2.2.3.2 Symptome ...31
2.2.3.3 Pathologie...32
2.2.4 Subklinische Nekrotisierende Enteritis (SNE)...33
2.2.5 Cl. perfringens assoziierte Hepatitis (CPH) ...36
2.2.6 Diagnostik...37
2.2.6.1 Kultureller Nachweis ...39
2.2.6.2 NE Lesion Scoring ...41
2.2.6.3 Nachweis von Cl. perfringens und seinen Toxinen...41
2.2.6.4 Weitere Methoden zur Charakterisierung ...43
2.2.7 Therapie ...43
2.2.8 Prophylaxe...44
2.2.8.1 Reinigung ...44
2.2.8.2 Impfung...45
2.2.8.3 Leistungsförderer und Antikokzidia...48
2.2.8.4 Fütterung ...50
2.2.9 Einfluss anderer Erreger auf Cl. perfringens...56
2.2.9.1 Kokzidien ...56
2.2.9.2 Campylobacter spp...59
2.2.10 Infektionsmodelle...59
2.3 Clostridium perfringens bei anderen Tierarten...62
2.4 Clostridium perfringens beim Menschen ...64
2.4.1 Enteritis...64
2.4.2 Gasbrand/Gasödem ...65
2.4.3 Enteritis necroticans (Darmbrand) ...66
3 MATERIAL UND METHODEN...67
3.1 Materialien...67
3.1.1 Bakterienstämme...67
3.1.2 Geräte und Materialien ...68
3.1.3 Probengewinnung aus Tierkörpern...68
3.2 Diagnostik von Cl. perfringens...70
3.2.1 Bakteriologische Untersuchung ...70
3.2.1.1 Quantitative Untersuchung ...70
3.2.1.2 Qualitative Untersuchung ...72
3.2.2 Identifizierung von Cl. perfringens und Toxinbestimmung mittels PCR ...73
3.2.3 Identifizierung von Cl. perfringens und Toxinbestimmung mittels ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) ...74
3.3 Diagnostik von Campylobacter spp....77
3.4 Diagnostik der Kokzidien...77
3.5 Untersuchungen zur Tenazität von Cl. perfringens...78
3.6 Untersuchungen zum Vorkommen von Cl. perfringens im Tier
und in Tierbeständen ...82
3.6.1 Abschnitt A: Untersuchungen zum zeitlichen Verlauf einer Infektion mit Cl. perfringens...82
3.6.2 Abschnitt B: Felduntersuchungen zur Prävalenz von Cl. perfringens in verschiedenen Mastbetrieben...83
3.6.3 Abschnitt C: Experimentelle Untersuchungen zur Korrelation von Cl. perfringens mit E. tenella-Infektionen ...84
3.6.4 Abschnitt D: Untersuchungen zur Prävalenz von Cl. perfringens an verschiedenen Lokalisationen des Verdauungstraktes...88
3.7 Statistische Auswertung...89
4 ERGEBNISSE ...90
4.1 Untersuchungen zur Tenazität von Cl. perfringens...90
4.1.1 Tenazitätsversuch 1...90
4.1.2 Tenazitätsversuch 2...91
4.1.3 Tenazitätsversuch 3...96
4.2 Abschnitt A: Untersuchungen zum zeitlichen Verlauf einer Cl. perfringens-Infektion ...99
4.2.1 Clostridienbelastung in Abhängigkeit vom Alter der Broiler ...99
4.2.2 Lokalisation von Cl. perfringens im Darm ...101
4.2.3 Korrelation des Tiergewichts mit dem Clostridiennachweis ...101
4.2.4 Clostridienbelastung in den einzelnen Mastdurchgängen...103
4.2.5 Korrelation zwischen Clostridiennachweis und jahreszeitlichen Einflüssen ...104
4.2.6 Auswirkung von Antibiotika auf Cl. perfringens...106
4.2.7 Auswirkung von Antikokzidia auf Cl. perfringens...109
4.2.8 Einfluss des Gesundheitszustandes auf die Clostridienbelastung...110
4.2.9 Einfluss einer Kokzidieninfektion auf die Clostridienbelastung ...111
4.3 Abschnitt B: Felduntersuchungen zur Prävalenz von Cl. perfringens...113
4.3.1 Cl. perfringens im Verlauf der Mast ...113
4.3.2 Korrelation zwischen Clostridiennachweis und jahreszeitlichen Einflüssen ...115
4.3.3 Einfluss von Kokzidieninfektionen auf Cl. perfringens...117
4.3.4 Einfluss der Antikokzidia im Broiler-Futter auf Cl. perfringens...118
4.3.5 Korrelation zwischen Cl. perfringens und Infektionen mit Campylobacter spp. (Abschnitt A und B) ...119
4.4 Abschnitt C: Experimentelle Untersuchungen zur Korrelation von Cl. perfringens mit E. tenella-Infektionen...120
4.4.1 Versuche mit niedriger Infektionsdosis (15-80 Oozysten)...120
4.4.2 Versuche mit höherer Infektionsdosis (20.000 Sporozoiten) ...123
4.5 Abschnitt D: Untersuchungen zur Prävalenz von Cl. perfringens an verschiedenen Lokalisationen des Verdauungstraktes...131
4.5.1 Vergleich von Ileum und Jejunum...131
4.5.2 Vergleich von Ileum und Zäkum ...136
4.5.3 Vergleich von Ileum und Kot...136
4.6 Abschnitt E: Bestimmung des Toxintyps von Cl. perfringens mittels ELISA und PCR ...138
5 DISKUSSION ...140
5.1 Qualitativer und quantitativer Nachweis von Cl. perfringens...140
5.2 Untersuchungen zur Tenazität von Cl. perfringens...142
5.3 Bewertung der Ergebnisse aus Abschnitt A und B ...145
5.3.1 Prävalenz von Cl. perfringens in den untersuchten Betrieben ...145
5.3.2 Zeitlicher Verlauf der Cl. perfringens-Infektion...147
5.3.3 Einfluss der Jahreszeit (Temperatur und Niederschlagsmenge) ...149
5.3.4 Einfluss der verwendeten Antibiotika ...150
5.3.5 Einfluss der verwendeten Antikokzidia ...151
5.3.6 Einfluss von Kokzidieninfektionen im Abschnitt A und B ...152
5.3.7 Einfluss von Campylobacterinfektionen ...152
5.3.8 Einfluss des Tiergewichts ...153
5.4 Bewertung der Ergebnisse des Abschnitts C (Korrelation von Cl. perfringens mit E. tenella-Infektionen) ...154
5.5 Bewertung der Ergebnisse des Abschnitts D (Prävalenz an verschiedenen Lokalisationen im Darm) ...156
5.6 Bewertung der Ergebnisse des Abschnitts E (Bestimmung des Toxintyps mittels ELISA und PCR) ...158
5.7 Schlussfolgerungen ...159
6 ZUSAMMENFASSUNG ...162
7 SUMMARY ...166
8 LITERATURVERZEICHNIS ...170
9 ANHANG...197
9.1 Ergänzende Abbildungen ...197
9.2 Ergänzende Tabellen...198
DANKSAGUNG ...252
Abkürzungsverzeichnis
Ak Antikörper
bzw. beziehungsweise
CCUG Culture Collection, University of Gothenburg, Sweden CEF Competitive Exclusion Flora
CLP Cl. perfringens
Cl. perfringens Clostridium perfringens
CPH Cl. perfringens assoziierte Hepatitis dNTP Desoxynucleotid-Triphosphate
DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
EU Europäische Union
IgG Immunglobulin G
KBE Kolonie bildende Einheiten
kDa Kilo Dalton
Lag-Phase Latenzphase, in der die Bakterien ihren Stoffwechsel auf die neuen Kulturbedingungen einstellen. In dieser Phase vermehren sie sich nicht oder nur sehr langsam.
LFG Lehr- und Forschungsgut
LG Lactose-Gelatine-Medium
log10 Logarithmus zur Basis 10
MHC Major Histocompatibility Complex
MLD Mouse Lethal Dose
MNT Maus-Neutralisations-Test NE Nekrotisierende Enteritis
ng Nanogramm
NM Nitrat Motility Medium PCR Polymerase Chain Reaction
pg Pikogramm
p.i. post infectionem
PLC Phospholipase C
PNS Peripheres Nervensystem
SFP-Agar Shahidi-Ferguson-perfringens-Agar SNE subklinische Nekrotisierende Enteritis SPS Sulfit-Polymyxin-Sulfadiazin-Agar
STABW Standardabweichung
TGY-Medium Tryptone-Glucose-Yeast Extract-Medium TMPS Trimethoprim-Sulfadiazin
TSC-Agar Tryptose Sulfite Cycloserine Agar TSN-Agar Trypton-Sulfit-Neomycin-Agar
w/v weight/volume
z.B. zum Beispiel
ZNS Zentrales Nervensystem
1 Einleitung und Zielsetzung
Clostridium perfringens verursacht beim Geflügel die Nekrotisierende Enteritis (NE), eine Geflügelkrankheit mit weltweiter Bedeutung (SLUIS 2000a; YEGANI u. KORVER 2007). Sie tritt sowohl in der klinischen als auch in der subklinischen Form auf, wobei beide Formen die Performance in der Geflügelmast und auch die Legeleistung erheblich beeinflussen (KALDHUSDAL u. LOVLAND 2002). Durch die offenbar weit verbreitete und an Häufigkeit zunehmende subklinische Krankheitsform stellt die NE vor allem ein wirtschaftliches Problem dar (SLUIS 2000b; WILSON et al. 2005).
Von verschiedener Seite wird angenommen, dass sich diese Problematik durch das Verbot von antibiotischen Leistungsförderern im Geflügelfutter in der EU seit dem 01.01.2006 [VO (EG) 1831/2003 Art.11 Abs.2] verschärft, da durch diese Substanzen auch die Nekrotisierende Enteritis unter Kontrolle gehalten wurde (ELWINGER et al.
1994; KALDHUSDAL u. LOVLAND 2002; YEGANI u. KORVER 2007). Außerdem ist nicht auszuschließen, dass in Zukunft auch der Einsatz von Antikokzidia beschränkt werden könnte, welche ebenfalls direkt oder indirekt hemmend auf Cl. perfringens wir- ken (KEPPELHOFF-WIECHERT 2003; GUILLOT 2004). Dadurch ist das Risiko für die Entstehung der NE in den letzten Jahren gestiegen (WILLIAMS 2005). Die wirtschaft- lichen Verluste durch die NE werden bereits jetzt als nicht unerheblich eingestuft und ihre weitere Steigerung durch das Verbot der Leistungsförderer und die gleichzeitig eingeschränkte Verfügbarkeit von Futtermitteln, insbesondere tierischem Eiweiß, sowie durch den Wandel im Management der Betriebe wird vermutet (MCDEVITT et al. 2006).
Das Ziel dieser Arbeit ist es, Daten zum aktuellen Auftreten von Cl. perfringens in ausgewählten Broilerbeständen zu erheben. Es soll untersucht werden, inwiefern Cl. perfringens-Infektionen mit dem klinischen und dem pathologisch-anatomischen Gesundheitsstatus der Tiere sowie dem Nachweis von Campylobacter spp. und Kokzi- dien korrelieren. Gleichzeitig findet eine Auswertung unter jahreszeitlichen Aspekten und zur Auswirkung des Einsatzes von Kokzidiostatika sowie Antibiotika statt.
Außerdem wird versucht, die Prävalenz von Cl. perfringens unter Berücksichtigung von Tieralter und Gewichtsentwicklung zu bewerten.
2 Literaturübersicht
2.1 Clostridien
2.1.1 Taxonomie und Eigenschaften der Gattung Clostridium
Das Genus Clostridium enthält über 60 Spezies von grampositiven, anaeroben, sporenbildenden Stäbchen, welche eine Vielzahl von Erkrankungen bei Mensch und Tier verursachen (BRYANT et al. 2006). Cl. perfringens ist mit dem Großteil dieser Spezies nur entfernt verwandt. Nach neuester Nomenklatur werden die Bakterien der Ordnung Clostridiales entsprechend ihrer evolutionären Zusammengehörigkeit in Cluster eingeteilt. Cl. perfringens und viele andere pathogene Clostridien gehören zum Cluster I, während der überwiegende Teil der Bakterien im Gastrointestinaltrakt von Mensch und Huhn dem Cluster XIVa zugeordnet werden. Viele dieser Bakterien im Cluster XIVa besitzen eine für den Organismus positive Funktion, zum Beispiel die Produktion von Buttersäure, welche das Darmepithel positiv beeinflusst (APAJALAHTI u. KETTUNEN 2006).
Cl. perfringens ist unbeweglich und bildet eine Kapsel. Die plumpen Stäbchen sind 0,9-1,3 x 3-9 µm groß. Ihre Länge variiert auch mit der Zusammensetzung des Wachstumsmediums. In stärkereichen Medien wachsen lange Stäbchen, in glucose- reichen Sporulationsmedien wachsen kurze Stäbchen (LABBE 1989; LABBE u. SHIH 1997; HINZ 2005). Cl. perfringens vermehrt sich in einem sehr breiten Temperaturbereich von 15°C bis 50°C mit einem Optimum zwischen 41°C und 45°C (WILLARDSEN et al. 1978; LABBE 1989). Auf Blutagarplatten wächst Cl. perfringens mit einer Doppelzonenhämolyse, welche dadurch zustande kommt, dass das theta- Toxin durch sein niedrigeres Molekulargewicht weiter diffundieren kann als das alpha-Toxin und so einen zweiten Hämolysehof bildet (GARCIA SUÁREZ 1993).
Die von Cl. perfringens gebildeten Sporen sitzen zentral oder subterminal (GARCIA SUÁREZ 1993). In Kulturpräparaten findet meist keine Sporulation statt (HINZ 2005).
Nach wie vor ist unklar, welche Substanz als Sporulationsfaktor dient. Bekannt ist hingegen, dass der Sporulationsfaktor konzentrationsabhängig, sowie hitze- und säurestabil ist und dass er von vegetativen und auch sporenbildenden Kulturen gebildet wird. Die Sporulation lässt sich durch die Zusammensetzung des Mediums beeinflussen. So wirken ein pH-Wert von 7,8, ein Temperaturbereich von 35-40°C und Koffeinzusatz begünstigend, während z.B. Guanosin oder hohe Konzentrationen von Kohlenhydraten die Sporulation hemmen (LABBE u. SHIH 1997).
In der Broilerproduktion hat Cl. perfringens unter den anaeroben Bakterien die größte Bedeutung als krankheitsauslösender Keim (NORTON u. HOERR 1999). Strittig ist allerdings, ob Cl. perfringens zur natürlichen Darmflora gehört. Während SHANE et al. (1984) den Erreger nur unregelmäßig im Darm gesunder Hühner nachweisen konnten, sehen MATEOS et al. (2002) das Bakterium zwar als normalen Bewohner des Blinddarmes, aber nicht des Dünndarms an. Viele Forscher sind jedoch der Meinung, dass Cl. perfringens bei gesunden Broilern auch im Dünndarm regelmäßig in geringen Mengen vorkommt (ELWINGER et al. 1994; ELWINGER et al. 1998;
NORTON 2000).
Die Menge an Cl. perfringens in gesunden Tieren wird auch von den Komponenten des Immunsystems beeinflusst, die mit dem MHC assoziiert sind. Einige Tiere scheinen eine angeborene Resistenz zu besitzen, während andere empfindlicher sind. Unklar ist, ob die Erkrankung an Nekrotisierender Enteritis bzw. subklinischer Nekrotisierender Enteritis eher bei den Tieren mit einer hohen oder bei denen mit einer niedrigen Cl. perfringens-Belastung auftritt (NORTON 2000).
2.1.2 Toxine
Obwohl bekannt ist, dass Cl. perfringens eine Vielzahl von Darmerkrankungen verursacht, weiß man nur wenig über den Zusammenhang zwischen den einzelnen Toxintypen und den durch sie hervorgerufenen Krankheitsbildern (WATERS et al.
2003). Bekanntermaßen exprimiert Cl. perfringens zahlreiche Toxine (Tabelle 14, Tabelle 15, im Anhang), welche für die Entstehung der einzelnen Erkrankungen verantwortlich sind. Die Toxine bilden Poren oder Kanäle in der Plasmamembran der Zielzellen. Außerdem schädigen sie die Gewebe, behindern Nervenfunktionen und zerstören rote Blutkörperchen, wodurch die Sauerstoffversorgung der Gewebe beeinträchtigt wird (NORTON u. HOERR 1999; SMEDLEY et al. 2004).
Cl. perfringens-Enterotoxin verursacht Lebensmittelvergiftungen beim Menschen, indem es nach Interaktion mit Zell-Zell-Verbindungen, den Tight junctions, im Darm Poren bildet. Ebenso formen das epsilon-Toxin und das beta-Toxin Poren in Zellmembranen innerhalb und auch außerhalb des Darmes (SMEDLEY et al. 2004).
NORTON (2000) vertritt die Meinung, dass Cl. perfringens bei gesunden Broilern in geringen Mengen vorkommt und auch über die Fähigkeit verfügt, Toxine zu bilden, es aber nicht immer tut. Dies ist darin begründet, dass Bakterien danach streben, so wenig Energie wie möglich aufzubringen, um zu überleben. Solange also Cl. perfringens keinen negativen Umweltbedingungen ausgesetzt ist, exprimiert es keine Toxine. Die Enterozyten signalisieren den Bakterien, dass „alles in Ordnung“
ist. Entsteht eine Darmschädigung, verändert sich das Signal und das Bakterium deutet dies als Gefahrensituation, wodurch es beginnt, Toxine als Kolonisationsfaktor zu bilden. Da diese Toxine ihrerseits neue Alterationen der Darmmukosa hervor- rufen, entsteht eine Art Circulus vitiosus.
Die Toxinbildung ist außerdem von der Temperatur abhängig, da die Toxin- Genpromotoren temperaturgesteuert sind. Deren höchste Aktivität liegt bei 37°C.
Diese wird allerdings durch die Anwesenheit von Glucose gehemmt (KARLSSON et al. 2003). Die Erzeugung von Toxinen verleiht den Clostridien einen Selektionsvorteil gegenüber anderen Bakterien im Organismus, indem sie die Kolonisation und Reproduktion unterstützen (SAWIRES u. SONGER 2006). Stämme von Tieren mit Nekrotisierender Enteritis haben ein größeres Toxinbildungsvermögen, bilden aber seltener Hyaluronidase und sind häufiger hitzeresistent als die Stämme gesunder Tiere (KÖHLER, B. et al. 1974a).
Haupttoxine
Die Einteilung von Cl. perfringens in die Toxintypen A bis E basiert auf Unter- schieden bezüglich der Bildung der Haupttoxine alpha, beta, epsilon und iota, für die folgende Gene kodieren: cpa, cpb, etxD und iap. Dabei exprimieren Typ A-Stämme nur das alpha-Toxin, Typ B-Stämme alpha-, beta- und epsilon-Toxin, Typ C-Stämme alpha- und beta-Toxin, Typ D alpha- und epsilon-Toxin, Typ E-Stämme alpha- und iota-Toxin (Tabelle 3).
Cl. perfringens alpha-Toxin ist ein hämolysierendes, letales, dermonekrotisierendes Toxin, das von nahezu allen Stämmen gebildet wird. Es besteht aus der Phospholipase C und einer Sphingomyelinase (HALE u. STILES 1999; SAKURAI et al. 2004). Das alpha-Toxin schädigt die Mitochondrien der Enterozyten und wirkt epitheliotoxisch (VISSIENNON et al. 1994). Die Stärke seiner Expression ist mit der Zellproliferation korreliert (SI et al. 2007). Geflügel reagiert zehnmal empfindlicher auf alpha-Toxin von Cl. perfringens als Säugetiere. Dafür ist es sehr resistent gegen beta- und epsilon-Toxin (KÖHLER, B. 2000a).
Das von Cl. perfringens gebildete beta-Toxin ist letal für Tiere, aber nicht hämolysierend und wirkt in ZNS und PNS. Gemeinsam mit dem alpha-Toxin ist es für die Darmwandnekrose verantwortlich (SAKURAI et al. 2004; SHARMA, S. P. D.
2007).
Einige Isolate produzieren auch das erst kürzlich entdeckte beta2-Toxin, welches mit dem Clostridien-induzierten Durchfall bei Schweinen in Zusammenhang steht und möglicherweise eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und dem Fortschreiten der Typhlocolitis des Pferdes spielt (GIBERT et al. 1997; HERHOLZ et al. 1999;
GARMORY et al. 2000). Dabei konnten WATERS et al. (2003) das beta2-Toxin bei allen 39 untersuchten Cl. perfringens-Stämmen nachweisen. Dagegen gelang es nicht, das Gen für das beta2-Toxin (cpb2) bei Isolaten aus der normalen Flora von Vögeln nachzuweisen. Alle getesteten Vogel-Stämme erwiesen sich als Typ A- Stämme (SAWIRES u. SONGER 2006).
Enterotoxin
Das Cl. perfringens-Enterotoxin (CPE) ist das am besten untersuchte Toxin von Cl. perfringens (SONGER 1996). Während GRANUM (1990) noch glaubte, dass Cl. perfringens Enterotoxin nur von den Toxintypen A, C und D gebildet wird, ist heute bekannt, dass alle Stämme dieses Toxin exprimieren können. Cl. perfringens- Enterotoxin stellt den Virulenzfaktor für Cl. perfringens Typ A bei Lebensmittel- vergiftungen dar. Es handelt sich um eine einzelne Polypeptidkette mit einem Molekulargewicht von 3,5 kDa, die an Rezeptoren auf Epithelzellen bindet. Das Gen (cpe) kann entweder chromosomal oder plasmidgebunden sein (BRYNESTAD u.
GRANUM 2002).
Die Produktion von Enterotoxin ist co-reguliert mit der Sporenbildung und es wird freigesetzt, wenn die vegetativen Zellen lysiert werden (JOHANNSON 2006).
Allerdings werden geringe Mengen des Toxins auch während des vegetativen Wachstums gebildet (GRANUM et al. 1984). Die vorrangige Bildung des Enterotoxins während der Sporulation stellt für viele Nachweismethoden ein Problem dar, weil es schwierig ist, die vegetativen Zellen zur Sporulation zu bringen (VAN-DAMME- JONGSTEN et al. 1990). Dies könnte erklären, weshalb bei vielen Untersuchungen nur selten Enterotoxin gefunden wird. HEIKINHEIMO und KORKEALA (2005) konnten bei keinem der 118 untersuchten Stämme das cpe-Gen nachweisen, welches das Enterotoxin codiert. Dieses Ergebnis stimmt mit der Studie von ENGSTROM et al. (2003) überein, die ebenfalls kein cpe-Gen fanden. Sie schätzen, dass das cpe-Gen in weniger als 5 % der weltweit verbreiteten Cl. perfringens-Isolate zu finden ist. Diese Einschätzung passt zu den Untersuchungen von BRYNESTAD und GRANUM (2002) sowie WEN et al. (2003), welche erkannten, dass tatsächlich nur 5 % der untersuchten Stämme das cpe-Gen enthalten.
Zu einer anderen Ansicht gelangten GOLDNER et al. (1986), da sie bei drei Cl. perfringens-Stämmen Enterotoxin nachweisen konnten, obwohl keine Sporulation stattgefunden hatte. Daher vermuten sie, dass zwei Formen von Enterotoxin existieren: eine, die sezerniert wird, und eine, die nur durch die Zelllyse nach der Sporulation frei wird. Möglicherweise gelang es in den anderen Studien nicht das
Enterotoxin nachzuweisen, weil die vorhandene Menge unter der Nachweisgrenze der benutzten Methoden lag (GOLDNER et al. 1986). VAN-DAMME-JONGSTEN et al. (1990) konnten das Cl. perfringens Enterotoxin-Gen mit Hilfe einer sensibleren Nachweismethode bei 145 von 245 Stämmen (59 %) isolieren und werden durch MIWA et al. (1997) bestätigt, die das cpe-Gen in 50 % der Cl. perfringens positiven Proben fanden.
Eine andere Erklärung für die unterschiedlichen Resultate ist, dass sich zwischen den dominanten CPE-negativen Stämmen regelmäßig geringe Zahlen CPE-positiver Stämme befinden. Diese können als Reservoir dienen und das cpe-Gen horizontal auf andere Stämme übertragen (MIWA et al. 1997; BRYNESTAD u. GRANUM 2002;
HEIKINHEIMO et al. 2006).
Das Enterotoxin beeinflusst die Hitzeresistenz von Cl. perfringens. Auch wenn LABBE und HUANG (1995) keinen Zusammenhang zwischen Enterotoxigenität und optimaler Wachstumstemperatur feststellen konnten, zeigte sich in einem anderen Experiment, dass Sporen von Enterotoxin-positiven Stämmen hitzeresistenter sind als Sporen von Enterotoxin-negativen Stämmen. Bei Erhitzung der Sporen auf mehr als 80°C veränderte sich die Zahl der Enterotoxin-positiven Sporen kaum und die Enterotoxin-negativen nahmen stark ab. Bei niedrigeren Temperaturen gab es keine Veränderung. Möglicherweise aktiviert Hitze die Bildung von Enterotoxin-positiven Cl. perfringens Sporen (MIWA et al. 2002).
Auch die Lokalisation des cpe-Gens wirkt sich auf die Hitzestabilität von Cl. perfringens aus. Stämme mit chromosomal bedingter Enterotoxinproduktion haben einen breiteren Temperaturbereich, in Bezug auf Wachstum und Überleben, als Stämme mit plasmidgebundener Enterotoxinproduktion. Erstere sind wesentlich hitzeresistenter und damit eine Gefahr bei unzureichend erhitztem Essen (SARKER et al. 2000; ANDERSEN et al. 2004; LI u. MCCLANE 2006). Auch RAJU und SARKER (2005) fanden heraus, dass das Enterotoxin-Plasmid nicht die Hitzeempfindlichkeit von Cl. perfringens beeinflusst.
Obwohl Cl. perfringens eine dynamische Population aufweist, bei der Gene zwischen verschiedenen Stämmen ausgetauscht werden (SAWIRES u. SONGER 2006), besaßen alle vegetativen Zellen von Cl. perfringens, die in einem Versuch das Erhitzen überlebten, anschließend ihr Cl. perfringens-Enterotoxin-Gen noch an seinem ursprünglichen Platz. Es gab keine Verschiebung vom Chromosom zum Plasmid oder umgekehrt (SARKER et al. 2000).
Toxintypen
Da die verschiedenen Toxintypen von Cl. perfringens eine unterschiedliche Bedeutung für die Entstehung von Krankheiten haben (Tabelle 15, im Anhang), ist es sinnvoll sie zu bestimmen. Allerdings gibt die Bestimmung des Toxintyps keine Auskunft über die Virulenz des Stammes (SAWIRES u. SONGER 2006).
Cl. perfringens Toxintyp A ist ubiquitär, sporenbildend, extrem proliferativ und toxisch. Diese Eigenschaften führen dazu, dass Cl. perfringens beim Geflügel fast immer vorhanden ist, sich vermehrt und unter bestimmten Bedingungen Toxine bildet (KALDHUSDAL u. LOVLAND 2002). Der Toxintyp A wird beim Geflügel mit Abstand am häufigsten nachgewiesen. Oft erweisen sich 100 % der untersuchten Stämme als Typ A (TAYLOR u. GORDON 1940; KALDHUSDAL u. HOFSHAGEN 1992;
ENGSTROM et al. 2003; HEIKINHEIMO u. KORKEALA 2005; JOHANSSON, A. et al. 2006). IBRAHIM (2001) fanden Typ A in 48 %, Typ C in 21 % und Typ D in 10 % der untersuchten Tiere, 21 % der Tiere enthielten nicht-toxigene Stämme. In einer anderen Untersuchung waren von 329 Stämmen 89 % vom Toxintyp A, 3 % vom Typ C und 8 % waren atoxisch (KÖHLER, B. et al. 1974a). Typ A-Stämme verursachen Lebensmittelvergiftungen und Durchfälle bei Menschen und Tieren (WEN et al.
2003).
Alpha- und beta-Toxin werden durch Trypsin, welches auch im Darminhalt vorkommt, inaktiviert. Daher sind die Toxintypen A und C nur vermehrungsfähig, wenn sich die Bedingungen im Darm verändern. Die Toxine von Typ D hingegen werden von Trypsin sogar aktiviert (NIILO 1965).
2.1.3 Tenazität von Cl. perfringens
Bakterien variieren in der Fähigkeit verschiedenen Umwelteinflüssen zu widerstehen.
Obwohl Cl. perfringens zu den robusteren Mikroorganismen gehört, ist es nicht sicher, dass Proben in ihrem natürlichen Medium (Blut, Darminhalt, Gewebe) stabil genug sind, so dass keine Veränderungen während Präparation, Transport und Lagerung auftreten (BOYD et al. 2006). Daher ist es wichtig den Einfluss der Temperatur und verschiedener Konservierungszusätze zu kennen.
Bei 15°C vermehren sich 94 % der getesteten Cl. perfringens-Stämme, wobei mit steigender Inkubationstemperatur auch das Wachstum zunimmt (JONG et al. 2004).
Bei 55°C werden die vegetativen Zellen von Cl. perfringens noch nicht geschädigt.
Auch bei 70°C und einer Inkubationszeit von 1 Stunde kommt es nur zu einer geringen Inaktivierung. Bei 90°C über 1 Stunde verringert sich die Clostridienmenge allerdings um bis zu 6 Zehnerpotenzen (STÖCKLEIN 2005). Unter 10°C gibt es kein Wachstum mehr und auch die Reduktion der vegetativen Zellen erfolgt bei 10°C besonders schnell. Eine Temperatur von 3°C erwies sich als optimal für das Überleben, hier findet die Reduktion der Zellen am langsamsten statt und der Erreger bleibt bis zu 7 Wochen stabil. Bei 7°C nimmt die Keimzahl zwar etwas schneller ab, aber der Unterschied zwischen 3°C und 7°C ist nicht signifikant (JONG et al. 2004).
Neben der Temperatur selbst beeinflusst die Geschwindigkeit, mit welcher Bakteriensuspensionen eingefroren und aufgetaut werden, das Überleben der Bakterien (KOTULA et al. 1979). So vermindert sich die Anzahl der vegetativen Keime bei Kälteschock-Kühlung auf 4°C um 96 %. In den anschließenden 90 min bei 4°C sterben noch einmal 95 % der verbliebenen Zellen. Aerobe Bedingungen fördern den Absterbeprozess von Cl. perfringens allerdings nicht (TRACI u. DUNCAN 1974).
Das Einfrieren der Stämme verbessert ihre Überlebensfähigkeit und ist eine gute Möglichkeit, Proben aufzubewahren. Cl. perfringens-Isolate können bei -60°C mindestens 2 Wochen überleben, am besten auf Blutagar (Schrägagar) mit Overlay (HAUSCHILD u. HILSHEIMER 1974). Bei -3°C ist es jedoch möglich, dass Teile der
Probe immer wieder gefrieren und auftauen und so die Zellen beschädigt werden (KOTULA et al. 1979). Toxin kann problemlos bei -8°C eingefroren werden, die spätere Auftaugeschwindigkeit beeinflusst die Stabilität nicht (STÄNDER u.
STÄNDER 1973).
Die Zellen verändern sich bei verschiedenen Temperaturen in ihrer Struktur, so sind die Stäbchen bei 15°C länger und neigen zur Kettenbildung, im Gegensatz zu einer Temperatur von 37°C. Außerdem passen sich die Zellen an die niedrigeren Temperaturen an, indem sie das Fettsäuremuster der Zellmembran verändern.
Wachstumsrate und Lag-Phase werden davon jedoch nicht beeinflusst. Auch die Temperaturadaptation von Cl. perfringens-Zellen vor der Inkubation wirkt sich weder auf Wachstumsrate noch auf die Lag-Phase aus (JONG et al. 2004).
Zu bedenken ist auch, dass Cl. perfringens die Fähigkeit hat, Sporen zu produzieren.
Die Sporenbildung tritt bei allen Temperaturen zwischen 3 und 37°C auf, egal ob die Stämme hitzeaktiviert wurden oder nicht (JONG et al. 2004). Die Sporen sind äußerst stabil und wurden bei Versuchen erst nach 60 Minuten bei 100°C abgetötet (WEISS u. STRONG 1967). Auch Tiefkühltemperaturen von -29°C überleben sie gut, während die Zahl der vegetativen Keime unter diesen Bedingungen stark abnimmt (TRAKULCHANG u. KRAFT 1977).
Lebensmittelbehandlung
Für die Behandlung und Lagerung von Lebensmitteln spielt die Tenazität von Cl. perfringens eine große Rolle, was auch zu zahlreichen Studien zu diesem Thema geführt hat.
In gepökeltem Putenfleisch stellt sich das Überleben von Cl. perfringens wie folgt dar: bei 0,6°C, bei 4,4°C bzw. bei 10,0°C sinkt die Zahl von Cl. perfringens innerhalb von 7 Tagen um 2,52, 2,54 bzw. 2,75 log10 CFU/g (KALINOWSKI et al. 2003).
TAORMINA et al. (2003) berichten, dass sich die Clostridien nach dem Kochen des Fleisches während des Abkühlens von 54°C auf 7°C nicht mehr vermehren und bei der anschließenden 14-tägigen Kühllagerung bei 4°C zahlenmäßig leicht abnehmen.
In einer weiteren Untersuchung wurde mit Cl. perfringens (102 KBE /g) kontaminier- tes Hühnerfleisch für 4-6 Wochen bei -23°C eingefroren. Dabei verringerte sich die Anzahl der vegetativen Zellen und der Sporen signifikant und bei der Mehrzahl der Proben waren anschließend keine Clostridien mehr nachweisbar (LILLARD 1977).
Auch die Verwendung von Gewürzen wie Chili, Curry, Oregano, Nelke und einer Knoblauch-Kräuter-Mischung wurde geprüft, da diesen eine antimikrobielle Wirkung zugeschrieben wird. Allerdings verminderten die Gewürze die Keimzahlen von Cl. perfringens in gekochtem und anschließend gekühltem Fleisch im Vergleich zur Kontrolle nicht. Curry und die Knoblauch-Kräuter-Mischung bewirkten sogar eine Erhöhung der Clostridienzahlen (SABAH et al. 2004).
Ein Zusatz von 3 % NaCl zu gekochtem Putenfleisch, das bei unterschiedlichen Temperaturen gelagert wurde, hemmt das Wachstum von Cl. perfringens (JUNEJA u. MARMER 1996). Natriumlaktat (1 %), Natriumacetat (1 %) und Natriumcitrat (1 %), vermindern das Auskeimen der Sporen und das Wachstum von Cl. perfringens (JUNEJA u. THIPPAREDDI 2004).
STEELE und WRIGHT (2001) geben für rohe Putenbrust, die bei 72°C gekocht wurde, eine maximale Abkühlzeit von 8,9 Stunden für den Bereich zwischen 49°C und 13°C an, da es bei längerer Dauer zu einer Zunahme der Clostridien um mehr als eine 10er Potenz kommt. Optimal ist eine Abkühlzeit von 8 Stunden, da hier keine Vermehrung von Cl. perfringens stattfindet. Andere Autoren sind der Meinung, dass die Abkühlphase von Putenfleisch für den Bereich zwischen 65°C und 10°C maximal 5 Stunden in Anspruch nehmen darf (ANDERSEN et al. 2004). Das belegen auch die Ergebnisse von JUNEJA und THIPPAREDDI (2004), welche feststellten, dass es zum Auskeimen der Sporen und Wachstum von Cl. perfringens kam, wenn gekoch- tes Putenfleisch über einen Zeitraum von 15, 18 oder 21h heruntergekühlt wurde.
Bei 4°C gibt es generell kein Wachstum von Cl. perfringens in Putenfleisch, auch wenn die Temperatur im Kühlschrank schwankt (JUNEJA u. MARMER 1996).
Ebenso wird für Rindfleisch die Lagerung bei 4°C als optimal angesehen, da Sporenbildung und Wachstum verhindert werden. Eine Temperatur von 37°C führt
hingegen zu einem Anstieg der lebensfähigen Zellen nach nur einem Tag auf über 107 KBE/g Rindfleisch. Zusätzlich zur Kühlung auf 4°C hemmen auch eine Ozon- behandlung des Fleisches oder CO2-Konzentrationen von über 30 % das Auskeimen der Sporen und das Wachstum der vegetativen Zellen (NOVAK u. YUAN 2004).
Sollen Lebensmittelproben auf ihren Gehalt an Cl. perfringens untersucht werden, ist es wichtig, dass die Clostridien nicht schon vorher absterben. So stellte sich heraus, dass Cl. perfringens in Rinderhackfleisch besser überlebt, wenn es mit Trockeneis auf -55°C bis -60°C gekühlt wird, als bei einer Lagerung bei -3°C. Der Zusatz von Frostschutz-Substanzen wie Glycerin oder Dimethylsulfoxid verbessert zusätzlich die Überlebensfähigkeit (KOTULA et al. 1979). Nahrungsmittelproben können 1:1 (w/v) gemischt mit 20 %igem Glycerin bei einer Temperatur von -60°C ohne Verringerung der Keimzahlen transportiert oder gelagert werden. Bei -18°C oder +4°C kommt es dagegen zu einem Abfall der Cl. perfringens-Menge (HAUSCHILD u. HILSHEIMER 1974).
Antibiotika
Da einer erfolgreichen Therapie eine große Bedeutung bei der Bekämpfung der Nekrotisierenden Enteritis zukommt, haben MARTEL et al. (2004) die Wirkung verschiedener Antibiotika gegen Cl. perfringens getestet. Monensin, Lasalocid, Salinomycin, Maduramycin, Narasin, Avilamycin, Tylosin und Amoxicillin sind gegen alle Stämme gut, Flavomycin dagegen schwach wirksam. Außerdem erwiesen sich die getesteten Stämme einer anderen Untersuchung (KÖHLER, B. 1978) zufolge stets als empfindlich gegenüber Penicillin, Nitrofurantoin und Erythromycin. Beim Einsatz von anderen Antibiotika wie Lincomycin, Chlortetracyclin und Oxytetracyclin traten häufig Resistenzen auf. Dabei ist das Resistenzverhalten zeitlichen Schwankungen unterworfen. Während KÖHLER im Jahr 1978 eine Resistenzrate von 79 % für Chloramphenicol und Oxytetracyclin angibt, konnten andere Autoren seit 1980 einen Rückgang der Resistenzen gegen Tetrazykline von 74 % auf 66 % verzeichnen, gleichzeitig aber eine Zunahme der Resistenz gegen Lincomycin von 49 % auf 63 % erkennen (MARTEL et al. 2004).
2.2 Clostridium perfringens beim Huhn
2.2.1 Epidemiologie
Der Nachweis von Cl. perfringens in einer Broilerherde ist allein noch kein Anzeichen für das Vorliegen einer Erkrankung, da Cl. perfringens ubiquitär vorkommt und auch aus gesunden Broilern isoliert werden kann (FICKEN u. WAGES 1997). Einige Wissenschaftler vermuten, dass Cl. perfringens zur normalen Darmflora gehört (SHANE et al. 1984; ELWINGER et al. 1994). So konnten CRAVEN et al. (2001b) bei 15 von 16 Broilermast-Betrieben (94 %) Cl. perfringens nachweisen. KNARREBORG et al. (2002) fanden Cl. perfringens regelmäßig im Ileum von Tieren verschiedener Altersklassen. Allerdings handelt es sich dabei gewöhnlich um geringe Mengen (ELWINGER et al. 1994; ELWINGER et al. 1998). Je größer die Anzahl von Cl. perfringens im Darm ist, desto höher wird auch das Risiko für die Entwicklung einer Nekrotisierenden Enteritis eingestuft (ELWINGER et al. 1998).
Der Eintrag von Cl. perfringens in einen Broilerbestand lässt sich nur schwer vermeiden, da Hühner unter Feldbedingungen ständig dem Kontakt mit Clostridien ausgesetzt sind (ARAKAWA u. OHE 1975). Fliegen können direkt als Überträger fungieren, wie für einen Ausbruch von Nekrotisierender Enteritis in einem Legehennenstall nachgewiesen werden konnte (DHILLON et al. 2004). Aber auch eine Übertragung von Cl. perfringens durch Fliegen und Staub auf das Futter, welches vorher meist nicht kontaminiert war, ist möglich (CRAVEN et al. 2000;
CRAVEN et al. 2001b). Dagegen glauben andere Autoren, dass Clostridien über das Futter selbst eingeschleppt werden (KÖHLER, B. et al. 1977). Obwohl Geflügelfutter in der Regel wärmebehandelt ist, können noch Sporen von Cl. perfringens überleben (KALDHUSDAL 2000). Dies ließ sich in einer Studie, in welcher Futtermittel auf ihren Sporengehalt getestet wurden, nachweisen. So enthielten 6,7 % von 1502 Proben über 104 Sporen pro Gramm, welche in Versuchen zu Wachstumsdepression, höheren Tierverlusten und Nekrotisierender Enteritis führten (KÖHLER, B. 2000a).
Außerdem stellt die Brüterei ein potentielles Reservoir für Cl. perfringens dar, da sich bei einer Untersuchung im Mittel 20 % der Proben aus drei Brütereien als Cl. perfringens-positiv erwiesen. Dabei befand sich der Erreger auf Papierunterlagen, die teilweise wiederholt verwendet wurden, sowie auf Eischalen und Flaum der Tiere (CRAVEN et al. 2001a). Daher ist anzunehmen, dass der Verdauungstrakt einiger Tiere schon in der Brüterei besiedelt wird und somit die Clostridien bereits von der Brüterei zu den Aufzuchtbetrieben verschleppt werden (CRAVEN et al. 2001a;
CRAVEN et al. 2001b). SHANE et al. (1984) gehen sogar davon aus, dass Cl. perfringens vertikal übertragen wird, da sie den Keim aus dem Dottersack eines embryonierten Eies isolieren konnten.
Aber auch in der weiteren Produktionskette gibt es zahlreiche Möglichkeiten Cl. perfringens in den Bestand einzutragen. So stellte sich bei einer Untersuchung von 16 Broilermast-Betrieben heraus, dass Wände (53 %), Ventilatoren (46 %), Fliegenfallen (43 %), Schmutz vor dem Eingang der Mastanlage (43 %) und die Schuhe der Mitarbeiter (29 %) häufig mit Cl. perfringens belastet sind. Ebenso stellt die Verschmutzung der Transportkäfige ein Problem dar (CRAVEN et al. 2001b) und zusätzlich muss die Übertragung von Cl. perfringens durch Wildvögel auf Masttiere in Betracht gezogen werden (CRAVEN et al. 2000).
Prävalenz
Die Prävalenz der Nekrotisierenden Enteritis wird von vielen Faktoren beeinflusst. So schwankt sie mit dem Betrieb, dem Herdenmanager, der Jahreszeit und dem Alter der Tiere (CRAVEN et al. 2001b). Außerdem spielt die Genetik der Hühner eine wichtige Rolle, denn es gibt bestimmte Linien, die anfälliger sind für Cl. perfringens–
Infektionen als andere (SLUIS 2000a). So sind z.B. die Hühner des Masttyps durch genetische Disposition empfindlicher als Hühner des Legetyps, was dadurch verdeutlicht wird, dass die NE bei Broilern am häufigsten auftritt und Ausbrüche bei Legehennen nur selten vorkommen (KÖHLER, B. et al. 1977; KALDHUSDAL 2000).
In den meisten Fällen tritt die Erkrankung bei Broilern im Alter von 2 bis 5 Wochen auf, wobei es einen Peak am 23. und 24. Lebenstag gibt. Seltener sind auch jüngere
oder ältere Tiere betroffen (KÖHLER, B. et al. 1977; IBRAHIM et al. 2001;
KALDHUSDAL u. LOVLAND 2002; HINZ 2005). Die Häufung der NE zwischen 2.
und 5. Lebenswoche lässt sich mit dem Abfall der maternalen Antikörper und der noch nicht ausreichenden Bildung eigener Antikörper erklären (LOVLAND et al.
2004). KÖHLER, B. (2000a) ist der Ansicht, dass die bis zu diesem Zeitpunkt noch nicht ausgebildeten anaeroben Verhältnisse im Darm dafür verantwortlich sind, dass die NE erst ab dem 7. Lebenstag auftritt. Bei Legehennen bricht die Erkrankung meist im Zusammenhang mit dem Legebeginn zwischen der 22. und 30. Lebenswo- che aus (KÖHLER, B. et al. 1974b). KÖHLER, B. et al. (1977) berichten außerdem von einer Häufung der NE-Fälle in der Aufzuchtperiode zwischen Tag 80 und 120.
Den Einfluss verschiedener Haltungssysteme auf die Prävalenz der Nekrotisieren- den Enteritis untersuchten KÖHLER, B. et al. (1977) im Zeitraum von 1973 bis 1976.
Bei Broilern in Bodenhaltung trat die durch Cl. perfringens bedingte Enteritis bei 8,57 % der untersuchten Tiere auf, während die ebenfalls getesteten 13181 Broiler in Käfighaltung nur zu 0,40 % an NE erkrankt waren. Bei 3503 Broilerelterntieren in Bodenhaltung lag die Prävalenz bei 0,88 %. In einem Betrieb mit 3188 Legehennen in Käfighaltung hingegen konnten KÖHLER, B. et al. (1977) keine NE feststellen, nur während der Aufzucht in Bodenhaltung litten 0,57 % der Tiere an NE. Eine mögliche Erklärung ist, dass die Tiere in Bodenhaltung ständigen Reinfektionen durch die in der Einstreu enthaltenen Clostridien ausgesetzt sind (BALAUCA 1976).
Zum Einfluss der Jahreszeit finden sich teilweise widersprüchliche Angaben in der Literatur. Nachdem LONG (1973) einen Anstieg der Nekrotisierenden Enteritis von Juli bis Oktober festgestellt hatte, berichteten KÖHLER, B. et al. (1977), dass die NE im April und Mai häufiger nachzuweisen war als im übrigen Jahr. Zu ähnlichen Ergebnissen kamen CRAVEN et al. (2000), die im Frühling aus 52 % der Proben Cl. perfringens isolierten, während ihnen dieses im Herbst nur aus 4 % des Unter- suchungsmaterials gelang. Andererseits fanden CRAVEN et al. (2001b) in einer spä- teren Studie Cl. perfringens am häufigsten im Sommer und am seltensten im Winter.
Dagegen stellten LOVLAND und KALDHUSDAL (2001) eine Häufung von Cl. perfrin- gens assoziierter Hepatitis zu Beginn des Winters fest. Eine Ursache vermuten sie
im oftmals erhöhten Anteil von Weizen und Gerste im Futter im Herbst und Winter.
Dies deckt sich mit den Ergebnissen von KALDHUSDAL und SKJERVE (1996), die ermittelten, dass auch die NE im Winter häufiger auftritt als im Sommer.
Es gibt weltweit wenig aktuelle Studien über die Prävalenz der Nekrotisierenden Enteritis (MCDEVITT et al. 2006). KÖHLER, B. et al. (1977) untersuchten 81 Betriebe und konnten dabei in 78 Betrieben (96 %) NE nachweisen. Daher gehen sie davon aus, dass die NE ein enzootisches Geschehen und nach E. coli-Infektionen die zweithäufigste Infektionskrankheit in der Broilerproduktion ist. Dem gegenüber steht eine Studie von KÖHLER, B. (2000a), in welcher zwischen 1990 und 1999 insgesamt 10.477 verendete Broiler untersucht wurden. Von diesen Tieren hatten nur 251 (2,4 %) NE, wobei 248-mal der Toxintyp A und nur dreimal der Toxintyp C nachgewiesen werden konnte.
BALAUCA (1976) gibt an, dass 1,3 bis 37,3 % der von ihm untersuchten Broiler von Nekrotisierender Enteritis betroffen waren. In Großbritannien betrug die Prävalenz der NE im Jahr 2001 bei Broilerherden 31 % (WILLIAMS 2003). Eine Studie über die Verbreitung von NE in Norwegen zwischen 1969 und 1989 ergab dagegen eine geringere Inzidenz von durchschnittlich 1,2 %. Allerdings gab es im genannten Zeitraum zwei sogenannte Epidemien (2 bzw. 5 Jahre) mit Peaks bis zu 35 % positiver Betriebe (KALDHUSDAL u. SKJERVE 1996).
Beim Vergleich der Prävalenz verschiedener Länder ist zu beachten, dass der Einsatz von antibiotischen Leistungsförderern und Antikokzidia im Futter sowie das Herdenmanagement von Land zu Land variiert (BEDFORD 2000). Durch den Mangel an Untersuchungen, welche die Ausbreitung der NE direkt messen, haben einige Wissenschaftler (GRAVE et al. 2004; MCDEVITT et al. 2006) versucht, indirekte Aussagen zu treffen. Dazu wurden Daten wie z.B. Verkaufszahlen von Antibiotika oder ionophoren Antikokzidia herangezogen, da diese sehr gut mit der tatsächlichen Anzahl von NE – Fällen korrelieren. So untersuchten GRAVE et al. (2004) den Konsum von Antibiotika gegen Nekrotisierende Enteritis von 1990 bis 2001 anhand der Verkaufsstatistiken. Sie beschreiben einen Anstieg im Verbrauch therapeutischer Antibiotika zur Behandlung der NE um 100 %, nachdem im Mai 1995 in Norwegen
Avoparcin seine Zulassung als antibakterieller Futterzusatzstoff verloren hatte. Diese Verdopplung impliziert einen deutlichen Anstieg von bakteriellen Erkrankungen, besonders der NE.
Dies spiegelt sich auch in der Anzahl nachgewiesener Fälle von Nekrotisierender Enteritis wider, welche 1995 stark anstieg (NORTON 2000; GRAVE et al. 2004). Der prozentuale Anteil gegen NE behandelter Broiler verdoppelte sich von Juni 1995 bis Dezember 1995. Durch die Einführung von Narasin als ionophores Futteradditiv im November 1995 sank die Zahl der an NE erkrankten Broiler langsam wieder ab, erreichte jedoch bis 2001 nicht mehr das Niveau der Jahre vor dem Verbot von Avoparcin (GRAVE et al. 2004). Auch MATEOS et al. (2002) stellten fest, dass es durch den Wegfall von Leistungsförderern und Restriktionen bei der Verfütterung von tierischem Eiweiß wieder vermehrt zu Problemen mit der NE kam. Gleichzeitig bemerkten sie einen Anstieg im Verbrauch von therapeutischen Antibiotika.
KALDHUSDAL und LOVLAND (2000) beschreiben einen offensichtlichen Anstieg von Nekrotisierender Enteritis und von Leberläsionen bei der Schlachtung, nachdem die meisten Geflügelbetriebe in Norwegen ab dem 01.06.1995 keine Leistungsförderer mehr einsetzten. In Großbritannien hatte der Verkauf von antibakteriellen Substanzen 1996 mit 375 t seinen Höhepunkt erreicht und fiel nach der Beschränkung der Leistungsförderer bis zum Jahr 2002 auf 125 t. Der Absatz von therapeutischen Antibiotika blieb konstant, woraus zu schließen ist, dass es keinen Anstieg der NE-Fälle gab. Ein Grund dafür könnte der zwischen 1999 und 2002 gestiegene Verbrauch von Antikokzidia sein. Diese wurden möglicherweise eingesetzt, um den Wegfall der Leistungsförderer zu kompensieren (MCDEVITT et al. 2006). Außerdem gab es in einigen Ländern einen Wechsel zu Kokzidiostatika, die gleichzeitig gegen Cl. perfringens wirkten (GRAVE et al. 2004).
In Schweden wurden die antibiotischen Leistungsförderer 1986 verboten. Durch einen kontinuierlichen Einsatz von therapeutischen Antibiotika konnten die erwarteten Probleme mit der Nekrotisierenden Enteritis verhindert werden (WIERUP 2001).
2.2.2 Erkrankungen durch Cl. perfringens beim Huhn 2.2.2.1 Ätiologie und Pathogenese
Die Nekrotisierende Enteritis wird von Cl. perfringens Toxintyp A und C verursacht (BALAUCA 1976; KALDHUSDAL 2000). Es gibt aber auch Berichte, dass Typ D und nicht typisierbare Stämme die Krankheit ausgelöst haben (KÖHLER, B. et al. 1974a;
IBRAHIM et al. 2001). Das Wissen über die genaue Entstehung der Erkrankung ist allerdings begrenzt. Viele bakterielle Infektionen mit Anaerobiern haben endogenen Ursprung, weil die Erreger bereits im Körper vorhanden sind (NORTON u. HOERR 1999). Auch Cl. perfringens kann im hinteren Darmbereich nachgewiesen werden, ohne dass Symptome einer Erkrankung vorliegen. Dies liegt am relativ hohen Sauerstoffgehalt und am konstanten pH-Wert im Darm. Erst wenn es durch prädisponierende Faktoren zu Veränderungen dieser Parameter kommt, kann sich das Bakterium vermehren, in den vorderen Darmbereich wandern und dort den Darm schädigen (SHARMA, S. P. D. 2007). Die Nekrotisierende Enteritis resultiert letztend- lich aus der gehäuften Adhäsion von Cl. perfringens an der geschädigten Darm- mukosa, wodurch Vermehrung und Toxinproduktion erleichtert werden (KAGEYAMA et al. 1987; BABA et al. 1992). Diese Vermehrung des Bakteriums kann zu drei verschiedenen Krankheitsbildern führen: der akuten klinischen Enteritis mit vermehrter Mortalität, der subklinischen Enteritis, welche sich durch verminderte Leistung auszeichnet und zu einer Erkrankung, die durch Leberveränderungen geprägt ist (KALDHUSDAL 2000).
2.2.3 Klinische Nekrotisierende Enteritis (NE) 2.2.3.1 Prädisponierende Faktoren
Es sind ein oder mehrere prädisponierende Faktoren nötig, um Läsionen und die klinischen Erscheinungen der NE auszulösen (IMMERSEEL et al. 2004).
Bekannte prädisponierende Faktoren für das Entstehen einer Nekrotisierenden Enteritis sind vor allem eine Kokzidiose und eine, in Bezug auf die Entstehung von NE, ungünstige Fütterung (WILSON et al. 2005). Auch Resistenzen gegen antibiotische und antikokzidielle Zusätze im Futter spielen eine Rolle (KALDHUSDAL u. LOVLAND 2002). Als weitere Faktoren werden Traumata, unzureichende Durchblutung des Gewebes, Nekrosen sowie das Wachstum aerober Bakterien angesehen (NORTON u. HOERR 1999). Ferner können Schwierigkeiten bei der Beseitigung von Cl. perfringens – Sporen aus dem Stall, der Haltungsstandard und andere Managementfaktoren prädisponierend wirken (LOVLAND u. KALDHUSDAL 2001). So gibt es bei der Bodenhaltung und insbesondere bei hoher Besatzdichte die größten Probleme mit NE. Hierbei spielt auch die Art und Qualität der Einstreu eine große Rolle. Vor allem feuchte Einstreu ist ungünstig, daher sollte der Feuchtigkeitsgehalt der Einstreu zur Prophylaxe einer NE zwischen 20 % und 25 % liegen. Ebenfalls prädisponierend wirken Muskelmagenerosionen, klimatischer Stress und andere Grunderkrankungen, die das Immunsystem schwächen, sowie der Anfang der Legeperiode bei Broilerelterntieren und die Aufzuchtperiode bei Legehennen (KÖHLER, B. et al. 1977; KALDHUSDAL 2000; KÖHLER, B. 2000a;
SHANE 2005).
Auch Kokzidien wirken prädisponierend, da sie die Darmwand schädigen und es den nicht-invasiven Clostridien so ermöglichen einzudringen (KALDHUSDAL u.
LOVLAND 2002). Daher ist der konsequenten Kokzidienprophylaxe bei der Bekämpfung der Nekrotisierenden Enteritis die größte Bedeutung zuzumessen, denn die NE wird fast immer von einer Kokzidieninfektion begleitet (VISSIENNON et al.
2000).
2.2.3.2 Symptome
Die Krankheit tritt plötzlich und ohne vorherige Krankheitsanzeichen auf. Neben den plötzlichen Todesfällen fällt der veränderte Gesundheitszustand der Herde auf. Die Tiere zeigen Depression, Anorexie, Bewegungsunlust, gesträubtes Gefieder und Diarrhö, wobei die ersten Anzeichen bei einer experimentellen Infektion nach
24 bis 36 Stunden auftreten. Zu Beginn fallen eine verminderte Futteraufnahme und das Zusammendrängen der Tiere in kleinen Gruppen auf. Später steigert sich die Anorexie und stark betroffene Tiere verharren auf der Stelle und haben geschlossene Augen. Durch die Diarrhöe kommt es zur Dehydrierung und die Kloake ist kotverschmiert. Die Morbidität liegt in Abhängigkeit vom Behandlungserfolg zwischen 5 und 40 % (KÖHLER, B. et al. 1974b). Häufig sterben die Tiere nach nur einer kurzen Phase der klinischen Erkrankung. Ohne zusätzliche Stressoren wie zum Beispiel ungünstige Futterzusammensetzung oder Kokzidien kann die Mortalität gering sein (KÖHLER, B. et al. 1974b; NORTON u. HOERR 1999; BRENNAN 2001;
WAGES u. OPENGART 2003; SHARMA, S. P. D. 2007). Andernfalls zeichnet sich die NE jedoch durch eine erhöhte Mortalität aus, welche an bis zu 7 aufeinander folgenden Tagen um jeweils 1 % steigt (KALDHUSDAL u. LOVLAND 2000).
KÖHLER, B. et al. (1974b) gehen von einer durchschnittlichen Mortalität von 10 % aus, welche aber auf bis zu 30 % ansteigen kann. Dabei sinkt die Legeleistung um 10 bis 20 %.
2.2.3.3 Pathologie
Die Nekrotisierende Enteritis zeichnet sich durch eine akute nekrotisch-diphtheroide Entzündung der Mukosa von Zäkum und Dünndarm und eine Hyperämie von Leber und Milz aus. Die Leber erscheint dunkler, die Nieren sind marmoriert und in Leber und Milz wurde eine Erythrozytose mit Synzytienbildung beobachtet. Es kann ebenfalls zur Lymphozytendepletion und –nekrose in den lymphatischen Organen kommen (GLAVITS et al. 1989; KALDHUSDAL u. LOVLAND 2000).
Die Läsionen treten hauptsächlich im Dünndarm, besonders im Jejunum und Ileum auf. Dabei handelt es sich um fokale bis ausgebreitete Nekrosen mit oder ohne Hämorrhagien (KALDHUSDAL u. HOFSHAGEN 1992; ELWINGER et al. 1994;
BRENNAN 2001). Während SHARMA, S. P. D. (2007) davon ausgeht, dass sich die Läsionen auf Jejunum und Ileum beschränken, sind TRUSCOTT und AL-SHEIKHLY (1977) der Ansicht, dass die Läsionen vor allem im Bereich des Meckel´schen Divertikels entstehen und dann kranial oder kaudal fortschreiten. Bei hochgradigen
Infektionen können sie sich im gesamten Darm verbreiten. Auch BABA et al. (1997) sind der Meinung, dass die Läsionen bei stärkerer Infektion den gesamten Dünndarm betreffen. In einem Infektionsversuch verschwanden die Läsionen rasch nach dem Entfernen der Infektionsquelle (TRUSCOTT u. AL-SHEIKHLY 1977).
Die nekrotischen Ulzera erscheinen entweder einzeln oder als Aggregate in der Mukosa. Sie haben einen Durchmesser von 0,5 – 1,5 cm und sind zufällig verteilt.
Bei schweren Fällen ist die gesamte Oberfläche der Mukosa verfärbt und von einer nekrotischen, diphtheroiden Membran überzogen (SHANE et al. 1985). Die Därme sind häufig aufgebläht und brüchig, die Darmwand ist verdickt, ödematös und unelastisch. Das Lumen ist gefüllt mit Gas und brauner Flüssigkeit (KÖHLER, B. et al. 1974b; SHANE et al. 1985; NORTON u. HOERR 1999; SHARMA, S. P. D. 2007).
Die Clostridien befinden sich vorwiegend im nekrotischen Darmbereich zwischen den abgestorbenen Zellen und auf der Oberfläche der gesunden Epithelzellen der Mikrovilli. Sie liegen in großen Haufen um die Nekrosen herum (AL-SHEIKHLY u.
TRUSCOTT 1977; GLAVITS et al. 1989; OLKOWSKI et al. 2006).
Bei Küken herrschen hämorrhagische Veränderungen vor. Der Darm ist dilatiert, ödematös und mit dünnflüssigem, blutigem, schaumigem und unangenehm riechendem Inhalt gefüllt. Es treten Petechien, Ekchymosen, Sugillationen und diffus- subseröse Blutungen auf. Das Mesenterium ist verdickt und sulzig-ödematös. Die Leber ist von Hyperämien und fettigen Degenerationen geprägt und kann stecknadelkopfgroße Nekroseherde zeigen. Bis zu 65 % der erkrankten Tiere entwickeln eine Peritonitis (KÖHLER, B. et al. 1974b).
2.2.4 Subklinische Nekrotisierende Enteritis (SNE)
Für diese Erkrankungsform werden verschiedene Bezeichnungen verwendet:
Clostridial enteritis, SIBO (Small Intestinal Bacterial Overgrowth), Hit the Wall, Flushing, Summer gut oder auch Feed passage. Die Häufigkeit des Auftretens dieser Krankheit scheint bei Broilern und anderen schnellwachsenden Spezies zu steigen.
Dies wird vermutlich durch den vermehrten Einsatz von Weizen, Gerste und
Fischmehl und den verminderten Einsatz von Leistungsförderern (seit 2006 verbo- ten) verursacht (SLUIS 2000a).
Die Ätiologie der SNE ist nicht vollständig geklärt. Die pathogenen Clostridien sind in der Regel in ausreichender Menge vorhanden, um eine subklinische Erkrankung auszulösen, wenn dem Futter keine antibakteriellen Komponenten zugesetzt werden (KALDHUSDAL u. LOVLAND 2002). Das Infektionsgeschehen beginnt mit einem gesteigerten Bakterienwachstum, vor allem im Dünndarm. Das führt zu vermehrter Freisetzung von Endotoxinen und zu Schädigungen im Darm. Teilweise kommt es auch zur Abschwemmung von Bakterien in Leber und Blutbahn. Das bedingt schließlich eine verminderte Futteraufnahme, kann aber auch Lahmheiten verursachen (SLUIS 2000a).
Differenzen gibt es nicht nur bei der Benennung der Erkrankung, auch die Einstufung in klinische und subklinische Nekrotisierende Enteritis wird noch nicht einheitlich gehandhabt. SLUIS (2000a) beschreibt die subklinische nekrotisierende Enteritis beispielsweile als eine Erkrankung, die um den 23. Masttag herum auftritt und mit verringerten Zunahmen, verminderter Futteraufnahme und verändertem Kot einhergeht. Die Fäzes sind lockerer, heller und flüssiger. Daher bilden die Exkremente bei der SNE auf Zeitungspapier eine klar begrenzte Flüssigkeitszone, während die Ausscheidungen von gesunden Tieren keine Zone bilden. Virale oder E. coli-bedingte Infektionen verursachen wesentlich umfangreichere Flüssigkeits- zonen. Normalerweise gibt es keine gesteigerte Mortalität und keine ausgeprägten Läsionen der Darmschleimhaut.
KALDHUSDAL und HOFSHAGEN (1992) hingegen sprechen von subklinischer Nekrotisierender Enteritis, wenn die klinischen, pathologischen und bakteriologischen Befunde einer milden Nekrotisierenden Enteritis vorliegen. Das bedeutet, dass makroskopisch sichtbare, fokale nekrotische Läsionen in der Mukosa des Dünndarms, sowie erhöhte Keimzahlen von Cl. perfringens im Darminhalt vorhanden sind. Die Autoren wiesen bei Tieren mit SNE 8 log10 KBE/g Ileum nach, während gesunde Tiere eine durchschnittliche Keimzahl von 5 log10 KBE/g Ileum beher- bergten. Die Mortalität und die Zahl der erkrankten Tiere sind bei der SNE nicht
erhöht. Gleichzeitig kommt es zu schlechterer Futterverwertung und geringeren Zunahmen. Die Läsionen bei der SNE stellen sich als ausgeprägte, runde Einsenkungen mit hyperämischer Peripherie und einem Durchmesser von 1 bis 2 mm in der Dünndarmmukosa dar. Sie sind meistens von einer gelben, unregelmäßig geformten, teilweise anhaftenden Masse bedeckt.
Für KALDHUSDAL und LOVLAND (2000) ist die Einteilung in klinische und subklinische Form eine subjektive Entscheidung. Sie selbst sehen die SNE als Herdenerkrankung, bei der Mortalität und Zahl der klinisch erkennbar erkrankten Tiere nicht erhöht sind, bei der man aber die charakteristischen Darmläsionen findet.
Daraus ergibt sich, dass diese Erkrankungsform nur entdeckt wird, wenn ein geeignetes Lesion Scoring durchgeführt wird. Daher ist die gezielte Untersuchung durch die Geflügelfleischkontrolleure für eine rückblickende Beurteilung sehr nützlich.
Die Läsionen sind normalerweise auf der serösen Seite des Darms nicht zu erkennen. Es handelt sich um einzelne, kaum sichtbare hellgelbe Punkte oder auch um großflächige Läsionen mit nekrotischen Belägen und Einfurchungen der Mukosa.
KALDHUSDAL und HOFSHAGEN (1992) stellten bei Tieren mit subklinischer Nekrotisierender Enteritis klebrigen Kot und dunkle, feuchte Einstreu fest, was aber nicht direkt mit dem Vorhandensein von Darmläsionen verbunden war. Ein plötzlicher Anstieg der Einstreufeuchtigkeit ist für viele Herdenbetreuer ein Anzeichen für das Bevorstehen einer NE, obwohl es natürlich viele andere Ursachen dafür geben kann:
tropfende Tränken, schlechte Belüftung, zu hohe Anteile gesättigter Fettsäuren, Kalium oder Natrium im Futter, schlecht saugende Einstreu, hohe Besatzdichte, hohe Luftfeuchtigkeit oder andere Krankheitserreger (WILLIAMS 2005).
Die subklinische Erkrankungsform kann am besten durch die Untersuchung von zufällig ausgewählten, lebenden Tieren der Herde mit unspezifischen Symptomen oder suboptimaler Leistung diagnostiziert werden. Um die meist mittelmäßig ausgeprägten Darmläsionen zu erkennen, ist einige Erfahrung notwendig (KALDHUSDAL u. LOVLAND 2002). Außerdem ist die zeitaufwändige Darmunter- suchung kostspielig und schlecht zu standardisieren und sie muss wiederholt stattfinden, da der Peak der Darmläsionen nicht vorhersagbar ist. Ebenso muss die
quantitative bakteriologische Untersuchung mehrfach durchgeführt werden, um ein guter Indikator für die Nekrotisierende Enteritis zu sein. Deshalb haben LOVLAND et al. (2003) einen IgG-anti-alpha-Toxin-ELISA entwickelt, für den nur Serumproben gewonnen werden müssen. Die im Serum gemessenen IgG-Antikörper gegen Cl. perfringens-alpha-Toxin waren in Gruppen mit hohen SNE- und CPH-Raten höher, als in Gruppen mit weniger Veränderungen. Allerdings muss diese Methode noch standardisiert werden, es fehlen Referenzwerte und die Sensitivität des ELISAs muss bestimmt werden. In sehr großen Herden können sich Subpopulationen mit unterschiedlichem Cl. perfringens-Status bilden. Daher ist es sehr wichtig, repräsentative Stichproben zu nehmen. Der Vorteil der Darmuntersuchung ist, dass man physische Darmläsionen findet, die das Vorhandensein der Erkrankung direkt belegen. Die Untersuchung mittels ELISA stellt dagegen nur einen indirekten Indikator dar und die erst nach einer Woche einsetzende Ak-Antwort der Broiler führt zu einem Verzug in der Diagnosestellung (LOVLAND et al. 2003).
2.2.5 Cl. perfringens assoziierte Hepatitis (CPH)
Bei einer Infektion mit Cl. perfringens Typ A bei Broilern treten in der Regel auch Fälle von CPH auf (ELWINGER et al. 1994). Die genaue Pathogenese der Leberläsionen ist noch nicht vollständig geklärt, aber vermutlich gelangen Cl. perfringens und seine Toxine durch die geschädigte Darmwand in die Blutbahn und auf diesem Weg in die Leber. Möglich wären aber auch eine aufsteigende Infektion über die Gallengänge oder die Obstruktion der Gallengänge durch entzündliche Prozesse (KALDHUSDAL u. LOVLAND 2002). Bisher wurden zwei durch Cl. perfringens verursachte Arten von Leberläsionen beschrieben. Bei der ersten handelt es sich um eine Cholangiohepatitis, welche bevorzugt auftritt. Hierbei sind meist die intrahepatischen Anteile der Gallengänge betroffen, aber auch die Gallenblase und die extrahepatischen Anteile können verändert sein. Die Leber ist vergrößert und kann gelbbraun verfärbt sein. Ihre Oberfläche ist glatt und eben. Das Leberparenchym ist fest und zeigt ein Muster von hellen Inseln zwischen dem normal gefärbten Gewebe. Die Gallenblase ist manchmal verfärbt, ihre Wand verdickt und ihr Inhalt kann verfärbt und viskös sein. Außerdem kann es zu einer gelblichen
Verfärbung des gesamten Schlachtkörpers kommen. Seltener tritt eine multifokale Hepatitis mit fibrinösen Nekrosen auf (ONDERKA et al. 1990; LOVLAND u.
KALDHUSDAL 1999; KALDHUSDAL u. LOVLAND 2000).
Die Cl. perfringens – assoziierte Hepatitis führt zu verminderter Futterverwertung und reduzierten Schlachtgewichten, was die Gewinnmargen erheblich verringern kann (LOVLAND u. KALDHUSDAL 2001). Außerdem werden mehr Schlachtkörper ver- worfen (KALDHUSDAL 2000), weil Schlachtkörper mit CPH in eine dieser drei Kate- gorien fallen: Leberveränderungen, Aszites oder Kümmerer (LOVLAND et al. 2003).
Um die CPH zu diagnostizieren, ist die makroskopische Untersuchung von Leber und Gallenblase nötig (LOVLAND u. KALDHUSDAL 1999). Der kausale Zusammenhang zwischen natürlich auftretender NE und CPH ist experimentell kaum nachweisbar, da die CPH zu selten auftritt, um in zeitlich begrenzten Studien erforscht zu werden (LOVLAND u. KALDHUSDAL 2001). Auch ELWINGER et al. (1994) fanden bei ihren Untersuchungen nur in 0,4 % (15 Broiler) der Tiere CPH. Daher ist das Ermitteln der CPH-Prävalenz nur bedingt als Screeningmethode für NE-Probleme geeignet.
Andererseits ist die bei der Schlachtung ermittelte CPH-Prävalenz kumulativ, da die Leberläsionen nicht vollständig ausheilen und erübrigt somit die wiederholte Probenentnahme während der Mast.
2.2.6 Diagnostik
Zum Nachweis Cl. perfringens-bedingter Erkrankungen werden der kulturelle Erregernachweis, das Lesion Scoring, bei dem die Darmschädigungen klassifiziert werden, und der Nachweis von Cl. perfringens und seinen Toxinen per ELISA und PCR eingesetzt. Allerdings weisen diese diagnostischen Methoden Grenzen auf. Da eine Voraussage für den Zeitpunkt mit der stärksten Ausprägung der Läsionen als Folge der NE bzw. SNE nicht möglich ist, müssen regelmäßig Proben untersucht werden, um ein falsch negatives Ergebnis zu vermeiden. Genauso verhält es sich mit dem bakteriologischen Nachweis. Dagegen braucht die CPH-Prävalenz nur bei der Schlachtung erhoben werden, weil die schwereren Leberveränderungen nicht wieder
ausheilen. Allerdings ist mit dieser Methode nur ein nachträglicher Nachweis möglich. Der Vorteil des Lesion Scoring ist, dass ein physischer Schaden vorhanden ist, der ein spezifisches Krankheitsmaß darstellt, während die anderen Methoden indirekt arbeiten (LOVLAND et al. 2003). Die Mortalität ist ein weniger geeigneter Indikator für NE (KALDHUSDAL et al. 1999).
Auch der kulturelle Nachweis von Cl. perfringens ist umstritten, da einige Autoren der Meinung sind, dass die Isolierung von Cl. perfringens als Auslöser der Erkrankung von untergeordneter Rolle ist, weil er ein natürlicher Bewohner des Gastrointestinaltraktes ist (NORTON u. HOERR 1999) und auch gesunde Tiere eine individuell sehr unterschiedliche Clostridienmenge beherbergen (WAGES u.
OPENGART 2003). Andererseits vertreten KALDHUSDAL und LOVLAND (2002) die Meinung, dass die bakteriologische Untersuchung das Mittel der Wahl sei, um quantitative Untersuchungen durchzuführen. Im Verlauf ihrer Untersuchungen, bei denen sie Hühner experimentell mit Cl. perfringens infizierten, bewegte sich der Ort der höchsten Nachweishäufigkeit vom vorderen zum hinteren Abschnitt des Verdauungstraktes. Außerdem erhöhte sich in Jejunum, Ileum und Zäkum die absolute Menge an Cl. perfringens um 103 bis 105 (CRAVEN 2000). Ferner gibt es bei Broilern bis zu einem Alter von 5 Wochen eine positive Korrelation zwischen Alter und Cl. perfringens-Belastung (KALDHUSDAL et al. 2001).
Unklar ist allerdings, ab welchem Wert die Ergebnisse der quantitativen Untersuchung als Nekrotisierende Enteritis zu interpretieren sind. LONG et al. (1974) sind der Auffassung, dass 0 bis 105 KBE/g Darminhalt zur normalen Darmflora gehören, bei Tieren mit NE würde man 107 bis 108 KBE/g finden. Dies stimmt mit den Untersuchungen von BJERRUM et al. (2006) überein, welche Cl. perfringens nach experimenteller Infektion in Ileum und Zäkum mit einer Konzentration von 107 KBE/g nachwiesen. Auch KÖHLER, B. et al. (1974a) wiesen durchschnittlich 108 KBE pro Gramm Darminhalt bei an NE erkrankten Broilern nach. Allerdings variierten die Werte von 105 bis 1010 KBE/g. Von einer derartigen Streuung der Ergebnisse berichtet auch SONGER (1996), der anführt, dass Cl. perfringens in einer Konzentration von 104 bis 107 KBE/g bei einer Erkrankung regelmäßig auftritt.
KALDHUSDAL und LOVLAND (2002) geben an, dass Darminhalt oder Fäzes mindestens 106 KBE pro Gramm enthalten sollten, wenn man von einer Cl. perfringens-assoziierten nekrotisierenden Enteritis sprechen will. SI et al. (2007) ermittelten, dass der Schwellenwert für das Entstehen einer NE mit Läsionen der Stärke 2 (siehe 2.2.6.2) bei einem Clostridiengehalt von 105 KBE/g Ileuminhalt liegt.
2.2.6.1 Kultureller Nachweis
In jedem Fall sollten die Proben für die Diagnostik unverzüglich nach dem Tod des Tieres entnommen werden, um eine Vermehrung im Tierkörper zu vermeiden (JOHANNSON 2006).
Cl. perfringens wächst auf vielen gängigen Medien, wie z.B. Blutagar oder Eigelb- Agar. Da der Nachweis jedoch zumeist aus Darminhalt oder Kot erfolgt, ist es vorteilhaft Selektivmedien zu verwenden, um die Begleitflora zu unterdrücken. Am häufigsten werden der Sulfit-Polymyxin-Sulfadiazin-Agar (SPS), der Shahidi- Ferguson-perfringens-Agar (SFP) und der Trypton-Sulfit-Neomycin-Agar (TSN) eingesetzt. Dabei sollte die Wahl des Mediums den jeweiligen Anforderungen entsprechend getroffen werden. So sind SPS- und TSN-Agar bei starker Kontaminierung der Proben mit anderen Mikroorganismen dem SFP-Agar durch ihre bessere Selektivität überlegen. Bei wenig kontaminierten Proben ist der SFP–Agar vorteilhaft, da das Sporenwachstum hier signifikant höher ist. Das Wachstum vegetativer Zellen von Cl. perfringens ist bei SFP–Agar und SPS–Agar vergleichbar, bei TSN–Agar ist es etwas niedriger (HARMON et al. 1971). Insgesamt wird der SPS-Agar als ein gut geeignetes Medium zum Nachweis von Cl. perfringens angesehen (SHANE et al. 1984).
Die Ansprüche an die Zusammensetzung des Nährmediums sind bei verschiedenen Cl. perfringens – Stämmen gleich (GOLDNER et al. 1985). Die Bakterien wachsen besser, wenn die SPS-Platten nach der Beimpfung mit Agar überschichtet (Overlay) werden (HALL et al. 1969).
