Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen mit dem Verfahren der Bouillon-Mikrodilution bei pathogenen Bakterien von Fischen und molekulare Charakterisierung
von Resistenzgenen
INAUGURAL - DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin – Doctor medicinae veterinariae –
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Ellen von Czapiewski
Greifswald
Hannover 2010
Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. Stefan Schwarz
Institut für Nutztiergenetik, Friedrich- Loeffler-Institut (FLI), Neustadt-Mariensee
Prof. Dr. Reinhard Kroker
Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (BVL), Berlin
1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. Stefan Schwarz 2. Gutachter: Apl. Prof. Dr. Dieter Steinhagen
Tag der mündlichen Prüfung: 18.05.2010
Diese Arbeit wurde durch Mittel des Bundesverbands für Tiergesundheit e.V. gefördert.
Denen, die mich begleiteten
Schröer, U., E. von Czapiewski, S. Schwarz, J. Wallmann (2007) Ergebnisse der Empfindlichkeitsuntersuchung bakterieller Pathogene von Zier- und Nutzfischen.
Tagung des Arbeitskreises Veterinärmedizinische Infektionsdiagnostik (AVID) der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft (DVG), 24.-16.10.2007 Kloster Banz, Staffelstein
von Czapiewski, E., K. Kadlec, H. Kaspar, U. Steinacker, J. Wallmann, S.
Schwarz (2008) Molecular analysis of sulfonamide and trimethoprim resistance among fish-pathogenic aeromonads.
Abstracts of the 48th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (ICAAC), 25.-28.10.2008 Washington DC / USA, C2-3911, 207.
von Czapiewski, E., K. Kadlec, H. Kaspar, J. Wallmann, S. Schwarz (2008) Molekulare Grundlagen der Sulfonamid- und Trimethoprimresistenz bei fischpathogenen Aeromonas spp.
Abstracts der Tagung der Fachgruppe Bakteriologie und Mykologie der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft (DVG), 25.-27.06.2008 Braunschweig, publiziert in: Berliner und Münchener Tierärztliche Wochenschrift, 121, P 47, 407.
Kadlec, K., E. von Czapiewski, H. Kaspar, U. Steinacker, J. Wallmann, S.
Schwarz (2009) Molecular analysis of sulfonamide and trimethoprim resistance among fish-pathogenic aeromonads.
Abstracts of the 3rd Symposium on Antimicrobial Resistance in Animals and the Environment (ARAE) 01.-03.06.2009 in Tours, France, O30, 53.
1. Einleitung 1
2. Literaturübersicht 3
2.1. Taxonomie und Speziesbeschreibung 3
2.1.1. Bewegliche Aeromonas spp. 3
2.1.2 Aeromonas salmonicida 7
2.1.3. Yersinia ruckeri 9
2.2. Prophylaxe von Infektionen mit fischpathogenen Bakterien 10 2.3. Testung der In-vitro-Empfindlichkeit gegenüber antimikrobiell
wirksamen Stoffen 11
2.3.1. Agardiffusionstest 11
2.3.2. E-Test 12
2.3.3. Bouillon-Dilutionsverfahren 13
2.3.3.1. Bouillon-Mikrodilution 13
2.3.3.2. Bouillon-Makrodilution 14
2.4. Entstehung von Resistenzen 15
2.5. Mobile genetische Elemente 16
2.5.1. Plasmide 16
2.5.2. Transposons 16
2.5.3. Insertionselemente 17
2.5.4. Integrons und Genkassetten 18
2.6. Grundlagen der Resistenz gegenüber ausgewählten Antibiotika 21
2.6.1. Sulfonamid- und Trimethoprimresistenz 21
2.6.2. Aminoglykosid- und Aminocyclitolresistenz 23
2.6.3. Phenicolresistenz 26
2.6.4. Tetracyclinresistenz 28
2.6.5. β-Laktamresistenz 30
2.6.6. Resistenz gegenüber Gyrase-Inhibitoren 32
3. Material und Methoden 35
3.1.3. Medien 36
3.1.4. Mikrotiterplatten 37
3.1.5. PCR-Primer 39
3.2. Methoden 41
3.2.1. Mikrobiologische Methoden 42
3.2.1.1. Kultivierung und Lagerung 42
3.2.1.2. Speziesdifferenzierung 42
3.2.2. Bestimmung der In-vitro-Empfindlichkeit gegenüber antimikrobiell
wirksamen Stoffen 43
3.2.2.1. Anzuchtbedingungen der Isolate 43
3.2.2.2. Herstellung des Inokulums 43
3.2.2.3. Bouillon-Mikrodilution 44
3.2.2.4. Agardiffusion 46
3.2.3. Molekularbiologische Methoden 46
3.2.3.1. Agarose-Gelelektrophorese 47
3.2.3.2. Präparation der Gesamtzell-DNA 48
3.2.3.3. Präparation der Plasmid-DNA 49
3.2.3.3.1. Minilysat-Methode 49
3.2.3.3.2. Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Fällung 50
3.2.3.4. Restriktionsanalysen 51
3.2.3.5. Transformation 52
3.2.3.6. Sequenzanalysen 53
3.2.3.7. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 54
3.2.3.7.1. Sequenzierung von PCR-Produkten 55
3.2.3.7.2. Monoplex-PCR zur Detektion des Resistenzgenes aac(3´)-IV 56 3.2.3.7.3. Monoplex-PCR zur Detektion weiterer Resistenzgene 57 3.2.3.7.4. Multiplex-PCR für den Nachweis der Resistenzgene tet(A) bis tet(E) 61
3.2.3.7.5. Nachweis von Klasse 1-Integrons 62
3.2.3.8. Klonierung von Klasse 1-Integrons 63
®
3.2.3.9. Speziesidentifizierung der Aeromonaden 65
4. Resultate 67
4.1. Überprüfung der biochemischen Genuszugehörigkeit 67 4.1.1. Speziesidentifizierung der beweglichen Aeromonaden 68 4.2. Empfindlichkeit der fischpathogenen Bakterien gegenüber
verschiedenen antimikrobiellen Wirkstoffen 70
4.2.1. Resultate der Empfindlichkeitsbestimmung für Aeromonas spp. 70
4.2.1.1. Trimethoprim und Sulfonamide 70
4.2.1.2. Aminoglycoside und Aminocyclitole 73
4.2.1.3. Phenicole 76
4.2.1.4. Tetracycline 78
4.2.1.5. β-Laktame 80
4.2.1.6. Gyrase-Inhibitoren 82
4.2.1.7. Weitere getestete Wirkstoffe 85
4.2.2. Resultate der Empfindlichkeitsbestimmung für Aeromonas salmonicida 85 4.2.3. Resultate der Empfindlichkeitsbestimmung für Yersinia ruckeri 88 4.3. Untersuchung der Isolate hinsichtlich der Gene für Resistenz
gegenüber ausgewählten antimikrobiellen Wirkstoffen 90 4.3.1. Nachweis von Genen für Resistenz gegenüber Sulfonamiden und
Trimethoprim 92
4.3.1.1. Nachweis von Klasse 1-Integrons 92
4.3.1.2. Isolate mit mehreren Klasse 1-Integrons 124
4.3.1.3. Kassettenassoziierte Resistenzgene 125
4.3.1.4. Nicht-kassettenassoziierte Trimethoprimresistenz 127 4.3.2. Nachweis des Apramycin-Resistenzgenes aac(3´)-IV 129
4.3.3. Nachweis von Phenicol-Resistenzgenen 130
4.3.3.1. Nachweis von Chloramphenicol-Resistenzgenen 130 4.3.3.2. Nachweis von Chloramphenicol-/Florfenicol-Resistenzgenen 131
5.1.1. Speziesidentifizierung der beweglichen Aeromonaden 134
5.2. Methodik der Empfindlichkeitsprüfung 136
5.3. Empfindlichkeit der Isolate und identifizierte Resistenzgene 139 5.3.1. Resistenzgene gegenüber Trimethoprim/Sulfonamiden 139
5.3.2. Resistenzgene gegenüber Apramycin 141
5.3.3. Resistenzgene gegenüber Phenicolen 142
5.3.4. Resistenzgene gegenüber Tetracyclinen 143
5.3.5. Empfindlichkeit gegenüber β-Laktamen und Chinolonen 145 5.3.6. Isolate mit erhöhten MHK-Werten für mehrere Wirkstoffe 146
5.4. Klasse 1-Integrons 147
5.4.1. Klasse 1-Integrase 147
5.4.2. Variable Bereiche der Klasse 1-Integrons 147
5.5. Empfindlichkeit von Yersinia ruckeri 148
5.6. Kritische Aspekte des Arzneimitteleinsatzes bei Fischen 149
6. Zusammenfassung/Summary 151
7. Literatur 157
8. Anhang 185
8.1. MHK-Werte 185
8.1.1. MHK-Werte von Aeromonas spp. 185
8.1.2. MHK-Werte von Aeromonas salmonicida 196
8.1.3. MHK-Werte von Yersinia ruckeri 198
8.2. Medien, Lösungen, Puffer 201
9. Tabellenverzeichnis 207
10. Abbildungsverzeichnis 211
A. Aeromonas
aqua bidest. lat.: aqua bidestilata (zweifach destilliertes Wasser) ATCC American Type Culture Collection
bp Basenpaar(e)
BSA bovines Serum Albumin
bzw. beziehungsweise
CAT Chloramphenicol Acetyl Transferase CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
CoA Coenzym A
°C Grad Celsius
CaCl2 Calciumchlorid
CS engl.: conserved segment (konservierter Bereich von Klasse 1-Integrons) DHFR Dihydrofolatreduktase
DHPS Dihydropteroinsäure-Synthetase
DNA engl.: desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)
E. Escherichia
et al. lat.: et alii (und andere) fw engl: forward (vorwärts)
GCAT Glycerophospholipid:Cholesterol Acetyltransferase HG Hybridisierungsgruppe
kb Kilo-Basenpaare
L Liter
LB Luria Bertani (Agar oder Medium)
mg Milligramm
ml Milliliter
MHK minimale Hemmkonzentration
min Minute
NaCl Natriumchlorid
NCIMB National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria
P. Pseudomonas
PCR engl.: polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion) RNA engl.: ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)
rv engl: reverse (rückwärts)
SB Schafblut
sek Sekunde
sp. Spezies (Singular) spp. Spezies (Plural)
Y. Yersinia
z.B. zum Beispiel
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
1. Einleitung
Die Zunahme von Resistenzen bakterieller Krankheitserreger gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen wird sowohl bei tier- als auch bei humanpathogenen Bakterien beobachtet. Um eine weitere Selektion und Verbreitung von Resistenzmechanismen zu bewerten, sind objektive und vergleichbare Daten notwendig. Im Rahmen des jährlichen nationalen Resistenzmonitoringprogrammes GERM-Vet liegen bereits Daten zur Resistenzlage pathogener Bakterien bei Nutztieren (Rinder, Schweine und Geflügel) vor. Komplementär zum GERM-Vet Programm wurden in der BfT-GermVet Monitoringstudie 2004-2006 bakterielle Infektionserreger von Hunden, Katzen und Pferden hinsichtlich ihrer antimikrobiellen Resistenz untersucht. Vergleichbare Angaben über die Empfindlichkeit und die bei resistenten Isolaten zugrunde liegende Resistenzmechanismen von fischpathogenen Bakterien aus Deutschland fehlten jedoch bisher. Ziel der vorliegenden Dissertation war es daher, entsprechende Daten zu erarbeiten.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden 206 fischpathogene Isolate von Untersuchungsämtern aus Deutschland auf ihre In-vitro-Empfindlichkeit gegenüber bestimmten antimikrobiellen Wirkstoffen untersucht und Minimale Hemmkonzentrationen (MHK-Werte) ermittelt . Die Testung wurde nach Vorgaben des „Clinical and Laboratory Standards Institute“ durchgeführt, um eine Vergleichbarkeit und Reproduzierbarkeit der Daten zu gewährleisten.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden ausgewählte Isolate hinsichtlich der zugrunde liegenden molekularen Resistenzmechanismen untersucht. Um einen Überblick über bei Bakterien von Fischen vorhandene Resistenzmechanismen zu erhalten, wurden nach Auswertung der Empfindlichkeitsdaten Isolate mit einer deutlich erhöhten minimalen Hemmkonzentration im Vergleich zur restlichen Testpopulation molekulargenetisch untersucht. Dabei fokussierte sich diese Arbeit auf die Detektion von Resistenzgenen, die bereits auf mobilen genetischen Elementen beschrieben wurden.
2. Literaturübersicht
2.1. Taxonomie und Speziesbeschreibung
2.1.1. Bewegliche Aeromonas spp.
Vertreter der Gattung Aeromonadaceae sind ubiquitär vorkommende Gram-negative kokkoide bis stäbchenförmige Bakterien mit einer Länge von 1,0-3,5 µm und einer Breite von 0,3-1,0 µm. Sie sind fakultative Anaerobier, fermentieren verschiedene Zucker und sind Oxidase-positiv. Ein weiteres Merkmal ist ihre Beweglichkeit durch eine monotriche 1,7 µm lange polare Flagelle (POPOFF 1984). Aeromonaden können in einem Temperaturbereich von 0-45°C wachse n. Sie sind tolerant gegenüber einem pH-Bereich von 4,5-9,0 pH und einer NaCl-Konzentration von 0- 4% (PALUMBO 1986).
Die Taxonomie der Aeromonas-Spezies war in den letzten 20 Jahren aufgrund vielfältiger neuer biochemischer und molekularbiologischer Untersuchungsmöglich- keiten ständigen Veränderungen unterworfen. Spezies der Gattung Aeromonas wurden anfänglich in die Familie Vibrionaceae eingruppiert (POPOFF 1984) und in die Arten Aeromonas punctata (mesophil und beweglich durch monotriche Begeißelung) und Aeromonas salmonicida (psychrophil und atrich) unterteilt. Im Jahr 1986 erkannte man die Aeromonaden als eigenständige Familie, die Aeromonadaceae, an (COLWELL et al. 1986). Später erfolgte eine Unterteilung der Gattung A. punctata in die mesophilen Spezies A. hydrophila, A. caviae, A. sobria.
Diese Zuordnung erfolgte phänotypisch anhand biochemischer Reaktionen wie der Verstoffwechselung von verschiedenen Zuckern und Aminosäuren.
Schwierigkeiten bereitete allerdings die Speziesidentifizierung anhand biochemischer Nachweisreaktionen, da die phänotypische Charakterisierung häufig nicht mit den Ergebnissen der genotypischen Bestimmung übereinstimmte (WAHLI et al. 2005;
ORMEN et al. 2005). Humane Aeromonas-Isolate können mittlerweile anhand
biochemischer Reaktionen einer Hybridisierungsgruppe (HG) zugeordnet werden, während Umwelt- und Fischisolate stark abweichende Reaktionen zeigen. Aus diesem Grund wird in der Literatur die Einordnung anhand des Genotyps bzw. der Hybridisierungsgruppen (ABBOTT et al. 1992) favorisiert. Diese Klassifikation basiert auf der Southern Blot Hybridisierung und erlaubt die Unterteilung in mittlerweile 17 verschiedene Hybridisierungsgruppen (Tabelle 1).
Ein neuer Ansatz der Speziesidentifizierung der Aeromonaden besteht in der Analyse der ribosomalen DNA bzw. des Gens gyrB. Hierbei können bestimmte konservierte Sequenzbereiche als phylogenetische Marker für die Speziesidentifizierung eingesetzt werden. In der Arbeit von YANEZ et al. (2003) korrelierten die Ergebnisse der Southern Blot Hybridisierung mit den Ergebnissen der Sequenzanalysen des Genes gyrB. Dieses Gen kodiert für die Untereinheit B der DNA-Gyrase, welche zur Familie der Topoisomerasen Typ II gehört. DNA-Gyrasen übernehmen im bakteriellen Zellstoffwechsel eine wichtige Rolle: Sie sind für das negative Überspiralisieren der DNA nach Replikation, Transkription, Rekombination und/oder Reparatur zuständig.
Tabelle 1 – Hybridisierungsgruppen, Geno- und Phänotypen von Aeromonas spp.
Hybridisierungsgruppe Genotyp Phänotyp
1 A. hydrophila
2 A. bestiarum A. hydrophila
3 A. salmonicida subsp. salmonicida, achromogenes, masoucida, smithia
und pectinolytica
4 A. caviae
5 A. media A. caviae
6 A. eucrenophila
7 A. sobria
8 A. veronii biovar sobria A. sobria
9 A. jandaei
10 A. veronii biovar veronii
11 A. sp.
12 A. schubertii
A. schubertii-trota
13 A. sp.
14 A. trota
15 A. allosaccharophila
16 A. encheleia
17 A. popoffii
Bei Fischen spielen bewegliche Aeromonaden als fakultativ pathogene Bakterien eine wichtige Rolle. Sie verursachen bei immunsupprimierten Tieren Hautläsionen, Flossenfäule und Septikämien. In den einzelnen Arbeiten differieren die Häufigkeitsangaben der einzelnen Spezies. AUSTIN und ADAMS (1996) beschrieben die Spezies A. hydrophila als vorherrschende fischpathogene Spezies weltweit. Zu diesem Ergebnis kamen auch NIELSEN et al. (2001) bei
Untersuchungen von Aeromonas-Isolaten in chinesischen Aquakulturen.
Demgegenüber verursachte in einer Schweizer Fischfarm nur A. sobria Krankheitsausbrüche bei Karpfen, die Krankheitssymptome wie Flossenfäule und Hautläsionen zeigten (WAHLI et al. 2005). In der Arbeit von KOZINSKA et al. (2002) wurden 37 bewegliche Aeromonaden von erkrankten Karpfen untersucht, die zu den Spezies A. bestiarum, A. salmonicida, A. veronii, A. sobria und A. encheleia gehörten. In Untersuchungen auf einer Forellenfarm (LEE et al. 2002) ergab die Speziesidentifizierung mittels RFLP-Fingerprinting, dass 50% der Isolate zur Subspezies A. salmonicida und A. bestiarum, 14% zu A. hydrophila, 8% zu A. caviae und 18% zu A. media gehörten. IQUBAL et al. (1998) und RAHMAN et al. (2002) wiesen die Spezies A. veronii biovar sobria als vorherrschende fischpathogene Spezies in Malaysia, Thailand und Bangladesch nach. AUSTIN und ADAMS (1996) gaben als vorherrschende Fischpathogene die Spezies A. hydrophila, A. sobria, A. allosaccharophila, A. salmonicida und A. media an.
In den letzten zwanzig Jahren erkannte man, dass Aeromonaden auch in der Humanmedizin eine große Rolle als Verursacher von Wundinfektionen, Augen- und Lungenentzündungen, Septikämien und Gastroenteritiden, ausgehend von der Aufnahme oder dem Kontakt mit kontaminiertem Wasser und Lebensmitteln, spielen (ABBOTT et al. 1998, JANDA u. ABBOTT 1998, JOSEPH u. CARNAHAN 2000). In Nahrungsmitteln wurden Aeromonaden in Austern, Fischen und Krebstieren, in Frischfleisch von Geflügel, Rind, Schwein und Schaf, Frischgemüse sowie in roher und pasteurisierter Milch nachgewiesen (HANNINEN et al. 1995, TSAI et al. 1996, BORCH et al. 1996, KHALIL et al. 1997). Innerhalb der Aeromonas-Spezies wurden bei humanmedizinischen Erkrankungen zu einem Großteil die Spezies A hydrophila, A. caviae, A jandei, A. veronii biovar sobria und A. schubertii als Auslöser bei diesen Erkrankungen nachgewiesen (KUIJPER et al. 1989, ALTWEGG et al. 1990, HAVELAAR et al. 1992, KHÜN et al. 1997, BORRELL et al. 1998, ORMEN et al.
2005).
2.1.2. Aeromonas salmonicida
Aeromonas salmonicida ist ein Gram-negatives kokkoides, unbewegliches Stäbchenbakterium. Die Isolate sind vorwiegend Oxidase-positiv, nur von WIKLUND et al. (1994) wurden auch Oxidase-negative Isolate beschrieben. Die minimale Wachstumstemperatur beträgt 4°C, die maximale 34°C und das Temperaturoptimum liegt zwischen 20-22°C. Die Spezies wird in die HG 3 (Tabelle 1) eingeordnet.
Im Jahr 1894 wurde die Fischkrankheit Furunkulose zum ersten Mal in Deutschland bei Forellen beschrieben (EMMERICH u. WEIDEL 1894), die durch die beobachteten furunkelartigen Schwellungen ihren Namen erhielt. Der Erreger wurde zunächst als Bakterium oder Bacillus salmonicida bezeichnet (Mc CRAW 1952), bis er 1953 in Aeromonas salmonicida umbenannt wurde (GRIFFIN et al. 1953). Seit 1963 wurde auch über atypische A. salmonicida-Isolate berichtet. Mc CARTHY (1977) teilte daher die Spezies in zwei Gruppen ein: typische A. salmonicida und atypische A.
salmonicida. Im Jahr 1984 erfolgte durch POPOFF eine Unterteilung in die drei Subspezies A. salmonicida subsp. salmonicida, A. salmonicida subsp.
achromogenes und A. salmonicida subsp. masoucida. Als vierte Subspezies wurde A. salmonicida subsp. smithia (AUSTIN et al. 1989) und als fünfte A. salmonicida subsp. pectinolytica (PAVAN et al. 2000) beschrieben.
Die vier psychrophilen Subspezies A. salmonicida subsp. salmonicida, A.
salmonicida subsp. achromogenes, A. salmonicida subsp. masoucida und A.
salmonicida subsp. smithia wurden von Fischen isoliert, während die mesophile Subspezies A. salmonicida subsp. pectinolytica aus Wasserproben isoliert wurde. A.
salmonicida subsp. pectinolytica wächst bis zu einem Temperaturmaximum von 45°C. Die Subspezies A. salmonicida subsp. salmonicida bildet als auffallendes Merkmal ein braunes wasserlösliches Pigment. Dieses Pigment wird als Melanin bezeichnet und entsteht bei Oxidations- und Polymerisationsschritten aus Tyrosin (KOPPANG et al. 2000). Bei atypischen Stämmen wird vermutet, dass ihnen Enzyme bzw. Gene für die Pigmentproduktion fehlen. A. salmonicida Subspezies verfügen
über komplexe Virulenzfaktoren, die zwischen den einzelnen Subspezies variieren.
Drei Virulenzfaktoren wurden beschrieben. Zum einen ein Hüllprotein (additional cell envelope protein), welches eine zusätzliche Schutzschicht um die äußere Membran bildet. Zum anderen die bakteriellen Endotoxine LPS und GCAT, welche zusammen einen Komplex (GCAT/LPS) bilden und sezerniert werden. Dieser Komplex hämolysiert Fischerythrozyten und ist toxisch für andere Zellen wie z.B. Leukozyten.
Als dritter Virulenzfaktor sind Proteasen beschrieben worden (LEE u. ELLIS 1990, SHIEH u. MACLEAN 1975, SAKAI 1977, CIPRIANO et al. 1981, PRICE et al. 1989, GUDMUNDSDOTTIER et al. 1990).
Furunkulose, die durch A. salmonicida subsp. salmonicida verursacht wird, wird als typische Furunkulose bezeichnet, während die durch atypische A. salmonicida- Subspezies verursachten Symptome als atypische Furunkulose benannt sind (GROMAN et al. 1992, GUDMUNDSDOTTIR 1997, INGILÆ et al. 2000, LJUNGBERG u. JOHANSSON 1977). Bei der typischen Furunkulose, die vor allem bei Salmoniden auftritt, werden mehrere Krankheitsformen unterschieden. Die Geschwürform ist durch 2-20 mm große Beulen und offene Geschwüre dorsal und lateral gekennzeichnet. Diese Form verläuft chronisch, kann aber auch in die akute Form übergehen. Bei der akuten bis subakuten hämorrhagischen Form zeigen sich Petechien in den Eingeweiden, der Haut, den Kiemen, der Muskulatur und den Flossen. Besonders bei größeren Salmoniden wird diese Form beobachtet und verläuft sehr verlustreich. Die Darmfurunkulose zeigt sich durch starke Hyperämie des Darmes, Hämorrhagien der Pylorusanhänge und Protrusionen des Afters. Die vierte Form, die symptomlose Form, verursacht große Verluste bei der Brut und den Setzlingen und ist nur bakteriologisch nachzuweisen. Atypische A. salmonicida- Isolate wurden als Krankheitserreger vorrangig bei Fischarten, die nicht in die Gruppe der Salmoniden gehören, nachgewiesen. Sie verursachen die Karpfen- Erythrodermatitis (BÖHM et al. 1986), die Geschwürkrankheit bei Goldfischen (WHITTINGTON et al. 1987), die Hautgeschwürkrankheit bei Flundern und die ulzerative Furunkulose bei Salmoniden, auch atypische A. salmonicida-Infektion genannt.
2.1.3. Yersinia ruckeri
Die Gattung Yersinia (Y.) gehört in die Familie der Enterobacteriaceae. Yersinien sind kokkoide bis kurze Stäbchen, die bei 25°C durc h eine peritriche Begeißelung beweglich (mit Ausnahme von Y. pestis) und bei 37°C unbegeißelt und damit unbeweglich sind (BERCOVIER u. MOLLARET 1984, BOTTONE 1997, NEUBAUER et al. 2001a). Sie sind fakultative Anaerobier, Oxidase-negativ und Katalase-positiv, reduzieren Nitrat zu Nitrit und bilden das Enzym Urease. Ein Wachstum ist innerhalb von 4-42°C möglich, wobei die optimale Wachstumstem peratur bei 28-29°C liegt. Um Y. ruckeri von den morphologisch ähnlichen Hafnien zu differenzieren, eignet sich eine Überprüfung der Citrat-Verwertung, die bei Y. ruckeri positiv ausfällt. Dabei ist zu beachten, dass die Reaktion falsch negativ ausfällt, wenn die Bakterien bei Raumtemperatur (22-25°C) inkubiert werden (NWFHS La boratory Procedures Manual – Version 1.0, June 2001).
In der Gattung Yersinia befinden sich derzeit neben Y. ruckeri elf verschiedene Spezies (NEUBAUER et al. 2001b): Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y.
enterocolitica, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. aldovae, Y. mollaretii, Y. bercovieri und Y. rhodei (BRENNER 1979, WAUTERS et al. 1988). Die Spezies Y.
ruckeri verursacht die Rotmaulseuche (Enteric redmouth disease, ERM). Salmoniden sind empfindlich für diesen Erreger, wobei die Regenbogenforelle am häufigsten betroffen ist. Andere Fischarten sind häufig nur symptomlose Überträger dieses Erregers. Prädisponierende Faktoren für das Ausbrechen der Krankheit sind immunsupprimierende Einflüsse wie Transporte, hohe Besatzdichte oder hohe Wassertemperaturen bei geringem Sauerstoffgehalt. Bei erkrankten Fischen sind Hämorrhagien der Schleimhäute des Maules, der Bauchhöhle und der inneren Organe sichtbar. Anhand der Serotypisierung werden sechs verschiedene Serovare (Hagermann-Serovare) unterschieden. Serovar 1 ist weltweit am häufigsten an Krankheitsausbrüchen beteiligt (Mc CARTHY u. JOHNSON 1982). Weitere Möglichkeiten einer genaueren Zuordung sind die Einordnung in klonale Gruppen und in Serotypen anhand der O-Antigene (DAVIES 1990, DAVIES 1991). Yersinia
ruckeri-Isolate sind beweglich, allerdings wurden 2006 auch unbewegliche Isolate dieser Spezies beschrieben (FOUZ et al. 2006).
2.2. Prophylaxe von Infektionen mit fischpathogenen Bakterien
Krankheitsausbrüche führen in der Fischzucht zu großen Tierverlusten und damit zu einem hohen wirtschaftlichen Schaden für den Halter. In der Speisefischproduktion ist eine Einzeltierbehandlung nicht praktikabel, weil sie zu kostspielig ist und ein Handling einzelner Tiere sehr schwierig ist. Daher werden Prophylaxemaßnahmen ergriffen, um die Gefahr eines Krankheitsausbruches zu mindern. Hierzu zählen eine angemessene Besatzdichte, qualitativ hochwertiges Futter, regelmäßige Reinigung, gute Wasserqualität und das regelmäßige Überprüfen des Gesundheitszustandes der Tiere und der parasitären Belastung der Tiere. Bei Zierfischen werden Einzeltierbehandlungen hingegen häufiger durchgeführt, da bestimmte Fischarten wie der Koi einerseits einen hohen materiellen Wert besitzen und andererseits eine emotionale Bindung des Tierhalters besteht bzw. die Fische einen hohen ideellen Wert für den Tierhalter haben. Aus diesen Gründen werden bei Zierfischen auch Behandlungen durchgeführt, die den Anschaffungswert der Tiere übersteigen. Für die Prophylaxe der Furunkulose bei Salmoniden und der Rotmaulseuche stehen Impfstoffe zur Verfügung.
2.3. Testung der In-vitro-Empfindlichkeit von Bakterien gegenüber antimikrobiell wirksamen Stoffen
Die In-vitro-Empfindlichkeitsprüfung bakterieller Erreger stellt für die Behandlung erkrankter Tiere und als Kriterium für epidemiologische Erhebungen der Resistenzsituation gegenüber ausgesuchten Wirkstoffen ein wichtiges Hilfsmittel dar.
Für die Überprüfung der phänotypischen In-vitro-Empfindlichkeit der Isolate stehen verschiedene Testsysteme zur Verfügung. Sie geben Aufschluss darüber, ob der Erreger gegenüber bestimmten Antibiotika als empfindlich oder resistent anzusehen ist. Anhand der Aussage kann abgeschätzt werden, ob eine in-vivo Behandlung mit dem jeweiligen Wirkstoff erfolgreich sein wird. Allerdings kann eine In-vitro- Empfindlichkeit nicht uneingeschränkt für die in-vivo Empfindlichkeit übernommen werden. Einschränkende Parameter sind Faktoren wie die Absorption des Antibiotikums durch den Organismus, die Gewebegängigkeit und damit die Wirkstoffkonzentration am Zielort. Richter und Mitarbeiter (2007) haben eine Vielzahl von Faktoren beschrieben, die für ein Versagen der antibiotischen Therapie in der veterinärmedizinischen Praxis verantwortlich sein können.
Für die Empfindlichkeitsbestimmung innerhalb einer Wirkstoffklasse reicht es häufig aus, einzelne Stellvertretersubstanzen zu testen. Anhand dieser Daten ist ein Rückschluss auf das Empfindlichkeitsverhalten anderer Vertreter dieser Klasse möglich (WERCKENTHIN et al. 2005). Die verschiedenen Testsysteme für die Empfindlichkeitsprüfung unterscheiden sich hinsichtlich der qualitativen und quantitativen Aussagen zur Empfindlichkeit des Erregers, des Arbeitsaufwandes und der Kosten (ROCKSIN 2005).
2.3.1. Agardiffusionstest
Der Agardiffusionstest ist ein kostengünstiger und schnell durchführbarer Empfindlichkeitstest in der Routinediagnostik, welcher von BAUER et al. (1966)
etabliert wurde. Hierbei wird ein Inokulum mit einer definierten Bakteriendichte auf einer Agarplatte ausgespatelt. Anschließend wird der Agar mit Antibiotikatestplättchen beschickt, die eine definierte Wirkstoffmenge enthalten. Der Wirkstoff diffundiert während der Inkubation in den Nährboden und produziert einen Wirkstoffgradienten um das Testplättchen. Je nach Grad der Empfindlichkeit des Isolates wird das bakterielle Wachstum in einem unterschiedlich großen Radius um das Plättchen unterdrückt. Dieser Bereich wird als Hemmhof bezeichnet. Anhand des Durchmessers, der in Millimetern angegeben wird, kann das Isolat qualitativ unter Verwendung vorgegebener Grenzwerte als „resistent“, „intermediär“ oder
„empfindlich“ beurteilt werden. Eine quantitative Aussage zur Erregerempfindlichkeit ist mit diesem Testsystem nicht möglich.
Die Durchführung des Agardiffusionstests hat genau nach einer Durchführungsvor- schrift zu erfolgen, da die ermittelten Hemmhofdurchmesser sonst stark variieren können (ALREUTHER et al. 1997, STOCK et al. 2001). Ursachen für unterschiedliche Ergebnisse können bereits in geringfügigen Schichtdickenunterschieden des Agars, dem Alter der Platten, Abweichungen in den Inokulumdichten und im Zeitraum, bis die Bakteriensuspension auf dem Nährboden ausgespatelt wird, liegen (WIEDEMANN et al. 1983). Die CLSI-Vorschrift M42-A
„Methods for Antimicrobial Disk Susceptibility Testing of Bacteria Isolated From Aquatic Animals; Approved Guideline“ gibt wichtige Richtlinien für die lege artis Durchführung des Agardiffusionstests bei Bakterien aus aquatischen Systemen.
2.3.2. E-Test
Der E-Test ähnelt in der Durchführungsweise dem Agardiffusionstest. Jedoch werden statt der Testplättchen mit einer definierten Wirkstoffkonzentration Teststreifen verwendet, die den Wirkstoff in einem meist recht weiten Konzentrationsbereich enthalten. Eine Skalierung auf dem Streifen gibt die Wirkstoffkonzentration an der jeweiligen Stelle an. Im Gegensatz zum Agardiffusionstest kann die Empfindlichkeit
des Erregers hierbei auch quantitativ beurteilt werden. Es wird die minimale Hemmkonzentration (MHK) anhand des Bakterienwachstums vom Teststreifen abgelesen. Der MHK-Wert wird hier definiert als die niedrigste Wirkstoffkonzentration, bei der kein Erregerwachstum mehr sichtbar ist. Der E-Test ist für veterinärmedizinische Untersuchungen nur bedingt einsetzbar, da für viele veterinärmedizinisch relevante Wirkstoffe keine entsprechenden Teststreifen kommerziell erhältlich sind.
2.3.3. Bouillon-Dilutionsverfahren
Das Bouillon-Dilutionsverfahren ist ein Empfindlichkeitstest, der mit einem flüssigen Medium als Reihenverdünnungstest durchgeführt wird. Hierbei wird in der Regel eine zweifache Verdünnungsreihe des zu testenden Wirkstoffes verwendet. Mit Hilfe dieses Verfahrens ist eine quantitative Beurteilung des Empfindlichkeitsverhaltens möglich. Man unterscheidet man die Bouillon-Mikro- und die Bouillon-Makrodilution.
2.3.3.1. Bouillon-Mikrodilution
Dieser Test wird mit industriell hergestellten Mikrotiterplatten in Volumina von 50-100 µl durchgeführt. Die Mikrotiterplatten werden mit verschiedenen Antibiotika in unterschiedlicher Konzentration beschickt. Das Antibiotikum liegt dabei in gefrorener oder gefriergetrockneter Form vor und wird durch die Zugabe einer definierten Menge des Testmediums mit der standardisierten Bakterienmenge resuspendiert.
Die Mikrotiterplatten durchlaufen bereits beim Hersteller entsprechende Qualitätskontrollen, wodurch eine große Anzahl an Fehlerquellen im Gegensatz zu anderen Testsystemen ausgeschaltet wird. Dieses Testsystem stellt das bisher am besten geeignete und robusteste System für die Empfindlichkeitsprüfung und den Vergleich von Empfindlichkeitsdaten dar (ALTREUTHER et al. 1997; STOCK et al.
2001; SCHWARZ et al. 2003). Für die Empfindlichkeitsüberprüfung von
fischpathogenen Bakterien nach CLSI-Standard ist die Arbeitsanweisung M49-A
„Methods for Broth Dilution Susceptibility Testing of Bacteria Isolated From Aquatic Animals; Approved Guideline“ (CLSI, 2005) zu verwenden. Im Gegensatz zu den gut untersuchten human- und tierpathogenen Bakterien liegen für aquatische Bakterien bisher keine Breakpoints vor, die eine Klassifizierung von Vertretern der einzelnen Bakteriengenera bzw. -spezies in die qualitativen Kategorien resistent, intermediär oder empfindlich erlauben.
2.3.3.2. Bouillon-Makrodilution
Dieser Test stellt eine Variante der Bouillon-Mikrodilution dar, bei der einzelne Antibiotika in individuellen Konzentrationen überprüft werden können. Der Test wird in Volumina von 2-5 ml unter Verwendung von Reagenzgläsern durchgeführt. Auch hier enthält das Medium die zu testenden Antibiotika in unterschiedlichen Konzentrationen. Eine standardisierte Suspension des Erregers in dem Testmedium wird hinzugegeben, wobei darauf zu achten ist, dass die angestrebte Endkonzentration im Testmedium nicht unterschritten wird. Gemäß der Durchführungsschrift M49-A „Methods for Broth Dilution Susceptibility Testing of Bacteria Isolated From Aquatic Animals; Approved Guideline“ wird der MHK wie bei allen anderen Testsystemen nach einem definierten Inkubationszeitraum abgelesen.
Nachteile dieser Methode sind ein hoher Arbeitsaufwand und - bedingt durch die individuelle Herstellung der Verdünnungsreihen - eine höhere Anzahl möglicher Fehlerquellen.
2.4. Entstehung von Resistenzen
Resistenzen von Bakterien gegenüber antimikrobiellen Stoffen können durch unterschiedliche Mechanismen verursacht sein. Resistenzen werden in intrinsische, bzw. angeborene und extrinsische bzw. erworbene Resistenz unterteilt. Die intrinsische Resistenz beruht auf genus- und speziesspezifischen Eigenschaften der Bakterien. So verfügen intrinsisch resistente Bakterien nicht über die Angriffsorte bzw. Bindungsstellen für einzelne Antibiotika und sind daher diesen gegenüber unempfindlich. Ein Beispiel für die intrinsische Resistenz ist die β-Laktamresistenz der zellwandlosen Mykoplasmen.
Erworbene Resistenzen können durch genetische Mutationen oder die Aufnahme von mobilen genetischen Elementen, die Resistenzinformationen tragen, bedingt sein. Die erworbene Resistenz ist eine stammspezifische Eigenschaft, die aber vertikal bei der Zellteilung an Tochterzellen und je nach Art der erworbenen Resistenz auch horizontal an Bakterien gleicher und anderer Spezies und Genera weitergegeben werden kann. Die beim horizontalen Gentransfer wichtigsten mobilen Elemente stellen Plasmide, Transposons und Genkassetten dar, die als Träger für unterschiedliche Resistenzgene fungieren können (MAIDEN et al. 1998, SCHWARZ et al. 2006). Resistenzgene können verschiedene Resistenzmechanismen vermitteln wie enzymatische Inaktivierung, verminderte intrazelluläre Aufnahme, erhöhte Ausschleusung des Antibiotikums oder eine Veränderung der Angriffsstelle des Antibiotikums in der Zelle.
2.5. Mobile genetische Elemente
2.5.1. Plasmide
Plasmide sind extrachromosomale doppelsträngige DNA-Elemente. Sie liegen in der Zelle als ringförmiges Molekül im Zytoplasma in unterschiedlicher Anzahl und Größe vor. Die Größe der Plasmide kann zwischen 1 kb und mehr als 100 kb variieren. Oft sind Plasmide Träger von Resistenzgenen, es können aber auch andere Eigenschaften plasmidkodiert sein. Dazu zählen Pathogenitätsfaktoren, metabolische Funktionen oder Konjugations- und Fertilitätsfaktoren. Plasmide können innerhalb einer Spezies, aber auch zwischen verschiedenen Spezies per Konjugation, Transduktion oder Transformation übertragen werden. Innerhalb der Plasmide werden verschiedene Inkompatibilitätsgruppen unterschieden.
Bereits 1972 wurde in einer Arbeit von AOKI et al. der Nachweis transferabler Resistenzplasmide von A. salmonicida, die Resistenzen gegenüber Sulfonamiden, Streptomycin und Chloramphenicol vermittelten, beschrieben. In einer späteren Arbeit konnten AOKI et al. (1981) zeigen, dass die beiden Spezies A. salmonicida und A. hydrophila Plasmide der gleichen Größe und Inkompatibilitätsgruppe besaßen. Es wurden ebenfalls gleiche Plasmide bei Bakterienspezies aus unterschiedlichen geographischen Regionen nachgewiesen (SCHMIDT et al. 2001).
Auf den Plasmiden wurde bisher eine Vielzahl an anderen mobilen genetischen Elementen und an Resistenzgenen nachgewiesen. Einen guten Überblick über bisher untersuchte Plasmide von fischpathogenen Bakterien bieten SORUM et al.
(2006).
2.5.2. Transposons
Transposons bestehen wie Plasmide aus doppelsträngiger DNA, jedoch ohne die Fähigkeit der eigenständigen Replikation. Dafür benötigen sie ein replikationsfähiges
Vektormolekül wie chromosomale DNA oder in der Zelle befindliche Plasmide. Sie können in verschiedenen Größen von weniger als 1 kb bis über 60 kb vorkommen.
Kleine Transposons – sogenannte Insertionselemente siehe Kapitel 2.5.3. – enthalten nur das Gen für die für Integration und Desintegration innerhalb des Genoms zuständige Transposase, während größere häufig weitere Gene wie Antibiotikaresistenzgene enthalten. Transposons werden auch als springende Gene bezeichnet, da sie innerhalb des Bakteriengenoms einen Ortswechsel – eine Transposition – durchführen können (BERG, 1989). Es können auf diesem Weg auch bisher plasmidlokalisierte Transposons in die chromosomale DNA eingebaut werden und auch wieder entfernt werden. Auf diese Weise können transposonlokalisierte Resistenzgene in die chromosomale DNA gelangen.
In Sequenzanalysen von Plasmiden von Aeromonas spp. und A. salmonicida- Isolaten wurden unterschiedliche Transposons nachgewiesen. Bei der Untersuchung des 48 kb großen Plasmides pRAS2 von A. salmonicida wurde ein Tn5393-ähnliches Transposon, welches verschiedene genetische Elemente wie die Insertionselemente IS6100, IS1133 und die Streptomycinresistenzgene strA-strB enthält, gefunden (L`ABEE-LUND u. SORUM 2000). Auf dem 45 kb großen Resistenzplasmid pRAS1 wurde ein unvollständiges Transposon Tn1721 identifiziert (SORUM et al. 2003). Ein vollständiges Transposon Tn1721 konnte bei A. salmonicida auch auf dem Plasmid pASOT sequenziert werden (RHODES et al. 2000). Auch bei A. caviae konnte auf dem Plasmid pFBAOT6 dieses Transposon nachgewiesen werden (RHODES et al.
2000).
2.5.3. Insertionselemente
Insertionselemente zählen zu der Gruppe der Transposons. Sie wurden bisher bei einer Vielzahl von Human-, Tier- und Pflanzenpathogenen nachgewiesen. Bisher wurden über 500 verschiedene Insertionselemente beschrieben, die nach unterschiedlichen Nomenklaturen in Familien zusammengefasst werden können. Sie
besitzen an den terminalen Bereichen „inverted repeats“ und kodieren im mittleren Abschnitt für eine oder mehrere Transposase(n), welche für die Transposition erforderlich ist/sind und somit für die Mobilität der Elemente von entscheidender Bedeutung (MAHILLON u. CHANDLER 1998). Sie sind gekennzeichnet durch invertierte terminale Sequenzwiederholungen (inverted repeats).
In dieser Arbeit konnte ein Insertionselement der IS630 Familie innerhalb eines Klasse 1-Integrons nachgewiesen werden. Insertionselemente dieser Familie besitzen eine Größe zwischen 1100 und 1200 Basenpaare (bp) und zeigen eine hohe Spezifität für die Transposition in die Erkennungssequenz 5´-CTAG-3´. Für diese Familie wurde keine Co-Integration von weiteren genetischen Elementen beschrieben (TENZEN et al. 1990).
2.5.4. Integrons und Genkassetten
Genkassetten stellen kleine mobile genetische Elemente von einer Größe von 0,5 - 2 kb dar. In freier Form liegen sie als ringförmiges DNA-Molekül vor, welches aus einer spezifischen Rekombinationsstelle, dem 59-Basen Element, und aus einem Gen, oft einem Resistenzgen, aufgebaut ist. Genkassetten sind nicht zur eigenständigen Replikation befähigt und müssen daher zu ihrer Vermehrung in replikationsprofiziente DNA-Moleküle der Bakterienzelle, chromosomale DNA oder Plasmide, eingebaut werden. Da Genkassetten mit Ausnahme der cmlA-Genkassette über keine eigene Promotorregion verfügen, sind sie für die Expression der enthaltenen Gene auf einen Einbau in Promotornähe in das Wirtsgenom angewiesen. Die Integration erfolgt durch enzymatische Spaltung im 59-Basen Element durch die Integrase. Die Genkassette wird als lineares Element in spezifische DNA-Bereiche, die sogenannten Integrons, in das Bakteriengenom eingebaut. Aber auch intakte oder defekte Transposons können Genkassetten beherbergen (RECCHIA u. HALL, 1995). Genkassetten können auch in sekundäre Integrationsstellen außerhalb von Integrons eingebaut werden, wobei hier für die
funktionelle Expression des Kassettengens die Nutzung eines entsprechend vorhandenen Promotors entscheidend ist. Ein Beispiel für eine Integration in eine sekundäre Integrationsstelle stellt die Insertion einer dfrA14-Genkassette in das Streptomycinresistenzgen strA (OJO et al.2002) dar.
Integrons stellen genetische Funktionseinheiten dar, die Genkassetten erkennen, akquirieren, aber auch wieder verlieren können. Damit ermöglichen sie dem Mikroorganismus den Erwerb zusätzlicher Funktionen und somit einen möglichen Selektionsvorteil. Bisher wurden fünf verschiedene Integron-Klassen beschrieben (ROWE-MAGNUS et al. 2002). Klasse 1-Integrons stellen die häufigste Gruppe innerhalb der Familie der Integrons dar und konnten bei einer Vielzahl Gram- negativer Bakterien unterschiedlicher Herkunft nachgewiesen werden. Auch bei Isolaten aquatischer Herkunft wurden diese genetischen Einheiten gefunden (PETERSEN et al. 2000, ROSSER u. YOUNG 1999). Klasse 1-Integrons zählen nicht im eigentlichen Sinne zu den mobilen genetischen Elementen. Sie können aber chromosomal oder auf mobilen genetischen Elementen wie Plasmiden oder Transposons lokalisiert sein und dadurch übertragen werden.
Klasse 1-Integrons bestehen aus einem 5´-konservierten Segment (5’CS), welches ein Integrasegen (intI1), eine Promotorregion und die Rekombinationsstelle (attI) für die Integration der Genkassetten enthält und einem 3‘-konservierten Segment (3’CS), welches die Gene qacE∆1, sul1 und orf5 enthalten kann. Die Integrase ist für die Integration und Exzision der Genkassetten verantwortlich, während der Promotor für die Expression der integrierten Genkassetten zuständig ist. Das im 3´CS enthaltene Gen qacE∆1 ist ein Derivat des Gens qacE und kodiert ein Effluxprotein, welches eine Resistenz gegenüber quarternären Ammoniumverbindungen vermittelt und das Gen sul1 für Sulfonamidresistenz. Die Funktion des Leserahmens (open reading frame) orf5 ist bislang ungeklärt.
Bei aquatischen Bakterien wurde mittlerweile eine Vielzahl an Integron-assoziierten Genkassetten beschrieben. So wurden bei einer Untersuchung von 3000
Umweltisolaten in England bei 3,6% der Bakterien Integrons nachgewiesen (ROSSER u. YOUNG 1999). Die häufigsten Genkassetten enthielten aadA-Gene, die für eine kombinierte Streptomycin- und Spectinomycinresistenz kodieren. Weiterhin wurden Genkassetten mit catB3, catB5, dfr-Genen, aacA4 und aacA1, blaOXA-2, sat1, orfD, orfF, und orfX gefunden. Viele Integrons enthielten qacE∆ im 3´CS Bereich, aber kein sul1. Bei fischpathogenen Bakterien stellen Aminoglykosid- und Trimethoprimresistenzgenkassetten alleine oder in Kombination die häufigste Kassettenanordnung in Integrons dar (SCHMIDT et al. 2001, L´ÁBEE-LUND 2001, JACOBS u. CHENIA 2007). Weitere häufig nachgewiesene Kassettengene sind die Chloramphenicolresistenzgene vom catB-Typ. In einer Studie von Isolaten aus Südafrika wurden auch selten beschriebene Genkassetten mit blaOXA-2- und blaPSE-1- Genen gefunden (JACOBS u. CHENIA 2007).
2.6. Grundlagen der Resistenz gegenüber ausgewählten Antibiotika
Für die Behandlung bakterieller Erreger bei Fischen sind in Deutschland bisher nur zwei antimikrobielle Präparate, Tribrissen® und Borgal®, zugelassen. Als Wirkstoff enthalten sie eine Kombination aus Sulfonamid und Trimethoprim. Die Anwendung dieser Präparate ist in verschiedenen Formen möglich. Sie können als Fütterungsarzneimittel, als Injektion und als Tauchbad bei Sulfonamid/Trimethoprim- empfindlichen Erregern angewendet werden. Im Rahmen des Therapienotstandes ist es allerdings möglich, andere Medikamente über den Weg der Arzneimittelumwidmung einzusetzen (AMG §56a, Bundesgesetzblatt Teil I Nr. 73 S.
3394). In der Fischhaltung können neben antibiotischer Behandlung auch ein Aufsalzen des Wassers durch anorganische Stoffe wie z.B. NaCl zur Hemmung von bakteriellem Wachstum genutzt werden. Medikamente, die das Chemotherapeutikum Florfenicol enthalten, befinden sich derzeit in klinischen Tests für den Einsatz in Aquakulturen. Florfenicol (Aquaflor®) wird jedoch in diversen Nicht-EU-Staaten, wie Chile, Japan, Korea, Norwegen oder Canada, bereits zur Bekämpfung ausgewählter bakterieller Infektionen von Fischen eingesetzt.
2.6.1. Sulfonamid- und Trimethoprimresistenz
Die synthetischen Antibiotika aus der Gruppe der Sulfonamide und Trimethoprim greifen an verschiedenen Stufen der bakteriellen Folsäurebildung Gram-negativer und Gram-positiver Bakterien an. Jeder Wirkstoff für sich zeigt eine bakteriostatische Wirkung, in Kombination entfalten sie aber bakterizide Wirkungen auf Bakterien, die über keine Möglichkeit der exogenen Folsäurenutzung verfügen. Sulfonamide hemmen kompetitiv die Dihydropteroinsäure-Synthetase (DHPS) durch Substratkonkurrenz zur p-Aminobenzoesäure, während Trimethoprim die Reduktion der Dihydrofolsäure durch die Dihydrofolatreduktase (DHFR) hemmt. Ein kombinierter Einsatz dieser beiden Antibiotika besitzt zumindest In-vitro eine synergistische Wirkung. Unter in-vivo Bedingungen besteht diese synergistische
Wirkung aufgrund deutlich unterschiedlicher Halbwertzeiten beider Wirkstoffe nur bedingt. Einige Bakterien wie Enterokokken und Laktobazillen verfügen über die Möglichkeit, exogene Folsäurequellen zu nutzen. Sie besitzen damit eine natürliche Resistenz gegenüber diesen Antibiotika. Eine weitere Möglichkeit der intrinsischen Resistenz stellen Permeabilitätsbarrieren und Effluxpumpen dar. Für einige Bakterien wie Vertreter der Genera Bacteroides, Clostridium, Brucella und Neisseria sind DHFR-Enzyme bekannt, die nur eine geringe Affinität für Trimethoprim zeigen (SCHWARZ u. CHASLUS-DANCLA 2001).
Resistenzen gegenüber diesen Wirkstoffen können chromosomal durch Mutationen bedingt sein oder über mobile genetische Elemente erworben werden (HUOVINEN et al. 1995). Eine wichtige Rolle für die Resistenz gegenüber Trimethoprim spielen Trimethoprimresistenz-vermittelnde DHFR-Varianten. Ein Großteil der entsprechen- den dfr-Gene, von denen bisher mehr als 25 unterschiedliche Gene nachgewiesen wurden, ist auf transferablen Elementen wie Plasmiden, Transposons und Genkassetten (HUOVINEN et al. 1995, WHITE u. RAWLINSON 2001) lokalisiert.
Dihydrofolatreduktasegene werden aufgrund ihrer Struktur in zwei Familien unterteilt, dfrA und dfrB (RECCHIA u. HALL 1995). Die Gene für dfrA besitzen eine Größe von 152 bis 189 Aminosäuren (aa), während dfrB-Gene nur aus etwa 78 aa bestehen.
Der Ersatz von empfindlichen Enzymen durch resistente ist ebenfalls für Sulfonamide bekannt. Bisher wurden drei verschiedene sulfonamidresistenz-vermittelnde DHPS nachgewiesen. Sie werden von den Resistenzgenen sul1, sul2 und sul3 kodiert. Das Gen sul1 ist häufig ein Bestandteil des 3´-CS Bereichs von Klasse 1-Integrons, während sul2 und sul3 auf mobilen genetischen Elementen wie Plasmiden gefunden wurde. Ein weiterer Sulfonamidresistenz-Mechanismus sind chromosomale Mutationen. Sie können eine gesteigerte Synthese der p-Aminobenzoesäure bewirken und verdrängen somit Trimethoprim aus dem aktiven Zentrum der DHPS (QUINTILANI et al. 1999). Chromosomale Mutationen der DHFR und DHPS können eine gesenkte Affinität dieser Enzyme für Trimethoprim und Sulfonamide bewirken.
Bei den chromosomal lokalisierten dfr-Genen für trimethoprimempfindliche DHFRs
wurden Mutationen in der Promotorregion und im dfr-Gen selbst beschrieben, die zu Überexpressionen der empfindlichen Enzyme führten (HUOVINEN 2001, DE GROOT et al. 1996).
Bei bakteriellen Fischpathogenen wurde in vielen Arbeiten im Zusammenhang mit dem Nachweis von Klasse 1-Integron das Vorhandensein von dfr- und sul- Resistenzgenen nachgewiesen. Da sich das Resistenzgen sul1 im 3´-CS Bereich befindet, konnte in vielen Arbeiten die Sulfonamidresistenz auf dieses Gen zurückgeführt werden (SCHMIDT et al. 2001). In den Arbeiten von PERRETEN u.
BOERLIN (2003) wurden auch sul2 und sul3 Gene nachgewiesen. Innerhalb der Klasse 1-Integrons konnten bei einem Großteil der Isolate Genkassetten, die dfr- Gene enthielten, dargestellt werden. Auffällig ist, dass bei Klasse 1-Integrons, die mehr als eine Genkassette besitzen, die dfr-Kassette häufig dem 5´-CS Bereich zugewandt zu finden ist. Dies deutet darauf hin, dass diese Genkassette zuletzt erworben wurde. In der Arbeit von JACOBS u. CHENIA (2007) wurden zwei dfr- Genkassetten gefunden, von denen allerdings nur eine auch eine phänotypische Resistenz hervorrief. In der Literatur wurden am häufigsten bei Fischbakterien die dfr-Gene dfrA1, dfrB3 und dfrA16 nachgewiesen (SCHMIDT et al. 2001).
2.6.2. Aminoglykosid- und Aminocyclitolresistenz
Zu den Aminoglykosiden zählen Antibiotika wie Gentamicin, Kanamycin, Neomycin und Streptomycin. Diese Antibiotika sind sowohl in der Veterinär- als auch in der Humanmedizin zugelassen. Als Vertreter der Aminocyclitole sind Spectinomycin und Apramycin zu nennen, die aus Streptomyces-Spezies gewonnen werden. Sie unterscheiden sich von den Aminoglykosiden in ihrer chemischen Struktur, die keinen Aminozucker enthält. Spectinomycin kann ebenfalls in der Veterinär- und Humanmedizin eingesetzt werden. Apramycin ist nur für die Veterinärmedizin zugelassen.
Aminoglykoside und Aminocyclitole inhibieren durch Bindung an die 30S-Untereinheit der Ribosomen die bakterielle Proteinsynthese. Sie binden an unterschiedlichen Zentren im Ribosom (VAKULENKO u. MOBASHERY 2003). Die mRNA wird fehlerhaft abgelesen und es werden funktionsuntüchtige „Nonsense“-Proteine gebildet. Anaerobier besitzen eine intrinsische Resistenz für Aminoglykoside.
Die Resistenzbildung gegenüber Aminoglykosiden wird vorrangig durch zwei verschiedene Mechanismen vermittelt, der enzymatischen Inaktivierung und der verminderten Aufnahme des Antibiotikums. Die enzymatische Modifikation der Amino- oder Hydroxylgruppen wird von drei unterschiedlichen Enzymfamilien hervor- gerufen: Aminoglykosid-Phosphotransferasen (O-Phosphotransferasen, APHs), Aminoglykosid-Acetyltransferasen (N-Acetyltransferasen, AACs) und Aminoglykosid- Nukleotidyltransferasen (O-Adenyltransferasen, ANTs). Die veränderten Antibiotika können nicht mehr an den Ribosomen binden. APHs phosphorylieren unter ATP- Verbrauch die Hydroxylgruppen der Aminoglykoside an Position 4, 6, 3´, 2´´, und 3´´.
Es wurden bisher 11 verschiedene Klassen beschrieben. Die größte Klasse innerhalb der APHs stellen die APH(3´)-Enzyme dar, sie enthält bislang sieben verschiedene Enzyme. Die kodierenden Resistenzgene für APHs wurden auf mobilen genetischen Elementen wie Transposons und Plasmiden nachgewiesen, einige liegen aber auch chromosomal kodiert vor. Innerhalb der Gruppe der AACs werden vier verschiedene Enzymklassen anhand der Position, an der sie die Aminogruppe acetylieren, unterschieden: AAC(1), AAC(3), AAC(2´) und AAC(6´). Bisher wurden 16 verschiedene N-Acetyltransferasen beschrieben. Bei der Acetylierung wird Acetyl- CoA als Spender der Acetylgruppe benötigt. Dieser Resistenzmechanismus wurde v. a. bei Gram-negativen Bakterien gefunden. Die entsprechenden Resistenzgene sind vor allem auf mobilen genetischen Elementen lokalisiert und können auch Bestandteil von Genkassetten sein. Zu der Gruppe der O-Adenyltransferasen zählen fünf verschiedene Klassen, ANT(6), ANT(9), ANT(4´), ANT(2´´) und ANT(3´´). Sie benötigen ATP für die Adenylierung der Hydroxylgruppe (SCHWARZ et al. 2006). Die kodierenden Resistenzgene wurden auf mobilen genetischen Elementen wie Plasmiden, Transposons und Genkassetten nachgewiesen. Die einzelnen Enzyme
weisen unterschiedliche Substratspektren auf. Eine genaue Aufstellung der Enzyme und den entsprechenden Antibiotika kann den Arbeiten von SHAW et al. (1993) und VAKULENKO u. MOBASHERY (2003) entnommen werden.
Der zweithäufigste Resistenzmechanismus ist die verminderte Aufnahme der Aminoglykoside in die Zelle. Die Ursache hierfür sind Mutationen von Phosphaten in der Lipopolysaccharid-Schicht der Zellmembran und eine Veränderung des Membranpotentials. Diese Mechanismen sind für Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa beschrieben worden.
Für Staphylococcus aureus wurden chromosomale Mutationen beschrieben, die eine Veränderung des transmembranalen elektrischen Potentials bewirken und dadurch zu einer Aminoglykosidresistenz führen (MILLER et al. 1980). Eine weitere Möglichkeit der Resistenzentwicklung ist die Veränderung der Zielstruktur im Ribosom. Mutationen in der ribosomalen Proteinstruktur und der 16S rRNA sowie die enzymatische Methylierung der rRNA sind für verschiedene Gram-negative Bakterien als Ursache der Aminoglykosid-Resistenz beschrieben worden. Weiterhin konnten unterschiedliche Multidrug-Effluxpumpen bei verschiedenen Spezies wie Burkholderia pseudomallei (MOORE et al. 1999), P. aeruginosa (AIRES et al. 1999, WESTBROCK-WADMAN et al. 1999), Acinetobacter baumannii (MAGNET et al.
2001) und E. coli (ROSENBERG et al. 2000) nachgewiesen werden.
Als Ursache für die Resistenz von Aeromonas spp.- und A. salmonicida-Isolaten wurden verschiedene Resistenzgene nachgewiesen, die vorrangig Integron- lokalisiert waren. Die häufigsten Genkassetten mit einer Aminoglykosidresistenz stellten die aadA1- und die aadA2-Kassette dar. Bei Klasse 1-Integrons, die mehr als eine Genkassette enthielten, lag die Genkassette für die Aminoglykosidresistenz nahe am 5‘-CS Bereich (SCHMIDT et al. 2001; L`ABEE-LUND 2001; JACOBS u.
CHENIA 2007). Für A. salmonicida konnte ein Transposon vom Typ Tn5393 mit den Streptomycinresistenzgenen strA-strB nachgewiesen werden (L`ABEE-LUND u.
SORUM 2000).
2.6.3. Phenicolresistenz
Aus der Gruppe der Phenicole besitzen Chloramphenicol und Florfenicol eine hohe Bedeutung in der Behandlung bakterieller Krankheitserreger beim Tier. Während Chloramphenicol mittlerweile in der Veterinärmedizin nur noch für Heimtiere und Nicht Lebensmittel liefernde Tiere zugelassen ist, da es beim Menschen irreversible aplastische Anämien (MARTELO et al., 1964) auslösen kann, gewinnt Florfenicol als rein veterinärmedizinischer Wirkstoff zunehmend an Bedeutung. Durch den Austausch der Nitrogruppe durch eine Sulfonylgruppe und durch Fluor anstelle eines Chloratoms ist mit Florfenicol ein Wirkstoff entwickelt worden, welcher nicht die Nebenwirkungen des Chloramphenicols zeigt, nämlich nicht die dosisunabhängige aplastische Anämie beim Menschen hervorruft. Er ist seit 1995 bzw. 2000 in der EU für die Behandlung von Atemwegserkrankungen bei Rindern bzw. Schweinen zugelassen. In einigen Ländern außerhalb der EU kann Florfenicol in kommerziellen Fischfarmen als Premix zur Behandlung der Furunkulosis, hervorgerufen durch A.
salmonicida, eingesetzt werden.
Chloramphenicol wurde 1947 erstmals aus Streptomyces venezuelae isoliert (EHRLICH et al. 1947) und steht seit 1950 als synthetisches Präparat zur Verfü- gung. Die antimikrobielle Wirkung basiert auf einer Blockade der Proteinsynthese durch die Bindung an die Peptidyltransferase der 50S Untereinheit des Ribosoms.
Für Chloramphenicol sind verschiedene Resistenzmechanismen nachgewiesen worden. Der häufigste Mechanismus ist die enzymatische Inaktivierung durch Chloramphenicol-Acetyltransferasen (CATs) (MURRAY et al. 1997). Es wurden aber auch Effluxmechanismen, Phosphotransferasen, Mutationen des Angriffsortes und Permeabilitätsbarrieren beschrieben (SCHWARZ et al. 2004). Innerhalb der CATs dominieren zwei Typen, Typ A CATs und Typ B CATs. Die Typ A CATs werden in bislang 16 verschiedene Gruppen eingeteilt (SCHWARZ et al. 2004), deren Vertreter jeweils eine Aminosäurenübereinstimmung von über 80% zeigen. Zu den Typ B CATs zählen bisher fünf verschiedene Gruppen. Das Resistenzgen catB1 vermittelt
nur eine sogenannte „low-level“ Resistenz für Chloramphenicol mit MHK-Werten zwischen 5 und 20 mg/L (MURRAY et al. 1997). Während Typ A CATs häufig chromosomal oder plasmidlokalisiert sind, sind Typ B CATs oft als Genkassetten in Integrons zu finden. Abhängig von der Lokalisation innerhalb der Integrons werden sie unterschiedlich stark exprimiert. So zeigten ROWE-MAGNUS et al. (2002), anhand des Gens catB9, dass dieses promotornah eine Resistenz von ≥ 25 mg/L hervorrief, während es an siebenter Stelle im Integron nur noch einen MHK von < 1 mg/L verursachte. Florfenicol ist durch seine Fluorgruppe an der C-3 Position durch CATs nicht zu inaktivieren (CANNON et al. 1990). Ein weiterer Resistenzmechanismus für die Resistenz gegenüber Chloramphenicol ist ein Effluxmechanismus. Die cmlA-Gene sowie cmlB1 kodieren für aktive Exporter aus der Major Facilitator Superfamilie (KADLEC et al. 2007).
Beide bisher bekannten Resistenzmechanismen gegenüber Florfenicol vermitteln auch Chloramphenicolresistenz. Eine kombinierte Resistenz gegenüber Chloramphenicol und Florfenicol wird durch spezifische Transporter, kodiert von den Genen floR und fexA, vermittelt. Während floR bei Gram-negativen Bakterien identifiziert wird, ist fexA bisher nur bei Gram-positiven Erregern nachgewiesen worden (KADLEC et al. 2007, KEHRENBERG u. SCHWARZ 2006). Bei Gram- positiven Bakterien wurde außerdem das Gen cfr beschrieben (KEHRENBERG u.
SCHWARZ 2006). Das Resistenzgen cfr bewirkt eine Chloramphenicol- und Florfenicolresistenz sowie Resistenz gegenüber weiteren Proteinbiosynthese- Inhibitoren über die Methylierung der ribosomalen RNA (KEHRENBERG et al. 2005).
In Untersuchungen über die Antibiotikaresistenz von fischpathogenen Bakterien gegenüber Florfenicol und Chloramphenicol wurden bisher geringe Resistenzraten zwischen zwei und fünf Prozent für Aeromonas spp. festgestellt (GONI-URRIZA 2000, HO et al. 2000, MICHEL et al. 2003). HO et al. (2000) verglichen die Wirkungen der drei Phenicole Chloramphenicol, Thiamphenicol und Florfenicol auf bakterielle Fischpathogene in Taiwan. Dabei zeigte Florfenicol den höchsten antibakteriellen Effekt. In der Arbeit von MICHEL et al. (2003) wurden Isolate aus
Frankreich der fischpathogenen Spezies A. salmonicida und Y. ruckeri auf ihre Phenicolempfindlichkeit geprüft: Von den A. salmonicida-Isolaten zeigte ein Viertel der Untersuchungsgruppe erhöhte MHK-Werte für Chloramphenicol und einige der Y.
ruckeri-Isolate zeigten hohe Chloramphenicol-MHKs. In einer weiteren Studie wurde bei sieben dänischen A. salmonicida-Isolate eine Resistenz für Florfenicol festgestellt, obwohl der Einsatz von Florfenicol in Dänemark für Aquakulturen zu diesem Zeitpunkt noch nicht zugelassen war (SCHMIDT et al. 2001). Bei einem Isolat von A. bestiarum, isoliert aus Süßwasser, wurde ein 24,7 kb großes Plasmid sequenziert. Innerhalb des Plasmids konnten 20 codierende Sequenzen nachgewiesen werden, welche neben den Resistenzgenen sul2, strA-strB und tetR- tet(Y) auch das Florfenicol-Resistenzgen floR enthielt (GORDON et al., 2008).
2.6.4. Tetracyclinresistenz
Tetracycline haben eine bakteriostatische Wirkung durch die reversible Bindung an die 30S-Untereinheit der Ribosomen. Dadurch wird die bakterielle Proteinsynthese gehemmt. Die bekannten Resistenzmechanismen von Bakterien gegenüber Tetracyclinen sind aktiver Efflux, Schutz der Ribosomen oder eine enzymatische Inaktivierung (SPEER et al. 1992, ROBERTS et al. 1996). Es wurden bisher über 38 tet-Resistenzgene gefunden, die für Effluxproteine kodieren. Der Resistenzmechanismus für den Efflux von Tetracyclinen besteht bei Gram-negativen Bakterien aus zwei Strukturgenen, dem Gen für das Effluxprotein und einem gegenläufig orientierten Repressorgen (tetR). In der Abwesenheit von Tetracyclinen wird nur das Repressorgen exprimiert, und verhindert die Transkription des Tetracyclin-Resistenzgens. Sobald Tetracyclin in der Zelle vorhanden ist, wird das Tetracyclin vom Repressorgen gebunden und damit die Transkription der Effluxproteine aktiviert, die solange exprimiert werden bis kein Tetracyclin mehr in der Zelle vorhanden ist (HILLEN u. BERENS 1994, ROBERTS 1996, HINRICHS et al. 1994, KISKER et al. 1995). Andere Effluxsysteme wurden für Gram-positive Bakterien beschrieben, die kodierenden Gene sind tet(K) und tet(L) und werden über
attenuierte Translation ebenfalls nur dann exprimiert, wenn Tetracyclin in der Zelle vorhanden ist. Bei der attenuierten Translation ändert sich in An-/Abwesenheit von Tetracyclin die Sekundärstruktur auf Ebene der mRNA. In der Abwesenheit von Tetracyclin besitzt die mRNA eine Sekundärstruktur, in der die Ribosomenbindungsstelle des tet-Gens für die Ribosomen unzugänglich ist. Erst mit der Anwesenheit von Tetracyclin verändert sich die Struktur und der Transporter wird exprimiert (KHAN u. NOVICK 1983; SCHWARZ et al. 1992). Die Effluxsysteme sind spezifisch für die klassischen Tetracycline. Der Exporter, der vom Gen tet(B) kodiert wird, verfügt zusätzlich über die Fähigkeit, auch Minocyclin aus der Zelle auszuschleusen.
Die Resistenz gegenüber Tetracyclinen, Doxycyclin und Minocyclin durch ribosomale Schutzproteine wurde für zehn verschiedene Resistenzgene, u. a. tet(M) und tet(O) beschrieben (ROBERTS et al. 2003). Cytoplasmatische Proteine aus der Gruppe der GTPasen verhindern durch eine nicht-kompetitive Bindung an das aktive Zentrum die Bindung der Tetracycline an den Ribosomen (CONNELL et al. 2003). Die enzymatische Inaktivierung ist bisher für drei Resistenzgene beschrieben worden, tet(X), tet(34) und tet(37) (CHOPRA u. ROBERTS 2001, ROBERTS et al. 2005, SAPURANIC et al. 2005). Die Tetracyclin-Resistenzgene können chromosomal lokalisiert sein, sind aber häufig auch auf mobilen genetischen Elementen wie konjugativen Plasmiden und Transposons kodiert (CHOPRA u. ROBERTS 2001, HANSEN et al. 2004).
In Untersuchungen von Aeromonaden klinischer und aquatischer Herkunft wurden bei vierzehn bis sechzig Prozent der Aeromonaden Resistenzen gegenüber Tetracyclinen festgestellt (GONI-URRIZA 2000, SCHMIDT et al. 2001). Die vorherrschenden Resistenzgene waren tet(A) bis tet(E). In Nordeuropa dominierte tet(E) (ANDERSEN u. SANDAA, 1994; SCHMIDT et al., 2001), in den asiatischen Ländern wurden vorrangig tet(D) und tet(B) nachgewiesen (AOKI et al. 1983, FURUSHITA et al. 2003) und in einer Arbeit aus Südafrika ist das Resistenzgen tet(A) am häufigsten nachgewiesen worden (JACOBS u. CHENIA 2007). Bei einigen
der molekularbiologisch untersuchten Isolate wurden zwei verschiedene Tetracyclin- Resistenzgene gefunden (FURUSHITA et al. 2003, SCHMIDT et al. 2001). KIM et al.
wies 2004 erstmalig auch tet(M) und tet(S) bei marinen fischpathogenen Bakterien nach.
2.6.5. β-Laktamresistenz
Antibiotika aus der Gruppe der β-Laktame können in vier Gruppen unterteilt werden:
Penicilline, Cephalosporine, Monobaktame und Carbapeneme. In der Veterinärmedizin sind die Penicilline Amoxicillin, Ampicillin, Benzylpenicillin, Cloxacillin und Oxacillin und die Cephalosporine Cefacetril, Cefalexin, Cefapirin, Cefazolin, Cefoperazon, Ceftiofur und Cefquinom für unterschiedliche Anwendungsbereiche bei verschiedenen Tierarten zugelassen. Ampicillin und Amoxicillin gehören in die Gruppe der Aminopenicilline. Durch die Einführung einer Aminogruppe am Benzylrest entstanden Penicilline mit einem deutlich besseren Wirkungsspektrum gegen Gram-negative Bakterien. Sie sind nicht β-laktamasestabil.
Die bakterizide Wirkung der β-Laktame beruht auf einer Hemmung der bakteriellen Zellwandsynthese.
Der am häufigsten vorkommende Resistenzmechanismus bei β-Laktam-Antibiotika ist die enzymatische Inaktivierung durch β-Laktamasen. Diese spalten hydrolytisch den β-Laktamring. Es werden zwei Typen von β-Laktamasen anhand ihres molekularen Aufbaus unterschieden: Serin- und Metallo-β-Laktamasen. Zu den Serin-β-Laktamasen werden die Klasse A, Klasse C und Klasse D-β-Laktamasen hinsichtlich funktioneller Kriterien gezählt (AMBLER 1980, BUSH et al. 1995). Die Metallo-β-Laktamasen sind Klasse B-β-Laktamasen. Die Gene für β-Laktamasen können chromosomal als auch in Genkassetten, Transposons und/oder Plasmiden und lokalisiert vorliegen. Um eine Inaktivierung der Antibiotika durch β-Laktamasen zu verhindern, werden β-Laktame mit β-Laktamase-Inhibitoren wie Clavulansäure kombiniert. Einen weiteren Resistenzmechanismus stellen Penicillin-bindende
Proteine dar. Diese wurden bisher vor allem bei Gram-positiven Bakterien wie Staphylokokken beschrieben. Bei Gram-negativen Bakterien wurden weitere Mechanismen wie eine verminderte Aufnahme durch eine reduzierte Anzahl an Porinen und eine vermehrte Ausschleusung über aktive Transporter nachgewiesen (Poole 2004).
In der Literatur differieren die Angaben zum Resistenzverhalten der fischpathogenen Bakterien gegenüber den einzelnen β-Laktam-Antibiotika. Besonders für Ampicillin liegen unterschiedliche Daten vor. Während sich in einigen Arbeiten sämtliche Isolate der beweglichen Aeromonaden resistent gegenüber Ampicillin verhielten (MORITA et al. 1994), konnten in anderen Arbeiten 65% der Isolate als resistent für Ampicillin getestet werden (SAAVEDRA et al. 2004). Für Cephalosporine sind nur einzelne Vertreter gleichzeitig in den verschiedenen Arbeiten getestet worden. In der Arbeit von SAAVERDRA et al. (2004) waren 65% der Isolate resistent für Cephalosporine der 1. Generation. In einer Untersuchung von Isolaten aus Polen zeigten sich ähnliche Ergebnisse: 57% der Isolate verhielten sich resistent gegenüber Cephalothin (GUZ u. KOZINSKA 2004). Im Gegensatz dazu zeigten sich die Cephalosporine der 3. Generation wirksamer. Je nach Arbeit wurden nur wenige Isolate (MORITA et al. 1994) und bis zu 20% der Isolate als resistent für Cefotaxim getestet (SAAVEDRA et al. 2004). Hierbei ist anzumerken, dass weder für Penicilline noch Cephalosporine anerkannte Grenzwerte für fischpathogene Bakterien vorliegen, die eine Einstufung der Bakterien als resistent oder empfindlich erlauben.
Daher können unterschiedliche Resistenzraten durchaus auch auf der Anwendung unterschiedlicher Grenzwerte zur Empfindlichkeitsbeurteilung beruhen.
FOSSE et al. (2003) untersuchten die β-Laktamasen der einzelnen Spezies der beweglichen Aeromonaden. Aeromonaden des A. hydrophila-Komplexes besaßen Klasse B, Klasse C und Klasse D-Laktamasen, A. caviae besaß Klasse C und D, A.
veronii Klasse B und D, A. schubertii nur Klasse D und A. trota nur Klasse C-β- Laktamasen.
