Untersuchung zu minimalen Hemmkonzentrationen von antimikrobiellen Wirkstoffen gegenüber bovinen Mastitiseregern

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1. Auflage 2007

ISBN 978-3-939902-54-6

Verlag: DVG Service GmbH Frankfurter Straße 89

35392 Gießen 0641/24466 geschaeftsstelle@dvg.net

www.dvg.net

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Tierärztliche Hochschule Hannover Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit

und Klinik für Rinder

Untersuchung zu minimalen Hemmkonzentrationen von antimikrobiellen Wirkstoffen gegenüber bovinen Mastitiserregern

INAUGURAL - DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN

- Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)

Vorgelegt von Asmien Christiane Brix

(Seesen)

Hannover 2007

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Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Günter Klein

Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit und

Prof. Dr. Martina Hoedemaker, Ph.D.

Klinik für Rinder

1. Gutachter: Prof. Dr. Günter Klein

Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit und

Prof. Dr. Martina Hoedemaker, Ph.D.

Klinik für Rinder

2. Gutachter: Prof. Dr. Stefan Schwarz Institut für Tierzucht

Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL)

Tag der mündlichen Prüfung: 16. November 2007

Diese Arbeit wurde durch Mittel der Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH gefördert.

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Ergebnisse dieser Dissertation wurden auf folgenden Fachtagungen in Form von Postern präsentiert:

47. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft e.V. (2006):

ASMIEN BRIX,MARTINA HOEDEMAKER,GÜNTER KLEIN

Epidemiologische Untersuchung zu minimalen Hemmstoffkonzentrationen für ausgewählte bovine Mastitiserreger.

48. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft e.V. (2007):

ASMIEN BRIX,MARTINA HOEDEMAKER,GÜNTER KLEIN

Differenzierung und epidemiologische Untersuchung zu minimalen Hemmstoffkonzentrationen von Enterokokken, isoliert aus Milch boviner Mastitisinfektionen.

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I

NHALTSVERZEICHNIS

Asmien Brix:

Untersuchung zu minimalen Hemmkonzentrationen von antimikrobiellen Wirkstoffen gegenüber bovinen Mastitiserregern.

1 Einleitung ... 1

2 Literaturübersicht ... 3

2.1 Bovine Mastitis... 3

2.1.1 Definitionen und Einteilungen ... 3

2.1.2 Diagnostik im Labor ... 3

2.2 Empfindlichkeitsbestimmung... 4

2.2.1 Agardiffusionstest ... 5

2.2.2 E-Test ... 6

2.2.3 Agardilution... 6

2.2.4 Bouillondilution... 7

2.2.4.1 Bouillonmikrodilution nach den Vorgaben des CLSI (Auszug)... 8

2.2.4.2 Bewertung der Ergebnisse... 9

2.2.5 Resistenzmonitoring ... 10

2.3 Mastitiserreger ... 10

2.3.1 Kuhassoziierte Erreger ... 10

2.3.2 Umweltassoziierte Erreger... 11

2.3.3.Staphylococcus (S.)-Spezies ... 11

2.3.3.1 Gattungsmerkmale... 11

2.3.3.2 Staphylococcus aureus... 13

2.3.3.2.1 Eigenschaften und Differenzierung... 13

2.3.3.2.2 Klinische Bedeutung ... 13

2.3.3.3 Koagulasenegative Staphylokokken (KNS) ... 14

2.3.4 Streptococcus-Spezies ... 15

2.3.4.1 Gattungsmerkmale... 15

2.3.4.2 Streptococcus uberis... 17

2.3.4.3 Streptococcus dysgalactiae... 21

2.3.4.4 Streptococcus agalactiae... 23

2.3.5 Enterococcus-Spezies ... 24

2.3.5.1 Eigenschaften und Differenzierung... 24

2.3.5.2 Klinische Bedeutung ... 30

(10)

2.3.5.3 Besonderheiten bei der Empfindlichkeitsprüfung ...30

2.3.6 Arcanobacterium pyogenes...31

2.3.6.1 Eigenschaften und Differenzierung ...31

2.3.6.2 Klinische Bedeutung...32

2.3.6.3 Besonderheiten bei der Resistenzbestimmung ...32

2.3.7 Enterobacteriaceae...33

2.3.7.1 Familienmerkmale...33

2.3.7.2 Escherichia coli...34

2.3.7.2.1 Eigenschaften und Differenzierung ...34

2.3.7.2.2 Klinische Bedeutung...35

2.3.7.3 Klebsiella-Spezies...35

2.3.7.3.1 Eigenschaften und Differenzierung ...35

2.3.7.3.2 Klinische Bedeutung...36

2.4 Antimikrobielle Therapie der bovinen Mastitis ...37

2.4.1 Anwendung antimikrobieller Wirkstoffe ...37

2.4.1.1 Trockenstellen unter antimikrobiellem Schutz ...38

2.5 Antimikrobielle Substanzen ...39

2.5.1 β-Laktam-Antibiotika ...39

2.5.1.1 Cephalosporine ...40

2.5.1.1.1 Cefquinom...40

2.5.1.1.2 Cefazolin ...41

2.5.1.1.3 Cefoperazon...42

2.5.1.2 Penicilline ...42

2.5.1.2.1 Ampicillin ...43

2.5.1.2.2 Oxacillin...43

2.5.2 Aminoglykoside ...44

2.5.2.1 Kombination aus Penethamat und Framycetin...44

2.5.3 Makrolidantibiotikum Erythromycin...46

2.5.4 Fluorchinolon Enrofloxacin...46

2.5.5 Potenzierte Sulfonamide ...47

2.5.5.1 Besonderheiten bei der Empfindlichkeitsprüfung ...49

2.6 Antimikrobielle Resistenzen ...50

2.6.1 Kreuzresistenzen ...53

3 Material und Methoden ...55

3.1 Material...55

3.1.1 Stammsammlung ...58

3.1.2 Referenzstämme...58

3.1.3 Nährmedien...60

3.1.4 Auswahl der geprüften antimikrobiellen Wirkstoffe...60

3.2 Methoden ...62

3.2.1 Mikrobiologische Erregerdiagnostik ...62

3.2.1.1 Staphylococcus aureus und koagulasenegative Staphylokokken ...62

3.2.1.2 Streptococcus uberis...63

3.2.1.3 Streptococcus dysgalactiae...63

3.2.1.4 Streptococcus agalactiae...63

3.2.1.5 Enterococcus-Spezies...64

3.2.1.6 Arcanobacterium pyogenes...64

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3.2.1.7 Escherichia coli... 65

3.2.1.8 Klebsiella-Spezies... 65

3.2.2 Sammlung und Aufbewahrung der Bakterien ... 65

3.2.3 Bouillonmikrodilution... 66

3.2.3.1 Qualitätskontrollen ... 69

3.2.3.1.1 Wachstumskontrolle... 69

3.2.3.1.2 Reinheitskontrolle des Inokulums ... 69

3.2.3.1.3 Überprüfung der Einsaatdichte ... 69

3.2.4 Molekulargenetische Identifizierung fraglicher Enterococcus-Spezies mittels Polymerasekettenreaktion und Sequenzanalyse... 70

3.2.4.1 Isolate und Positivkontrolle ... 70

3.2.4.2 Isolierung der bakteriellen DNA ... 70

3.2.4.3 Polymerasekettenreaktion ... 71

3.2.4.3.2 Agarosegelelektrophorese ... 73

3.2.4.4 DNA-Sequenzanalyse... 73

4 Ergebnisse ... 75

4.1 Referenzstämme... 76

4.2 Staphylococcus aureus... 77

4.3 Koagulasenegative Staphylococcus-Spezies... 81

4.4 Streptococcus uberis... 89

4.5 Streptococcus dysgalactiae... 92

4.6 Streptococcus agalactiae... 98

4.7 Enterococcus-Spezies ... 101

4.7.1 Molekulargenetische Identifizierung fraglicher Enterococcus-Spezies mittels Polymerasekettenreaktion und Sequenzanalyse... 108

4.8 Arcanobacterium pyogenes... 111

4.9 Escherichia coli... 114

4.10 Klebsiella-Spezies... 117

5 Diskussion... 125

5.1 Staphylococcus aureus... 126

5.1.1 Speziesmerkmale ... 126

5.1.2 MHK-Ermittlung ... 127

5.2 Koagulasenegative Staphylococcus-Spezies... 130

5.2.1 Gattungsmerkmale ... 130

5.3 Streptococcus uberis... 132

5.4 Streptococcus dysgalactiae... 136

5.5 Streptococcus agalactiae... 140

5.6 Enterococcus-Spezies ... 142

5.6.1 Gattungsmerkmale ... 142

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5.7. Arcanobacterium pyogenes...148

5.7.1 Speziesmerkmale...148

5.7.2 MHK-Ermittlung...148

5.8 Escherichia coli...151

5.8.1 Speziesmerkmale...151

5.9 Klebsiella-Spezies ...154

5.9.1 Gattungsmerkmale...154

5.10 Resistenzraten anhand der von der DVG-Arbeitsgruppe „Antibiotikaresistenz“ zusammengefassten Breakpoints ...157

6 Schlussfolgerungen...161

7 Zusammenfassung...163

8 Summary...165

9 Anhang...167

9.1 Tabellenanhang...167

9.1.1 Übersicht aus der Literatur zu den Charakteristika der Erreger ...167

9.1.2 Literaturübersicht Minimale Hemmkonzentrationen ...173

9.1.3 Weitere Tabellen der eigenen MHK-Ermittlung ...186

9.2 Verbrauchsmaterialien und Rezepte ...217

9.2.1 Geräte ...219

9.3 Verbrauchsmaterialien und Geräte für Polymerasekettenreaktion und Sequenzanalyse...221

9.4 Abkürzungsverzeichnis...225

9.5 Tabellenverzeichnis...229

9.6 Abbildungsverzeichnis...234

10 Literaturverzeichnis ...235

11 Danksagung...253

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1 E

INLEITUNG

Zu den weltweit wirtschaftlich und lebensmittelhygienisch bedeutendsten Erkrankungen der Milchkuh gehört die Entzündung der Milchdrüse. In der Milchwirtschaft ist deshalb der Einsatz antimikrobieller Wirkstoffe zu therapeutischen oder prophylaktischen Zwecken von großer Bedeutung. Für die Auswahl des am besten geeigneten antimikrobiellen Wirkstoffes ist die Kenntnis der in vitro ermittelten Empfindlichkeit eine wichtige Vorausetzung. Therapeutische Anwendungen können dadurch gezielter und effektiver erfolgen („prudent use“). Dies hat im Hinblick auf den Eintrag von Antibiotikaresistenzen in die Lebensmittelkette einen hohen Stellenwert für den gesundheitlichen Verbraucherschutz.

Aussagefähige Daten zu In-vitro-Hemmkonzentrationen stehen nicht für alle antimikrobiellen Wirkstoffe bzw. Wirkstoffkombinationen sowie Mastitiserreger, wie z.B. Enterokokken und Klebsiellen, zur Verfügung.

Daher wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit für die Indikation „bovine Mastitis“

regelmäßig eingesetzte bzw. neu zugelassene antimikrobielle Wirkstoffe sowie zwei Wirkstoffkombinationen gegenüber insgesamt 808 Bakterienstämmen auf ihre minimale Hemmkonzentration (MHK) geprüft. Die Bestimmung der bakteriellen Spezies basierte auf konventioneller und biochemischer Diagnostik. Zur abschließenden Identifizierung der Enterokokkenfeldisolate wurde zusätzlich zu den herkömmlichen phänotypischen Techniken auch die molekulargenetische Diagnostik mittels Sequenzanalyse eingesetzt.

Für die Empfindlichkeitsprüfungen gemäß den Empfehlungen der Arbeitsgruppe

„Antibiotikaresistenz“ der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft (DVG) wurde die Bouillonmikrodilution ausgewählt und nach internationalen Vorgaben des Clinical Laboratory Standards Institute durchgeführt.

Die Resultate geben einen detaillierten Überblick über den quantitativen Empfindlichkeitsstatus der berücksichtigten Mastitiserreger und leisten einen Beitrag zur Grenzwertfestlegung für Wirkstoffe, für die bislang keine anerkannten veterinärmedizinischen „Breakpoints“ zur qualitativen Einschätzung („sensibel“ bzw.

„resistent“) der minimalen Hemmkonzentrationen vorliegen.

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2 L

ITERATURÜBERSICHT

2.1 Bovine Mastitis

2.1.1 Definitionen und Einteilungen

Als Mastitis wird die Entzündung der Milchdrüse in der Gesamtheit ihrer milchbildenden, -speichernden und -ableitenden Abschnitte bezeichnet. Mastitiden können nach ihrer Morphologie oder nach ihrer Ätiologie eingeteilt werden, wobei das Prinzip der ätiologischen Klassifizierung von Mastitiden insbesondere aus Sicht der mikrobiologischen Diagnostik zweckmäßig ist. Je nach Vorhandensein klinischer Symptome werden sie in klinische bzw. subklinische (Zellgehaltserhöhung ohne Auftreten klinischer Symptome) Mastitiden eingeteilt. Darüber hinaus beschreiben die Begriffe akut, subakut und chronisch die zeitliche Dauer einer Mastitiserkrankung (HAMANN u. FEHLINGS 2002).

2.1.2 Diagnostik im Labor

Die klinische Untersuchung des erkrankten Euters erlaubt keine ätiologische Diagnose der Mastitis. Diese ist ausschließlich durch eine bakteriologische Untersuchung aseptisch entnommener Milchproben zu stellen (SHPIGEL u. SCHMID 1997). Um den dominanten Keim einer Herde zu identifizieren, ist eine sichere Mastitisdiagnostik nur auf Basis von Viertelanfangsgemelken möglich (WATTS et al.

1993; DVG 2000). Als Nährboden für die wichtigsten Mastitiserreger werden nicht- selektiver Blutagar und bei Bedarf Selektivnährmedien eingesetzt. Zur Vordifferenzierung von Streptokokken hat sich der Test auf Äskulinhydrolyse bewährt. Die kulturelle Auswertung erfolgt nach 24- und 48-stündiger Inkubation. Je nach erwarteter Spezies werden die Parameter der Bebrütung (meist + 36 +/- 1 °C aerob) variiert. Zudem findet eine Beurteilung der Keime nach der Koloniemorphologie sowie mittels Nativpräparat und Gramfärbung statt. Eine weitere Differenzierung ist mit biologischen, biochemischen und serologischen Methoden möglich.

Nach der korrekten Identifizierung des Infektionserregers wird die In-vitro- Empfindlichkeit gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen mittels einer einheitlichen und

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aussagekräftigen Methode festgestellt (ALTREUTHER et al. 1997; SCHWARZ et al.

2003), um daraus therapeutische Hinweise zur Behandlung der durch die Erreger verursachten Erkrankung zu finden. Für die Durchführung einer Empfindlichkeitsprüfung sollte der verursachende Erreger in Reinkultur vorliegen (ALTREUTHER et al. 1997). Die Beurteilung von Mischkulturen ist laut DVG (2000) grundsätzlich schwierig, da bei zwei oder mehr Bakterienarten in einer Milchprobe der für die Mastitis verantwortliche Erreger nicht benannt werden kann.

2.2 Empfindlichkeitsbestimmung

Die In-vitro-Empfindlichkeitsprüfung im Rahmen der bakteriologischen Untersuchungen stellt eine essentielle Grundlage für eine erfolgreiche Therapie und ein wichtiges Instrument zur Vermeidung von Resistenzselektionen dar (RICHTER et al. 2006). Man unterscheidet im Wesentlichen zwei Vorgehensweisen zur Empfindlichkeitsbestimmung: Die Reihenverdünnungsverfahren, bei denen die minimale Hemmkonzentration (MHK) ermittelt wird, und die Agardiffusion. Eine Kombination dieser beiden Techniken stellt der E-Test dar (SCHWARZ et al. 2003), der allerdings auch die Bestimmung der MHK, v.a. bei schwer anzüchtbaren Bakterien ermöglicht. Als Methode der Wahl gilt laut SCHWARZ et al. (2003) und LUHOFER et al. (2004) derzeit die Ermittlung der MHK mittels der Bouillonmikrodilution nach den Vorgaben des Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI, ehemals National Committee for Clinical Laboratory Standards [NCCLS]).

Ein Erreger wird in vitro als sensibel eingestuft, wenn die für ein entsprechendes Antibiotikum ermittelte MHK so gering ist (≤ einer festgelegten Grenzkonzentration), dass bei einer Therapie mit der üblichen Dosierung, geeigneter pharmakokinetischer Verteilung, ausreichender Konstitution des Patienten und bei einer geeigneten Indikation ein Therapieerfolg zu erwarten ist. Als antibiotikaresistent gilt der Erreger, bei dem der für ein entsprechendes Antibiotikum ermittelte MHK-Wert über der jeweiligen Grenzkonzentration (Breakpoint) liegt, so dass auch bei Verwendung der zugelassenen Höchstdosierung ein therapeutischer Erfolg vermutlich ausbleibt. Für

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die meisten Wirkstoffe gibt es eine dritte Kategorie, die als „intermediär“ bezeichnet wird. Hier ist der Therapieerfolg zweifelhaft, und es ist für eine Behandlung evtl. eine höhere Dosierung des Therapeutikums nötig. Dies könnte zu Problemen bei lebensmittelliefernden Tieren hinsichtlich einer verlängerten Wartezeit und zu Unverträglichkeitsreaktionen führen (SCHWARZ et al. 2003). Des Weiteren dient die Kategorie intermediär als Pufferzone, um Bakterien aufgrund von kleineren technischen Problemen nicht als falsch resistent („major error“) oder falsch sensibel („very major error“) einzustufen (CLSI 2002; SCHWARZ et al. 2003).

Nachfolgend werden die unterschiedlichen Verfahren zur In-vitro- Empfindlichkeitsprüfung mit ihren Vor- und Nachteilen dargestellt.

2.2.1 Agardiffusionstest

Beim Agardiffusionstest (LINZENMEIER 1990; CLSI 2002) werden auf einem hemmstofffreien Nährboden die zu untersuchenden Bakterien in bestimmter Menge aufgetragen und verschiedene wirkstoffhaltige Plättchen aufgelegt. Während der Inkubation entsteht durch Diffusion in den Nährboden um die Plättchen ein Konzentrationsgefälle, welches, je nach Empfindlichkeit des inokulierten Erregers, das Bakterienwachstum hemmt und einen Hemmhof entstehen lässt. Dessen Durchmesser wird zur Bewertung herangezogen. Anhand von Referenzdaten kann eine Einteilung in die Kategorien „empfindlich“, „intermediär“ und „resistent“ erfolgen.

Vorteil: Der Agardiffusionstest ist mit geringem Kostenaufwand schnell durchführbar, weil bei diesem Test zeitgleich mehrere Wirkstoffe auf einer Agarplatte getestet werden können (ALTREUTHER et al. 1997). Daher findet dieser Test in einigen Routinelabors noch seine Anwendung.

Nachteil: Die Ergebnisse sind ausschließlich qualitativ zu werten, in Form der Kategorien "empfindlich", "intermediär" oder "resistent". Der Test erlaubt somit keine Quantifizierung bezüglich der Wirkstoffkonzentration, die im Tier bzw. im erkrankten Organ erreicht werden muss, um eine effiziente Erregerbekämpfung zu gewährleisten (SCHWARZ et al. 2003). Weiterhin können viele Faktoren die Testergebnisse beeinflussen, wodurch die für eine allgemeine Aussage zur Resistenzsituation ausreichende Präzision fehlt (ALTREUTHER et al. 1997).

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2.2.2 E-Test

Der E-Test ist eine Kombination aus Agardiffusion und Reihenverdünnung, die der MHK-Ermittlung dient (SCHWARZ et al. 2003). Wie bei der Agardiffusion diffundiert hier der Wirkstoff in den Agar und inhibiert damit das bakterielle Wachstum. Beim E- Test kommt ein Kunststoffstreifen zum Einsatz, auf dem der Wirkstoff als Konzentrationsgradient aufgetragen ist, wodurch sich ein entsprechendes Gefälle um den Streifen herum im Agar bildet. Das Bakterienwachstum wird nicht wie bei der Agardiffusion kreisförmig, sondern ellipsoid gehemmt. Die MHK wird mittels einer Skalierung auf dem Teststreifen an der Stelle abgelesen, an der das sichtbare Bakterienwachstum auf den Streifen trifft.

Vorteil: Der E-Test ermöglicht, im Gegensatz zum regulären Agardiffusionstest, durch die Bestimmung des MHK-Wertes eine quantitative Beschreibung des Resistenzverhaltens des getesteten Erregers und ist zudem ein robustes Verfahren (ALTREUTHER et al. 1997), das auch für anspruchsvolle sowie anaerobe Bakterien anwendbar ist.

Nachteil: Die zu untersuchenden Wirkstoffe sind bei Verwendung regulärer Agarplatten auf zwei Wirkstoffe begrenzt, so entstehen möglicherweise hohe Kosten.

Außerdem sind nicht alle antimikrobiellen Wirkstoffe/Wirkstoffkombination, insbesondere solche mit ausschließlich veterinärmedizinischer Zulassung, kommerziell als E-Test-Streifen erhältlich (ALTREUTHER et al. 1997; SCHWARZ et al. 2003).

2.2.3 Agardilution

Die Agardilution ist eine Methode zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration. Vom antimikrobiellen Wirkstoff wird eine geometrisch abgestufte Verdünnungsreihe hergestellt und in einem definierten Agar gelöst (CLSI 2002; SCHWARZ et al. 2003). Jede Agarplatte einer Verdünnungsreihe entspricht dabei einer Konzentrationsstufe. Die MHK ist hier die geringste Konzentration eines Wirkstoffs, die eine Koloniebildung umfassend verhindert (CLSI 2002).

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Vorteil: Es handelt sich um eine gut standardisierbare und außerdem quantitative Methode (ALTREUTHER et al. 1997). Im Gegensatz zur Bouillondilution können mikrobielle Kontaminationen schnell erkannt werden.

Nachteil: Der Test ist zeit- und kostenintensiver, da jeweils nur eine Konzentration eines Wirkstoffes pro Agarplatte getestet werden kann.

2.2.4 Bouillondilution

Bei den Bouillondilutionsverfahren handelt es sich um einen Reihenverdünnungstest in flüssigen Nährmedien, wobei zwischen Mikro- und Makrodilution (in Mikrotiterplatten bzw. Reagenzgläsern) unterschieden wird (CLSI 2002; SCHWARZ et al. 2003).

Der Verdünnung der antimikrobiellen Wirkstoffe bzw. seinem Lyophilisat wird eine Suspension des zu testenden Bakteriums zugegeben. Nach 16 - 24-stündiger Inkubation ist bakterielles Wachstum in der Mikrotiterplatte durch eine so genannte Knopfbildung oder Trübung des Mediums zu erkennen. Die MHK ist definiert als die niedrigste Konzentration des antimikrobiellen Wirkstoffes in einer definierten Verdünnungsreihe, bei der kein sichtbares Bakterienwachstum mehr feststellbar ist (CLSI 2002).

Die Arbeitsgruppe „Antibiotikaresistenz“ der DVG schlägt vor, den Agardiffusionstest durch das Verfahren der Bouillonmikrodilution zu ersetzen (LUHOFER et al. 2004), und entwickelte dafür Layoutvorschläge für eine so genannte „Großtier“

(lebensmittelliefernde Tiere)- und eine „Mastitis“-Platte, welche mittlerweile in der Routinediagnostik eingesetzt werden. Pro Wirkstoff enthalten diese mindestens drei Konzentrationsstufen, die die Grenzwerte für die Kategorien „empfindlich“,

„intermediär“ und „resistent“ einschließen (LUHOFER et al. 2004). Bei den Konzentrationsstufen wurde berücksichtigt, dass die derzeit für einen bestimmten Wirkstoff anerkannten Grenzwerte in Abhängigkeit von den zu testenden Erregern erheblich differieren können (SCHWARZ et al. 2003, LUHOFER et al. 2004).

Für einige tiermedizinisch relevanten pathogenen Keimen liegen bisher allerdings noch keine validen Breakpoints für diverse antimikrobielle Wirkstoffe vor (KIETZMANN et al. 2004). In Monitoringstudien werden in der Regel auch niedrigere

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Konzentrationsbereiche überprüft, um genauere Aussagen über MHK-Werte und Resistenzentwicklungen innerhalb der empfindlichen Bakterienpopulation treffen zu können. Des Weiteren erstellte die Arbeitsgruppe eine Anweisung für das Verfahren der Bouillonmikrodilutionsmethode in Anlehnung an die Vorschriften des CLSI, die sich in Ringversuchen als zuverlässig erwies (WALLMANN et al. 2005). In den Vorgaben des CLSI sind ferner detaillierte Empfehlungen zur internen Systemüberprüfung für das Verfahren der Bouillonmikrodilution beschrieben, deren Einhaltung einen elementaren Aspekt bei der Standardisierung darstellt. Zur Qualitätsüberwachung ist das Mitführen vorgeschriebener Referenzstämme notwendig (TROLLDENIER 1999a).

Vorteil: Die Ermittlung von MHK-Werten zur Empfindlichkeitsprüfung von Bakterien gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen stellt ein quantitatives Verfahren dar und wird derzeit als verlässlichste Methode angesehen (ALTREUTHER et al. 1997;

SCHWARZ et al. 2003). Außerdem ist es mit kommerziell hergestellten und qualitätsgeprüften Mikrotiterplatten leicht durchführbar (SCHWARZ et al. 2003).

Ein weiterer Vorteil ist die Möglichkeit, Trends in der Empfindlichkeit unterschiedlicher Erregerpopulationen über eine Zeitspanne beobachten und Veränderungen leicht erkennen zu können (LUHOFER et al. 2004). Die Ergebnisse ermöglichen außerdem einen Vergleich mit der im Rahmen eines therapeutischen Einsatzes im Zielgewebe erreichbaren Wirkstoffkonzentration (SCHWARZ et al.

2003).

Nachteil: Im Gegensatz zum Agardiffusionstest fehlt bei der Mikrodilution die Flexibilität hinsichtlich der testbaren antimikrobiellen Wirkstoffe. Des Weiteren spielt die Bouillonmakrodilution aufgrund des Aufwandes in der Routinediagnostik und bei Monitoringprogrammen keine Rolle (JORGENSEN u. FERRARO 1998).

2.2.4.1 Bouillonmikrodilution nach den Vorgaben des CLSI (Auszug)

Als Testmedium sollte bei anspruchslosen Bakterien wie z.B. Escherichia (E.) coli und Staphylokokken die Mueller-Hinton-Bouillon angewendet werden. Diese weist niedrige Gehalte an Substanzen auf, die im Stande sind, einzelne antimikrobielle Substanzen (z.B. Sulfonamide) zu hemmen. Außerdem sollten die zweiwertigen

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Kalzium- und Magnesiumkationen die vorgeschriebene Konzentration von 20 - 25 mg/L (Ca²⁺) und 10 - 12,5 mg/L (Mg²⁺) in der Bouillon aufweisen, um so die Beeinflussung der Ergebnisse von einigen Wirkstoffen (z.B. Aminoglykoside) zu verhindern.

Zur Gewährleistung des Wachstums anspruchsvoller Bakterien (z.B. Streptokokken) darf dem Testmedium 2 - 5% lysiertes Pferdeblut zugegeben werden.

2.2.4.2 Bewertung der Ergebnisse

Bei der MHK handelt es sich um ein Intervall zwischen zwei Konzentrationsstufen eines Antibiotikums (SCHWARZ et al. 2003). Dies bedeutet, dass ein Isolat, das bei einer Konzentration von 16 mg/L des Wirkstoffs noch Wachstum zeigt, bei 32 mg/L jedoch nicht mehr, einen ermittelten theoretischen MHK-Wert von 32 mg/L besitzt, die "wahre MHK" aber zwischen > 16 und ≤ 32 mg/L liegt (CLSI 2002).

Zur besseren Charakterisierung der Verteilung der minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) in einer Bakterienpopulation werden die MHK50- (= MHK bei der mindestens 50% des Testkollektivs gehemmt werden) bzw. MHK90-Werte (= MHK bei der mindestens 90% des Testkollektivs gehemmt werden) genutzt. Eine breite Spanne zwischen diesen beiden Werten kennzeichnet häufig eine bimodale Verteilung, in der eine vermeintlich empfindliche und eine vermeintlich resistente Subpopulation unterschieden werden können. Eng nebeneinander liegende Werte von MHK50 und MHK90 weisen auf eine weitgehende Normalverteilung in der Bakterienpopulation hin.

Die MHK-Werte dokumentieren nur die In-vitro-Empfindlichkeit der Erreger, gewinnen aber medizinische Bedeutung, wenn sie zu den mit der Therapie erreichbaren Milch- bzw. Blutspiegeln der entsprechenden Wirkstoffe in Beziehung gesetzt werden (GEDEK 1985; SCHWARZ et al 2003; RICHTER et al. 2006). Für den Therapieerfolg spielen neben der notwendigen In-vitro-Wirksamkeit eines Therapeutikums selbstverständlich noch andere Faktoren, wie z.B. die Pharmakokinetik im tierischen Organismus (Resorption, Verteilung und Metabolismus) eine Rolle.

Außerdem betonten RICHTER et al. (2006), dass bei einer in vitro ermittelten Empfindlichkeit nicht notwendigerweise auch von einer In-vivo-Empfindlichkeit auszugehen ist.

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2.2.5 Resistenzmonitoring

Im Jahre 2001 wurde das "German Resistance Monitoring"-Projekt (GERM-Vet) des Bundesamts für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (BVL) initiiert. Ziel ist die Langzeitbeobachtung der Verbreitung resistenter veterinärpathogener Bakterien (WALLMANN 2006). Es zeigte sich, dass die Resistenzrate der hierbei getesteten Isolate wesentlich geringer war als zunächst erwartet wurde (WALLMANN et al.

2003, 2004, WALLMANN 2006).

Um zu gewährleisten, dass die in Resistenzmonitoringstudien untersuchten Isolate einer repräsentativen Stichprobe der in Deutschland vorkommenden natürlichen Bakterienpopulation entsprechen, sollten einige Faktoren bei der Planung berücksichtigt werden. Laut ALTREUTHER et al. (1997) sind vor Durchführung einer derartigen Studie alle Parameter exakt zu definieren. BÖTTNER et al. (2000) fordern getrennte und vollständige Datenerhebungen für jede Zieltierart und jede Indikation.

Um eine durch Antibiotikaeinsatz möglicherweise erfolgte Selektion der Erreger zu vermeiden, sollten für die Durchführung einer Empfindlichkeitsprüfung nur Erreger aus antibiotisch nicht vorbehandelten Infektionen getestet werden. Außerdem sind so genannte Copy-Stämme auszuschließen, indem pro Herde nur ein Stamm einer Spezies in die Untersuchung einbezogen wird (WALLMANN 2006). Ferner sollte die Empfindlichkeitstestung mittels Bouillonmikrodilution nach den Vorgaben des CLSI erfolgen.

2.3 Mastitiserreger

Entsprechend ihrer unterschiedlichen Übertragungsmodi werden die bedeutendsten Mastitiserreger in verschiedene Gruppen eingeteilt (BRADLEY 2002).

2.3.1 Kuhassoziierte Erreger

Die so genannten kuhassoziierten oder kontagiösen Mastitiserreger gehören zur normalen Mikroflora von Euter- und Zitzenhaut. Sie stellen somit eine ständige Quelle für die Kolonisation des Zitzenendes bzw. -kanals dar (HOEDEMAKER 2001).

Zu ihnen gehören die klassischen Mastitiserreger wie Streptococcus (S.) agalactiae

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und Staphylococcus (S.) aureus (BRADLEY 2002). Diese Erreger passieren den Zitzenkanal und infizieren die Kühe galaktogen. Die Übertragung findet hauptsächlich während des Melkens statt. Die bedeutsamste Quelle sind dabei infizierte Euter laktierender Tiere (HOEDEMAKER 2001).

2.3.2 Umweltassoziierte Erreger

Umweltassoziierte Mastitiserreger (Umwelterreger) gewinnen unter den Bedingungen der modernen Milchkuhhaltung immer mehr Bedeutung (HAMANN u. FEHLINGS 2002). Im Gegensatz zu den kontagiösen Erregern vermehren sich umweltassoziierte Erreger primär im Darmtrakt, in Genitalorganen und infektiösen Prozessen wie Abszessen, Wunden sowie Klauengeschwüren (DVG 1994). Sie können außerhalb der Kuh in der Umwelt überleben, wobei die Beschaffenheit der Einstreu und die Hygiene in der Umwelt der Kuh von großer Bedeutung sind (HOEDEMAKER 1995).

Die hauptsächlichen Erreger dieser Gruppe sind Streptococcus (S.) uberis, Enterococcus (E.) spp. sowie gramnegative Keime wie E. coli und Klebsiella (K.) spp.

(WATTS 1988; TODHUNTER et al. 1995). Diese Autoren zählten auch Streptococcus (S.) dysgalactiae zu den umweltassoziierten Erregern, BRADLEY (2002) teilt ihn in die Gruppe der kontagiösen Keime ein.

Die Übertragung dieser Erreger wird durch die hygienischen Rahmenbedingungen bestimmt und geschieht in der Zwischenmelkzeit.

2.3.3.Staphylococcus (S.)-Spezies 2.3.3.1 Gattungsmerkmale

Staphylokokken werden neben den Gattungen Micrococcus, Stomatococcus und Planococcus der Familie der Micrococcaceae zugeordnet. Diese umfasst grampositive, katalasepositive, aerobe und/oder fakultativ anaerobe Kokken (BLOBEL u. SCHLIESSER 1994a). Sie sind ubiquitär vorhanden, besiedeln Haut, Hautdrüsen und Schleimhäute von Menschen sowie Tieren und sind medizinisch als Eitererreger und Lebensmittelvergifter bedeutsam (SELBITZ 2002a).

Aufgrund unterschiedlicher DNA-Basenzusammensetzung werden Staphylokokken von Mikrokokken unterschieden. Der Gehalt an Guanin und Cytosin beträgt in der

(24)

DNA der Staphylokokken 30 - 39% und in der der Mikrokokken 63 - 73%

(SCHLEIFER 1986). Zur Abgrenzung der Staphylokokken von den Mikrokokken wird in der Routinediagnostik der anaerobe Glukoseabbau und die Sensitivität gegenüber Furazolidon (BLOBEL u. SCHLIESSER 1994a), einem in der Veterinärmedizin nicht zugelassenen Nitrofuran-Antibiotikum, genutzt.

Staphylokokken stellen sich im Mikroskop als grampositive Kokken mit einem Durchmesser von 0,5 - 1,5 µm dar, welche meistens in Haufen zusammen liegen, aber auch einzeln, in Paaren oder kurzen Ketten auftreten (BLOBEL u.

SCHLIESSER 1994a). Sie sind durch schnelles aerobes oder anaerobes Wachstum auf einem breiten Spektrum von Nährmedien (u.a. Blutagar) charakterisiert (SELBITZ 2002a). Einzelne Kolonien können von unterschiedlich großen Hämolysezonen umgeben sein, außerdem sind sie von glatter, konvexer Form und haben nach 18 - 24 h Wachstum bei + 36 °C einen Durchmesser von 1 - 4 mm. Die Koloniepigmente variieren von grau bis weiß, die klassisch goldenen Kolonien von S. aureus, hervorgerufen durch Carotinoide, müssen nicht immer vorhanden sein (KLOOS u.

SCHLEIFER 1986). Staphylokokken produzieren eine Vielzahl von virulenzassoziierten Toxinen und Enzymen. Es sind zellgebundene von extrazellulären Substanzen zu unterscheiden. Zu den zellgebundenen Virulenzfaktoren gehören die Kapsel, Fibronektin-Rezeptoren, Protein A, Schleimsubstanzen und der Clumping Factor. Extrazelluläre Substanzen sind Koagulase, Staphylokinase, Hyaluronidase, Thermonuklease, Lipase, Leukozidine, verschiedene Toxine und Hämolysine. Die Koagulase ist das wichtigste Kriterium, um die Staphylokokken in die zwei Klassen der koagulasepositiven (S. aureus) und die koagulasenegativen Staphylokokken (KNS) einzuteilen (BLOBEL u. SCHLIESSER 1994b), wobei die Koagulase auch von S. intermedius und teilweise von S. hyicus gebildet wird (KLOOS u. SCHLEIFER 1986). Die in seltenen Fällen notwendige Abgrenzung von S. intermedius zu S. aureus erfolgt durch Nachweis der anaeroben Mannitspaltung oder der fehlenden β-D-Galaktosidase-Bildung (PETERS u.

SCHUMACHER-PERDREAU 1992). Die Koagulase ist ein extrazelluläres Protein, welches zusammen mit Prothrombin im Plasma die Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin bewirkt. Auf diese Weise ist die Koagulase an der Bildung einer Fibrinbarriere

(25)

zum Schutz der Bakterien vor Phagozytose beteiligt. Ein zellwandständiges Protein ist der so genannte Clumping Factor und reagiert direkt mit Fibrinogen ohne Vermittlung eines Plasmafaktors (BLOBEL u. SCHLIESSER 1994b). Ca. 6% der S.

aureus-Stämme sind Clumping-Factor-negativ und einige S. intermedius-Stämme positiv (PETERS u. SCHUMACHER-PERDREAU 1992). Der für die Speziesbestimmung von S. aureus bedeutsame Nachweis des Clumping Factors bzw. der Koagulasereaktion erfolgt mittels Schnell-Agglutinationstests bzw.

Kaninchen-Plasma (KLOOS u. SCHLEIFER 1986; SELBITZ 2002a). Eine weitere Speziesdifferenzierung ist mittels der Resistenzprüfung gegenüber dem Antibiotikum Novobiocin (MHK ≥ 1,6 mg/L)möglich (BLOBEL u. SCHLIESSER 1994a). Hierbei handelt es sich um ein gegen grampositive Keime wirksames, doch derzeit in Deutschland, u.a. aufgrund von zahlreichen Nebenwirkungen, nicht zugelassenes Tierarzneimittel (VETIDATA 2007).

2.3.3.2 Staphylococcus aureus

2.3.3.2.1 Eigenschaften und Differenzierung

Die typischen biochemischen Merkmale von S. aureus umfassen u.a. die Fermentation von Glukose als hauptsächliche Kohlenstoff- und Energiequelle sowie die Bildung karotinoider Pigmente. Der Erreger stellt keine besonderen kulturellen Ansprüche und wächst auch unter erhöhten Bebrütungstemperaturen (z.B. + 45 °C) auf den herkömmlichen Nährböden. Eine ausführliche Darstellung der biochemischen Erkennungsmerkmale von S. aureus findet sich in Tabelle 9-1 des Kapitels 9.1.1.

2.3.3.2.2 Klinische Bedeutung

Die subklinische (chronische) Form der S.-aureus-Mastitiden kommt am häufigsten vor, doch auch schwerwiegende klinische Euterentzündungen werden festgestellt.

Aufgrund seiner schlechten Therapierbarkeit gehört S. aureus zu den Problemkeimen unter den Mastitiserregern (HOEDEMAKER 2001). Meist können im Euter, trotz In-vitro-Empfindlichkeit, keine ausreichende Wirkstoffkonzentrationen erreicht werden, da die koagulasebedingte Plasmagerinnung und die

(26)

Keimverklumpung die Erreger vor dem Chemotherapeutikum schützen. Ferner können viele Antibiotika nicht zu den in den Phagolysosomen der Makrophagen vorliegenden Keimen vordringen (SUTRA u. POUTREL 1994).

Die in der Literatur bisher erfassten MHK50/90-Werte von den in dieser Studie berücksichtigten antimikrobiellen Wirkstoffen gegenüber S. aureus zeigt Tabelle 9-6 im Kapitel 9.1.2. Die einzelnen MHK-Ergebnisse dieser Antiinfektiva aus dem nationalen Resistenzmonitoring des BVL gibt Tabelle 9-7 (Kapitel 9.1.2) wieder.

2.3.3.3 Koagulasenegative Staphylokokken (KNS) 2.3.3.3.1 Eigenschaften und Differenzierung

KNS stellen die aus bovinen Mastitismilchproben am häufigsten isolierte Erregergruppe dar (MYLLYS 1995; AARESTRUP u. JENSEN 1997; DEVRIESE et al.

2002). Jedoch werden sie in vielen Studien als eine große Gruppe dargestellt, ohne Spezies bzw. Subspezies zu nennen und ohne die (speziesbedingt) unterschiedlichen Empfindlichkeiten und Resistenzraten innerhalb der KNS zu berücksichtigen (DEVRIESE et al. 2002).

Zur Identifizierung auf Speziesebene können verschiedene kommerzielle Differenzierungs-Kits angewendet werden. Diese liefern bei veterinärmedizinischen Stämmen häufig keine reproduzierbaren Ergebnisse (BURRIEL u. SCOTT 1998;

DEVRIESE et al. 2002) wodurch die Diagnostik erschwert wird. Dies kann auf die begrenzte Zahl an tiermedizinischen Stämmen in der Datenbank der Kits zurückgeführt werden (POUTREL u. RYNIEWICZ 1984; MATTHEWS et al. 1991;

BES et al. 2000). Aufgrund dieses Problems divergieren die Ergebnisse der KNS- Spezies-Beteiligung bezüglich boviner Mastitiden.

TAPONEN et al. (2006) identifizierten anhand des „STAPH ID 32“-APIs (Fa.

bioMérieux) S. simulans (n = 58; 43,6%) als häufigste KNS-Spezies in bovinen Viertelanfangsgemelken, gefolgt von S. chromogenes (n = 31; 23,3%). In einer deutschen Studie untersuchten LÜTHJE und SCHWARZ (2006) 298 KNS-Stämme aus Milchproben boviner subklinischen Mastitiden. Am häufigsten wurden Isolate der Spezies S. chromogenes (32,2%), S. simulans (23,2%), S. epidermidis (11,7%) sowie S. xylosus und S. haemolyticus (je 9,4%) nachgewiesen, und seltener S. sciuri,

(27)

und S. warneri. RATHER et al. (1986) fanden in 84 Milchproben (neben 27,4% S.

aureus), 41,7% S. simulans, 11,9% S. xylosus, 3,6% S. epidermidis, 3,6% S.

saprophyticus und 2,9% S. hyicus.

Eine ausführliche Darstellung der biochemischen Merkmale von den drei in der vorliegenden Studie am häufigsten isolierten KNS-Spezies findet sich in Tabelle 9-1 des Kapitels 9.1.1.

In Nordamerika wurden KNS schon in den 90er Jahren des letzten Jahrhunderts in S.

agalactiae-freien Beständen als häufigste Erreger von intramammären Infektionen nachgewiesen (HOEDEMAKER 1995). Im Unterschied zu anderen grampositiven Mastitiserregern verursachen KNS-Infektionen häufig subklinische Mastitiden, charakterisiert durch erhöhten Gehalt somatischer Zellen in der Milchdrüse und verminderte Milchproduktion (GENTILINI et al. 2002).

Minimale Hemmkonzentrationen verschiedener Studien gegenüber KNS sind Tabelle 9-8 und die einzelnen MHK-Daten der in der vorliegenden Arbeit berücksichtigten Wirkstoffe des nationalen Resistenzmonitoring sind Tabelle 9-9 (beide Tabellen in Kapitel 9.1.2) zu entnehmen.

2.3.4 Streptococcus-Spezies 2.3.4.1 Gattungsmerkmale

Zur Gattung Streptococcus gehören kugelförmige oder ovoide grampositive, unbewegliche, nicht-sporenbildende Kokken mit einem Durchmesser von 0,5 - 2 µm.

In flüssigem Medium liegen sie in Paaren oder Ketten vor. Generell wachsen sie fakultativ anaerob. Ihr Metabolismus ist fermentativ, unter Laktat-, nicht aber unter Gasproduktion. Die optimale Wachstumstemperatur liegt bei + 37 °C, einige wachsen aber auch in Bereichen zwischen 25° und 45° C. Sie produzieren keine Katalase, was ein wichtiges Kriterium für die Abgrenzung zu den Staphylokokken ist. Die von einigen Streptokokken verursachte vollständige Hämolyse der Blutagar-Erythrozyten wird als β-Hämolyse bezeichnet. Bei der α-Hämolyse handelt es sich lediglich um eine Vergrünung durch Bildung von Methämoglobin. Der Begriff „γ-Hämolyse“ ist

(28)

insofern irreführend, als dass er nicht-hämolysierende Stämme beschreibt (SELBITZ 2002a). Zur Hemmung von Begleitflora werden Selektivmedien z.B. Natriumacid, Natriumsulfit, Kristallviolett und Kanamycin zugesetzt. Für Schnelltests im Routinelabor hat der Nachweis des antigenwirksamen Zellwandpolysaccharids, der sogenannten C-Substanz („C“ von Carbohydrate), zentrale Bedeutung. Auf ihm beruht die Einteilung der Streptokokken in die serologischen Lancefield-Gruppen (LANCEFIELD 1934). Rhamnose, Glukose und Galaktose sind wesentliche Bestandteile dieser Antigene. Die Gruppenantigene werden mittels Latexagglutination nachgewiesen. Für die nähere Speziesdiagnostik kommen Stoffwechselkriterien in Betracht, die in Tabelle 9-2 im Kapitel 9.1.1 aufgelistet sind und u.a. mit dem „rapid ID 32 STREP“-API (Fa. bioMérieux) bestimmt werden können.

Die Virulenz der Streptokokken wird von Bestandteilen der Kapsel und der Zellwand sowie extrazellulären Toxinen und Enzymen (z.B. Hämolysine) bestimmt (SELBITZ 2002a).

MATTHEWS et al. (1991) untersuchte die Enzymproduktion von verschiedenen aus boviner Mastitismilch isolierten Streptococcus- und Enterococcus-Spezies mittels eines 4-Methylumbelliferyl-konjugierten Agars. Die folgende Tabelle 2-1 beinhaltet die einzelnen Ergebnisse.

(29)

Tab. 2-1: Überprüfung speziessspezifischer Enzymproduktion von Streptokokken-Isolaten aus bovinen Mastitismilchproben mittels eines 4-Methylumbelliferyl-konjugierten Mediums (nach MATTHEWS et al. 1991).

Enzym Aktivität

Erreger n β-D-

Glukuronidase N-Acetyl-β-D-

Glukosaminidase β-D- Galaktosidase S. agalactiae:

ATCC 27956 1 + (+) +

4 + - +

2 + + +

S. dysgalactiae:

ATCC 27957 1 + - -

23 + - -

4 + + +

S. uberis:

ATCC 27958 + + +

36 + + +

8 + - +

S. equinus:

ATCC 27960 1 - + +

6 - + +

2 - + -

Enterococcus spp.*: 5 - + +

2 - + -

* E. faecalis und E. faecium (+) schwach positiv

2.3.4.2 Streptococcus uberis

Isoliert aus flüssigem Medium, liegen S. uberis-Isolate als Paare oder in kurzen Ketten vor. Diese Spezies ist serologisch heterogen, 50% der von ROGUINSKY (1971) untersuchten Stämme waren keiner Lancefield-Gruppe zuzuordnen. 30%

reagierten mit Gruppe-E-Antiserum sowie ein geringer Teil mit C-, D-, P- und U- Antigenen. Aufgrund des Vermögens bei + 10° und + 45° C zu wachsen sowie die Erhitzung bis zu + 60 °C für 30 min zu überleben, bemerkten DEIBEL und SEELEY (1974) eine Ähnlichkeit zu den D-Streptokokken. Hinsichtlich der Hydrolyse von Hippurat sowie der Bildung von Ammonium nach Argininumsetzung besteht eine Vergleichbarkeit mit S. agalactiae. Auf Blutagar kommt es zu keiner Hämolyse der

(30)

Erythrozyten und selten ist eine schwache α-Hämolyse zu beobachten. Weitere biochemische Charakteristika sind der Tabelle 9-2 (Kapitel 9.1.1) zu entnehmen.

Umweltassoziierte Streptokokken können im Gegensatz zu S. aureus und S.

agalactiae nicht leicht anhand ihrer Kolonie-Morphologie oder ihrer Hämolyse-Form identifiziert werden. SCHAEREN et al. (1984) nutzten zur Differenzierung der aus bovinen Euterinfektionen isolierten S. uberis-Stämme (n = 88) das „API 20 STREP“- Testsystem (Fa. bioMérieux). Dabei wurden hauptsächlich folgende als charakteristisch geltende Kriterien berücksichtigt:

• Hydrolyse von Äskulin und Hippurat

• Fermentation von:

o Trehalose o Sorbitol o Mannitol o Inulin o Laktose

• Bildung von Ammonium aus Arginin

• Kein Abbau von Raffinose

Die folgende Tabelle 2-2 zeigt die Ergebnisse der API-Reaktionen von S. uberis in der Studie von SCHAEREN et al. (1984).

(31)

Tab. 2-2: Biochemische Eigenschaften von 88 S. uberis-Stämmen (äskulinspaltend, CAMP [Christie, Atkins, Munch-Petersen]-Phänomen-negativ) aus bovinen Mastitismilchproben (modifiziert nach SCHAEREN et al. 1984).

Laut SCHAEREN et al. (1984) sowie DEVRIESE et al. (1999) lassen sich äskulinspaltende Streptokokken mit dem Enzym β-D-Glukuronidase der Spezies S.

uberis zuordnen. Außerdem unterscheidet diese Emzymreaktion und/oder die Fermentation von Inulin S. uberis von den Laktokokken (DEVRIESE et al. 1999).

DEVRIESE et al. (1999) charakterisierte ebenfalls 88 S. uberis-Stämme aus subklinischen Euterentzündungen mit dem „API 20 STREP“-Testsystem (Fa.

Test Prozentanteil positiver Stämme [%]

S. uberis

Voges-Proskauer-Test 100

Hippurathydrolyse 100

Pyrrolidonylarylamidase 94,3

α-D-Galaktosidase 0,0

β-D-Glukuronidase 100

β-D-Galaktosidase 2,3

Alkalische Phosphatase 45,5

E n zy m e

Arginindihydrolase 100

Ribose 93,2

L-Arabinose 0,0

Mannitol 100

Sorbitol 100

Laktose 100

Trehalose 100

Inulin 100

Raffinose 0,0

Stärke 15,9

Z u ck er fe rm en ta ti o n

Glykogen 14,8

(32)

bioMérieux). Dabei zeigten zwei atypische Isolate eine negative Inulin-Reaktion und sechs waren β-D-Glukuronidase-negativ.

ODIERNO et al. (2006) nutzen das in Tabelle 2-3 abgebildete Schema von zehn verschiedenen Tests, um die Mastitisdiagnostik bezüglich S. uberis schnell, effizient und kostengünstig zu gestalten. Drei der untersuchten Stämme wurden von diesem Identifizierungsschema als E. faecalis identifiziert.

Tab. 2-3: Biochemische Testergebnisse von S. uberis (n = 47) isoliert aus Milch von bovinen Mastitiden und dem in der Studie dienenden Referenzstamm S. uberis ATCC 27958 (nach ODIERNO et al. 2006).

Test S. uberis ATCC 27958

%-Anteil der Stämme, die das gleiche Ergebnis wie der Referenzstamm zeigten [n = 47]

Hydrolyse von

Arginin + 83,0

Äskulin + 89,0

Hippurat + 96,0

Wachstum in

6,5% Natriumchlorid - 100

Inulin + 64,0

Mannitol + 98,0

Raffinose - 94,0

Salizin + 94,0

Sorbitol + 96,0

Wachstum bei + 45 °C - 98,0

CAMP-Reaktion - 81,0

Ein Studie von WATTS et al. (1993) zeigte, dass die β-D-Galaktosidase-Produktion eine wichtige Eigenschaft von S. uberis und somit bedeutsam für die Abgrenzung zu anderen Streptokokken-Spezies ist. In der folgenden Tabelle 2-4 werden die Ergebnisse der Studie bezüglich der Produktion des Enzyms β-D-Galaktosidase von 377 Streptokokken, isoliert aus Mastitis-Milchproben, dargestellt.

(33)

Tab. 2-4: Produktion von β-D-Galaktosidase verschiedener Streptococcus-Isolate aus Mastitismilch (nach WATTS et al. 1993).

Positives Testergebnis β-D-Galaktosidase-Produktion

Erreger Getestete

Isolate

[n] [n] [%]

S. agalactiae 57 0 0,0

S. dysgalactiae 67 0 0,0

S. uberis 159 151 94,9

E. saccharolyticus 41 0 0,0

E. faecalis 16 0 0,0

S. uberis ist heutzutage einer der wichtigsten umweltassozierten Erreger. Er ist verantwortlich für klinische und subklinische Mastitiden während der Laktation sowie in der Trockenstehzeit von Milchkühen (ODIERNO et al. 2006). In einer Studie von BENTLEY et al. (1993) wurden 107 (90%) S. uberis-Isolate in Milch klinisch erkrankter Mastitisviertel gefunden. Außerdem wurde S. uberis in 71% der subklinischen Mastitis-Fälle isoliert. GEDEK (1985) diagnostizierte in Mastitismilch vier routinemäßig erfassbare Gruppen von Streptokokken, wobei er pro Gruppe deutliche Unterschiede in der Antibiotikaempfindlichkeit ermittelte.

Die MHK50/90-Werte von verschiedenen Studien sind der Tabelle 9-10 (Kapitel 9.1.2) zu entnehmen. Die einzelnen MHK-Ergebnisse der in der vorliegenden Arbeit berücksichtigten antimikrobiellen Wirkstoffe aus dem nationalen Resistenzmonitoring gibt Tabelle 9-11 wieder.

2.3.4.3 Streptococcus dysgalactiae

Streptococcus dysgalactiae gehört wie auch S. agalactiae zu den pyogenen Streptokokken. Aus flüssigem Medium isoliert, stellen sie sich mikroskopisch sichtbar in kurzen bis mittellangen Ketten dar. Äskulin wird nicht hydolysiert. Es kommt zur Ammoniumbildung nach Argininspaltung. Eine Umsetzung von Hippurat findet im Gegensatz zu S. uberis und S. agalactiae nicht statt. Die Hauptbestandteile der Zellwand sind Proteine, Polysaccharide und Peptidoglykane. Die Polysaccharide

(34)

(Rhamnose und N-Acetylgalactosamine) sind dabei die gruppenspezifischen Antigene (ROTTA 1986).

In der Vergangenheit wurden sie aufgrund ihrer biochemischen Eigenschaften wie folgt eingeteilt:

• S. dysgalactiae subsp. equisimilis (FROST u. ENGELBRECHT 1936):

Fermentation von Trehalose und Glycerol; β-Hämolyse

• S. dysgalactiae subsp. dysgalactiae (DIERNHOFER 1932):

Fermentation von Trehalose, nicht jedoch von Glycerol; α-Hämolyse

• S. dysgalactiae subsp. zooepidermicus (FROST u. ENGELBRECHT 1936):

keine Fermentation von Trehalose und Glycerol; dagegen von Sorbitol, β- Hämolyse

S. dysgalactiae subsp. equisimilis wurden vor allem als humanpathogene, die beiden anderen Subspezies als tierpathogene Keime eingeschätzt. Die drei Formen wurden als „Gruppe-C- Streptokokken“ zusammengefasst.

In neueren Studien, basierend auf der Elektrophorese von Zellwandproteinen, schlugen VANDAMME et al. (1996) vor, Stämmen tierischen Ursprungs, die den Lancefield-Serogruppen C und L angehören, den Namen S. dysgalactiae subsp.

dysgalactiae zu geben. Der Name S. dysgalactiae subsp. equisimilis sollte für Stämme der Lancefield-Gruppen C und G humanen Ursprungs verwendet werden.

Die Gruppe-L-Streptokokken, S. dysgalactiae subsp. equisimilis und humane Gruppe-G-Streptokokken werden regelmäßig aus bovinen Milchdrüsen isoliert (WATTS 1988). AARESTRUP und JENSEN (1996) untersuchten 129 S.

dysgalactiae-Stämme aus Dänemark und den USA. Sie identifizierten die Stämme anhand der α-Hämolyse auf Blutagar, der positiven Gramfärbung und der negativen CAMP-Reaktion, ferner hinsichtlich der Fermentation von Trehalose, fehlender Vergärung von Salicin, der negativen Äskulinhydrolyse und aufgrund der Zugehörigkeit zur Lancefield-Serogruppe C. Die Biotypisierung wurde mit Hilfe der Inulin-, Fibrinolyse-, und Hyaluronidase-Reaktionen des „rapid ID 32 STREP“-APIs (Fa. bioMérieux) vorgenommen. Basierend auf den 36 durchgeführten Tests wurde

(35)

die Fermentation von Tagatose und Sorbitol als einzig selektive Reaktion bezüglich der Biotypisierung erkannt. Tabelle 2-5 stellt die Ergebnisse der Studie dar.

Tab. 2-5: Fermentation von Tagatose und Sorbitol von dänischen (n = 100) und nordamerikanischen S. dysgalactiae-Stämmen (n = 29) (modifiziert nach AARESTRUP u. JENSEN 1996).

Tagatose Sorbitol Dänemark [%] USA [%]

- - 66,0 3,4

+ - 18,0 69,0

+ + 1,0 13,8

- + 15,0 13,8

Weitere biochemische Umsetzungen von S. dysgalactiae sind der Tabelle 9-2 im Kapitel 9.1.1 zu entnehmen.

Der Keim kommt hauptsächlich beim Rind und Schwein vor. Er wird regelmäßig aus intramammären Infektionen isoliert und ist somit sowohl während der Laktation als auch in der Trockenstehzeit verantwortlich für klinische und subklinische Mastitiden (CALVINHO et al. 1998). Der Anteil dieses Erregers am Mastitisgeschehen wird zwischen 5 und 20% angegeben (WENDT et al. 1994a). Sowohl die akute klinische als auch die subklinische Form können in Form einer katarrhalischen Galaktophoritis und Mastitis verlaufen.

Die in verschiedenen Studien erfassten MHK50/90-Werte der in der vorliegenden Arbeit berücksichtigten antimikrobiellen Wirkstoffen gegenüber S. dysgalactiae gibt Tabelle 9-12 im Kapitel 9.1.2 wieder.

2.3.4.4 Streptococcus agalactiae

Die taxonomische Klassifizierung der Spezies Streptococcus agalactiae basiert auf einem spezifischen Zellwand-Polysaccharid, welches typisch für die Lancefield

(36)

Gruppe B ist (LANCEFIELD 1934). Es besteht aus Rhamnose, N-Acetylglucosamin und Galaktose (CURTIS u. KRAUSE 1964) und gilt als Virulenzfaktor. Die kokkoiden Bakterien liegen im mikroskopischen Bild in langen Ketten vor. Wie S. uberis hydrolysieren sie Hippurat. Auf Blutagar wachsen sie unter Ausbildung unterschiedlicher Hämolyseformen, meistens allerdings als β-, selten sind sie α- oder nicht-hämolysierend. Äskulin wird nicht gespalten.

Eine sichere Diagnose ist mit dem CAMP-Phänomen möglich. Nach CHRISTIE et al.

(1944) kommt es durch den CAMP-Faktor, ein extrazelluläres Protein, zur Verstärkung der β-Hämolyse eines Staphylokokkenstammes auf Schafblutagar. Als eiterbildende Bakterien zählen sie zu den sogenannten pyogenen Streptokokken.

Weitere biochemische Reaktionen sind Tabelle 9-2 (Kapitel 9.1.1) zu entnehmen.

In den 40er und 50er Jahren des letzten Jahrhunderts war S. agalactiae der bedeutendste Mastitiserreger (MYLLYS et al. 1994). Durch S. agalactiae ausgelöste Mastitiden nehmen meist einen subklinischen, später chronischen Verlauf. Seltener löst der Keim klinisch-katharrhalische Mastitiden aus. Bei der Behandlung wird die hohe Empfindlichkeit des Erregers gegenüber Penicillin G genutzt. WENDT et al.

(1994b) geben diese mit 95,6 - 100% an.

Die in der Literatur ausgewiesenen MHK50/90-Werte zeigt Tabelle 9-13 im Kapitel 9.1.2.

2.3.5 Enterococcus-Spezies

2.3.5.1 Eigenschaften und Differenzierung

Diesen im Darm von Menschen und Tieren vorkommenden Bakterien wurden innerhalb der Gattung Streptococcus lange eine Sonderstellung eingeräumt, bis SCHLEIFER und KILPPER-BÄLZ (1984) mittels DNA-DNA- und DNA-rRNA- Hybridisationsversuche die grundsätzlichen Unterschiede zwischen Enterokokken und Streptokokken aufzeigen konnten. Daher wurde 1984 eine eigene Gattung für Enterokokken eingeführt. Sie wachsen fakultativ anaerob, treten einzeln auf, bilden Paare (Diplokokken) oder kurze Ketten. Enterokokken sind in der Lage, in

(37)

Grenzbereichen zu wachsen; das wird in der Diagnostik genutzt, um sie von anderen Streptokokken abzugrenzen (MUNDT 1986):

• Temperaturbereich: + 10 bis + 45 °C

• Natriumchlorid-Konzentration: ≤ 6,5 %

• pH: 9,6

Wie S. uberis hydrolysieren sie Äskulin zu Äskuletin und Glukose. Neben Enterococcus (E.) faecalis und E. faecium, den wichtigsten Spezies innerhalb dieser Gattung, wurden u.a. E. avium, E. casseliflavus, E. durans, E. gallinarum, E. hirae, (SCHLEIFER u. KILPPER-BÄLZ 1987) und E. saccharolyticus beschrieben.

Eine akkurate Identifizierung des Genus Enterococcus ist wichtig vor allem bezüglich der Prävalenz von Antibiotikaresistenzen (GRAY et al. 1991). Laut REUTER und KLEIN (2003) gibt es über 100 Modifikationen der Selektiv-Medien, um Streptokokken oder Enterokokken von anderen Spezies zu isolieren, darunter:

• Citrat-Azid-Tween-Carbonat (CATC) -Agar,

• Kanamycin-Äskulin-Azid (KAA) -Agar,

• M-Enterococcus-Agar,

• Äskulin-Galle-Azid-Agar

• Thallous-Azetat-Tetrazolium-Glukose-Agar

Allerdings halten REUTER und KLEIN (2003) keines der Medien für ausreichend selektiv, weder für die gesamten Gruppe-D-Streptokokken noch für alle Enterokokken, sieht man von einigen Spezies ab, wie z.B. E. faecalis. Einige Medien hemmen z.B. nicht das Wachstum von Laktokokken (REUTER u. KLEIN 2003). Auf Enterokokken-Selektivagar nach SLANETZ und BARTLEY zeigten diese Gattungen ein uneinheitliches Wachstum, auf stark beimpften Stellen wachsen große rote Kolonien, es gibt aber auch teilweise oder komplett gehemmtes Wachstum (DEVRIESE et al. 1999.)

Bei Enterokokken und Laktokokken finden sich Stämme, die sich nicht mit den traditionellen Kriterien differenzieren lassen (DEASY et al. 2000). Wichtige Tests für die Identifizierung von Laktokokken und Enterokokken sind das Wachstum bei + 45

°C und in Anwesenheit von 6,5% Natriumchlorid (NaCl), wobei die erste Gattung

(38)

geringgradig empfindlicher auf diese beiden Parameter reagiert. DEASY et al. (2000) charakterisierten 131 Isolate u.a aus Milchprodukten, bovinen Eutern und menschlichem Probenmaterial; darunter waren auch Lactococcus spp.-Stämme aus Mastitismilchproben. Dafür nutzen sie, wie KLEIN et al. (1998) sowie MASCHIETO et al. (2004), typische Gattungseigenschaften, z.B. die Gramfärbung, den Katalase- Test und Wachstum bei + 10, + 15, + 30, + 37 und + 45 °C. Weitergehend ermittelten DEASY et al. (2002) die Salztoleranz bei Konzentrationen von 2, 4 und 6,5%, außerdem das Wachstum auf Kanamycin-Äskulin-Azid-Agar, die Gasproduktion von Glukose, Hämolyse auf Blutagar und die Äskulin-Spaltung sowie die Möglichkeit der Ammoniumbildung aus Arginin. Die biochemischen Reaktionen wurden mittels des

„rapid ID 32 STREP“-APIs (Fa. bioMérieux) und des BBL Crystal ID (Fa. Becton Dickinson) überprüft. Anschließend charakterisierten DEASY et al. (2000) jeden Stamm mit einer zu etablierenden PCR-Methode.

Ebenfalls typisch für Enterokokken ist die Ribosevergärung, welche genutzt wird zur Abgrenzung des ihnen ähnlichen S. bovis (DEVRIESE et al. 1999). Die Pyrrolidonylarylamidaseaktivität ist ein weiteres Kriterium zur Unterscheidung von anderen Genera (MASCHIETO et al. 2004). Für die Identifizierung von E. faecalis diente KLEIN et al. (1998) die Fermentation des Methyl-α-D-Glucopyranosids.

(39)

Zur Abgrenzung von anderen grampositiven, katalasenegativen Kokken nutzen KLEIN et al. (1998) folgende Eigenschaften:

• Serogruppen-Bestimmung

• Serogruppe D bzw. nicht zu typisieren

• Wachstum in Anwesenheit von 6,5% NaCl und bei + 10 °C

• Gasbildung von Glukose

• Wachstum bei + 45 °C

• Fermentation von Mannitol (MAN), Sorbitol (SBL), Arabinose (ARA) und Raffinose (RAF):

MAN -, SBL -, ARA -, RAF - → E. durans MAN -, SBL -, ARA -, RAF + → E. hirae MAN +, SBL +, ARA -, + 50 °C - → E. faecalis MAN +, SBL +/-, ARA+, + 50 °C + → E. faecium

MAN +, SBL -, ARA - → Lactococcus spp.

Eine Zusammenstellung charakteristischer Eigenschaften einiger Enterokokken- Spezies enthält die folgende Tabelle 2-6.

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Tab. 2-6: Charakteristische Eigenschaften einiger Enterococcus spp. (modifiziert nach DOMIG et al. 2003).

Wachstum in Anwesenheit von

Spezies 6,5%

NaCl

Galle-40%

zusatz

0,04%

Sodium Azid

Äskulin-

Spaltung Sero- Gruppe D

E. casseliflavus V/+ + + + +

E. durans + + + + (+)

E. faecalis + + + + +

E. faecium + + + + V

E. gallinarum + + + + +

E. hirae + + + + V

E. saccharolyticus (+) + n.u. + -

+ = positiv - = negativ V = variabel (+) = schwach positiv n.u. = nicht untersucht

Alle hier aufgeführten Spezies wachsen bei + 10 und + 45 °C

DEVRIESE et al. (1999) isolierten 243 äskulinspaltende, katalasenegative, grampositive Kokken aus Milchprobenmaterial (subklinische bovine Euterentzündungen). Sie stellten sich als sehr heterogen heraus, wodurch die große Vielfalt der Genera und Spezies der äskulinhydrolysierenden Kokken unterstrichen wird. Zur Differenzierung nutzten die Autoren das „API 20 STREP“-Testsystem (Fa.

bioMérieux). 30% wurden als S. uberis identifiziert (β-D-Glukuronidase-positiv) und 26% als Enterokokken.

SCHAEREN et al. (1984) isolierten äskulinpositive Streptokokken aus Mastitismilchproben und identifizierten mittels des „API 20 STREP“-Testsystems (Fa.

bioMérieux) in elf Fällen E. faecalis und fünfmal E. faecium. Die einzelnen biochemischen Reaktionen zeigt die folgende Tabelle 2-7. In dieser Untersuchung erwies sich keines der Enzyme als spezifisch für Enterokokken. Nach Meinung der Autoren ist daher eine Genus-Differenzierung mit dem API ohne zusätzliche Untersuchungen nicht möglich. Allerdings ist die Aussagekraft aufgrund der geringen Anzahl untersuchter Stämme gering.

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Tab. 2-7: Ergebnisse von E. faecalis (n = 11) und E. faecium (n = 5) im „API 20 STREP“- Testsystems (Fa. bioMérieux) (modifiziert nach SCHAEREN et al. 1984).

Eine ausführliche Darstellung biochemischer Erkennungsmerkmale ausgewählter Enterococcus-Spezies findet sich in Tabelle 9-3 in Kapitel 9.1.1.

Prozentanteil positiver Stämme [%]

Test E. faecalis

[n = 11] E. faecium [n = 5]

Voges-Proskauer-Test 100 100

Hippurathydrolase 72,7 80,0

Pyrrolidonylarylamidase 100 80,0

α-D-Galaktosidase 0,0 0,0

β-D-Glukuronidase 0,0 0,0

β-D-Galaktosidase 18,2 100

Alkalische Phosphatase 0,0 0,0

E n zy m e

Arginindihydrolase 100 80,0

Ribose 100 100

L-Arabinose 18,2 100

Mannitol 100 80,0

Sorbitol 72,7 20,0

Laktose 81,8 100

Trehalose 100 100

Inulin 0,0 0,0

Raffinose 0,0 20,0

Stärke 9,1 80,0

Z u ck er

Glykogen 0,0 40,0

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2.3.5.2 Klinische Bedeutung

Enterokokken sind heterogene Bakterien, deren Bedeutung auch als Lebensmittelinfektionserreger und nosokomiale humanpathogene Keime im Mittelpunkt der Diskussion steht. So werden sie als Indikatorkeime für das Vorkommen von Antibiotikaresistenzen herangezogen, weil sie gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen eine Vielzahl von natürlichen und u. U. auch erworbenen Resistenzdeterminanten besitzen.

Durch ihre weite Verbreitung und ihr massives Auftreten im Kot existieren hohe Infektionsrisiken. Interpretationen bezüglich der ätiologischen Bedeutung bei Infektionen werden dadurch aber auch erschwert. Enterokokken werden sehr häufig aus Milch isoliert, wobei es sich allerdings oftmals um eine postsekretorische Kontamination handelt. JAYARAO und OLIVER (1992) konnten E. faecalis und E.

faecium bei bovinen Euterentzündungen nachweisen. Die Spezies E. saccharolyticus wurde von WATTS (1988) aus bovinen Milchdrüsen isoliert und ist ferner im National Mastitis Council Differenzierungs-Schema gelistet (DEVRIESE et al. 1999).

2.3.5.3 Besonderheiten bei der Empfindlichkeitsprüfung

Bei der Testung bestimmter Erreger-Wirkstoff-Kombinationen kann es zu falschen Ergebnissen kommen; bei den Enterokokken sind dies Aminoglykoside und Trimethoprim-Sulfamethoxazol (CLSI 2002). Mögliche Erklärungsansätze für die reduzierte Aussagekraft dieser Testkombinationen ist die intrinsische Resistenz von Enterokokken gegenüber den therapeutisch möglichen Konzentrationen dieser Antibiotika. Bestimmte Wirkstoffe können in vivo unter mikroaeroben bzw. anaeroben Bedingungen nicht effizient aufgenommen werden, da oxidative Prozesse für die Bereitstellung von Energie für die Transportprozesse durch die Zytoplasmamembran benötigt werden. In vitro werden Enterokokken unter aeroben Verhältnissen getestet, wodurch sie fälschlicherweise als „empfindlich“ eingestuft werden. Des Weiteren werden unter In-vitro-Bedingungen folatfreie Medien verwendet. Enterokokken können exogene Folate nutzen und zeigen daher, in Abhängigkeit vom Vorhandensein dieser Stoffe in vivo eine reduzierte Empfindlichkeit gegenüber Antagonisten des Folsäurestoffwechsels wie Sulfonamiden und Trimethoprim.

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Die in verschiedenen Studien ermittelten MHK-Werte gegenüber der Gattung Enterococcus sind Tabelle 9-14 im Kapitel 9.1.2 zu entnehmen.

2.3.6 Arcanobacterium pyogenes

2.3.6.1 Eigenschaften und Differenzierung

Arcanobacterium pyogenes gehört in die Familie der Actinomycetaceae. Im Jahre 1982 wurde das Bakterium aufgrund von physiologischen, metabolischen und biochemischen Charakteristika vorerst dem Genus Actinomyces (REDDY et al. 1982) angegliedert und konnte erst 1997 durch 16S rRNA-Analysen dem Genus Arcanobacterium zugeordnet werden (RAMOS et al. 1997).

A. pyogenes ist ein 0,2 - 0,5 x 0,6 - 1,9 µm kleines, unbewegliches, grampositives und nicht sporenbildendes Stäbchen (SCHAAL 1986). Das Zellbild des Bakteriums ist pleomorph, d.h. es ist nicht einheitlich gestaltet und kann von stäbchenartiger, coryneformer oder auch kokkoider Gestalt sein. Makroskopisch bildet A. pyogenes auf Blutagar glatte, zirkuläre Kolonien, die weiß bis farblos sind (SCHAAL 1986). Erst nach 48 Stunden ist der Koloniedurchmesser auf einen Millimeter angewachsen und zeigt dann eine deutliche Hämolyse. Da der Erreger über zahlreiche Proteasen verfügt (JOST et al. 1999), macht man sich die proteolytischen Fähigkeiten durch den Nachweis der Serolyse auf einem rinderserumhaltigen Nährmedium, der sogenannten „Löffler-Serumplatte“, diagnostisch zu Nutze. Es handelt sich hierbei um eine für A. pyogenes spezifische Reaktion, die durch Grabenbildung in das Medium hinein gekennzeichnet ist. Die Arcanobacterium-Spezies sind vom metabolischen Standpunkt aus gesehen aerotolerante Anaerobier (REDDY et al.

1982), d. h. sie lassen sich zwar aerob anzüchten, ihr Stoffwechsel ist jedoch streng fermentativ.

REDDY et al. (1982) wiesen in Deletionsversuchen nach, dass eine Supplementierung der Nährbouillon mit Hämin und Hydrogencarbonat für die Vermehrung dieser Bakterien notwendig ist. Um gutes Bakterienwachstum zu erreichen wird empfohlen, dem Nährmedium Blut oder Serum zuzugeben (GUÉRIN- FAUBLÉE et al. 1993b), sowie die Inkubationsatmosphäre mit CO2 oder das Medium mit Bicarbonat anzureichern (SCHAAL 1986).