Aminoglykosid- und Aminocyclitolresistenz

Zu den Aminoglykosiden zählen Antibiotika wie Gentamicin, Kanamycin, Neomycin und Streptomycin. Diese Antibiotika sind sowohl in der Veterinär- als auch in der Humanmedizin zugelassen. Als Vertreter der Aminocyclitole sind Spectinomycin und Apramycin zu nennen, die aus Streptomyces-Spezies gewonnen werden. Sie unterscheiden sich von den Aminoglykosiden in ihrer chemischen Struktur, die keinen Aminozucker enthält. Spectinomycin kann ebenfalls in der Veterinär- und Humanmedizin eingesetzt werden. Apramycin ist nur für die Veterinärmedizin zugelassen.

Aminoglykoside und Aminocyclitole inhibieren durch Bindung an die 30S-Untereinheit der Ribosomen die bakterielle Proteinsynthese. Sie binden an unterschiedlichen Zentren im Ribosom (VAKULENKO u. MOBASHERY 2003). Die mRNA wird fehlerhaft abgelesen und es werden funktionsuntüchtige „Nonsense“-Proteine gebildet. Anaerobier besitzen eine intrinsische Resistenz für Aminoglykoside.

Die Resistenzbildung gegenüber Aminoglykosiden wird vorrangig durch zwei verschiedene Mechanismen vermittelt, der enzymatischen Inaktivierung und der verminderten Aufnahme des Antibiotikums. Die enzymatische Modifikation der Amino- oder Hydroxylgruppen wird von drei unterschiedlichen Enzymfamilien hervor-gerufen: Aminoglykosid-Phosphotransferasen (O-Phosphotransferasen, APHs), Acetyltransferasen (N-Acetyltransferasen, AACs) und Aminoglykosid-Nukleotidyltransferasen (O-Adenyltransferasen, ANTs). Die veränderten Antibiotika können nicht mehr an den Ribosomen binden. APHs phosphorylieren unter ATP-Verbrauch die Hydroxylgruppen der Aminoglykoside an Position 4, 6, 3´, 2´´, und 3´´.

Es wurden bisher 11 verschiedene Klassen beschrieben. Die größte Klasse innerhalb der APHs stellen die APH(3´)-Enzyme dar, sie enthält bislang sieben verschiedene Enzyme. Die kodierenden Resistenzgene für APHs wurden auf mobilen genetischen Elementen wie Transposons und Plasmiden nachgewiesen, einige liegen aber auch chromosomal kodiert vor. Innerhalb der Gruppe der AACs werden vier verschiedene Enzymklassen anhand der Position, an der sie die Aminogruppe acetylieren, unterschieden: AAC(1), AAC(3), AAC(2´) und AAC(6´). Bisher wurden 16 verschiedene N-Acetyltransferasen beschrieben. Bei der Acetylierung wird Acetyl-CoA als Spender der Acetylgruppe benötigt. Dieser Resistenzmechanismus wurde v. a. bei Gram-negativen Bakterien gefunden. Die entsprechenden Resistenzgene sind vor allem auf mobilen genetischen Elementen lokalisiert und können auch Bestandteil von Genkassetten sein. Zu der Gruppe der O-Adenyltransferasen zählen fünf verschiedene Klassen, ANT(6), ANT(9), ANT(4´), ANT(2´´) und ANT(3´´). Sie benötigen ATP für die Adenylierung der Hydroxylgruppe (SCHWARZ et al. 2006). Die kodierenden Resistenzgene wurden auf mobilen genetischen Elementen wie Plasmiden, Transposons und Genkassetten nachgewiesen. Die einzelnen Enzyme

weisen unterschiedliche Substratspektren auf. Eine genaue Aufstellung der Enzyme und den entsprechenden Antibiotika kann den Arbeiten von SHAW et al. (1993) und VAKULENKO u. MOBASHERY (2003) entnommen werden.

Der zweithäufigste Resistenzmechanismus ist die verminderte Aufnahme der Aminoglykoside in die Zelle. Die Ursache hierfür sind Mutationen von Phosphaten in der Lipopolysaccharid-Schicht der Zellmembran und eine Veränderung des Membranpotentials. Diese Mechanismen sind für Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa beschrieben worden.

Für Staphylococcus aureus wurden chromosomale Mutationen beschrieben, die eine Veränderung des transmembranalen elektrischen Potentials bewirken und dadurch zu einer Aminoglykosidresistenz führen (MILLER et al. 1980). Eine weitere Möglichkeit der Resistenzentwicklung ist die Veränderung der Zielstruktur im Ribosom. Mutationen in der ribosomalen Proteinstruktur und der 16S rRNA sowie die enzymatische Methylierung der rRNA sind für verschiedene Gram-negative Bakterien als Ursache der Aminoglykosid-Resistenz beschrieben worden. Weiterhin konnten unterschiedliche Multidrug-Effluxpumpen bei verschiedenen Spezies wie Burkholderia pseudomallei (MOORE et al. 1999), P. aeruginosa (AIRES et al. 1999, WESTBROCK-WADMAN et al. 1999), Acinetobacter baumannii (MAGNET et al.

2001) und E. coli (ROSENBERG et al. 2000) nachgewiesen werden.

Als Ursache für die Resistenz von Aeromonas spp.- und A. salmonicida-Isolaten wurden verschiedene Resistenzgene nachgewiesen, die vorrangig Integron-lokalisiert waren. Die häufigsten Genkassetten mit einer Aminoglykosidresistenz stellten die aadA1- und die aadA2-Kassette dar. Bei Klasse 1-Integrons, die mehr als eine Genkassette enthielten, lag die Genkassette für die Aminoglykosidresistenz nahe am 5‘-CS Bereich (SCHMIDT et al. 2001; L`ABEE-LUND 2001; JACOBS u.

CHENIA 2007). Für A. salmonicida konnte ein Transposon vom Typ Tn5393 mit den Streptomycinresistenzgenen strA-strB nachgewiesen werden (L`ABEE-LUND u.

SORUM 2000).

2.6.3. Phenicolresistenz

Aus der Gruppe der Phenicole besitzen Chloramphenicol und Florfenicol eine hohe Bedeutung in der Behandlung bakterieller Krankheitserreger beim Tier. Während Chloramphenicol mittlerweile in der Veterinärmedizin nur noch für Heimtiere und Nicht Lebensmittel liefernde Tiere zugelassen ist, da es beim Menschen irreversible aplastische Anämien (MARTELO et al., 1964) auslösen kann, gewinnt Florfenicol als rein veterinärmedizinischer Wirkstoff zunehmend an Bedeutung. Durch den Austausch der Nitrogruppe durch eine Sulfonylgruppe und durch Fluor anstelle eines Chloratoms ist mit Florfenicol ein Wirkstoff entwickelt worden, welcher nicht die Nebenwirkungen des Chloramphenicols zeigt, nämlich nicht die dosisunabhängige aplastische Anämie beim Menschen hervorruft. Er ist seit 1995 bzw. 2000 in der EU für die Behandlung von Atemwegserkrankungen bei Rindern bzw. Schweinen zugelassen. In einigen Ländern außerhalb der EU kann Florfenicol in kommerziellen Fischfarmen als Premix zur Behandlung der Furunkulosis, hervorgerufen durch A.

salmonicida, eingesetzt werden.

Chloramphenicol wurde 1947 erstmals aus Streptomyces venezuelae isoliert (EHRLICH et al. 1947) und steht seit 1950 als synthetisches Präparat zur Verfü-gung. Die antimikrobielle Wirkung basiert auf einer Blockade der Proteinsynthese durch die Bindung an die Peptidyltransferase der 50S Untereinheit des Ribosoms.

Für Chloramphenicol sind verschiedene Resistenzmechanismen nachgewiesen worden. Der häufigste Mechanismus ist die enzymatische Inaktivierung durch Chloramphenicol-Acetyltransferasen (CATs) (MURRAY et al. 1997). Es wurden aber auch Effluxmechanismen, Phosphotransferasen, Mutationen des Angriffsortes und Permeabilitätsbarrieren beschrieben (SCHWARZ et al. 2004). Innerhalb der CATs dominieren zwei Typen, Typ A CATs und Typ B CATs. Die Typ A CATs werden in bislang 16 verschiedene Gruppen eingeteilt (SCHWARZ et al. 2004), deren Vertreter jeweils eine Aminosäurenübereinstimmung von über 80% zeigen. Zu den Typ B CATs zählen bisher fünf verschiedene Gruppen. Das Resistenzgen catB1 vermittelt

nur eine sogenannte „low-level“ Resistenz für Chloramphenicol mit MHK-Werten zwischen 5 und 20 mg/L (MURRAY et al. 1997). Während Typ A CATs häufig chromosomal oder plasmidlokalisiert sind, sind Typ B CATs oft als Genkassetten in Integrons zu finden. Abhängig von der Lokalisation innerhalb der Integrons werden sie unterschiedlich stark exprimiert. So zeigten ROWE-MAGNUS et al. (2002), anhand des Gens catB9, dass dieses promotornah eine Resistenz von ≥ 25 mg/L hervorrief, während es an siebenter Stelle im Integron nur noch einen MHK von < 1 mg/L verursachte. Florfenicol ist durch seine Fluorgruppe an der C-3 Position durch CATs nicht zu inaktivieren (CANNON et al. 1990). Ein weiterer Resistenzmechanismus für die Resistenz gegenüber Chloramphenicol ist ein Effluxmechanismus. Die cmlA-Gene sowie cmlB1 kodieren für aktive Exporter aus der Major Facilitator Superfamilie (KADLEC et al. 2007).

Beide bisher bekannten Resistenzmechanismen gegenüber Florfenicol vermitteln auch Chloramphenicolresistenz. Eine kombinierte Resistenz gegenüber Chloramphenicol und Florfenicol wird durch spezifische Transporter, kodiert von den Genen floR und fexA, vermittelt. Während floR bei Gram-negativen Bakterien identifiziert wird, ist fexA bisher nur bei Gram-positiven Erregern nachgewiesen worden (KADLEC et al. 2007, KEHRENBERG u. SCHWARZ 2006). Bei Gram-positiven Bakterien wurde außerdem das Gen cfr beschrieben (KEHRENBERG u.

SCHWARZ 2006). Das Resistenzgen cfr bewirkt eine Chloramphenicol- und Florfenicolresistenz sowie Resistenz gegenüber weiteren Proteinbiosynthese-Inhibitoren über die Methylierung der ribosomalen RNA (KEHRENBERG et al. 2005).

In Untersuchungen über die Antibiotikaresistenz von fischpathogenen Bakterien gegenüber Florfenicol und Chloramphenicol wurden bisher geringe Resistenzraten zwischen zwei und fünf Prozent für Aeromonas spp. festgestellt (GONI-URRIZA 2000, HO et al. 2000, MICHEL et al. 2003). HO et al. (2000) verglichen die Wirkungen der drei Phenicole Chloramphenicol, Thiamphenicol und Florfenicol auf bakterielle Fischpathogene in Taiwan. Dabei zeigte Florfenicol den höchsten antibakteriellen Effekt. In der Arbeit von MICHEL et al. (2003) wurden Isolate aus

Frankreich der fischpathogenen Spezies A. salmonicida und Y. ruckeri auf ihre Phenicolempfindlichkeit geprüft: Von den A. salmonicida-Isolaten zeigte ein Viertel der Untersuchungsgruppe erhöhte MHK-Werte für Chloramphenicol und einige der Y.

ruckeri-Isolate zeigten hohe Chloramphenicol-MHKs. In einer weiteren Studie wurde bei sieben dänischen A. salmonicida-Isolate eine Resistenz für Florfenicol festgestellt, obwohl der Einsatz von Florfenicol in Dänemark für Aquakulturen zu diesem Zeitpunkt noch nicht zugelassen war (SCHMIDT et al. 2001). Bei einem Isolat von A. bestiarum, isoliert aus Süßwasser, wurde ein 24,7 kb großes Plasmid sequenziert. Innerhalb des Plasmids konnten 20 codierende Sequenzen nachgewiesen werden, welche neben den Resistenzgenen sul2, strA-strB und tetR-tet(Y) auch das Florfenicol-Resistenzgen floR enthielt (GORDON et al., 2008).

2.6.4. Tetracyclinresistenz

Tetracycline haben eine bakteriostatische Wirkung durch die reversible Bindung an die 30S-Untereinheit der Ribosomen. Dadurch wird die bakterielle Proteinsynthese gehemmt. Die bekannten Resistenzmechanismen von Bakterien gegenüber Tetracyclinen sind aktiver Efflux, Schutz der Ribosomen oder eine enzymatische Inaktivierung (SPEER et al. 1992, ROBERTS et al. 1996). Es wurden bisher über 38 tet-Resistenzgene gefunden, die für Effluxproteine kodieren. Der Resistenzmechanismus für den Efflux von Tetracyclinen besteht bei Gram-negativen Bakterien aus zwei Strukturgenen, dem Gen für das Effluxprotein und einem gegenläufig orientierten Repressorgen (tetR). In der Abwesenheit von Tetracyclinen wird nur das Repressorgen exprimiert, und verhindert die Transkription des Tetracyclin-Resistenzgens. Sobald Tetracyclin in der Zelle vorhanden ist, wird das Tetracyclin vom Repressorgen gebunden und damit die Transkription der Effluxproteine aktiviert, die solange exprimiert werden bis kein Tetracyclin mehr in der Zelle vorhanden ist (HILLEN u. BERENS 1994, ROBERTS 1996, HINRICHS et al. 1994, KISKER et al. 1995). Andere Effluxsysteme wurden für Gram-positive Bakterien beschrieben, die kodierenden Gene sind tet(K) und tet(L) und werden über

attenuierte Translation ebenfalls nur dann exprimiert, wenn Tetracyclin in der Zelle vorhanden ist. Bei der attenuierten Translation ändert sich in An-/Abwesenheit von Tetracyclin die Sekundärstruktur auf Ebene der mRNA. In der Abwesenheit von Tetracyclin besitzt die mRNA eine Sekundärstruktur, in der die Ribosomenbindungsstelle des tet-Gens für die Ribosomen unzugänglich ist. Erst mit der Anwesenheit von Tetracyclin verändert sich die Struktur und der Transporter wird exprimiert (KHAN u. NOVICK 1983; SCHWARZ et al. 1992). Die Effluxsysteme sind spezifisch für die klassischen Tetracycline. Der Exporter, der vom Gen tet(B) kodiert wird, verfügt zusätzlich über die Fähigkeit, auch Minocyclin aus der Zelle auszuschleusen.

Die Resistenz gegenüber Tetracyclinen, Doxycyclin und Minocyclin durch ribosomale Schutzproteine wurde für zehn verschiedene Resistenzgene, u. a. tet(M) und tet(O) beschrieben (ROBERTS et al. 2003). Cytoplasmatische Proteine aus der Gruppe der GTPasen verhindern durch eine nicht-kompetitive Bindung an das aktive Zentrum die Bindung der Tetracycline an den Ribosomen (CONNELL et al. 2003). Die enzymatische Inaktivierung ist bisher für drei Resistenzgene beschrieben worden, tet(X), tet(34) und tet(37) (CHOPRA u. ROBERTS 2001, ROBERTS et al. 2005, SAPURANIC et al. 2005). Die Tetracyclin-Resistenzgene können chromosomal lokalisiert sein, sind aber häufig auch auf mobilen genetischen Elementen wie konjugativen Plasmiden und Transposons kodiert (CHOPRA u. ROBERTS 2001, HANSEN et al. 2004).

In Untersuchungen von Aeromonaden klinischer und aquatischer Herkunft wurden bei vierzehn bis sechzig Prozent der Aeromonaden Resistenzen gegenüber Tetracyclinen festgestellt (GONI-URRIZA 2000, SCHMIDT et al. 2001). Die vorherrschenden Resistenzgene waren tet(A) bis tet(E). In Nordeuropa dominierte tet(E) (ANDERSEN u. SANDAA, 1994; SCHMIDT et al., 2001), in den asiatischen Ländern wurden vorrangig tet(D) und tet(B) nachgewiesen (AOKI et al. 1983, FURUSHITA et al. 2003) und in einer Arbeit aus Südafrika ist das Resistenzgen tet(A) am häufigsten nachgewiesen worden (JACOBS u. CHENIA 2007). Bei einigen

der molekularbiologisch untersuchten Isolate wurden zwei verschiedene Tetracyclin-Resistenzgene gefunden (FURUSHITA et al. 2003, SCHMIDT et al. 2001). KIM et al.

wies 2004 erstmalig auch tet(M) und tet(S) bei marinen fischpathogenen Bakterien nach.

2.6.5. β-Laktamresistenz

Antibiotika aus der Gruppe der β-Laktame können in vier Gruppen unterteilt werden:

Penicilline, Cephalosporine, Monobaktame und Carbapeneme. In der Veterinärmedizin sind die Penicilline Amoxicillin, Ampicillin, Benzylpenicillin, Cloxacillin und Oxacillin und die Cephalosporine Cefacetril, Cefalexin, Cefapirin, Cefazolin, Cefoperazon, Ceftiofur und Cefquinom für unterschiedliche Anwendungsbereiche bei verschiedenen Tierarten zugelassen. Ampicillin und Amoxicillin gehören in die Gruppe der Aminopenicilline. Durch die Einführung einer Aminogruppe am Benzylrest entstanden Penicilline mit einem deutlich besseren Wirkungsspektrum gegen Gram-negative Bakterien. Sie sind nicht β-laktamasestabil.

Die bakterizide Wirkung der β-Laktame beruht auf einer Hemmung der bakteriellen Zellwandsynthese.

Der am häufigsten vorkommende Resistenzmechanismus bei β-Laktam-Antibiotika ist die enzymatische Inaktivierung durch β-Laktamasen. Diese spalten hydrolytisch den β-Laktamring. Es werden zwei Typen von β-Laktamasen anhand ihres molekularen Aufbaus unterschieden: Serin- und Metallo-β-Laktamasen. Zu den Serin-β-Laktamasen werden die Klasse A, Klasse C und Klasse D-β-Laktamasen hinsichtlich funktioneller Kriterien gezählt (AMBLER 1980, BUSH et al. 1995). Die Metallo-β-Laktamasen sind Klasse B-β-Laktamasen. Die Gene für β-Laktamasen können chromosomal als auch in Genkassetten, Transposons und/oder Plasmiden und lokalisiert vorliegen. Um eine Inaktivierung der Antibiotika durch β-Laktamasen zu verhindern, werden β-Laktame mit β-Laktamase-Inhibitoren wie Clavulansäure kombiniert. Einen weiteren Resistenzmechanismus stellen Penicillin-bindende

Proteine dar. Diese wurden bisher vor allem bei Gram-positiven Bakterien wie Staphylokokken beschrieben. Bei Gram-negativen Bakterien wurden weitere Mechanismen wie eine verminderte Aufnahme durch eine reduzierte Anzahl an Porinen und eine vermehrte Ausschleusung über aktive Transporter nachgewiesen (Poole 2004).

In der Literatur differieren die Angaben zum Resistenzverhalten der fischpathogenen Bakterien gegenüber den einzelnen β-Laktam-Antibiotika. Besonders für Ampicillin liegen unterschiedliche Daten vor. Während sich in einigen Arbeiten sämtliche Isolate der beweglichen Aeromonaden resistent gegenüber Ampicillin verhielten (MORITA et al. 1994), konnten in anderen Arbeiten 65% der Isolate als resistent für Ampicillin getestet werden (SAAVEDRA et al. 2004). Für Cephalosporine sind nur einzelne Vertreter gleichzeitig in den verschiedenen Arbeiten getestet worden. In der Arbeit von SAAVERDRA et al. (2004) waren 65% der Isolate resistent für Cephalosporine der 1. Generation. In einer Untersuchung von Isolaten aus Polen zeigten sich ähnliche Ergebnisse: 57% der Isolate verhielten sich resistent gegenüber Cephalothin (GUZ u. KOZINSKA 2004). Im Gegensatz dazu zeigten sich die Cephalosporine der 3. Generation wirksamer. Je nach Arbeit wurden nur wenige Isolate (MORITA et al. 1994) und bis zu 20% der Isolate als resistent für Cefotaxim getestet (SAAVEDRA et al. 2004). Hierbei ist anzumerken, dass weder für Penicilline noch Cephalosporine anerkannte Grenzwerte für fischpathogene Bakterien vorliegen, die eine Einstufung der Bakterien als resistent oder empfindlich erlauben.

Daher können unterschiedliche Resistenzraten durchaus auch auf der Anwendung unterschiedlicher Grenzwerte zur Empfindlichkeitsbeurteilung beruhen.

FOSSE et al. (2003) untersuchten die β-Laktamasen der einzelnen Spezies der beweglichen Aeromonaden. Aeromonaden des A. hydrophila-Komplexes besaßen Klasse B, Klasse C und Klasse D-Laktamasen, A. caviae besaß Klasse C und D, A.

veronii Klasse B und D, A. schubertii nur Klasse D und A. trota nur Klasse C-β-Laktamasen.