Die In-vitro-Empfindlichkeitsprüfung bakterieller Erreger stellt für die Behandlung erkrankter Tiere und als Kriterium für epidemiologische Erhebungen der Resistenzsituation gegenüber ausgesuchten Wirkstoffen ein wichtiges Hilfsmittel dar.
Für die Überprüfung der phänotypischen In-vitro-Empfindlichkeit der Isolate stehen verschiedene Testsysteme zur Verfügung. Sie geben Aufschluss darüber, ob der Erreger gegenüber bestimmten Antibiotika als empfindlich oder resistent anzusehen ist. Anhand der Aussage kann abgeschätzt werden, ob eine in-vivo Behandlung mit dem jeweiligen Wirkstoff erfolgreich sein wird. Allerdings kann eine In-vitro-Empfindlichkeit nicht uneingeschränkt für die in-vivo In-vitro-Empfindlichkeit übernommen werden. Einschränkende Parameter sind Faktoren wie die Absorption des Antibiotikums durch den Organismus, die Gewebegängigkeit und damit die Wirkstoffkonzentration am Zielort. Richter und Mitarbeiter (2007) haben eine Vielzahl von Faktoren beschrieben, die für ein Versagen der antibiotischen Therapie in der veterinärmedizinischen Praxis verantwortlich sein können.
Für die Empfindlichkeitsbestimmung innerhalb einer Wirkstoffklasse reicht es häufig aus, einzelne Stellvertretersubstanzen zu testen. Anhand dieser Daten ist ein Rückschluss auf das Empfindlichkeitsverhalten anderer Vertreter dieser Klasse möglich (WERCKENTHIN et al. 2005). Die verschiedenen Testsysteme für die Empfindlichkeitsprüfung unterscheiden sich hinsichtlich der qualitativen und quantitativen Aussagen zur Empfindlichkeit des Erregers, des Arbeitsaufwandes und der Kosten (ROCKSIN 2005).
2.3.1. Agardiffusionstest
Der Agardiffusionstest ist ein kostengünstiger und schnell durchführbarer Empfindlichkeitstest in der Routinediagnostik, welcher von BAUER et al. (1966)
etabliert wurde. Hierbei wird ein Inokulum mit einer definierten Bakteriendichte auf einer Agarplatte ausgespatelt. Anschließend wird der Agar mit Antibiotikatestplättchen beschickt, die eine definierte Wirkstoffmenge enthalten. Der Wirkstoff diffundiert während der Inkubation in den Nährboden und produziert einen Wirkstoffgradienten um das Testplättchen. Je nach Grad der Empfindlichkeit des Isolates wird das bakterielle Wachstum in einem unterschiedlich großen Radius um das Plättchen unterdrückt. Dieser Bereich wird als Hemmhof bezeichnet. Anhand des Durchmessers, der in Millimetern angegeben wird, kann das Isolat qualitativ unter Verwendung vorgegebener Grenzwerte als „resistent“, „intermediär“ oder
„empfindlich“ beurteilt werden. Eine quantitative Aussage zur Erregerempfindlichkeit ist mit diesem Testsystem nicht möglich.
Die Durchführung des Agardiffusionstests hat genau nach einer Durchführungsvor-schrift zu erfolgen, da die ermittelten Hemmhofdurchmesser sonst stark variieren können (ALREUTHER et al. 1997, STOCK et al. 2001). Ursachen für unterschiedliche Ergebnisse können bereits in geringfügigen Schichtdickenunterschieden des Agars, dem Alter der Platten, Abweichungen in den Inokulumdichten und im Zeitraum, bis die Bakteriensuspension auf dem Nährboden ausgespatelt wird, liegen (WIEDEMANN et al. 1983). Die CLSI-Vorschrift M42-A
„Methods for Antimicrobial Disk Susceptibility Testing of Bacteria Isolated From Aquatic Animals; Approved Guideline“ gibt wichtige Richtlinien für die lege artis Durchführung des Agardiffusionstests bei Bakterien aus aquatischen Systemen.
2.3.2. E-Test
Der E-Test ähnelt in der Durchführungsweise dem Agardiffusionstest. Jedoch werden statt der Testplättchen mit einer definierten Wirkstoffkonzentration Teststreifen verwendet, die den Wirkstoff in einem meist recht weiten Konzentrationsbereich enthalten. Eine Skalierung auf dem Streifen gibt die Wirkstoffkonzentration an der jeweiligen Stelle an. Im Gegensatz zum Agardiffusionstest kann die Empfindlichkeit
des Erregers hierbei auch quantitativ beurteilt werden. Es wird die minimale Hemmkonzentration (MHK) anhand des Bakterienwachstums vom Teststreifen abgelesen. Der MHK-Wert wird hier definiert als die niedrigste Wirkstoffkonzentration, bei der kein Erregerwachstum mehr sichtbar ist. Der E-Test ist für veterinärmedizinische Untersuchungen nur bedingt einsetzbar, da für viele veterinärmedizinisch relevante Wirkstoffe keine entsprechenden Teststreifen kommerziell erhältlich sind.
2.3.3. Bouillon-Dilutionsverfahren
Das Bouillon-Dilutionsverfahren ist ein Empfindlichkeitstest, der mit einem flüssigen Medium als Reihenverdünnungstest durchgeführt wird. Hierbei wird in der Regel eine zweifache Verdünnungsreihe des zu testenden Wirkstoffes verwendet. Mit Hilfe dieses Verfahrens ist eine quantitative Beurteilung des Empfindlichkeitsverhaltens möglich. Man unterscheidet man die Bouillon-Mikro- und die Bouillon-Makrodilution.
2.3.3.1. Bouillon-Mikrodilution
Dieser Test wird mit industriell hergestellten Mikrotiterplatten in Volumina von 50-100 µl durchgeführt. Die Mikrotiterplatten werden mit verschiedenen Antibiotika in unterschiedlicher Konzentration beschickt. Das Antibiotikum liegt dabei in gefrorener oder gefriergetrockneter Form vor und wird durch die Zugabe einer definierten Menge des Testmediums mit der standardisierten Bakterienmenge resuspendiert.
Die Mikrotiterplatten durchlaufen bereits beim Hersteller entsprechende Qualitätskontrollen, wodurch eine große Anzahl an Fehlerquellen im Gegensatz zu anderen Testsystemen ausgeschaltet wird. Dieses Testsystem stellt das bisher am besten geeignete und robusteste System für die Empfindlichkeitsprüfung und den Vergleich von Empfindlichkeitsdaten dar (ALTREUTHER et al. 1997; STOCK et al.
2001; SCHWARZ et al. 2003). Für die Empfindlichkeitsüberprüfung von
fischpathogenen Bakterien nach CLSI-Standard ist die Arbeitsanweisung M49-A
„Methods for Broth Dilution Susceptibility Testing of Bacteria Isolated From Aquatic Animals; Approved Guideline“ (CLSI, 2005) zu verwenden. Im Gegensatz zu den gut untersuchten human- und tierpathogenen Bakterien liegen für aquatische Bakterien bisher keine Breakpoints vor, die eine Klassifizierung von Vertretern der einzelnen Bakteriengenera bzw. -spezies in die qualitativen Kategorien resistent, intermediär oder empfindlich erlauben.
2.3.3.2. Bouillon-Makrodilution
Dieser Test stellt eine Variante der Bouillon-Mikrodilution dar, bei der einzelne Antibiotika in individuellen Konzentrationen überprüft werden können. Der Test wird in Volumina von 2-5 ml unter Verwendung von Reagenzgläsern durchgeführt. Auch hier enthält das Medium die zu testenden Antibiotika in unterschiedlichen Konzentrationen. Eine standardisierte Suspension des Erregers in dem Testmedium wird hinzugegeben, wobei darauf zu achten ist, dass die angestrebte Endkonzentration im Testmedium nicht unterschritten wird. Gemäß der Durchführungsschrift M49-A „Methods for Broth Dilution Susceptibility Testing of Bacteria Isolated From Aquatic Animals; Approved Guideline“ wird der MHK wie bei allen anderen Testsystemen nach einem definierten Inkubationszeitraum abgelesen.
Nachteile dieser Methode sind ein hoher Arbeitsaufwand und - bedingt durch die individuelle Herstellung der Verdünnungsreihen - eine höhere Anzahl möglicher Fehlerquellen.