1301 GCATGTGCGA AAAGTGCATC GACCCGCGCC GAGGGCATCT GATGCCTAAC 1351 TCGGCGTTCA AGCGGACGGG CTGCGCCCGC CGCTCAACTA TGCGTTAGAT 1401 GCACTAAGCA CATAATTGCT CACAGCCAAA CTATCAGGTC AAGTCTGCTT 1451 AGTCTGCTCA GGTCAAGTCT GCTT
Abb. 17: 4. Kassettenkombination: (a) Sequenz des variablen Bereichs des Klasse 1-Integrons mit dieser Kassettenkombination. Der variable Teil von 1264 bp Größe ist fett gedruckt. Das letzte Nukleotid (G) des 5’CS und jeder Genkassette ist rot unterlegt. Das dfrB3-Gen ist hellblau und das aadA1-Gen ist hellgrün unterlegt.
(b) Schematische Darstellung dieser Kassettenkombination. Die Größen-skala ist in kb angegeben. Die grau gefüllten Boxen stehen für das 5´CS und 3´CS. Die Gene sind als Pfeile dargestellt.
5. Kassettenkombination: dfrA1-aadA1
Diese Kassettenkombination wurde bei vier Isolaten gefunden. Es ist das zweite vorliegende Klasse 1-Integron für das A. sobria-Isolat, welches auch ein Integron mit der 4. Kassettenkombination besitzt. Bei den restlichen drei Isolaten lag es als einziges Klasse 1-Integron vor. Zwei Isolate stammten von Zierfischen: A. veronii biovar veronii (HG10) von einem Koi (F99) und A. veronii biovar sobria (HG8) von einem Goldfisch (F209). Auch bei der Spezies A. salmonicida von einem Lachs (Nutzfisch) konnte dieses Klasse Integron nachgewiesen werden. Das Klasse 1-Integron des A. sobria-Isolats wurde sequenziert und bei den drei weiteren Isolaten wurden Restriktionsanalysen der 5’-3’CS-PCR-Produkte mit den Enzymen ClaI und BclI durchgeführt. ClaI hat eine Schnittstelle in der dfrA1-Genkassette an Base 420,
während BclI in der aadA1-Genkassette an der Base 249 eine Schnittstelle erkennt.
Der variable Anteil dieser 5. Kassettenkombination ist 1433 bp groß (Abb. 18).
Die dfrA1-Genkassette hat eine Größe von 577 bp. Das Gen dfrA1 besteht aus 459 Basenpaaren und kodiert für eine Dihydrofolatreduktase von 153 aa. Dieses Gen beginnt mit dem Startkodon ATG und endet mit dem Stoppkodon TAA. Ein 59-Basen-Element von 95 bp Länge ist vollständig vorhanden. Im Sequenzvergleich mit den Datenbanken stimmt die gesamte Genkassette in der Basenabfolge zu 100% mit vielen Einträgen (z.B. mit Datenbankeintrag AM932672, isoliert von E. coli tierischen Ursprungs aus Deutschland) überein. Die nachfolgende Genkassette mit dem Resistenzgen aadA1 ist 856 bp groß. Dieses Gen vermittelt Resistenz gegenüber Streptomycin und Spectinomycin. Das 780 bp große aadA1-Gen beginnt mit dem Startkodon GTG und endet mit dem Stoppkodon TAA. In dieser Genkassette liegen im Vergleich mit den nächstverwandten Datenbankeinträgen DQ388124 (Salmonella enterica subsp. enterica Serovar Typhimurium, isoliert von Pferden in den Niederlanden) und AB285480.1 (Salmonella sp.) zwei Basenaustausche vor. Der erste Basenaustausch befindet sich an Position 611. In der vorliegenden Sequenz befindet sich anstatt der Base Guanin Adenin. Dieser Austausch hat einen Wechsel der Aminosäure zur Folge: Statt Arginin befindet sich jetzt die Aminosäure Lysin an dieser Stelle. Der zweite Basenaustausch an Position 759, an der Cytosin statt Thymin steht, zieht keine Veränderung der Aminosäure nach sich. Ein 59-Basen-Element von 60 bp Länge ist vollständig vorhanden.
Abb. 18 zeigt die Nukleotidsequenz des gesamten sequenzierten Integronbereichs sowie eine schematische Darstellung der Anordnung der Genkassetten. Die Sequenz dieses Integrons ist in den Datenbanken unter der Zugangsnummer FM877479 zu finden.
(a)
1 CGCGTTACGC CGTGGGTCGA TGTTTGATGT TATGGAGCAG CGACGATGTT 51 ACGCAGCAGG GCAGTCGCCC TAAAACAAAG TTAACCTCTG AGGAAGAATT 101 GTGAAACTAT CACTAATGGT AGCTATATCG AAGAATGGAG TTATCGGGAA 151 TGGCCCTGAT ATTCCATGGA GTGCCAAAGG TGAACAGCTC CTGTTTAAAG 201 CTATTACCTA TAACCAATGG CTGTTGGTTG GACGCAAGAC TTTTGAATCA 251 ATGGGAGCAT TACCCAACCG AAAGTATGCG GTCGTAACAC GTTCAAGTTT 301 TACATCTGAC AATGAGAACG TAGTGATCTT TCCATCAATT AAAGATGCTT 351 TAACCAACCT AAAGAAAATA ACGGATCATG TCATTGTTTC AGGTGGTGGG 401 GAGATATACA AAAGCCTGAT CGATCAAGTA GATACACTAC ATATATCTAC 451 AATAGACATC GAGCCGGAAG GTGATGTTTA CTTTCCTGAA ATCCCCAGCA 501 ATTTTAGGCC AGTTTTTACC CAAGACTTCG CCTCTAACAT AAATTATAGT 551 TACCAAATCT GGCAAAAGGG TTAACAAGTG GCAGCAACGG ATTCGCAAAC 601 CTGTCACGCC TTTTGTACCA AAAGCCGCGC CAGGTTTGCG ATCCGCTGTG 651 CCAGGCGTTA AACATCATGA GGGAAGCGGT GATCGCCGAA GTATCGACTC 701 AACTATCAGA GGTAGTTGGC GTCATCGAGC GCCATCTCGA ACCGACGTTG 751 CTGGCCGTAC ATTTGTACGG CTCCGCAGTG GATGGCGGCC TGAAGCCACA 801 CAGTGATATT GATTTGCTGG TTACGGTGAC CGTAAGGCTT GATGAAACAA 851 CGCGGCGAGC TTTGATCAAC GACCTTTTGG AAACTTCGGC TTCCCCTGGA 901 GAGAGCGAGA TTCTCCGCGC TGTAGAAGTC ACCATTGTTG TGCACGACGA 951 CATCATTCCG TGGCGTTATC CAGCTAAGCG CGAACTGCAA TTTGGAGAAT 1001 GGCAGCGCAA TGACATTCTT GCAGGTATCT TCGAGCCAGC CACGATCGAC 1501 CTTAACTCAA GCGTTAGATG CACTAAGCAC ATAATTGCTC ACAGCCAAAC 1551 TA
Abb. 18: 5. Kassettenkombination: (a) Sequenz des variablen Bereichs des Klasse 1-Integrons mit dieser Kassettenkombination. Der variable Teil von 1433 bp Größe ist fett gedruckt. Das letzte Nukleotid (G) des 5’CS und jeder Genkassette ist rot unterlegt. Das dfrA1-Gen ist hellblau und das aadA1-Gen ist hellgrün unterlegt.
(b) Schematische Darstellung dieser Kassettenkombination. Die Größen-skala ist in kb angegeben. Die grau gefüllten Boxen stehen für das 5´CS und 3´CS. Die Gene sind als Pfeile dargestellt.
6. Kassettenkombination: dfrA14-rekombinantes aadA6
Diese Kassettenkombination wurde bei einem A. hydrophila-Isolat (HG1) eines Zierfisches (Prachtschmerle) isoliert. Der variable Bereich dieses Klasse 1-Integrons besteht aus 1390 bp und beinhaltet zwei Genkassetten (Abb. 19).
Die erste Genkassette enthält das Trimethoprim-Resistenzgen dfrA14 und besitzt eine Größe von 568 bp. Das 474 bp große dfrA14-Gen beginnt mit dem ungewöhnlichen Startkodon TTG und endet mit dem Stoppkodon TAA. Im Vergleich zur Gensequenz von einem E. coli-Isolat mit der gleichen Genkassettenkombination (Datenbanknummer: AM932674) ist in diesem dfrA14-Gen ein Basenaustausch an Position 226 (A ↔ C) festzustellen. Dieser Basenaustausch bewirkt jedoch keine Veränderung der Aminosäure Serin. Ein vollständiges 59-Basen Element von 87 bp Länge ist vorhanden. Bei der zweiten Genkassette handelt es sich um eine Rekombination der Genkassetten aadA6/aadA10 (FIETT et al. 2006). Neuere Untersuchungen deuten jedoch darauf hin, dass es sich eher um eine Rekombination zwischen einem aadA6-Gen und dem 3´-konservierten Segment eines Klasse 1-Integrons handelt (KADLEC u. SCHWARZ 2008). Diese rekombinante aadA6-Gen beginnt mit dem Startkodon ATG und endet nach 834 bp mit dem Stoppkodon TGA im 3´-konservierten Segment. Ein 59-Basen Element ist somit in diesem Fall nicht vorhanden. Die Sequenz dieser Genkassette stimmt im Datenbankvergleich mit mehreren Sequenzen überein; zu der Sequenz von dem E. coli-Isolat aus Deutschland (AM932674) lag kein Basenaustausch vor.
Abb. 19 zeigt die Nukleotidsequenz des gesamten sequenzierten Integronbereichs sowie eine schematische Darstellung der Anordnung der Genkassetten. Die Sequenz dieses Integrons ist in den Datenbanken unter der Zugangsnummer FM877480 zu finden.
(a)
1 GGCTTGGCAT CCAAGCAGCA AGCGCGTTAC GCCGTGGGTC GATGTTTGAT 51 GTTATGGAGC AGCAACGATG TTACGCAGCA GGGCAGTCGC CCTAAAACAA 101 AGTTAACCCA GGATGAGAAC CTTGAAAGTA TCATTGATAG CTGCGAAAGC 151 GAAAAACGGC GTGATTGGTT GCGGTCCAGA CATACCCTGG TCCGCGAAAG 201 GGGAGCAGCT ACTTTTTAAA GCATTGACCT ACAATCAGTG GCTTCTGGTG 251 GGTCGCAAGA CGTTTGAATC TATGGGCGCA CTCCCCAATA GGAAATACGC 301 GGTCGTTACC CGCTCAGGTT GGACATCGAA TGATGACAAT GTAGTTGTAT 351 TTCAGTCAAT CGAAGAGGCC ATGGACAGGC TAGCTGAATT CACCGGTCAC 401 GTTATAGTGT CTGGTGGCGG AGAAATTTAC CGAGAAACAT TACCCATGGC 451 CTCTACGCTC CACTTATCGA CGATCGACAT CGAGCCAGAG GGGGATGTTT 501 TCTTCCCGAG TATTCCAAAT ACCTTCGAAG TTGTTTTTGA GCAACACTTT 551 ACTTCAAACA TTAACTATTG CTATCAAATT TGGAAAAAGG GTTAACAAAG 601 CTATGCAATC GACGGCAAAA AGCTTCGTTC GCTTCGCGCA CTACGCCTTT 651 TTCCGCGATT GATAGCGACG TTAGACATCA TGAGTAACGC AGTACCCGCC 701 GAGATTTCGG TACAGCTATC ACTGGCTCTC AACGCCATCG AGCGTCATCT 751 GGAATCAACG TTGCTGGCCG TGCATTTGTA CGGCTCTGCA CTGGACGGTG 801 GCCTGAAGCC ATACAGTGAT ATTGATTTGC TGGTTACTGT GGCTGCACGG 851 CTCGATGAGA CTGTCCGACA AGCCCTGGTC GTAGATCTCT TGGAAATTTC 901 TGCCTCCCCT GGCCAAAGTG AGGCTCTCCG CGCCTTGGAA GTTACCATCG 951 TCGTGCATGG TGATGTTGTC CCTTGGCGTT ATCCGGCCAG ACGGGAACTG 1001 CAATTCGGGG AGTGGCAGCG TAAGGACATT CTTGCGGGCA TCTTCGAGCC 1251 CTCGCATTTG GTACAGCGCA GCAACCGGCA AGATCGCACC GAAGGATATC 1301 GTTGCCAACT GGGCAATGGA GCGTCTGCCA GATCAACATA AGCCCGTACT 1351 GCTTGAAGCC CGGCAGGCTT ATCTTGGACA AGGAGAAGAT TGCTTGGCCT 1401 CACGCGCGGA TCAGTTGGCG GCGTTCGTTC ACTTCGTGAA ACATGAAGCC 1451 ACTAAATTGC TTAGTGCCAT GCCAGTGATG TCTAAAACAA AGTTAGATGC 1501 ACTAAGCACA TGATTGCTCA CAACCAAACT ATCAGGTCAA GTCTGCTTAA 1551 GCC
(b)
Abb. 19: 6. Kassettenkombination: (a) Sequenz des variablen Bereichs des Klasse 1-Integrons mit dieser Kassettenkombination. Der variable Teil von 1390 bp Größe ist fett gedruckt. Das letzte Nukleotid (G) des 5’CS und jeder Genkassette ist rot unterlegt. Das dfrA14-Gen ist hellblau und das rekombinante aadA6-Gen ist hellgrün unterlegt.
(b) Schematische Darstellung dieser Kassettenkombination. Die Größen-skala ist in kb angegeben. Die grau gefüllten Boxen stehen für das 5´CS und 3´CS. Die Gene sind als Pfeile dargestellt.
7. Kassettenkombination: catB3-aadA2
Das Klasse 1-Integron wurde bei drei Isolaten von Kois gefunden, zwei A.
hydrophila-Isolaten (HG1) und einem A. veronii biovar sobria-Isolat (HG2). Ein PCR Produkt wurde sequenziert, während alle drei PCR-Produkte Restriktionsanalysen unterzogen wurden. Analysen mit den Restriktionsenzymen BclI und MaeI ergaben die gleichen Fragmentmuster bei den PCR-Produkten aller drei Isolate. BclI besitzt in diesem Integron zwei Schnittstellen an Position 300 in catB3 und an Position 1017 in aadA2. Das Enzym MaeI hat eine Schnittstelle an Position 1470 in der aadA2-Genkassette. Der variable Bereich dieses Klasse 1-Integrons besitzt eine Größe von 1570 Basen (Abb. 20).
Die erste Genkassette mit Chloramphenicolreistenzgen catB3 hat eine Größe von 714 bp. Das 633 bp große catB3-Gen beginnt mit dem Startkodon ATG und endet mit dem Stoppkodon TAA. Ein Basenaustausch, der im Vergleich zu anderen catB3-Sequenzen aus den Datenbanken zu einem Aminosäurenaustausch (G ↔ A) führt, befindet sich an Position 418, was in dem vorliegenden CatB3-Protein zu einem Wechsel der Aminosäure von Valin zu Isoleucin führt. Ein vollständiges
59-Basen-Element von 60 bp Länge ist vorhanden. Die zweite Genkassette, die das Streptomycin-/Spectinomycin-Resistenzgen aadA2 beherbergt, besteht aus 856 bp.
Das aadA2-Gen besitzt eine Größe von 780 bp. Es beginnt mit dem Startkodon GTG und endet mit dem Stoppkodon TAA. Das entsprechende AadA2-Protein hat eine Länge von 259 aa. Das 59-Basen-Element ist in dieser Kassette ebenfalls 60 bp lang. Im Datenbankvergleich finden sich keine Sequenzabweichungen zu diversen anderen aadA2-Genen (z.B. DQ462519).
Abb. 20 zeigt die Nukleotidsequenz des gesamten sequenzierten Integronbereichs sowie eine schematische Darstellung der Anordnung der Genkassetten. Die Sequenz dieses Integrons ist in den Datenbanken unter der Zugangsnummer FM877482 zu finden.
(a)
1 GGCATCCAAG CAGCAAGCGC GTTACGCCGT GGGTCGATGT TTGATGTTAT 51 GGAGCAGCAA CGATGTTACG CAGCAGGGCA GTCGCCCTAA AACAAAGTTA 101 GACGGCAAAG TCACAGACCG CGGGATCTCT ATGACCAACT ACTTTGATAG 151 CCCCTTCAAA GGCAAGCTGC TTTCTGAGCA AGTGAAGAAC CCCAATATCA 201 AAGTTGGGCG GTACAGCTAT TACTCTGGCT ACTATCATGG GCACTCATTC 251 GATGACTGCG CACGGTATCT GTTTCCGGAC CGTGATGACG TTGATAAGTT 301 GATCATCGGT AGTTTCTGCT CTATCGGGAG TGGGGCTTCC TTTATCATGG 351 CTGGCAATCA GGGGCATCGG TACGACTGGG CATCATCTTT CCCGTTCTTT 401 TATATGCAGG AAGAACCTGC ATTCTCAAGC GCACTCGATG CCTTCCAAAA 451 AGCAGGTAAT ACTGTCATTG GCAATGACGT TTGGATCGGC TCTGAGGCAA 501 TGGTCATGCC CGGAATCAAG ATCGGGCACG GTGCGGTGAT AGGCAGCCGC 551 TCGTTGGTGA CAAAAGATGT GGAGCCTTAC GCTATCGTTG GCGGCAATCC 601 CGCTAAGAAG ATTAAGAAAC GCTTCACCGA TGAGGAAATT TCATTGCTTC 651 TGGAGATGGA GTGGTGGAAT TGGTCACTGG AGAAGATCAA AGCGGCAATG 701 CCCATGCTGT GCTCGTCTAA TATTGTTGGC CTGCACAAGT ATTGGCTCGA 751 GTTTGCCGTC TAACAATTCA ATCAAGCCGA TGCCGCTTCG CGGCACGGCT 801 TATTTCACGC GTTAAACATC ATGAGGGAAG CGGTGATCGC CGAAGTATCG 851 ACTCAACTAT CAGAGGTAGT TGGCGTCATC GAGCGCCATC TCGAACCGAC 901 GTTGCTGGCC GTACATTTGT ACGGCTCCGC AGTGGATGGC GGCCTGAAGC 951 CACACAGTGA TATTGATTTG CTGGTTACGG TGACCGTAAG GCTTGATGAA 1001 ACAACGCGGC GAGCTTTGAT CAACGACCTT TTGGAAACTT CGGCTTCCCC 1051 TGGAGAGAGC GAGATTCTCC GCGCTGTAGA AGTCACCATT GTTGTGCACG
1051 TGGAGAGAGC GAGATTCTCC GCGCTGTAGA AGTCACCATT GTTGTGCACG 1601 GTCGGCAAAT AATGTCTAAC AATTCGTTCA AGCCGACGCC GCTTCGCGGC 1651 GCGGCTTAAC TCAAGCGTTA GATGCACTAA GCACATAATT GCTCACAGCC 1701 AAACTATCAG GTCAAGTCTG CTT
Abb. 20: 7. Kassettenkombination: (a) Sequenz des variablen Bereichs des Klasse 1-Integrons mit dieser Kassettenkombination. Der variable Teil von 1470 bp Größe ist fett gedruckt. Das letzte Nukleotid (G) des 5’CS und jeder Genkassette ist rot unterlegt. Das catB3-Gen ist orange und das aadA2-Gen ist hellgrün unterlegt.
(b) Schematische Darstellung dieser Kassettenkombination. Die Größen-skala ist in kb angegeben. Die grau gefüllten Boxen stehen für das 5´CS und 3´CS. Die Gene sind als Pfeile dargestellt.
8. Kassettenkombination: dfrA12-orfF-aadA2
Die 8. Genkassettenanordnung mit den dfrA12-, orfF- und aadA2-Genkassetten wurde in dieser Studie am häufigsten gefunden. Von den achtzehn Isolaten, die diese Kassettenkombination aufwiesen, stammten drei Isolate von Nutzfischen (Regenbogenforelle und Nase), zu zwei Isolaten konnten keine Angaben gemacht werden und die restlichen 13 Isolate wurden von Zierfischen [Koi (n=12) und Goldfisch (n=1)] isoliert. Das PCR-Produkt der 5´-/3´-CS-PCR wurde von einem A.
hydrophila-Isolat von einem Koi sequenziert. Die PCR-Produkte der variablen Region