2.5.1. Plasmide
Plasmide sind extrachromosomale doppelsträngige DNA-Elemente. Sie liegen in der Zelle als ringförmiges Molekül im Zytoplasma in unterschiedlicher Anzahl und Größe vor. Die Größe der Plasmide kann zwischen 1 kb und mehr als 100 kb variieren. Oft sind Plasmide Träger von Resistenzgenen, es können aber auch andere Eigenschaften plasmidkodiert sein. Dazu zählen Pathogenitätsfaktoren, metabolische Funktionen oder Konjugations- und Fertilitätsfaktoren. Plasmide können innerhalb einer Spezies, aber auch zwischen verschiedenen Spezies per Konjugation, Transduktion oder Transformation übertragen werden. Innerhalb der Plasmide werden verschiedene Inkompatibilitätsgruppen unterschieden.
Bereits 1972 wurde in einer Arbeit von AOKI et al. der Nachweis transferabler Resistenzplasmide von A. salmonicida, die Resistenzen gegenüber Sulfonamiden, Streptomycin und Chloramphenicol vermittelten, beschrieben. In einer späteren Arbeit konnten AOKI et al. (1981) zeigen, dass die beiden Spezies A. salmonicida und A. hydrophila Plasmide der gleichen Größe und Inkompatibilitätsgruppe besaßen. Es wurden ebenfalls gleiche Plasmide bei Bakterienspezies aus unterschiedlichen geographischen Regionen nachgewiesen (SCHMIDT et al. 2001).
Auf den Plasmiden wurde bisher eine Vielzahl an anderen mobilen genetischen Elementen und an Resistenzgenen nachgewiesen. Einen guten Überblick über bisher untersuchte Plasmide von fischpathogenen Bakterien bieten SORUM et al.
(2006).
2.5.2. Transposons
Transposons bestehen wie Plasmide aus doppelsträngiger DNA, jedoch ohne die Fähigkeit der eigenständigen Replikation. Dafür benötigen sie ein replikationsfähiges
Vektormolekül wie chromosomale DNA oder in der Zelle befindliche Plasmide. Sie können in verschiedenen Größen von weniger als 1 kb bis über 60 kb vorkommen.
Kleine Transposons – sogenannte Insertionselemente siehe Kapitel 2.5.3. – enthalten nur das Gen für die für Integration und Desintegration innerhalb des Genoms zuständige Transposase, während größere häufig weitere Gene wie Antibiotikaresistenzgene enthalten. Transposons werden auch als springende Gene bezeichnet, da sie innerhalb des Bakteriengenoms einen Ortswechsel – eine Transposition – durchführen können (BERG, 1989). Es können auf diesem Weg auch bisher plasmidlokalisierte Transposons in die chromosomale DNA eingebaut werden und auch wieder entfernt werden. Auf diese Weise können transposonlokalisierte Resistenzgene in die chromosomale DNA gelangen.
In Sequenzanalysen von Plasmiden von Aeromonas spp. und A. salmonicida-Isolaten wurden unterschiedliche Transposons nachgewiesen. Bei der Untersuchung des 48 kb großen Plasmides pRAS2 von A. salmonicida wurde ein Tn5393-ähnliches Transposon, welches verschiedene genetische Elemente wie die Insertionselemente IS6100, IS1133 und die Streptomycinresistenzgene strA-strB enthält, gefunden (L`ABEE-LUND u. SORUM 2000). Auf dem 45 kb großen Resistenzplasmid pRAS1 wurde ein unvollständiges Transposon Tn1721 identifiziert (SORUM et al. 2003). Ein vollständiges Transposon Tn1721 konnte bei A. salmonicida auch auf dem Plasmid pASOT sequenziert werden (RHODES et al. 2000). Auch bei A. caviae konnte auf dem Plasmid pFBAOT6 dieses Transposon nachgewiesen werden (RHODES et al.
2000).
2.5.3. Insertionselemente
Insertionselemente zählen zu der Gruppe der Transposons. Sie wurden bisher bei einer Vielzahl von Human-, Tier- und Pflanzenpathogenen nachgewiesen. Bisher wurden über 500 verschiedene Insertionselemente beschrieben, die nach unterschiedlichen Nomenklaturen in Familien zusammengefasst werden können. Sie
besitzen an den terminalen Bereichen „inverted repeats“ und kodieren im mittleren Abschnitt für eine oder mehrere Transposase(n), welche für die Transposition erforderlich ist/sind und somit für die Mobilität der Elemente von entscheidender Bedeutung (MAHILLON u. CHANDLER 1998). Sie sind gekennzeichnet durch invertierte terminale Sequenzwiederholungen (inverted repeats).
In dieser Arbeit konnte ein Insertionselement der IS630 Familie innerhalb eines Klasse 1-Integrons nachgewiesen werden. Insertionselemente dieser Familie besitzen eine Größe zwischen 1100 und 1200 Basenpaare (bp) und zeigen eine hohe Spezifität für die Transposition in die Erkennungssequenz 5´-CTAG-3´. Für diese Familie wurde keine Co-Integration von weiteren genetischen Elementen beschrieben (TENZEN et al. 1990).
2.5.4. Integrons und Genkassetten
Genkassetten stellen kleine mobile genetische Elemente von einer Größe von 0,5 - 2 kb dar. In freier Form liegen sie als ringförmiges DNA-Molekül vor, welches aus einer spezifischen Rekombinationsstelle, dem 59-Basen Element, und aus einem Gen, oft einem Resistenzgen, aufgebaut ist. Genkassetten sind nicht zur eigenständigen Replikation befähigt und müssen daher zu ihrer Vermehrung in replikationsprofiziente DNA-Moleküle der Bakterienzelle, chromosomale DNA oder Plasmide, eingebaut werden. Da Genkassetten mit Ausnahme der cmlA-Genkassette über keine eigene Promotorregion verfügen, sind sie für die Expression der enthaltenen Gene auf einen Einbau in Promotornähe in das Wirtsgenom angewiesen. Die Integration erfolgt durch enzymatische Spaltung im 59-Basen Element durch die Integrase. Die Genkassette wird als lineares Element in spezifische DNA-Bereiche, die sogenannten Integrons, in das Bakteriengenom eingebaut. Aber auch intakte oder defekte Transposons können Genkassetten beherbergen (RECCHIA u. HALL, 1995). Genkassetten können auch in sekundäre Integrationsstellen außerhalb von Integrons eingebaut werden, wobei hier für die
funktionelle Expression des Kassettengens die Nutzung eines entsprechend vorhandenen Promotors entscheidend ist. Ein Beispiel für eine Integration in eine sekundäre Integrationsstelle stellt die Insertion einer dfrA14-Genkassette in das Streptomycinresistenzgen strA (OJO et al.2002) dar.
Integrons stellen genetische Funktionseinheiten dar, die Genkassetten erkennen, akquirieren, aber auch wieder verlieren können. Damit ermöglichen sie dem Mikroorganismus den Erwerb zusätzlicher Funktionen und somit einen möglichen Selektionsvorteil. Bisher wurden fünf verschiedene Integron-Klassen beschrieben (ROWE-MAGNUS et al. 2002). Klasse 1-Integrons stellen die häufigste Gruppe innerhalb der Familie der Integrons dar und konnten bei einer Vielzahl Gram-negativer Bakterien unterschiedlicher Herkunft nachgewiesen werden. Auch bei Isolaten aquatischer Herkunft wurden diese genetischen Einheiten gefunden (PETERSEN et al. 2000, ROSSER u. YOUNG 1999). Klasse 1-Integrons zählen nicht im eigentlichen Sinne zu den mobilen genetischen Elementen. Sie können aber chromosomal oder auf mobilen genetischen Elementen wie Plasmiden oder Transposons lokalisiert sein und dadurch übertragen werden.
Klasse 1-Integrons bestehen aus einem 5´-konservierten Segment (5’CS), welches ein Integrasegen (intI1), eine Promotorregion und die Rekombinationsstelle (attI) für die Integration der Genkassetten enthält und einem 3‘-konservierten Segment (3’CS), welches die Gene qacE∆1, sul1 und orf5 enthalten kann. Die Integrase ist für die Integration und Exzision der Genkassetten verantwortlich, während der Promotor für die Expression der integrierten Genkassetten zuständig ist. Das im 3´CS enthaltene Gen qacE∆1 ist ein Derivat des Gens qacE und kodiert ein Effluxprotein, welches eine Resistenz gegenüber quarternären Ammoniumverbindungen vermittelt und das Gen sul1 für Sulfonamidresistenz. Die Funktion des Leserahmens (open reading frame) orf5 ist bislang ungeklärt.
Bei aquatischen Bakterien wurde mittlerweile eine Vielzahl an Integron-assoziierten Genkassetten beschrieben. So wurden bei einer Untersuchung von 3000
Umweltisolaten in England bei 3,6% der Bakterien Integrons nachgewiesen (ROSSER u. YOUNG 1999). Die häufigsten Genkassetten enthielten aadA-Gene, die für eine kombinierte Streptomycin- und Spectinomycinresistenz kodieren. Weiterhin wurden Genkassetten mit catB3, catB5, dfr-Genen, aacA4 und aacA1, blaOXA-2, sat1, orfD, orfF, und orfX gefunden. Viele Integrons enthielten qacE∆ im 3´CS Bereich, aber kein sul1. Bei fischpathogenen Bakterien stellen Aminoglykosid- und Trimethoprimresistenzgenkassetten alleine oder in Kombination die häufigste Kassettenanordnung in Integrons dar (SCHMIDT et al. 2001, L´ÁBEE-LUND 2001, JACOBS u. CHENIA 2007). Weitere häufig nachgewiesene Kassettengene sind die Chloramphenicolresistenzgene vom catB-Typ. In einer Studie von Isolaten aus Südafrika wurden auch selten beschriebene Genkassetten mit blaOXA-2- und blaPSE-1 -Genen gefunden (JACOBS u. CHENIA 2007).