Empfindlichkeit der Isolate und identifizierte Resistenzgene

5.3.1. Resistenzgene gegenüber Trimethoprim/Sulfonamiden

Die Kombination Trimethoprim/Sulfonamid (1:19) ist in Deutschland die einzige zugelassene Wirkstoffkombination für die Behandlung von Fischen mit bakteriellen Infektionen. Somit kann von einem Selektionsdruck durch die Verwendung der Wirkstoffe ausgegangen werden und ein höherer Anteil resistenter Isolate ist zu erwarten. Eine medikamentöse Behandlung findet bei Fischen häufig über den Zusatz zum Wasser oder als Fütterungsarzneimittel statt. Für diese Art der Medikation sollten Wirkstoffe verwendet werden, die nach kurzer Zeit aus der Umwelt eliminiert werden. Diese Bedingung ist jedoch bei diesen Wirkstoffen nicht gegeben.

Aufgrund ihres schlechten biologischen Abbaus können beide Wirkstoffe im Grundwasser nachgewiesen werden. Dieser Aspekt sollte beim Einsatz dieses Medikamentes mitberücksichtigt werden, da es sonst wie bei Trimethoprim und Sulfonamiden zu einer Persistenz dieser Stoffe in der Umwelt kommen kann. Dieses erhöht dann wiederum die Gefahr einer Resistenzbildung auch bei Umweltbakterien und Kommensalen von Fischen.

Wie bei SCHMIDT et al. (2000) und AKINBOWALE et al. (2006) konnte auch in der vorliegenden Arbeit bei Isolaten mit hohen MHK-Werten gegenüber der Wirkstoffkombination Sulfamethoxazol/Trimethoprim das Resistenzgen sul1 nachgewiesen werden. Da dieses Resistenzgen häufig im 3`-konservierten Segment von Klasse 1-Integrons lokalisiert ist, fand nach der Detektion von sul1 eine Untersuchung der Isolate auf Klasse 1-Integrons statt. Diese Untersuchungen führten zum Nachweis einer erheblichen Anzahl strukturell unterschiedlicher Klasse 1-Integrons.

Im Jahr 2008 wurde von GORDON et al. das Resistenzgen sul2 plasmidlokalisiert bei einem A. bestiarum-Isolat nachgewiesen. Da jedoch für alle Isolate in der vorliegenden Arbeit die erhöhten MHK-Werte gegenüber Sulfonamiden und somit die

molekulare Grundlage für die reduzierte Empfindlichkeit erklärt werden konnte, unterblieben weitere Untersuchungen auf sul2 und sul3.

Bei 30 Aeromonas spp. und bei den zwei A. salmonicida mit erhöhten MHK-Werten für Trimethoprim/Sulfamethoxazol konnten innerhalb der variablen Bereiche der Klasse 1-Integrons Genkassetten mit Trimethoprim-Resistenzgenen detektiert werden. Es wurden sieben unterschiedliche dfr-Gene nachgewiesen (dfrA1, dfrA12, dfrA14, dfrA28, dfrB1, dfrB3 und dfrB4). Einige dieser Trimethoprim-Resistenzgene konnten bereits in anderen Arbeiten bei Aeromonaden nachgewiesen werden. Wie in der vorliegenden Arbeit konnten sie innerhalb von Klasse 1-Integrons lokalisiert werden. So wiesen SCHMIDT et al. (2001) bei 118 von 313 Isolaten und L´ABBEE-LUND et al. (2001) bei 8 von 38 Isolaten kassettenlokalisierte Trimethoprim-Resistenzgene nach. Demgegenüber konnten JACOBS u. CHENIA (2007) in Südafrika nur zwei dfrA1-Genkassetten in Klasse 1-Integrons nachweisen, von denen jedoch nur ein Isolat gegenüber Trimethoprim unempfindlich war.

Wie bereits L´ABBEE-LUND et al. (2001) bemerkten, sind die gefundenen Trimethoprim-Resistenzgene bereits bei humanpathogenen Bakterien beschrieben worden. Dieses Ergebnis unterstützt die These, dass ein gemeinsamer Genpool für unterschiedliche Organismen verschiedener Umweltbereiche besteht und in diesem Genpool ein Austausch von Resistenzgenen erfolgt.

Bei vier Isolaten konnte keine kassettenassoziierte Trimethoprimresistenz nachgewiesen werden. Zwei Isolate wiesen zwar Klasse 1-Integrons auf, diese enthielten jedoch keine dfr-Genkassetten. Bei den zwei übrigen Isolaten konnte kein Klasse 1-Integron nachgewiesen werden. Für diese vier Isolate wurde per PCR das Resistenzgen dfrA1 nachgewiesen. Trimethoprim-Resistenzgene können sich an unterschiedlicher Stelle im Genom befinden. Häufig sind sie in Genkassetten lokalisiert und liegen auf weiteren mobilen genetischen Elementen wie Plasmiden oder Transposons (HUOVINEN et al. 1995, WHITE u. RAWLINSON 2001) vor. OJO et al. (2002) konnten eine Genkassette mit dem Resistenzgen dfrA14 auf einem

Plasmid von E. coli identifizieren. Die Genkassette war statt in einem Integron in das für Streptomycinresistenz kodierende Gen strA integriert. Jedoch konnte eine solche Integration in der vorliegenden Arbeit nicht nachgewiesen werden.

5.3.2. Resistenzgene gegenüber Apramycin

Bei verschiedenen Bakterienspezies wurde bisher das Resistenzgen aac(3´)IV als Ursache der Resistenz gegenüber dem Aminocyclitol Apramycin und dem Aminoglykosid Gentamicin nachgewiesen (YATES et al. 2004, ROCKSIN 2005). In der Arbeit von ROCKSIN (2005) wurden auch bei Kälbern, die bisher nicht mit Apramycin oder Gentamicin behandelt wurden, Isolate mit einem MHK von ≥ 32 mg/L nachgewiesen. Bei diesen Isolaten konnte das Resistenzgen aac(3´)IV als verantwortliches Resistenzgen nachgewiesen werden. In anderen Arbeiten, in denen fischpathogene Bakterien auf ihre Empfindlichkeit gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen untersucht wurden, gehörte Apramycin nicht zu den bisher getesteten Antibiotika. Fischpathogene Bakterien wurden in der vorliegenden Arbeit erstmalig auf das Vorhandensein dieses Resistenzgenes untersucht. Ein Großteil der untersuchten Isolate zeigte MHK-Werte zwischen 1 – 16 mg/L. Die acht Isolate, die MHK-Werte von ≥ 64 mg/L aufwiesen, wurden per PCR auf das Resistenzgen aac(3´)IV untersucht. Während sieben Isolate in der PCR das Resistenzgen aufwiesen, konnte bei einem Isolat kein Amplikon in der erwarteten Größe von 836 bp nachgewiesen werden. Ein negatives Ergebnis in der PCR kann auf ein Nicht-Vorhandensein des Resistenzgens, jedoch auch auf Mutationen im Primer-Bindungsbereich hinweisen. Weitere Mechanismen für Apramycinresistenz wurden bisher nicht beschrieben. Die acht Isolate aus dieser Arbeit zeigten erwartungsgemäß ebenfalls hohe MHK-Werte von ≥ 8 mg/L gegenüber Gentamicin.

5.3.3. Resistenzgene gegenüber Phenicolen

Das Phenicol Chloramphenicol zählt v.a. in asiatischen Ländern zu den häufig eingesetzten Wirkstoffen. In Europa ist der Einsatz dieses Wirkstoffes aufgrund der Nebenwirkungen für Lebensmittel liefernde Tiere nicht mehr zugelassen. Für Florfenicol gibt es nur sehr eingeschränkte Zulassungen für die Bekämpfung von bestimmten respiratorischen Erregern bei Rindern oder Schweinen. Für Fische ist Florfenicol in Deutschland nicht zugelassen. In der vorliegenden Arbeit konnte trotz des Einsatzverbotes bei einem Nutzfischisolat ein erhöhter MHK von 16 mg/L sowohl für Chloramphenicol als auch für Florfenicol festgestellt werden.

Für das Phenicol Chloramphenicol konnte in der vorliegenden Arbeit bei Zierfischisolaten mit hohen MHK-Werten von 256 mg/L das Resistenzgen catA2 detektiert werden. Zwei weitere Chloramphenicol-Resistenzgene catB2 und catB3 konnten in den Klasse 1-Integrons als Genkassetten nachgewiesen werden.

Genkassetten, die das Resistenzgen catB2 enthielten, wurden auch von SCHMIDT et al. (2001) bei Aeromonas spp. nachgewiesen. Auch ROSSER u. YOUNG (1999) konnten bei Bakterien aus Süßwasserproben in England die Genkassetten catB3 und catB5 in Klasse 1-Integrons nachweisen. In der vorliegenden Arbeit scheinen die catB-Gene nur leicht erhöhte MHK-Werte für Chloramphenicol hervorzurufen. Die zwei Isolate in dieser Arbeit, bei denen catB2 nachgewiesen wurde, zeigten einen MHK-Wert von 4 mg/L. Von den vier Isolaten mit catB3 hatten zwei Isolate niedrige MHK-Werte von 1 und 2 mg/L. Bei den zwei Isolaten mit hohen MHK-Werten von 128 und 256 mg/L wurde zusätzlich ein catA2-Gen detektiert, auf welches die hohen MHK-Werte zurückzuführen sind.

Kombinierte Resistenz gegen Florfenicol und Chloramphenicol konnte bei Gram-negativen Bakterien auf das Effluxprotein FloR, welches in die Gruppe der Major Facilitator Superfamily (MFS) eingeordnet wird, zurückgeführt werden (SCHWARZ et al. 2004). In dieser Arbeit wiesen alle dreizehn Aeromonas spp.-Isolate mit MHK-Werten von ≥ 16 mg/L für Chloramphenicol und Florfenicol das Gen floR auf.

Zusätzlich wurden diese Isolate auf die Präsenz von catA2 untersucht. Dabei zeigte sich, dass nur Isolate mit einem MHK von ≥ 128 mg/L für Chloramphenicol zusätzlich positiv für catA2 waren. Allerdings gab es auch einzelne Isolate mit MHK-Werten von 128 und 64 mg/L, die weder catA2 noch ein anderes der untersuchten Chloramphenicol-Resistenzgene aufwiesen.

5.3.4. Resistenzgene gegenüber Tetracyclinen

Tetracycline gehören neben Trimethoprim/Sulfonamiden weltweit zu den am häufigsten in Aquakulturen eingesetzten Wirkstoffen. Untersuchungen von aquatischen Bakterien und fischpathogenen Bakterien berichten über hohe Resistenzraten gegenüber Tetracyclinen. Neben einem großen Einsatz von Tetracyclinen v.a. in asiatischen Ländern ist eine weitere mögliche Erklärung für die Persistenz der hohen Resistenzraten auch nach langjähriger Medikamentenpause der schlechte Abbau von Tetracyclinen in der Umwelt. Die Wirkstoffe dieser Substanzklasse sind schwer biologisch abbaubar und bilden im Boden persistente Rückstände, die in Spurenkonzentrationen im Sicker- und Grundwasser nachgewiesen werden können (ALEXY 2003).

In der vorliegenden Arbeit konnten bei einem Großteil der Isolate erhöhte MHK-Werte gegenüber Tetracyclin festgestellt werden. Hier zeigt sich jedoch ein deutlicher Unterschied der MHK50- und MHK90-Werte zwischen Nutz- und Zierfischen. Die Nutzfischisolate wiesen deutlich geringere MHK-Werte als die Zierfischisolate auf.

Während für andere antimikrobielle Wirkstoffe in dieser Arbeit jeweils nur Isolate mit den höchsten MHK-Werten in die Untersuchung nach den zugrunde liegenden Resistenzmechanismen aufgenommen wurden, wurden alle Isolate von Aeromonas spp. mit MHK-Werten von ≥ 1 mg/L auf enthaltene Resistenzgene der Klassen tet(A)-(E) und tet(Y) untersucht. Bei den MHK-Werten zeigte sich deutlich eine Teilung der Aeromonas spp. in zwei Gruppen, eine Gruppe wies MHK-Werte von ≤ 0,06 mg/L bis 0,25 mg/L auf, während die zweite Gruppe MHK-Werte im Bereich von 1 -

≥ 128 mg/L zeigte. In der zweiten Gruppe wurde – mit Ausnahme von zwei Isolaten – für alle Isolate mindestens ein tet-Gen nachgewiesen. Eine Korrelation zwischen den einzelnen tet-Genen und bestimmten MHK-Werten konnte jedoch nicht gesehen werden. Wie in der Arbeit von SCHMIDT et al. (2001) konnte bei den beweglichen Aeromonaden als dominierendes Resistenzgen für Tetracycline das tet(E)-Gen festgestellt werden. Im Vergleich zu der Arbeit von SCHMIDT et al. (2001) konnten jedoch zusätzlich die Resistenzgene tet(C) und tet(Y) nachgewiesen werden. Das Resistenzgen tet(B) konnte bisher erst einmal in einer amerikanischen Arbeit (NAWAZ et al. 2006) bei fischpathogenen Aeromonaden nachgewiesen werden. Dort wiesen 28% der A. veronii-Isolate dieses häufig plasmidlokalisierte Resistenzgen auf.

Ein Nachweis des Resistenzgens tet(Y) bei tetracyclinresistenten beweglichen Aeromonaden fand bisher nur in der Arbeit von Gordon et al. (2008) statt. Dort wurde das tet(Y)-Gen als Bestandteil eines Multiresistenzplasmids identifiziert. In der Arbeit von SCHMIDT et al. (2001) wurden die resistenten Isolate ebenfalls auf das Vorhandensein von Plasmiden untersucht. Im Anschluss wurden die Plasmide in E.

coli konjugiert. Die erhaltenen Transkonjuganden enthielten v.a. tet(A) als Tetracyclin-Resistenzgen. In einer weiteren Arbeit von RHODES et al. (2000) wurden bewegliche Aeromonaden von Fischen aus Aquakulturen (n=91) und aus Krankenhausabwässern (n=72) hinsichtlich ihrer Fähigkeit, Tetracyclinresistenz auf E. coli zu übertragen, untersucht. Elf Isolate aus Krankenhausabwasser und sechs Fischisolate übertrugen Tetracyclinresistenz mittels Plasmiden. Die Plasmide wurden auf die Gene tet(A)-tet(E) und tet(G) untersucht und nur das Gen tet(A) wurde nachgewiesen. In Anschlussuntersuchungen wurde gezeigt, dass sich tet(A) innerhalb des Transposons Tn1721 auf den Plasmiden befand.

Für A. salmonicida liegen ähnliche Ergebnisse vor. Von den insgesamt 13 in dieser Arbeit untersuchten Isolaten enthielten alle Isolate mit höheren Tetracyclin-MHKs tet-Gene: zwei Isolate tet(E), ein Isolat tet(A) und ein Isolat tet(C). LÁBÉE-LUND (2001) stellte unter 38 sulfonamidresistenten A. salmonicida bei 20 Isolaten eine Resistenz gegenüber Tetracyclin fest, die durch die Resistenzgene tet(A) und tet(E) hervorgerufen wurde. Dabei konnte zusätzlich nachgewiesen werden, dass tet(A)

häufig mit dem Transposon Tn1721 assoziiert war. Auch SCHMIDT et al. (2001) wiesen unter 29 oxytetracyclinresistenten A. salmonicida bei 17 Isolaten tet(A), drei Isolaten tet(C) und je einem Isolat tet(A) und tet(C) nach. Bei fünf Isolaten konnte die Resistenz nicht geklärt werden. Dafür untersuchten sie die Isolate, die über das Gen tet(C) verfügten genauer. Alle tet(C)-positiven Isolate besaßen ein 13 kb großes Plasmid. Ein ähnliches Ergebnis findet sich bei AOKI u. TAKAHASHI (1986), die ein nicht transferables Resistenzplasmid von 11,4 kb Größe beschrieben. Dieses Plasmid enthielt ein transposon-assoziiertes tet(C)-Gen. Weiterhin stellten sie bei einem amerikanischen Isolat das Resistenzgen tet(D) auf einem 140 kb-großen Plasmid fest.

5.3.5. Empfindlichkeit gegenüber β-Laktamen und Chinolonen

Für die untersuchten β-Laktame Ampicillin und Penicillin sind die hohen Resistenzraten nicht überraschend. In vielen Studien werden Aeromonaden als ampicillin- und penicillinresistent beschrieben (MORITA et al. 1994, SON et al. 1997, SAHA et al. 2002, MIRANDA u. ZEMELMANN 2002, CHELOSSI 2003). Jedoch wurde 2003 von ABBOTT et al. eine neue Spezies beschrieben, die Ampicillin-empfindliche Spezies A. trota. Eine Möglichkeit, warum in den Untersuchungen so wenige bzw. keine ampicillinempfindlichen Isolate beschrieben werden, ist die Verwendung eines Selektivnährmediums für die Isolierung der entsprechenden Bakterien. Viele Labors verwenden zur Isolierung der Aeromonaden einen Aeromonas-Pseudomonas-Selektivagar. Dieser enthält als Selektivmedium 100.000 I. E. Penicillin G-Natrium und zum Teil 0,01 g/L Pimaricin. Dadurch könnten ampicillinempfindliche Aeromonaden bereits im Vorfeld eliminiert worden sein.

Demgegenüber konnte auch in anderen Studien ohne die Verwendung des Selektivagars ein hoher Anteil von 86% (AKINBOWALE et al. 2006) ampicillinresistenter Isolate nachgewiesen werden.

Das Antibiotikum Amoxicillin, welches wie Ampicillin zur Untergruppe der Aminopenicilline gerechnet wird, zählt zu den am häufigsten verwendeten Wirkstoffen in der Human- und Veterinärmedizin. In der vorliegenden Arbeit wurde dieser Wirkstoff in Kombination mit dem β-Laktamaseinhibitor Clavulansäure getestet. Mit Ausnahme von zwei Isolaten von Zierfischen zeigten alle Isolate niedrige MHK-Werte gegenüber dieser Wirkstoffkombination.

Über die Empfindlichkeit gegenüber Cephalosporinen und Chinolonen sind bisher nur wenige Daten veröffentlicht worden. Es liegen Arbeiten von SAAVEDRA et al.

(2004), SCHMIDT et al. (2001) und JACOBS u. CHENIA (2007) vor, deren Resultate jedoch aufgrund der unterschiedlichen Methoden der Empfindlichkeitsbewertung nicht miteinander vergleichbar sind.

5.3.6. Isolate mit erhöhten MHK-Werten für mehrere Wirkstoffe

In dieser Arbeit konnten bei vielen Isolaten erhöhte MHK-Werte gegenüber mehr als zwei Wirkstoffen nachgewiesen werden. In der Tabelle 37 sind nur die Wirkstoffe dargestellt, für die auch der Nachweis an entsprechenden Resistenzgenen geführt wurde. So konnten bei einem Zierfischisolat hohe Werte gegenüber mehr als acht Wirkstoffen oder Wirkstoffkombinationen festgestellt werden. Der in dieser Arbeit am häufigsten gefundene Resistenzphänotyp war Resistenz gegenüber Sulfonamid-Trimethoprim-Spectinomycin. Auch in anderen Studien konnten bei vielen Isolaten Multiresistenzen detektiert werden (Mc PHEARSON et al. 1991, SCHMIDT et al.

2001, HATHA et al. 2005). Bei Schmidt et al. (2001) wiesen 48% der Untersuchungsgruppe Resistenzen für mindestens zwei Wirkstoffe auf. Der vorwiegende Resistenzphänotyp war mit 28% Resistenz gegenüber Amoxicillin-Oxytetracyclin-Trimethoprim/Sulfonamid, gefolgt von 10% der Isolate mit Resistenzen gegenüber Oxacillin und 9% gegenüber Oxytetracyclin-Oxacillin-Trimethoprim/Sulfonamid. Auch SIESENOP u. BÖHM (2000) stellten bei 73,6% der untersuchten Aeromonaden aus Deutschland Mehrfachresistenzen

gegenüber den überprüften Wirkstoffen fest. Diese Stämme zeigten drei oder mehr Resistenzen gegenüber fünf getesteten Antibiotika.