3. Material und Methoden
3.2.3. Molekularbiologische Methoden
In der Durchführungsvorschrift M49-A der CLSI liegen bisher keine Grenzwerte für die einzelnen Fischpathogene zur Klassifizierung der Antibiotikaempfindlichkeit in die qualitativen Kategorien „empfindlich“, „intermediär“ und „ resistent“ vor. Daher wurden die anschließenden Untersuchungen zum Nachweis von Resistenzgenen an Isolaten durchgeführt, deren MHK-Werte deutlich, d. h. mindestens 3 Titerstufen höher waren als die MHKs der normal verteilten Isolate.
In die Untersuchungen zum Nachweis von Resistenzgenen wurden nur die beweglichen Aeromonadenisolate, bzw. Aeromonas spp., und A. salmonicida-Isolate einbezogen. Ein Nachweis von Resistenzgenen bei Yersinia-Isolaten unterblieb, da deren MHK-Werte homogen über nur wenige Konzentrationsstufen verteilt waren.
3.2.3.1. Agarose-Gelelektrophorese
Für die Darstellung der chromosomalen DNA, der Plasmide, der PCR-Produkte sowie der Restriktionsverdaus von Plasmiden oder PCR-Produkten wurde die Agarose-Gelelektrophorese gewählt. Diese Methode basiert auf der Polarität von Nukleinsäuren. Bei einer angelegten Spannung wandern die DNA-Moleküle als Anionen zur Kathode. Dabei wird die Laufgeschwindigkeit von der Größe der Fragmente und der Molekülform beeinflusst. Kurze oder ringförmige Fragmente laufen schneller, während lange oder linearisierte Fragmente langsamer sind.
Zusätzlich können die Laufeigenschaften von der Konzentration des Gels beeinflusst werden. Bei niedrigeren Konzentrationen werden große DNA-Fragmente, bei höherprozentigen Gelen werden kleine Fragmente besser aufgetrennt.
Standardmäßig wurden 1 %ige (w/v) Agarosegele bei den Untersuchungen eingesetzt. Dafür wurden 40 mg Agarose (Multi-Purpose, Roth, Karlsruhe, Deutschland)-Pulver mit 40 ml 1 x Tris-Acetat-EDTA (TAE)-Puffer aufgekocht und in Flachbettformen mit der Größe 10 x 5 x 0,7 cm gegossen. In die Formen wurde vorher ein Kamm eingesetzt, um die Taschen im Gel für die Proben zu erhalten. Die Gele wurden in Elektrophorese-Kammern (BioRad, München, Deutschland) als Horizontalgele geladen. In den ersten zehn Minuten wurde eine geringe Spannung von 40 mA angelegt, die anschließend auf 80 mA für weitere 90 Minuten erhöht wurde. Als Laufpuffer wurde ebenfalls 1 x TAE-Puffer verwendet.
Die zu ladenden Proben wurden mit einem Ladepuffer versetzt. Dieser dient dem Beschweren der DNA und damit zum Erleichtern des Einfüllens in die Geltaschen, zum Abstoppen von Restriktionsreaktionen und als Kontrolle der Laufweite der Proben im Gel. Zwei Puffer, der Blau-Puffer und der 6x Orange Loading Dye Solution (Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) (im folgenden „Orange-Puffer“), wurden verwendet. Der Blau-Puffer (Farbstoff: Bromophenolblau) verhält sich im Gel wie ein 350 bp doppelsträngiges linearisiertes DNA-Molekül, während sich der Orange-Puffer in zwei Banden teilt. Die schnellere orangefarbige Bande (Farbstoff: Orange G) läuft
wie ein 50 bp Fragment, während die langsamere grüne Bande (Farbstoff: Xylen Cyanol FF) in Höhe eines 4000 bp Fragmentes läuft. Der Blau-Puffer wurde standardmäßig bei allen größeren Fragmenten eingesetzt, während der Orange-Puffer vor allem bei kleinen Fragmenten verwendet wurde.
Für die Größenbeurteilung von PCR-Produkten und Restriktionsfragmenten wurde die 1 kb DNA Leiter (Invitrogen, Leek, Niederlande) verwendet. Nur bei Fragmenten mit einer Größe unter 400 bp wurde der Marker GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder Plus (Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) verwendet.
Für die Darstellung der DNA in den Agarosegelen wurden die Gele im Anschluss an die Elektrophorese für 60 s in Ethidiumbromidlösung (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland) gefärbt. Ethidiumbromid lagert sich als interkalierende Substanz zwischen die Stränge der Doppelstrang-DNA ein (SENGBUSCH 1979).
Anschließend wurden die Gele für 10 min mit Wasser entfärbt. Unter UV-Beleuchtung (312 nm) auf einem UV-Tisch stellen sich die DNA-Banden als leuchtende Banden dar. Mit einer Kamera (Herolab E.A.S.Y. RH 429K, Herolab, Wiesloch) wurden die Ergebnisse fotographisch dokumentiert.
3.2.3.2. Präparation der Gesamtzell-DNA
Die Präparation der Gesamtzell-DNA erfolgte nach einem modifizierten Protokoll von JORDENS u. HALL (1988). Dafür werden Einzelkolonien über Nacht in 5 ml LB-Medium in Corexröhrchen bei 22 ± 2°C inkubiert. Ans chließend wurde die Bakteriensuspension für 10 min bei 6000 Umdrehungen pro Minute (rpm) zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Bakterienpellet einmal mit 1 ml Tris-EDTA-NaCl (TES)-Puffer resuspendiert, anschließend erneut zentrifugiert und dann mit 0,5 ml TES-Puffer erneut resuspendiert und in Eppendorf-Cups überführt.
Zu der Suspension wurden für die Lyse der Zellen 15 µl 15%iges Natrium-Dodecylsulfat (SDS) dazugegeben und für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend wurde das Lysat mit einer gleichvolumigen Menge Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) (Roth, Karlsruhe, Deutschland) geschüttelt und dann 10 Minuten bei 14000 rpm zentrifugiert. Dieser Vorgang wird noch zweimal wiederholt. Anschließend wird eine äquivalente Menge Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) zugegeben, per Hand geschüttelt und danach bei 10 Minuten bei 14000 rpm zentrifugiert. Bei jedem dieser Schritte kommt es zu einer Phasentrennung, in der jeweils die obere Phase die extrahierte DNA und die untere Phase die gefällten Proteine enthält. Für den jeweils folgenden Schritt wurde die obere Phase in ein neues Cup pipettiert. Im nächsten Schritt wurde eine äquivalente Menge Isopropanol zugegeben und die Gesamtzell-DNA unter vorsichtigem Schwenken präzipitiert. Um den Akohol zu entfernen, wurde die Probe bei 13000 rpm für 20 min zentrifugiert und der Überstand abpipettiert. Anschließend wurde das Pellet für 10 min im Exsikkator getrocknet und in 50 µl autoklaviertem Aqua bidest.
aufgenommen und bei 4 °C bis zur weiteren Verwendun g gelagert. Am nächsten Tag erfolgte eine Kontrolle der DNA mittels gelelektrophoretischer Auswertung.
3.2.3.3. Präparation der Plasmid-DNA
3.2.3.3.1. Minilysat-Methode
Für das Verfahren der Minilysat-Methode wurde ein modifiziertes Protokoll nach BIRNBOIM u. DOLY (1979) verwendet (KEHRENBERG 2002). Mit dieser Methode können Bakterien auf das Vorhandensein von Plasmiden überprüft werden. Dabei werden mit einer alkalischen Denaturierung und anschließender Renaturierung Plasmide von anderen Molekülen wie Proteinen, RNA und chromosomaler DNA getrennt.
Einzelkolonien wurden in 2 ml LB-Bouillon inkubiert. Die Bakteriensuspension wurde anschließend in Eppendorf-Cups überführt und für 10 min bei 7000 rpm zentrifugiert.
Das so erhaltene Bakterienpellet wurde mit 100 µl Puffer P1 mit RNAse resuspendiert. Anschließend wurden 200 µl Puffer P2 zugegeben, geschwenkt und
die Lösung für 10 min auf Eis gelagert. Nach Zugabe von 150 µl Minilysat-Lösung III wurde die Probe für weitere 5 min auf Eis gelagert. Dies bewirkt eine Renaturierung der Plasmide, während andere Makromoleküle im denaturierten Zustand verbleiben.
Im nächsten Schritt wurde die Probe erneut für 30 min bei 14000 rpm zentrifugiert und der Überstand mit den Plasmiden vorsichtig in ein neues, mit 1 ml kaltem absolutem Ethanol befülltes Cup überführt. Nach 1 h Fällungszeit bei Raumtemperatur wurde die Probe wiederholt unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert und der Überstand verworfen. Auf das Pellet wurden nun zum Waschen 500 µl 80 %iges Ethanol gegeben und die Probe bei 14000 rpm für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde sorgfältig mit Pipetten abgezogen und das erhaltene Pellet bei Raumtemperatur für 15 min im Exsikkator vakuumgetrocknet.
Anschließend wurde das Pellet in 30 µl Aqua bidest. aufgenommen. Die Minilysate wurden bei –20°C aufbewahrt.
3.2.2.3.2. Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Fällung
Die Phenol-Chloroform-Fällung ist eine schnelle und kostengünstige Methode, um Plasmide darzustellen. Sie wurde in dieser Arbeit vor allem für die Identifizierung von Insert-positiven Klonen nach Klonierungsreaktionen genutzt. Eine weitere Nutzung der erhaltenen Plasmide ist allerdings durch den hohen Phenol-Chloroform-Anteil in der Präparation nur in begrenztem Umfang möglich.
Von den Kulturen wurden 300 µl in ein Eppendorf-Cup pipettiert und mit 50 µl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) (Roth, Karlsruhe, Deutschland) gemischt. Anschließend wurden die Cups bei 14000 rpm für 3 min zentrifugiert und aus der oberen Phase 30 µl abpipettiert. Dieses Lysat wurde mit 6 µl Blau-Puffer auf ein 1%iges Gel geladen.
3.2.3.4. Restriktionsanalysen
Restriktionsendonukleasen sind Enzyme, die doppelsträngige DNA innerhalb der Phosphodiesterbindungen spalten können. Jedes Enzym besitzt eine eigene Erkennungssequenz innerhalb der Nukleotidabfolge, an der die DNA geschnitten wird. Die Restriktionsreaktionen wurden in dieser Arbeit als Kontrolle der erfolgreichen Klonierung und für die Überprüfung von PCR-Produkten verwendet. Es wurden Einzel- und Doppelverdaus, also Restriktionen mit einer oder mit zwei Endonukleasen, angewendet. Alle Reaktionsansätze wurden auf ein Endvolumen von 15 µl pipettiert (Tabelle 9). Es erfolgte ein Zusatz von bovinem Serum Albumin (BSA), falls im Puffer keines vorhanden war. Die Menge wurde der DNA-Konzentration entsprechend angepasst. Der Reaktionsansatz wurde vor Zugabe des Enzyms kurz abzentrifugiert und nach Enzymzugabe für 90 min auf einem Thermomixer (Eppendorf Thermomixer 5436, EPPENDORF, Hamburg) bei der enzymspezifischen optimalen Temperatur inkubiert. Die Reaktion wurde mit 4 µl Blau-Puffer oder 3 µl Orange-Puffer gestoppt und je nach Größe der geschnittenen DNA auf ein 1 – 2 %iges Gel geladen.
Tabelle 9: Pipettieransatz für einen Einzelverdau
Volumen Reagenz 1,0 - 11,5 µl DNA (ca. 1µg)
1,0 µl BSA
1,5 µl 10 x Reaktionspuffer 1,0 µl Enzym (5-10 U) ad 15,0 µl Aqua bidest.
3.2.3.5. Transformation
Durch Transformation können Plasmide in kompetente Bakterien eingebracht werden. In dieser Arbeit wurden Transformationsexperimente durchgeführt, um die rekombinanten Plasmide (siehe Pkt. 3.2.17.) in geeignete Empfängerstämme zu transferieren. Dadurch konnten die Resistenzeigenschaften der in den Genkassetten lokalisierten Gene auf ihre Funktionalität überprüft werden. Als Empfängerstamm wurden die E. coli-Stämme TOP10, XL-10-Gold Kan und AS19 verwendet. Die Empfängerstämme TOP10 und XL-10-Gold Kan wurden laut Herstellerangaben für die Transformation der Klonierungsreaktionen verwendet. Im Anschluss wurde AS19 dazu genutzt, alle rekombinanten Plasmide in den gleichen Empfänger zu bringen.
Zudem zeigt AS19 im Gegensatz zu den anderen beiden E. coli Stämmen Empfindlichkeit gegenüber allen in dieser Arbeit untersuchten Wirkstoffen.
Bei den Transformationsexperimenten wurden chemisch kompetente Zellen hergestellt und die CaCl2-Methode für die Kompetentmachung der Empfängerzellen verwendet. Der Empfängerstamm wurde in 2 ml LB-Bouillon über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Übernachtkultur wurde in 100 ml 37°C -warme LB-Bouillon überführt und bei 37°C bis zum Erreichen einer optischen Dich te von 0,2 – 0,3 bei einer Wellenlänge von 600 nm inkubiert. Die Bakterien befinden sich dann in der logarithmischen Phase. Nach 10 min auf Eis zum Abstoppen des Wachstums wurde die Suspension bei 7000 rpm für 10 min bei 4°C abze ntrifugiert. Das entstandene Pellet wurde erneut für 20 min auf Eis gelagert, anschließend mit 20 ml 0,1 molarer CaCl2-Lösung vorsichtig resuspendiert und für 7 min bei 7000 rpm bei 4°C zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde in 500 µl CaCl2 resuspendiert und in ein Eppendorf-Cup überführt. Das Cup wurden für eine weitere Stunde auf Eis gekühlt.
Die so erhaltenen kompetenten Zellen wurden in Reaktionsansätze von je 100 µl Zellsuspension in Eppendorf-Cups pipettiert. Dazu wurde 2 µl zu transformierende Minilysat-DNA gegeben. Die Zellen wurden für 15 min auf Eis gekühlt. Im Anschluss wurden sie zweimal für 5 min bei 37°C inkubiert und dazwischen für 15 min auf Eis gekühlt. Sedimentierte Zellen wurden zwischen den Schritten durch vorsichtiges
Schnippen der Cups wieder gemischt. Anschließend wurde in jedes Cup 700 µl 37°C-warme LB-Bouillon zugegeben und die Cups bei 3 7°C für eine Stunde inkubiert. Von der erhaltenen Zellsuspension wurden je 100 µl auf aufgewärmte selektive LB-Agarplatten ausgespatelt und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Die erhaltenen Kolonien wurden mit der Minilysat-Methode auf die Aufnahme der DNA überprüft und für weitere Untersuchungen auf selektiven Platten und in Glycerinkultur bei -80°C gesichert.
3.2.3.6. Sequenzanalysen
Die Sequenzierung der DNA erfolgte durch die Firma Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Deutschland). Es wurde 1 µg getrockneter Minilysat-DNA für die Sequenzierung eingesandt.
Die Konzentration und die Reinheit der DNA wurde mit dem Pharmacia Gene Quant II RNA/DNA-Calculator (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) bestimmt. Dafür wurde die DNA-Probe im Verhältnis 1:50 verdünnt. Anschließend wurde 1 µg DNA als luftgetrocknetes Pellet zum Sequenzieren verschickt. Zunächst wurden mittels der Standardprimer die äußeren 500-1000 bp des klonierten PCR-Produktes sequenziert. Bei PCR-Produkten über 1000 bp wurden die mittleren Sequenzen über Primerwalking auf beiden Strängen ermittelt. Die erhaltenen Sequenzen wurden mit der DNAMAN Software (Lynnon Corporation, Quebec, Kanada) bearbeitet.
Datenbankabfragen erfolgten mit BLAST® (ALTSCHUL et al. 1997) und ORF-Finder® über die Internetseiten des NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ und http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ORF/).
3.2.3.7. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die PCR wird verwendet, um bestimmte DNA-Abschnitte In-vitro zu vervielfältigen.
Vorraussetzung dafür ist, dass von den zu vervielfältigenden Abschnitten die Gensequenzen bekannt sind und diese Sequenzen zur Primersynthese genutzt werden können (SAIKI et al., 1985). Die Reaktion erfolgte in PCR-Cyclern (Trio-Thermoblock TM, Biometra, Deutschland). Initial erfolgt bei der PCR durch kurzes Erhitzen eine Denaturierung der DNA-Doppelhelix, die für die folgenden Schritte als Einzelstrang vorliegt. In der nächsten Phase, der Annealing-Phase, lagern sich die Primer an die komplementären Sequenzen der DNA an. In der anschließenden Synthesephase (Extensionsphase) werden durch eine hitzestabile Polymerase die komplementären Stränge synthetisiert. In jedem Zyklus werden die DNA-Kopien verdoppelt und dienen im nächsten Zyklus ebenfalls als Vorlage, so dass es zu einer exponentiellen Zunahme des PCR-Produktes kommt.
Als DNA-Vorlage wurde chromosomale DNA und Plasmid-DNA von Minilysaten verwendet. Zur Kontrolle der PCR wurden jeweils eine Positiv- und eine Negativkontrolle in jedem Versuchsansatz mitgeführt. Die Positivkontrolle enthielt DNA eines Isolates, welches über den gesuchten Genabschnitt verfügt, während die Negativkontrolle statt DNA Aqua bidest. enthielt. Die Reaktionsansätze wurden nach einem Standardschema (eine Ausnahme bildet der Ansatz für das Resistenzgen aac(3´)-IV – siehe Pkt. 3.2.3.7.2. - und die PCR für tet(A) - tet(E) – siehe Pkt.
3.2.3.7.4.) pipettiert. Das Endvolumen des Ansatzes betrug jeweils 50 µl. Dieser Standardansatz wurde nach dem Schema in Tabelle 10 pipettiert.
Tabelle 10: Pipettieransatz für eine Standard-PCR
Volumen Reagenz 1,0 µl DNA
1,0 µl Primer forward (20 pmol/µl) 1,0 µl Primer reverse (20 pmol/µl)
3,0 µl dNTP-Mix (2 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
5,0 µl Puffer für Polymerase (10 x konzentriert für Taq-Polymerase) 0,5 µl DNA-Polymerase (Taq – 4 U/µl)
ad 50,0 µl Aqua bidest.
Die proof-reading Pfu-Polymerase wurde eingesetzt, um blunt-end-PCR-Produkte zu erhalten, die anschließend für Klonierungsreaktionen genutzt wurden. Hier wurde vom Hersteller ein 5-fach Puffer mitgeliefert und das Pipettierschema wurde dementsprechend angepasst. Die Konzentration der eingesetzten 0,5 µl Pfu-Polymerase betrug 2,5 U/µl. Die Sequenzen der Primer für die verwendeten PCR´s sind in den Tabellen 4 bis 7 aufgeführt.
3.2.3.7.1. Sequenzierung von PCR-Produkten
PCR-Produkte wurden auf ein Gel geladen, mittels eines Kits von Qiagen aus dem Gel extrahiert und an Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Deutschland) zum Sequenzieren geschickt. Für die Gelextrakion wurde das QIAquick-Kit® (Qiagen, Hilden, Deutschland) genutzt. Dafür wurden drei Ansätze der PCR und somit 150 µl PCR-Produkt je Probe in einem verbreiterten Slot gemeinsam auf ein 1 %iges Gel geladen. Unter UV-Licht wurde die spezifische Bande mit einem Skalpell ausgeschnitten und in ein Eppendorf-Cup überführt. Anschließend wurden je 100 mg Probe 300 µl Puffer QG dazugegeben und die Proben für 10 min bei 50°C inkubiert.
Im nächsten Schritt wurden je 100 mg Probengel 100 µl Isopropanol hinzugefügt und gemischt. Die Suspensionen wurden auf QIAqick-Säulen pipettiert, welche auf ein Auffanggefäß gesetzt wurden. Nach einer einminütigen Inkubationszeit bei Raumtemperatur wurden die Säulen für 1 min bei 14000 rpm abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Auf die Säulen wurden anschließend 500 µl Puffer QG pipettiert und erneut zentrifugiert. Mit 750 µl Puffer PE wurden die Säulen in einem neuen Zentrifugationsschritt gewaschen und anschließend für fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Säulen wurden auf ein neues Auffanggefäß gesetzt und die DNA mit 25 µl Aqua bidest. nach 1,5 minütiger Inkubation in einem wiederholten Zentrifugationsschritt eluiert.
Anschließend wurden die Konzentration und die Reinheit der DNA mit dem Pharmacia Gene Quant II RNA/DNA-Calculator (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) bestimmt. Dafür wird die DNA-Probe im Verhältnis 1:50 verdünnt. Abhängig von der Größe des PCR-Produktes wurden anschließend 20 ng Probe je 100 bp PCR-Produkt als luftgetrocknetes Pellet an Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Deutschland) gesendet. Die Sequenzen wurden wie im Kapitel 3.2.
beschrieben mit Hilfe der Datenbanken analysiert.
3.2.3.7.2. Monoplex-PCR zur Detektion des Resistenzgenes aac(3´)-IV
Zum Nachweis des Resistenzgenes aac(3´)-IV wurde ein abweichender Reaktionsansatz nach ROCKSIN (2005) gewählt. Der Ansatz ist unten dargestellt (Tabelle 10). Das Endvolumen beträgt hier 20 µl. Die spezifischen Primer sind in Tabelle 11 angegeben. Das für diese PCR verwendete Programm umfasst einen initialen Denaturierungsschritt für 2 min bei 94 °C . Anschließend erfolgen 30 Zyklen mit einer Denaturierung für 1 min bei 94 °C, einem Annealing für 1 min bei 55 °C und einer Extensionsphase für 1 min bei 72 °C. Abschlie ßend erfolgt eine Inkubation des Ansatzes für 7 min bei 72°C.
Tabelle 11: Pipettieransatz für die aac(3´)-IV-PCR
Volumen Reagenz 1,2 µl DANN
2,5 µl Primer forward (20 pmol/µl) 2,5 µl Primer reverse (20 pmol/µl)
1,2 µl dNTP-Mix (2 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 2,0 µl Puffer für Polymerase (10 x konzentriert) 0,2 µl DNA-Polymerase (Taq – 4 U/µl)
ad 20,0 µl Aqua bidest.
3.2.3.7.3. Monoplex-PCR zur Detektion weiterer Resistenzgene
Die PCR-Bedingungen für die jeweiligen Resistenzgene sind in den folgenden Tabellen beschrieben. Die dazugehörigen Primer sind in Tabelle 6 dargestellt.
Tabelle 12: PCR-Bedingungen für den Nachweis des Resistenzgenes floR
Zeit Temperatur Zyklen
1 min 94°C 1
1 min 94°C
30
1 min 55°C
1 min 72°C
7 min 72°C 1
Tabelle 13: PCR-Bedingungen für den Nachweis der Resistenzgene oqxAB
Zeit Temperatur Zyklen
2 min 94°C 1
1 min 94°C
30
1 min 45°C
1,5 min 72°C
7 min 72°C 1
Tabelle 14: PCR-Bedingungen für den Nachweis des Resistenzgenes catA1
Zeit Temperatur Zyklen
2 min 94°C
1
1 min 55°C
3 min 72°C
0,5 min 94°C
30 0,5 min 50°C
0,5 min 72°C
10 min 72°C 1
Tabelle 15: PCR-Bedingungen für den Nachweis des Resistenzgenes catA2
Zeit Temperatur Zyklen
1 min 94°C 1
0,5 min 94°C
30 0,5 min 61°C
0,5 min 72°C
7 min 72°C 1
Tabelle 16: PCR-Bedingungen für den Nachweis des Resistenzgenes catA3
Zeit Temperatur Zyklen
1 min 94°C 1
1 min 94°C
35
2 min 56°C
3 min 72°C
7 min 72°C 1
Tabelle 17: PCR-Bedingungen für den Nachweis der Resistenzgene cmlA/cmlB
Zeit Temperatur Zyklen
2 min 94°C 1
1 min 94°C
30
1 min 60°C
2 min 72°C
5 min 72°C 1
Tabelle 18: PCR-Bedingungen für den Nachweis des Resistenzgenes sul1
Zeit Temperatur Zyklen
2 min 94°C 1
1 min 94°C
35
2 min 64°C
3 min 72°C
7 min 72°C 1
Tabelle 19: PCR-Bedingungen für den Nachweis der Resistenzgene dfrA1, dfrA15, dfrA16
Zeit Temperatur Zyklen
1 min 94°C 1
0,5 min 94°C
30 0,5 min 50°C
0,5 min 72°C
7 min 72°C 1
Dieser letztere PCR-Assay dient zum Nachweis der eng verwandten Trimethoprim-Resistenzgene dfrA1, dfrA15 und dfrA16. Positive PCR-Produkte wurden mit dem Restriktionsenzym ClaI (Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) verdaut. Anhand der geschnittenen Fragmente konnte das tatsächlich vorhandene Resistenzgen bestimmt werden. Bei einem Verdau erhält man für dfrA1-positive Isolate zwei Fragmente mit den Größen von 151 bp und 264 bp. Die dfrA15-positiven Isolate zeigen drei Fragmente der Größen 82 bp, 151 bp und 183 bp. Das PCR-Produkt von dfrA16 enthält keine Schnittstellen für ClaI und liegt daher ungeschnitten in der Größe von 414 bp vor.
Tabelle 20: PCR-Bedingungen für den Nachweis des Resistenzgenes aadA2
Zeit Temperatur Zyklen
5 min 94°C 1
1 min 94°C
30
1 min 56°C
1,5 min 72°C
Tabelle 21: PCR-Bedingungen für den Nachweis des Resistenzgenes tet(Y)
Zeit Temperatur Zyklen
2 min 94°C 1
1 min 94°C
35
2 min 50°C
3 min 72°C
7 min 72°C 1
3.2.3.7.4. Multiplex-PCR für den Nachweis der Resistenzgene tet(A) bis tet(E)
Die PCR für den Nachweis der Resistenzgene tet(A), tet(B), tet(C), tet(D) und tet(E) wurde wie in der Arbeit von NAWAZ et al. (2006) als Multiplex-PCR angesetzt. Der Reaktionsansatz beträgt 50 µl (Tabelle 22). Die Primer sind in Tabelle 7 und die Reaktionsbedingungen in Tabelle 23 dargestellt.
Tabelle 22: Pipettieransatz für den Nachweis der Resistenzgene tet(A – E)
Volumen Reagenz 3 µl DNA
je 0,5 µl Primer forward (20 pmol/µl) – tet(A) bis tet(E) je 0,5 µl Primer reverse (20 pmol/µl) – tet(A) bis tet(E) 5 µl dNTP-Mix (2 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 5,0 µl Puffer für Polymerase (10 x konzentriert) 1,0 µl DNA-Polymerase (Taq – 4 U/µl)
ad 50,0 µl Aqua bidest.
Tabelle 23: PCR-Bedingungen für den Nachweis der Resistenzgene tet(A – E)
Zeit Temperatur Zyklen
2 min 94°C 1
20 sek 94°C
30 10 sek 53°C
45 sek 65°C
4 min 65°C 1
3.2.3.7.5. Nachweis von Klasse 1-Integrons
Klasse 1-Integrons verfügen über ein 5´- und ein 3´-konserviertes Segment, mit einem dazwischen liegenden variablen Teil. Für ein erstes Screening wurde eine PCR für das sul1-Gen durchgeführt, welches sich im 3´-konservierten Segment be-findet. Die Anleitung für die PCR ist im Kapitel 3.2.3.7. zu finden. Bei sul1-positiven Isolaten wurde eine 5´-3´CS-PCR und eine PCR für die Klasse 1-Integrase (intI1) durchgeführt. Die Primer sind in Tabelle 5 dargestellt und die Reaktionsabläufe in Ta-belle 24 und 25 aufgeführt. Anhand der 5´/3´CS-PCR-Produkte kann auf die Größe und Anzahl der im variablen Teil enthaltenen Genkassetten geschlussfolgert werden.
Tabelle 24: PCR-Bedingungen für die Klasse 1-Integrase (intI1)
Zeit Temperatur Zyklen
7 min 72°C 1
1 min 94°C
35
2 min 55°C
1 min 72°C
7 min 72°C 1
Tabelle 25: PCR-Bedingungen für die Amplifizierung der variablen Region von Klasse 1-Integrons (5‘/3‘CS-PCR)
Zeit Temperatur Zyklen
7 min 72°C 1
1 min 94°C
35
2 min 56°C
3 min 72°C
7 min 72°C 1
3.2.3.8. Klonierung von Klasse 1-Integrons
In dieser Arbeit wurden zwei unterschiedliche Klonierungs-Kits gemäß den Anweisungen der Hersteller genutzt. Vorrangig kam das Zero Blunt® PCR Cloning Kit (INVITROGEN, Karlsruhe, Deutschland) zum Einsatz. Bei 5´-3´CS-Produkten über einer Größe von 2500 bp wurde auf das PCR-Script® Amp Cloning Kit (STRATAGENE, Heidelberg, Deutschland) zurückgegriffen. Als Empfängerzellen wurden die Stämme E. coli TOP10 oder E. coli XL-10-Gold Kan verwendet.
3.2.3.8.1. Klonierung mit dem Zero Blunt® PCR Cloning Kit
Für dieses Kit werden blunt-end PCR-Fragmente benötigt. Für die PCR-Reaktion wurde die Pfu-Polymerase und der entsprechende 5 x Puffer verwendet. Das
Für dieses Kit werden blunt-end PCR-Fragmente benötigt. Für die PCR-Reaktion wurde die Pfu-Polymerase und der entsprechende 5 x Puffer verwendet. Das