D
ie histo- und zytopathologi- sche Untersuchung von Zell- und Gewebsproben stellt nach wie vor die unersetzliche Basis für die Mehrzahl medizinischer Diagnosen dar.Unter Anwendung konventio- neller Verfahren ist allerdings in zahl- reichen Fällen eine eindeutige Festle- gung nicht möglich. Um eine höhere diagnostische Präzision zu erreichen, können die neuen Techniken der Mo- lekularpathologie eingesetzt werden, die dem Kliniker präzisere Aussa- gen für sein therapeutisches Handeln liefern.
Dabei ist die Molekularpatholo- gie als Teilgebiet der Pathologie zu definieren, das unter Anwendung der Nukleinsäurenanalytik zur „geno- typischen Diagnostik“ von Erkran- kungen beiträgt. Dies gilt für drei Bereiche:
! die Onkologie zur Bestim- mung der Dignität, Prognose und mit Einschränkungen des therapeuti- schen Ansprechens,
! die Infektiologie zum Er- regernachweis und
! die Gewebsidentifikation (speziell in der Rechtsmedizin, selten in der Pathologie).
Da die Untersuchungen größten- teils an formalinfixiertem, in Paraffin eingebettetem Material durchgeführt werden können, eröffnet sich ein brei- tes Spektrum neuer Aufgaben.
Im folgenden Beitrag wird eine Übersicht über Methoden und An- wendungsgebiete der molekularen Pathologie gegeben, um dem anfor- dernden Arzt – Kliniker und Nieder- gelassenen im gleichen Maß – Infor-
mationen über Möglichkeiten und Li- mitationen der aktuellen Entwick- lung aufzuzeigen.
Das Methodenspektrum
Zur Basismethode hat sich die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit ihren zahlreichen Variationen entwickelt, wie beispielsweise kompe- titive, geschachtelte, multiplex oder differentielle PCR. Die PCR erlaubt eine exponentielle Vervielfältigung von DNA und RNA und kann an Ge- webshomogenaten, Zellsuspensionen und Einzelzellen oder an mittels Mi- krodissektion gewonnenen Zellker- nen durchgeführt werden. Das PCR- Produkt wird je nach Fragestellung mit verschiedenen Methoden analy- siert, zum Beispiel Restriktionsendo- nukleaseverdau, denaturierende oder temperaturabhängige Gradienten- Gelelektrophorese, Southern Blot, Dot-Blot, direktes Sequenzieren, Einzelstrang-Konformations-Poly- morphismus oder Restriktions-Frag- ment-Längen-Polymorphismus (3, 8, 14, 3, 30, 31). Als Erleichterung bei der praktischen Anwendung hat sich die Möglichkeit der nicht-radioakti- ven Markierung der DNA-/RNA- Sonden, beispielsweise mit Digoxige- nin oder Biotin, erwiesen (23).
Mit der Vielfarben-Fluoreszenz- in-situ-Hybridisierung (FISH) kön- nen ganze Genome und einzelne Ge- nomabschnitte sichtbar gemacht wer-
den (5). Dadurch gelingt es, moleku- largenetische Analysen an Metapha- sechromosomen und Interphasen- Zellkernen von konventionell aufge- arbeitetem Zell- und Gewebsmaterial durchzuführen. Die Hybridisierung mit spezifischen Sonden erlaubt dabei die Detektion bekannter Läsionen.
Die neue Methode der komparativen genomischen Hybridisierung (CGH) wird hingegen insbesondere als gene- tisches Screening auf unbekannte chromosomale Umlagerungen in soli- den Tumoren eingesetzt. Das gegen- wärtig noch begrenzte Auflösungs- vermögen dieses Verfahrens wird zukünftig durch die Anwendung der konfokalen Lasermikroskopie weiter verbessert werden (15).
Von großer Wichtigkeit bei der Durchführung molekularer Verfah- ren sind die exakten Einzelfallkon- trollen und Ringversuche zwischen verschiedenen Laboratorien. Außer- dem muß darauf hingewiesen werden, daß Formalinfixierung und Paraffin- einbettung zu Einschränkungen der Empfindlichkeit oben genannter Me- thoden führen können – ein Problem, das durch weiter verbesserte Techni- ken voraussichtlich an Bedeutung verlieren wird.
Notwendigkeit
molekularpathologischer Untersuchungen
Um Mißverständnissen vorzu- beugen, sei klargestellt, daß am Be- ginn aller zyto- und histologischen Untersuchungen die konventionelle Aufarbeitung steht und der Aus-
Diagnostische
Molekularpathologie
Manfred Dietel
Die klinische Pathologie hat in den vergangenen Jahren zahlreiche Methoden der Molekularbiologie an die wissen- schaftlichen und diagnostischen Fragestellungen des Fach- gebietes adaptiert. Nach der Einführung der Immunhistolo- gie vor etwa 20 Jahren, die zur Immunphänotypisierung der Gewebsveränderungen führte und heute als Standard anzusehen ist, stellt die Molekularpathologie einen weite-
ren „Quantensprung“ in der Entwicklung der pathologi- schen Diagnostik dar. Hieraus resultiert die Möglichkeit, tu- moröse, infektiologische, hereditäre und andere Erkran- kungen genotypisch zu charakterisieren und das damit er- heblich erweiterte Befundspektrum in die funktionelle Dia- gnostik einzubringen. Möglichkeiten und Grenzen dieser Techniken in der täglichen Diagnostik werden dargestellt.
Institut für Pathologie der Charité (Direktor:
Prof. Dr. med. Manfred Dietel), Humboldt- Universität zu Berlin
gangspunkt der diagnostischen Tätig- keit in der Pathologie, auch in der Molekularpathologie, die formalinfi- xierte, paraffineingebettete und in seltenen Fällen die tiefgefrorene Ge- websprobe ist. Erst nach deren Beur- teilung sollte vom Pathologen ent- schieden werden, welche molekula- ren Zusatzuntersuchungen sinnvoll sind (21). Zur besseren Übersichtlich- keit werden die Indikationen an Hand der wichtigsten Anwendungsgebiete dargestellt.
Onkologie
Aufgrund der therapeutischen Konsequenzen muß die Diagnose ei- nes Malignoms mit besonders hoher Verläßlichkeit gestellt werden. Auch die sich in der Onkologie immer mehr durchsetzenden individualisierten Therapiestrategien erfordern ein Höchstmaß an präzisen Aussagen über Histogenese, Prognose und, wenn möglich, über das Ansprechen auf die geplante Therapie. Ferner ist die Früherkennung kleiner Tumoren, erster Metastasen oder eines minima- len Resttumors ein akzeptiertes Ziel, das zur Verbesserung der Therapie und deren Wirksamkeit beitragen soll. Um diesen Anforderungen so gut wie irgend möglich gerecht zu wer- den, können die Detektion von On- kogenen, Tumorsuppressorgenen und die Bestimmung von tumorspezifi- schen Mutationen ein wertvoller Zu- satz bei der Diagnose, Klassifikation, Prognoseabschätzung und Verlaufs- kontrolle von Malignomen sein (24).
Hämatologische Tumoren
Bei Verdacht auf ein malignes Non-Hodgkin-Lymphom (NHL) ist die Aufarbeitung der Lymphknoten- biopsie mit molekularen Methoden dann hilfreich, wenn reaktive Verän- derungen, beispielsweise bei Virusin- fektionen, nicht sicher von einem ma- lignen NHL abgegrenzt werden kön- nen (Grafik 1). Der PCR-gestützte Nachweis monoklonaler Zellpopula- tionen sowie deren Linienzugehörig- keit (B- oder T-Zellen) ist hierbei dia- gnoserelevant (11, 25). Als molekula- re Marker dienen klonspezifische Umlagerungen von Gensegmenten
(V-, D-, J-) der Immunglobuline (Ig) bei B-Zellymphomen beziehungs- weise der T-Zellrezeptor-Gene bei T- Zellymphomen. Die Umlagerung der Gensegmente ist die spezifische Visi- tenkarte des Zellklons, die auch bei einer neoplastischen Entartung erhal- ten bleibt.
Einige Beispiele: Die chronische myeloische Leukämie (CML) läßt sich über die PCR-gesteuerte Detek- tion der BCR/ABL-Translokation mit Überexpression des Fusionsproteins p210 (Tyrosinkinase) sicher beweisen.
Bei Infiltration von extranodalem Gewebe (zum Beispiel Magenmuko- sa, Haut) mit suspekten lymphoiden Zellen und dem Verdacht auf ein MALT-Lymphom oder ein kutanes T- Zellymphom kann der Nachweis der Klonalität und Linienspezifität den Verdacht auf eine Neoplasie häufig schon in einem frühen Stadium unter- mauern (Tabelle 1). Allerdings bedeu- tet Monoklonalität nicht immer Mali- gnität.
Epitheliale Tumoren
Spezifische, eine Tumorentität charakterisierende Mutationen sind in Karzinomen im Vergleich zu den hämatopoetischen Tumoren seltener.
Epitheliale Tumoren sind hingegen insbesondere durch das Auftreten
von Deletionen charakterisiert. Die damit assoziierte Inaktivierung eines oder mehrerer Tumorsuppressor-Ge- ne ist vermutlich der entscheidende Mechanismus sowohl in der Ätiologie als auch der Tumorprogression (28).
Da einzelne Mutationen jedoch in un- terschiedlicher Häufigkeit auftreten, kommt deren Nachweis durchaus eine diagnosti- sche Bedeutung zu.
So kann die Diagnose eines Pankreaskarzinoms an einem Feinnadelaspirat äußerst schwierig sein.
Wird eine Mutation im K- ras-Gen (codon 12) gefun- den, so liegt bei allen Pati- enten ein Karzinom vor (12). Auch in bronchoal- veolären Lavagen ist die Detektion dieser Mutation fast beweisend für ein Bronchialkarzinom (17).
Hier ist die hohe Sensiti- vität der Methode beson- ders nützlich, da der Nach- weis aus nur wenigen Tu- morzellen zwischen vielen normalen Zellen erfolgen muß. Die Detektion von Mutationen in Stuhl, Urin- sediment und Sputum wird auch in der Früherkennung bezie- hungsweise Rezidivdiagnostik einge- setzt (33). Im Falle der Urindiagno- stik wurde sogar gezeigt, daß die mo- lekulargenetische Diagnostik der zy- tologischen überlegen ist (34, 18).
Analoge Untersuchungen laufen für Kolon-, Ovarial- und Mammakarzi- nome.
Zur Erkennung von erblichen Krebserkrankungen ist der Nachweis der verantwortlichen Mutation in dem betreffenden Gen von zentraler Bedeutung (die ethische Problema- tik derartiger Untersuchungen soll hier nicht diskutiert werden). So wird bei Verdacht auf die familiäre Form des Brust- oder Eierstockkarzinoms das BRCA-1- oder BRCA-2-Gen auf bestimmte Keimbahnmutatio- nen untersucht (Grafik 2). Dieser Nachweis gelingt heute mit den ge- nannten Methoden aus Blutproben oder winzigen Gewebsproben von po- tentiellen Mutationsträgerinnen. Zur Sicherung der Familienanamnese kann noch nach Jahrzehnten an Par- Grafik 1
Ig-Schwerketten-Rearrangementanalyse einer Lymphknotenbiopsie (LK) mittels PCR. Die scharfen Doppelbanden (Spur 3 und 4) erlauben den hochgradigen Verdacht auf Monoklonalität, das heißt ein malig- nes B-Zell-Lymphom, da alle Zellen das gleiche Immunglobulin-Rear- rangement aufweisen. In reaktiven LK (Spur 2 und 6) hingegen ist aufgrund der verschiedenen V- und N-Segmente ein breites Banden- spektrum als Zeichen polyklonaler B-Zellpopulationen vorhanden.
Ethidiumbromid-gefärbtes, UV-angeregtes Polyacrylamidgel, Spur 1 und 5: Kontroll-PCR von zwei bekannten NHL.
Tabelle 1
Anwendungen der Molekularpathologie in der Tumordiagnostik*)
Verdacht auf Genloci Þchromo- Funktion
somale Lokalisation
HÄMATOLOGISCHE TUMOREN
malignes Non-Hodgkin- Immunglobulin-Schwer- Ig-Rearrangement →Monoklonalität von
Lymphom, B-Typ ketten-Gen Þ14q B-Zellen
malignes Non-Hodgkin- T-Zellrezeptor-Gene Þ TCR-Rearrangement →Monoklonalität von
Lymphom, T-Typ diverse T-Zellen
Burkitt-Lymphom IGHV/MYC Þ6 (8; 14) Ýdes c-myc Onkoproteins
chronisch myeloische BCR/ABL Þt (9; 22) Ýdes Fusionsproteins p210 (Tyrosinkinase) Leukämie
follikuläres Lymphom IGHV/BCL2 Þt (14; 18) Ýdes bcl-2-Proteins in neoplastischen Keimzentren
anaplastisches großzelliges ALK/NPM Þ t (2; 5) Ýeines Fusionsproteins (Kinase) Lymphom (ALCL)
Mantelzonenlymphom, IGHV/CCND1 Þ Ýeines D-Cyclin
selten CLL t (11; 14)
akute lymphatische IGHV/MYC Þt (8; 14), Rearrangement des T-Zellrezeptors a Leukämie, T-Typ
SOLIDE TUMOREN
Ewing-Sarkom FLI/EWS Þt (11; 22) RNA/DNA-Bindungsfusionsprotein
alveoläres Rhabdomyo- PAX 3/FKHR Þt (2; 13) veränderte Zellzyklusproteine
sarkom PAX 7/FKHRÞt (1; 13)
myxoides Liposarkom TLS/CHOP Þt (12; 16) mutiertes DNA-Bindungsfusionsprotein Synovialissarkom SSXT/SSX1/2 Þt (X; 18) Fusionsprotein
Retinoblastom RB1 Þdel 13q14 Genverlust →mutiertes Zellzyklusprotein
multiple endokrine RET Þ10q11.2 veränderte Tyrosinkinase
Neoplasie 2 (MEN2)
Kolonkarzinom (CC) DCC Þdel 18q21 Genverlust →Zelladhäsionsproteindefekt familiäre adenomatöse Polyposis APC Þdel 5q21 Genverlust →veränderte Signalvermittlung hereditäre Nicht-Polyposis MLH1 Þ3p13 Mutationen in DNA-Reparaturproteinen
(HNPCC) MSH2 Þ2p12 Mutationen in DNA-Reparaturproteinen
PMS1 Þ2q Mutationen in DNA-Reparaturproteinen PMS2 Þ7p Mutationen in DNA-Reparaturproteinen familiäres Mamma- und BRCA1 Þdel 17q21 Genverlust / mutiertes Genprodukt Ovarialkarzinom BRCA2 Þdel 13q14 Genverlust / mutiertes Genprodukt zahlreiche solide Tumoren TP53 Þdel 17p13 p53-Mutation →Verlust der Wachstums-
(Li-Fraumeni-Syndrom kontrolle
zahlreiche solide und MDR1 Þ7q31 ÝP-Glycoprotein mit Freisetzung von
hämatologische Tumoren Zytostatika →Multidrug-Resistenz
*) Untersuchungen sind an formalinfixiertem, paraffineingebetteten Gewebe möglich.
Þ lokalisiert
Ý vermehrte Expression
→ zeigt an
affinmaterial, beispielsweise von früher entnommenen Tumoren von Familienangehörigen, der Mutations- nachweis erfolgen. Dies kann zur Dif- ferenzierung zwischen der familiären und sporadischen Form beitragen. Da eine große Anzahl verschiedener Mu- tationen in Betracht kommt und zunächst die Keimbahnmutation identifiziert werden muß, ist die gene- tische Untersuchung außerordentlich aufwendig. Somit wird diese Diagno- stik voraussichtlich auch in Zukunft Hauptdomäne der Humangenetik bleiben. Eine vergleichbare Situation liegt bei Patienten mit hereditärem kolorektalem Karzinomsyndrom und Formen der multiplen endokrinen Neoplasie (MEN2) vor (Tabelle 1).
Bei Karzinomen konnte gezeigt werden, daß die Akkumulation gene- tischer Alterationen in vielen Fällen mit der Aggressivität der Tumoren korreliert (Grafik 3). So wurden in Kolonkarzinomen relativ häufig Ver- änderungen der Chromosomenab- schnitte 5q, 17p und 18p detektiert, in Lungentumoren auf Chromosomen- abschnitten 3p, 13q und 17p (26). We- niger das Vorhandensein einer einzel- nen Läsion als vielmehr der multipli-
kative Effekt mehrerer Mutationen bestimmt die Prognose. Die Korrela- tion eines einzelnen genetischen Mar- kers, zum Beispiel einer Mutation im p53-Tumorsuppressor-Gen, mit der Prognose hat zu widersprüchlichen
Aussagen geführt. Sie kann möglicherweise im Einzelfall hilfreich sein (16). Der Nachweis meh- rerer Aberrationen als Ausdruck einer geneti- schen Instabilität ist ver- mutlich besser geeignet, die Malignität eines Tu- mors abzuschätzen. Gene- tische Screening-Metho- den wie die CGH (Grafik 4) könnten zukünftig eine große Bedeutung bei der Tumorgradierung bekom- men. Eine genetische Tu- morklassifizierung als Er- gänzung der histologi- schen Bestimmung wäre für viele morphologisch nur schwer einschätzba- ren Tumorentitäten wün- schenswert.
Zukünftig werden bei Grenzfalltumoren die molekularen Zusatzunter- suchungen eine wichtige Rolle bei der Frage spie- len, ob bereits eine meta- stasierungsfähige Läsion vorliegt. So konnte für Borderline-Tumoren des Ovars gezeigt werden, daß ein He- terozygotie-Verlust auf Chromoso- menabschnitt 17p ein seltenes Ereig- nis ist, während es bei Ovarialkarzi- nomen in mehr als 60 Prozent auf- tritt (22). Bei Patientinnen kann der Nachweis einer X-Chromo- som-Inaktivierung in einer Läsion einen Hinweis auf Klonalität ge- ben, beispielsweise bei der Ab- grenzung einer atypischen Endo- metrium-Hyperplasie von einem hochdifferenzierten Karzinom.
Mesenchymale und neurogene Tumoren
Liegt in dieser Tumorgruppe eine sogenannte klein- und rund- zellige Läsion vor, so ist die „rein“
morphologische Abgrenzung zwi- schen dem Ewing-Sarkom (ES), einem primitiven neuroektoder- malen Tumor (PNET) oder einem anderen undifferenzierten Tumor in vielen Fällen schwierig (13, 19).
Diese Frage spielt besonders in der Kinderonkologie eine Rolle.
Der Nachweis einer Translokati- Grafik 2
Keimbahnmutation im BRCA1-Gen (Exon 12, del4282AG) bei familiärem Mammakarzinom. Im oberen Segment Wildtyp-Se- quenz einer Normalperson mit sauberer Detektion der Basen, im unteren Segment Heterozygotie für Mutation bei einer Patien- tin mit überlappenden Sequenzen ab Position 107 (vgl. N-Markierung).
Grafik 3
solider Anteil (G 3) tubulärer Anteil (G 2)
Allelverlust (LOH) in Tumorareal A
Die Anzahl genetischer Verluste korreliert häufig mit der Differenzierung von malignen Tumoren; hier am Beispiel ei- nes serösen Ovarialkarzinoms verdeutlicht. Links: niedrig differenzierter G3-Tumorbereich mit loss of heterozygosity (LOH) auf Chromosom 17 (Pfeil), rechts: höher differenzier- ter G2-Tumoranteil ohne LOH.
on (11;22) ist dann beweisend für ein ES (9). In der Differentialdiagnose zu einem alveolären Rhabdomyosar- kom, das eine Translokation (2;13) aufweist, kann die Genanalyse eine klare Entscheidung herbeiführen (10). Auch für Liposarkome, Retino- blastome und weitere Sarkome sind charakteristische, nicht jedoch spezi- fische Genveränderungen beschrie- ben. Bei zahlreichen Weichteiltumo-
ren sind aufgrund der therapeuti- schen Konsequenzen die genannten Zusatzuntersuchungen heute als dia- gnostischer Standard zu fordern (37).
Metastasensuche und minimale Resttumoren
Liegen bei einer hämotologi- schen Neoplasie definierte geneti- sche Veränderungen vor, so können diese auch bei geringsten Tumorzell- zahlen (105bis 106) als minimale Re- sidualerkrankung nachgewiesen wer- den. Dabei dienen zum Beispiel die Translokationen BCR/ABL bei CML, PML/RAR-a/MYL bei der Promyelozytenleukämie und IG- HV/BCL2 bei follikulären Lympho- men als spezifische Marker (4, 20).
Bei Malignomen ist die Bestimmung
des Ausmaßes der Metastasierung oder die Suche nach wenigen Resttu- morzellen nach einer Chemotherapie ein wichtiges Kriterium zur Entschei- dung über Form und Intensität der nachfolgenden Maßnahmen. Dabei besteht bei der Frage nach Lymph- knoten-, Organ oder Knochenmarks- metastasen stets die Schwierigkeit, daß bei konventioneller histologi- scher Aufarbeitung nur ein verhält-
nismäßig geringer Teil des Gewebes untersucht werden kann und somit ei- ne maligne Infiltration möglicherwei- se unerkannt bleibt.
Dieses Problem kann überwun- den werden, indem die Gesamt-RNA eines Lymphknotens präpariert und auf das Vorhandensein nicht-lympho- zytärer mRNA, zum Beispiel für Zyto- keratine oder tumorassoziierte Anti- gene, untersucht wird. Um bei diesem Vorgang eine hohe Sicherheit zu errei- chen, ist es notwendig, mehre- re Primerpaare gegen verschiedene nicht-lymphozytäre mRNAs, die re- vers transkribiert wurden, einzusetzen.
Als Beispiele seien das östrogenre- zeptor-positive Mammakarzinom und das für das prostataspezifische Anti- gen (PSA) positive Prostatakarzinom genannt, bei denen ein Primerpaar
gegen die cDNA von Zytokeratinen und ein zweites gegen die des Östro- genrezeptorproteins beziehungsweise des PSA verwendet werden sollten.
Mehrfach wurde gezeigt, daß beim Einsatz der PCR der Prozentsatz befallener Lymphknoten deutlich höher ist als bei (immun-)histologi- scher Aufarbeitung (6). Sollte sich dies bewahrheiten, so wird sich die Metasta sensuche mittels PCR möglicherwei- se zu einem Rou- tineverfahren ent- wickeln (40).
Besteht der Verdacht auf eine zerebrale Tumorlä- sion mit Anschluß an das Ventrikelsy- stem, so ist zum Beispiel der Nach- weis des mutierten p53-Gens in Zellen aus dem Liquor ein starker Hinweis auf eine Tumorinfiltra- tion (27).
Mit der CGH können gröbere ge- nomische Verände- rungen verschiede- ner Tumorproben eines Patienten charakterisiert und verglichen werden.
Bei Übereinstim- mung der Altera- tionen ist die Zu- ordnung Primärtu- mor-Metastase gegenüber zwei Pri- märtumoren eindeutig zu treffen – ei- ne in der pathologischen Diagnostik häufige Frage.
Nachweis der Zytostatikaresistenz
Um bei disseminierten malignen Tumoren eine rationale Grundlage für Therapieentscheidungen zu erhal- ten, ist die möglichst genaue Bestim- mung ihres Verhaltens gegenüber ei- ner Chemotherapie durch die Bestim- mung der Zytostatikaresistenz hilf- reich (7). So kodiert beispielsweise das mdr-1-Gen für das membrange- bundene Pumpprotein P-170, dessen Überexpression mit einer Resistenz gegen viele verschiedene Zytostatika assoziiert ist, der sogenannten multi Grafik 4
CGH-Summen-Karyogramm eines kleinzelligen Bronchialkarzinoms: rot entspricht einer Deletion, grün einer DNA-Amplifikation, blau der Normalverteilung zwischen Tumor- und Normalgewebe. Das bunte Bild spiegelt die multiplen Aberrationen und damit die hohe Mali- gnität des Tumors wider.
drug resistance (MDR). Es wird in zahlreichen Tumoren primär oder se- kundär nach Chemotherapie überex- primiert. Zum Nachweis der mdr- 1mRNA in Gewebe wird die semi- quantitative RT-PCR
angewendet (1). Bei starker Expression des P-Glykoprotein haben sich die Tumo- ren in klinischen Stu- dien als weitgehend resistent für MDR- Zytostatika erwiesen, so daß dann auf andere Substanzen zurückgegriffen wer- den sollte.
Infektions- pathologie
Die Detektion von Viren, Bakterien, Parasiten und Myko- plasmen direkt am hi- stologischen Gewebs- material stellt, insbe- sondere beim immun-
supprimierten Patienten ohne zuver- lässige serologische Befunde, zum Bei- spiel nach Chemotherapie oder Trans- plantation, bei hämatologischen Er- krankungen oder AIDS, den einzig möglichen Weg zum sicheren und spe- zifischen Nachweis dar. Hier liegt ein zukunftsweisendes Einsatzgebiet der
Molekularpathologe (Tabelle 2), das an einigen Beispielen verdeutlicht wird.
l Der Nachweis einer Tuberku- loseinfektion, häufig mit histochemi- schen Färbungen nur unzuverlässig zu
erreichen, ist mit molekularen Tech- niken präzise möglich (36, 39). Da das Gewebe nach Homogenisierung voll- ständig aufgearbeitet werden kann, wird zumindest theoretisch jedes Tu-
berkelbakterium einer Detektion zu- geführt. Wegen zahlreicher techni- scher Probleme (Kontamination, Ge- webeverschleppung et cetera) sei hier nochmals auf die Notwendigkeit ent- sprechender Kontrollen hingewiesen.
l Bei Patienten nach Transplan- tation ergibt sich eine Verschlechte- rung der Leberwerte.
Es stellt sich die Frage, ob dies auf eine exa- zerbierte virale He- patitis oder eine bei- spielsweise medika- menteninduzierte Le- berinsuffizienz zurück- zuführen ist. In diesem Fall kann an einer Leberstanzbiopsie der Virusnachweis oder -ausschluß mittels PCR und anschließender Hybridisierung schnell und zuverlässig erfol- gen (2, 29), während die serologische Titerbestimmung nur eingeschränkt aussagekräftig ist. Zu- sätzlich können Mischinfektionen zum Beispiel mit Zytomegalieviren aufgedeckt werden.
l Ein AIDS-Patient zeigt die Symptome einer Hepatitis ohne ent- sprechende serologische Befunde. Die an der Biopsie durchgeführte PCR kann eine Infektion zweifelsfrei nach- weisen und zusätzlich zwischen den ver- schiedenen Subtypen (beispielsweise HBV, HCV) differenzieren.
l Auch extrem seltene oder kürzlich entdeckte Erreger, wie der Hantaan-Vi- rus (35) oder das hu- mane Herpes-Virus 8 (Abbildung), können bei Kenntnis der Erb- informationen mit- tels PCR diagnosti- ziert werden, ohne daß erst Antikörper für einen serologi- schen Test hergestellt werden müssen.
l In gynäkolo- gischen Abstrichen können „maligne“
HPV-Stämme (Typ 16, 18) mittels PCR erkannt und durch Restriktionsana- lysen typisiert werden (38).
Gewebeidentifikation
Sollte in einem histologischen La- bor einmal eine Probe nicht mit dem vom Einsender angegebenen Gewe- be übereinstimmen, so ist die eindeuti- ge „genetische Identifikation“ mög- lich, wenn von dem Patienten eine weitere Probe oder auch nur einige Zellen (Plattenepithel- oder Schleim- hautabstriche) zur Verfügung stehen.
Diese werden dann molekular vergli- chen, indem mehrere polymorphe Marker in den betreffenden Proben untersucht werden. Eine relativ selte- ne, aber bei juristischen Auseinander- setzungen wichtige Möglichkeit.
Ausblick
Die voraussichtlich rasante Ent- wicklung der molekularen Methoden wird der Molekularpathologie zahlrei- che zusätzliche Möglichkeiten zur Steigerung der diagnostischen Präzi- Tabelle 2
Molekulare Infektionspathologie – Erregernachweis aus Gewebsmaterial oder am histologischen Schnitt*)
Bakterien Viren Parasiten, Pilze
und andere Erreger Mycobact. tuberculosis Hepatitis B Virus (HBVc, HBVs) Entamoeba histolytica Atypische Mycobakterien Hepatitis C Virus (HCV) Candida albicans Mycobact. leprae Hepatitis D Virus (HDV) Plasmodium E. coli Hum. Papilloma Virus (HPV) Trichomonas vaginalis Rickettsia Herpes simplex Virus (HSV) Trichomonas beigeli Chlamydien trachomatis Human Herpes Virus 8 (HHV8) Lamblium Helicobacter pylori Epstein-Barr Virus (EBV) Mycoplasmen Bordetella pertussis Cytomegalie Virus (CMV)
Salmonella typhimurium Coxsackie Virus Pneumocystis carinii Parvovirus B19
Clostridium difficile Human Immundef. Virus (HIV) Hantaan-Virus
*)Sämtliche Nachweise sind an formanlinfixierten, paraffineingebetteten Proben möglich.
Abbildung: Kaposisarkom im Larynx eines AIDS-Patienten (links) mit Nachweis eines Human-Herpes-Virus8-spezifischen 234-bp-Amplifikats mittels PCR und Elektrophorese (rechts). Spur 1: Positivkontrolle, Spuren 2–3: Negativkontrol- len, Spur 4: DNA-Isolat aus der darstellten Biopsie, Spur 5: 220-bp-Marker.
son eröffnen. Im Mittelpunkt stehen die Tumor- und Infektionspathologie.
Vor dem Hintergrund begrenzter Mit- tel ist allerdings eindringlich auf die Notwendigkeit der kritischen und sorgfältigen Auswahl der einzusetzen- den Zusatzuntersuchung hinzuweisen.
Gewarnt wird auch vor einer euphori- schen Überbewertung, da das tech- nisch anspruchsvolle Methodenspek- trum mit teilweise extrem hoher Sen- sibilität erhebliche Risiken insbeson- dere einer falsch positiven Aussage birgt. Daher sollten nur Arbeitsgrup- pen mit speziellen Fachkenntnissen in der diagnostischen Molekularpatho- logie tätig sein. Auf diesem Gebiet ar- beitende Ärzte sollten die Zusatzbe- zeichnung „Molekularpathologie“
vorweisen. Zusätzlich müssen sich die entsprechenden Laboratorien regel- mäßigen Ringversuchen unterziehen, um ihre Kompetenz zu belegen.
Zitierweise dieses Beitrags:
Dt Ärztebl 1996; 93: A-2856–2863 [Heft 44]
Die Zahlen in Klammern beziehen sich auf das Literaturverzeichnis im Sonderdruck, anzufordern über den Verfasser.
Anschrift des Verfassers:
Prof. Dr. med. Manfred Dietel Institut für Pathologie der Charité Humboldt-Universität zu Berlin Schumannstraße 20–21
10117 Berlin
Danksagung
Dr. Kölble und Dr. Petersen (Institut für Pa- thologie) wird für die intensive Mitarbeit am Manuskript gedankt, ebenso Dr.
Scherneck (Max-Delbrück-Zentrum, Berlin- Buch) für die Überlassung der Abbildung.
In einer großen amerikanischen Studie wurden von 1991 bis 1993 Da- ten von 586 507 Blutspendern von fünf Blutbanken bezüglich der In- fektiosität mit dem humanen Immundefizienz-Virus (HIV), dem humanen T-Zell-lymphotrophen-Vi- rus (HTLV), dem Hepatitis-C-Virus (HCV) und dem Hepatitis-B-Virus (HBV) untersucht. Hierbei wurde bei den regelmäßig wiederkeh- renden Spendern vor allem der Zeitraum der Infektiosität bei nega- tiven Screening-Tests („diagnosti- sche Lücke“) retrospektiv erfaßt und mit Hilfe dieser Methode die poten- tielle Infektiosität der Blutprodukte ermittelt.
Bei Spendern mit negativen Screening-Tests für die oben aufge- führten Erkrankungen ergaben sich folgende Wahrscheinlichkeiten, wäh- rend einer „diagnostischen Lücke“
Blut zu spenden: für HIV 1 : 493 000;
für HTLV 1 : 641 000; für HCV 1 : 103 000 und für HBV 1 : 34 000.
Durch Einsatz neuer, hochsen- sitiver Screening-Tests auf Virus- Antigene oder Virus-Nukleinsäuren ließen sich diese Zahlen nach An- sicht der Autoren noch um 27 bis 72 Prozent verbessern. acc
Schreiber, GB., et al.: The risk of transfu- sion-transmitted viral infections. N Engl J Med 1996; 334: 1685–1690
Dr. Schreiber, Westat Inc., 1650 Research Blvd., Rockville, MD 20850, USA
Über die Ergebnisse der Präven- tion peptischer Ulzera und dyspepti- scher Symptome unter einer Lang- zeittherapie mit nichtsteroidalen An- tirheumatika mit Protonenpumpen- hemmern lagen bislang noch keine wissenschaftlichen Studien vor.
Eine skandinavische Arbeits- gruppe berichtet jetzt über eine erste Studie an 175 Patienten, bei de- nen 20 Miligramm Omeprazol mit ei- ner Plazebomedikation hinsichtlich gastroduodenaler Ulzera, Erosionen und dyspeptischer Symptome unter einer Dauertherapie mit nichtstero- idalen Antirheumatika-Präparaten verglichen wurden. Eine Analyse er- folgte jeweils nach einem und nach drei Monaten.
Unter der Therapie mit Ome- prazol entwickelten 4 von 85 Patien- ten, das entspricht 4,7 Prozent, ein Ulkus im Vergleich zu 15 von 90, das entspricht 16,7 Prozent, unter Plaze- bo. Dieser ulkusprophylaktische Ef- fekt des Omeprazols war weder von einer positiven Ulkusanamnese noch von einem Helicobacter-pylori-Sta- tus abhängig.
15 der 85 Patienten, das ent- spricht 15,3 Prozent, entwickelten behandlungsbedürftige dyspeptische Symptome unter Omeprazol, 35,6 Prozent entwickelten diese Sympto- me unter Plazebo. In der beschriebe- nen Studie waren primär Patienten mit einer Dyspepsieanamnese oder einer unkomplizierten Ulkuskrank- heit aufgenommen worden.
Die Autoren kommen zu dem Schluß, daß zumindest bei diesem be- schriebenen Kollektiv eine prophy- laktische Behandlung mit Omepra- zol einen weitreichenden Schutz vor der Entwicklung einer Nichtsteroi- dale-Antirheumatika-Gastropathie
bietet. w
Ekström P, Carling L, Wetterhus S, Win- gren P E, Anker-Hansen O, Lundegardh G, Thorhallsson E, Unge P: Prevention of Peptic Ulcer and Dyspeptic Symptoms with Omeprazole in Patients Receiving Continuous Non-Steroidal Anti-Inflam- matory Drug Therapy. Scand J Gastroen- terol 1996; 31: 753–758
Department of Surgery, Sandvikens Hos- pital, 81189 Sandviken, Schweden.
Risiko von Virusinfektionen nach Transfusion
Viele Patienten berichten, daß sie nach Einstellung des Nikotinkonsums zugenommen haben. Die Autoren un- tersuchten den Einfluß des Nikotins auf die Magenmotilität und konnten mittels Elektrogastrographie und Ma- nometrie zeigen, daß Nikotin bei Rau- chern und Nichtrauchern zu einer An- trumhypomotilität führt. Bei Nichtrau- chern ließen sich prostaglandingab- hängige Magendysrhythmien nachwei- sen. Raucher weisen eine Desensibili- sierung gegenüber nikotinstimulierten Rhythmusstörungen (Tachygastrie,
Arrhythmie) auf. w
Kohagen KR et al.: Nicotine Effects on Prostaglandin-Dependent Gastric Slow Wave Rhythmicity and Antral Motility in Nonsmokers and Smokers. Gastroente- rology 1996; 100: 3–11
Division of Gastroenterology, Depart- ment of Internal Medicine, University of Michigan Medical Center, Ann Arbor, Michigan, USA
