Braunschweig
Kryokonservierung von Rinderembryonen mit verschiedenen Einfrier- und Auftaumethoden unter Praxisbedingungen -
eine retrospektive Analyse
I N A U G U R A L - D I S S E R T A T I O N zur Erlangung des Grades eines
D O C T O R M E D I C I N A E V E T E R I N A R I A E durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Barbara Götz
aus Uedem
Hannover 2000
1. Gutachter: Apl.-Prof. Dr. Niemann
2. Gutachter: Apl.-Prof. Dr. Weitze
Tag der mündlichen Prüfung: 29. November 2000
1. Einleitung 1
2. Schriftum 4
2.1. Kryobiologische Grundlagen der Tiefgefrierung 4
2.1.1. Intrazelluläres und extrazelluläres Gefrieren 5
2.1.2. Schäden durch Gefrieren 9
2.2. Kryoprotektiva 13
2.2.1. Penetrierende Gefrierschutzmittel 15
2.2.1.1. Glycerin 16
2.2.1.2. Dimethylsulfoxid (DMSO) 22
2.2.1.3. Propanediol 25
2.2.1.4. Ethylenglykol 28
2.2.2. Nicht penetrierende Gefrierschutzmittel 35
2.2.2.1. Sucrose 36
2.2.2.2. Trehalose 41
2.2.2.3. Ficoll 42
2.2.2.4. Polyvinylpyrrolidon (PVP) und Polyvinylalkohol (PVA) 43
2.3. Tiefgefrierverfahren 45
2.3.1. Konventionelle Gefrierverfahren 46
2.3.1.1. Langsames Tiefgefrieren 47
2.3.1.2. Schnelles Tiefgefrieren 47
2.3.2. Vitrifikation 52
2.3.3. Ultraschnelles Tiefgefrieren 61
2.3.4. Auftaumethoden 63
2.3.5. Ausverdünnungsmethoden 65
2.3.5.1. Schrittweises Ausverdünnen von Glycerin 65
2.3.5.2. One-Step-Methode 71
2.3.5.3. Direktes Ausverdünnen von Ethylenglykol 74
3.1. Datenmaterial 82
3.2. Spendertiere 84
3.2.1. Superovulation und künstliche Besamung 84
3.2.2. Spül- und Kulturmedium 86
3.2.3. Gewinnung von Embryonen 86
3.2.4. Aufsuchen und Beurteilung von Embryonen 87
3.3. Kryoprotektiva 90
3.3.1. Glycerin 90
3.3.2. Ethylenglykol 91
3.3.3. Säulenzahl in der Tiefgefrierpaillette bei Verwendung von Ethylenglykol 91
3.4. Tiefgefriervorgang 94
3.4.1. Tiefgefrieren auf Alkoholbasis 94
3.4.2. Tiefgefrieren auf Stickstoffbasis 94
3.5. Auftau- und Ausverdünnungsvorgang 95
3.5.1. Glycerin 95
3.5.1.1. 3 Ausverdünnungsschritte (Gly-3) 95
3.5.1.2. 1 Ausverdünnungsschritt (Gly-1) 95
3.5.2. Ethylenglykol 96
3.5.2.1. Direkttransfer (EG/DT) 96
3.5.2.2. Kontrollierte Ausverdünnungsverfahren 96
3.6. Empfängertiere 97
3.6.1. Vorbereitung der Empfängertiere 97
3.6.2. Transfervorgang 98
3.6.3. Trächtigkeitsuntersuchungen 98
3.7. Statistische Auswertung des Datenmaterials 98
4. Ergebnisse 99
4.1. Einflüsse auf die Trächtigkeitsrate 99
4.1.4. Gefriergerät 110
4.1.5. Empfängerqualität 112
4.1.6. Alter des Empfängertiers (Rind oder Kuh) 115
5. Diskussion 118
6. Zusammenfassung 134
7. Summary 137
8. Literaturverzeichnis 140
1. Einleitung
Die Kryokonservierung von Rinderembryonen wird im Rahmen des Embryotransfers heute in der Rinderzucht routinemäßig angewendet. 1998 wurden bereits mehr als 50% aller gewonnenen Rinderembryonen nach Tiefgefrierkonservierung übertragen (THIBIER 1999).
Ziel der Kryokonservierung ist die unbefristete Lagerung der Embryonen, ohne die Entwicklungsfähigkeit nach dem Auftauen zu beeinträchtigen. Besonders kritische Schritte für das Überleben der Embryonen sind das eigentliche Einfrieren und das Auftauen mit dem Ausverdünnen des Gefrierschutzmittels.
Im Jahre 1971 gelang die erste erfolgreiche Kryokonservierung von Mäuseembryonen (WHITTINGHAM 1971), und zwei Jahre später wurde das erste lebende Kalb nach Transfer eines tiefgefrorenen Rinderembryos geboren (WILMUT u. ROWSON 1973). Von einer praktischen Anwendung war man zu diesem Zeitpunkt jedoch noch weit entfernt. Viele grundlegende Arbeiten zur Kryokonservierung von Mäuseembryonen haben wichtige Hinweise für die Entwicklung eines praxisnahen Tiefgefrierverfahrens geliefert (WHITTINGHAM 1980).
Anfangs wurden die Rinderembryonen mit Dimethylsulfoxid (DMSO) (WILLADSEN et al.
1978; TERVIT u. ELSDEN 1981), später dann vorwiegend mit Glycerin als Kryoprotektivum tiefgefroren (LEHN-JENSEN 1984). Beide Gefrierschutzmittel mußten aufgrund des hohen osmotischen Gradienten stufenweise ausverdünnt werden, was zeitaufwendig und für die praktische Anwendung häufig schwierig war. Durch den Einsatz von nicht penetrierenden Kryoprotektiva (z. B. Sucrose) konnte das Ausverdünnungsverfahren verkürzt werden (RENARD et al. 1983).
Zu Beginn der 90er Jahre wurde vermehrt über den Einsatz von Ethylenglykol bei der Kryokonservierung von Rinderembryonen berichtet. Durch die geringere Toxizität und gute Permeabilität mußte dieses Kryoprotektivum nach dem Auftauen nicht stufenweise ausverdünnt werden, und der Embryo konnte per Direkttransfer auf den Empfänger übertragen
werden (VOELKEL u. HU 1992b; McINTOSH u. HAZELEGER 1994). Dies führte zu einer weiteren Verbesserung und Vereinfachung der Methode beim kommerziellen Embryotransfer (GÖRLACH 1996). Das Verfahren des Direkttransfers wurde schnell mit guten Trächtigkeitsergebnissen von vielen Embryotransfer-Stationen auf breiter Basis eingesetzt.
Allerdings treten bei Anwendung dieser Methode unter Feldbedingungen immer noch starke Schwankungen in den Ergebnissen auf. Dies wurde u.a. mit der fehlenden morphologischen Kontrolle nach dem Auftauen begründet (BIELANSKY et al. 1986; JANOWITZ u.
HERMANNS 1995).
Neben dem Direkttransfer unter Verwendung von Ethylenglykol sind deshalb vereinfachte Auftauverfahren unter Verwendung von Glycerin wieder häufiger eingesetzt worden. Als Auftaumethode wird hier seit einiger Zeit das Ausverdünnen in einem Schritt mit Sucrose angewandt (HRUSKA 1991).
Neben der Einfrier- und Auftaumethode werden die Trächtigkeitsergebnisse von weiteren Faktoren beeinflußt. Bei einigen Faktoren, wie z. B. der Embryonenqualität (MASSIP et al.
1982; HASLER et al. 1987), der Qualität des Empfängertieres (SCHUBERTH 1984;
NOHNER 1986) und dem Alter des Empfängertiers (Rind oder Kuh) (JANOWITZ 1994;
MASSIP et al. 1995b) wurde ein deutlicher Einfluß auf die Überlebens- und Trächtigkeitsraten nach der Kryokonservierung nachgewiesen. Der Einfluß des Entwicklungsstadiums wird von einigen Autoren als geringer angesehen (LINDNER u. WRIGHT 1983; NELSON u. NELSON 1988). Andere Autoren hingegen konnten einen Einfluß einzelner Entwicklungsstadien feststellen (NIEMANN 1982; MASSIP et al. 1984; KLING 1997)
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten in einer retrospektiven Untersuchung verschiedene Variationen beim Einfrieren und Auftauen von Rinderembryonen unter Praxisbedingungen auf ihren Einfluß auf die Trächtigkeitsraten analysiert werden. Es sollten die Ergebnisse nach Direkttransfer mit Ethylenglykol mit denen verschiedener kontrollierter Ausverdünnungsverfahren mit Ethylenglykol mit oder ohne Sucrose und denen unter Verwendung von Glycerin verglichen werden.
Außerdem wurden die Einflüsse von Embryonenqualität, Entwicklungsstadium, Gefriergerät, Empfängerqualität und Alter des Empfängertiers (Rind oder Kuh) auf das Trächtigkeitsergebnis in Abhängigkeit von den verschiedenen Einfrier- und Auftaumethoden untersucht.
2. Schriftum
2.1. Kryobiologische Grundlagen der Tiefgefrierung
Gefrieren ist das Überführen von Wasser vom Lösungszustand in Eiskristalle (MERYMAN 1956). Eis bildet sich beim Kühlen von Embryonen auf Temperaturen unter 0°C zwischen -5 und -10°C zunächst im extrazellulären Medium.
Ziel der Kryokonservierung ist die zeitlich unbefristete Lagerung der Embryonen, ohne die Entwicklungsfähigkeit nach dem Auftauen zu beeinträchtigen. Bei Temperaturen unter
-139°C ist keine ausreichende Energie mehr für die meisten zellulären Reaktionen der Embryonen vorhanden. Bei weiterer Abkühlung auf -196°C ruht der metabolische Stoffwechsel (LEIBO u. MAZUR 1971). Dies bietet die Möglichkeit für eine vollständige Erhaltung der Ausgangseigenschaften des biologischen Materials (FRIEDLER et al. 1988;
BÜRKLE u. HAHN 1989).
Eine Langzeitlagerung bei -196°C scheint keinen Einfluß auf das Überleben der Embryonen zu haben. Kalkulationen haben ergeben, daß Embryonen ca. 30000 Jahre gelagert werden müßten, bevor eine akkumulierte ionisierende Strahlung einen Wert erreicht, bei dem die Embryonen geschädigt würden (ASHWOOD-SMITH u. FRIEDMANN 1979).
Es treten drei Phänomene auf, wenn Embryonen auf Temperaturen unter 0°C gekühlt werden.
Eiskristalle werden gebildet, die Zelle dehydriert, und die Konzentration der gelösten Stoffe steigt (MAZUR 1965). Dabei müssen die Embryonen während des Tiefgefrierens nicht nur sehr niedrige Temperaturen sondern auch das zweifache Durchschreiten des Temperaturbereichs zwischen -15 und -50°C während des Kühlens und während des Auftauens überstehen (MAZUR 1980).
2.1.1. Intrazelluläres und extrazelluläres Gefrieren
Im Verlauf des Kühlprozeßes geht mehr und mehr des extrazellulären Mediums in Eis über.
Zwischen den Eiskristallen befindet sich die noch nicht gefrorene extrazelluläre Lösung, deren Konzentration an gelösten Stoffen kontinuierlich auf multimolare Werte ansteigt. So bildet sich ein wachsender Konzentrationsunterschied von gelösten Stoffen zwischen der unterkühlten Lösung in den Zellen und der zunehmend konzentrierteren Lösung außerhalb der Zelle heraus (MAZUR 1966; LEVIN u. CRAVALHO 1976; MAZUR u. SCHNEIDER 1986).
Es gibt zwei unterschiedliche Wege, um diese Differenz im chemischen Potential auszugleichen. Wasser kann aus der Zelle herausfließen und extrazellulär gefrieren. Dabei wird die intrazelluläre Lösung konzentriert. Der andere Weg ist, daß das intrazelluläre Wasser gefriert und sich die intrazelluläre Lösung dabei konzentriert (MAZUR 1977; MAZUR 1980).
Bei einer niedrigen Kühlrate ist genügend Zeit für das Ausströmen des Wassers aus der Zelle vorhanden. Die Zelle dehydriert und das Wasser gefriert extrazellulär (MAZUR 1965). Die Permeabilität gegenüber Zellwasser ist größer als für gelöste Stoffe. Daher geschieht die Equilibrierung (Anpassung an sich verändernde osmotische Bedingungen) des chemischen Potentials zwischen Zytoplasma und extrazellulärem Eis vorwiegend durch Ausfluß von Wasser und weniger durch Einfluß von extrazellulär gelösten Stoffen (FRIEDLER et al. 1988).
Bei einer schnellen Kühlung (hohe Kühlrate), dehydrieren die Zellen kaum und gefrieren intrazellulär (MAZUR 1965). Bei hohen Kühlraten verläuft das Eiskristallwachstum schnell, und es entstehen gleichzeitig viele kleine Kristalle (s. Abb.1). Bei niedrigen Kühlraten treten weniger Kristalle auf, die aber größer sind (LEIBO et al. 1978). Kleine, bei hoher Kühlgeschwindigkeit produzierte Kristalle, haben ein großes Oberflächen- / Volumenverhältnis und eine größere Oberflächenenergie als große Kristalle und sind daher thermodynamisch instabil (MAZUR 1965; MAZUR 1966).
Die Höhe der Kühlrate, bei der intrazelluläres Eis entsteht, hängt von dem Oberflächen- / Volumenverhältnis der Zelle und ihrer Permeabilität für Wasser ab. Die Permeabilität einer Membran gegenüber Wasser ist der bestimmende Faktor dafür, ob Zellen durch Dehydration oder durch intrazelluläres Gefrieren bei niedrigen Temperaturen equilibrieren. Rote Blutkörperchen haben eine hohe kritische Kühlgeschwindigkeit (5000°C/min). Dies ist Folge der hohen Permeabilität für Wasser und dem großen Oberflächen- / Volumenverhältnis (MAZUR 1970). Dementsprechend gefrieren sie nicht intrazellulär, wenn sie nicht mit einer Rate gekühlt werden, die viel höher ist als die, die notwendig ist, um intrazelluläres Eis in Hefezellen zu produzieren. Hefezellen besitzen eine geringere Permeabilität gegenüber Wasser und ein kleineres Oberflächen- / Volumenverhältnis (LEIBO u. MAZUR 1971). Je größer das Oberflächen- /Volumenverhältnis und je größer die Permeabilität, desto größer ist auch die Kühlrate, die benötigt wird, damit intrazelluläres Eis entsteht (MAZUR 1965).
Der Inhalt einer Zelle bleibt beim Kühlen zunächst ungefroren, da die Zellmembran die Bildung von Eiskristallen bei Temperaturen über -10°C verhindert. Der Zellinhalt wird aber zunehmend unterkühlt. Diesen Vorgang nennt man „Supercooling“ oder Unterkühlung (MAZUR 1980).
Beim weiteren Kühlen der Lösung tritt eine spontane Kristallisation nicht an ihrem wahren Gefrierpunkt, sondern bis zu 10°C und mehr darunter ein. Dadurch kommt es zur Rückerwärmung des Systems bis nahe an den Gefrierpunkt und beim abschließenden Temperaturabfall zur Erhöhung der Kühlrate. Dies kann wiederum beim Tiefgefrieren von Embryonen zu einer verringerten Überlebensrate durch intrazelluläre Eisbildung führen (WILLADSEN 1977).
Die Induktion der Eiskristallbildung, das sogenannte Seeding, reduziert den nachfolgenden Temperaturanstieg, der durch Freisetzung latenter Wärme während des Phasenwechsels geschieht und schützt damit vor exzessiven Supercooling (MAURER 1978). Allgemeine Praxis beim Tiefgefrieren von Embryonen ist, die Eiskristallisation zu induzieren, wenn die Temperatur 1 bis 3°C unter den wahren Gefrierpunkt gefallen ist. Dann ist eine osmotische Reaktion der Zellen des Embryos möglich (LEHN-JENSEN 1984). Es ist günstig, die Seeding-
Temperatur noch für 2 bis 5 min zu halten, um ein thermisches und osmotisches Equilibrium zu erreichen (LEIBO u. MAZUR 1978).
2.1.2. Schäden durch Gefrieren
Schäden während der Kryokonservierung von Embryonen resultieren aus den Interaktionen einer großen Zahl von Faktoren. Die beiden wichtigsten Faktoren sind die Schäden, die mit der Bildung von intrazellulärem Eis und verlängertem Ausgesetztsein in konzentrierten Lösungen (Lösungseffekte) während des Tiefgefrierens zusammenhängen (DE LEUW et al. 1991).
Nach MAZUR (1966) treten bei Kühlgeschwindigkeiten über dem Optimum Schäden als Folge intrazellulären Gefrierens, bei Kühlgeschwindigkeiten unterhalb des Optimums aber als Folge der hochkonzentrierten Elektrolyten auf (s. Abb.2). Diese Hypothese wurde durch zahlreiche Untersuchungen mit verschiedenen Zellen bestätigt. Die optimale Kühlrate ist die, die langsam genug ist, um die Bildung von intrazellulärem Eis zu verhindern, aber schnell genug ist, um die Zeitdauer, die die embryonalen Zellen den Lösungseffekten ausgesetzt sind, zu minimieren (MAZUR 1970). Das Optimum liegt dort, wo beide Effekte minimal sind (MAZUR et al.
1972).
Abb.2: Schematische Darstellung der Beeinflussung der Überlebensrate durch die
Gefriergeschwindigkeit
Gefriergeschwindigkeit (°C/min)
Überlebens- rate (%)
Je schneller die Kühlung verläuft, desto geringer ist die Dehydration und desto größer ist die Wahrscheinlichkeit des intrazellulären Gefrierens (MAZUR 1977; POLGE 1977). Zellen mit großem Volumen verlieren Wasser bei einer gegebenen Kühlrate langsamer als kleinvolumigere Zellen. Zellen mit großem Volumen werden daher stärker unterkühlt und neigen eher zum intrazellulären Gefrieren (MAZUR 1966). MAZUR (1970), BANK u. MAZUR (1973) und LEIBO (1977) wiesen eine mechanische Schädigung der Zellstrukturen durch große Eiskristalle nach. Das Ausmaß der Schäden durch intrazelluläres Gefrieren korrelierte mit der Gesamtmenge an Eis pro Zelle. Dabei sind auch die osmotischen Kräfte, die beim Schmelzen des intra- und extrazellulären Eises auftreten, von Bedeutung (FARRANT et al. 1977).
Kleine Eiskristalle wachsen zusammen, wenn das Aufwärmen langsam genug ist, daß ausreichend Zeit für diesen Vorgang vorhanden ist. Dieser Vorgang der Kristallbildung während des Erwärmens wird Rekristallisation genannt und führt wie auch intrazelluläres Gefrieren zum Tod der Embryonen (MAZUR et al. 1972; WHITTINGHAM 1980). Das Ausmaß der Schäden während der Rekristallisation ist proportional zur Dauer des Auftauprozesses, der wiederum indirekt proportional zur Auftaurate ist (DILLER et al. 1972).
Bei der Kühlung von Embryonen mit zu niedrigen Raten treten durch den Ausfluß von Wasser aus den embryonalen Zellen Lösungseffekte auf (NIEMANN 1983). Die Konzentration der gelösten Stoffe steigt an, das Zellvolumen wird verringert, und es kommt zur Ausfällung der gelösten Stoffe. Dies gilt als Ursache für Zellschädigungen, die bis hin zur Zellysis führen können (BÜRKLE u. HAHN 1989).
Nach LOVELOCK (1953) und MAZUR (1977) ist eine hohe Konzentration an Elektrolyten die Ursache für Membranläsionen, die zur osmotischen Lysis der embryonalen Zellen während des Gefrierens führen. Beobachtungen an humanen Erythrozyten zeigten, daß es zu Lipidveränderungen in der Zellmembran kommt. Kationen können in die nun hypertonisch werdende Zelle einströmen und beim Auftauen kommt es zur osmotischen Lysis (LOVELOCK 1953). Hohe Elektrolytkonzentrationen schädigen neben den inneren Zellmembranoberflächen
auch die intrazellulären Proteine. LEVIN u. MILLER (1981) sehen darin ebenfalls einen Grund für die Lysis der embryonalen Zellen.
Schäden an den Membranen werden auch durch ein Unterschreiten des Mindestzellvolumens ausgelöst. Erythrozyten können nicht auf weniger als 55% ihres normalen Volumens schrumpfen. Entlang der Membran kommt es durch Druckgradienten zur Schädigung der Membran. Es kommt zur Equilibrierung durch Wanderung der Elektrolyten in die Zelle und zur osmotischen Lysis beim nachfolgenden Auftauen (MERYMAN 1968).
Faktoren, die die Größe der Schäden bestimmen, sind neben der tatsächlichen Konzentration der gelösten Stoffe auch die Temperatur und die Zeit, die Embryonen dieser Konzentration ausgesetzt sind (FARRANT 1965). So hat die Bildung von Eis bei großen Kühlraten ebenfalls zur Folge, daß die intrazelluläre Konzentration von gelösten Stoffen ansteigt, wie dies bei der Dehydration während des langsamen Tiefgefrierens geschieht, aber diese intrazelluläre, hypertonische Lösung hat während des schnellen Tiefgefrierens keine Zeit, die Membranen zu beeinflussen (FARRANT u. MORRIS 1973).
Die Fähigkeit der Zellen, Tiefgefrieren zu überleben, hängt nach MAZUR (1970) mehr vom Schutz der Zelloberfläche als vom Schutz des Zellinneren ab. Das Zellinnere enthält normalerweise hohe Konzentrationen an schützenden Makromolekülen. Auch die Ergebnisse von FRIEDLER et al. (1988) deuteten auf eine Abhängigkeit der Überlebensfähigkeit vom Schutz der Zelloberfläche hin. Sie wiesen nach, daß Kryoprotektiva auch ohne Penetration der Zelle schützen können.
Kryomikroskopische Untersuchungen haben gezeigt, daß Risse in der Zona pellucida durch Bruchstücke im Eis (fracture planes) entstehen können. Rapide Temperaturveränderungen in der umgebenden Eismatrix gelten als Ursache für „fracture planes“. Die Zonaschäden treten nur an solchen Stellen auf, wo „fracture planes“ den Embryo passieren. Dabei wird die Überlebensfähigkeit der Embryonen nach dem Auftauen jedoch nicht unbedingt beeinträchtigt und eine normale embryonale Entwicklung nach Transfer nicht ausgeschlossen. Teilweise wird
von in vitro-Entwicklungsraten bis zu expandierten Blastozysten von 91% berichtet (RALL u.
POLGE 1984). In vielen Fällen schrumpft der Embryo ausreichend und erlaubt ein Passieren der „fracture planes“ durch den perivitellinen Raum. Dies erklärt das Vorhandensein von normalen Embryonen mit fehlender oder geschädigter Zona pellucida nach der Kryokonservierung (KANAGAWA et al. 1979; LEHN-JENSEN 1984; RALL u. MEYER 1989).
2.2. Kryoprotektiva
Gefrierschutzmittel (Kryoprotektiva) sind für das Überleben von tiefgefrorenen Zellen notwendig. Sie werden in zwei Klassen eingeteilt, in penetrierende und nicht penetrierende Gefrierschutzmittel (MERYMAN 1971).
Die genaue Wirkungsweise der Kryoprotektiva ist noch nicht ausreichend bekannt, aber verschiedene Effekte werden diskutiert. Folgende Mechanismen der Schutzwirkung sind wahrscheinlich. Durch die Kryoprotektiva kommt es zu einer Erniedrigung der Temperatur, bei der intrazelluläres Gefrieren erfolgt. Sie reduzieren ferner die Schädigungen durch Lösungseffekte und intrazelluläres Gefrieren und tragen so zu einer Stabilisierung der Zellmembranen bei (NIEMANN 1983).
Vermutlich werden im Medium ohne Kryoprotektivum Kristalle gebildet, bis die Zwischenräume beinahe verwischen, so daß Zellen einem beträchtlichen Druck ausgesetzt sind und das Auftauen zu einem gewaltsamen und zerreißenden Prozeß wird. Wenn dem Medium aber ein Kryoprotektivum zugefügt wird, bilden sich bei niedrigen Temperaturen kleinere Kristalle, so daß Kanäle und Räume entstehen, in denen die Zellen geschützt sind und das Auftauen einen glatten und stufenlosen Prozeß darstellt (SMITH et al. 1951).
Wenn die gesamte molare Fraktion aus Elektrolyten besteht, wird deren Konzentration durch Zugabe von Nicht-Elektrolyten (in diesem Fall Kryoprotektiva) gesenkt (MAZUR 1970;
FARRANT u. MORRIS 1973). Dies geschieht durch die kolligative Wirkung (Wasserbindungsfähigkeit) der Gefrierschutzmittel. Dadurch wird die Dehydrierung der Zellen verzögert, und die intra- und extrazelluläre Ionenkonzentration steigt erst in einem niedrigeren Temperaturbereich auf einen kritischen Wert, so daß zellschädigende Prozesse verzögert ablaufen (LOVELOCK 1954; LEIBO 1977; MERYMAN et al. 1977; LEIBO u. MAZUR 1978; LEHN-JENSEN 1981; FRIEDLER et al. 1988). Kryoprotektiva schützen Zellen zwar vor schädigenden Einflüßen durch hohe Elekrolytkonzentrationen, aber nicht vor der Bildung von intrazellulärem Eis (WHITTINGHAM 1980).
Von den verschiedenen Eigenschaften hypertonischer Lösungen gehen Membranveränderungen aus. Der kryoprotektive Effekt, sowohl der penetrierenden wie auch der extrazellulären Bestandteile eines Kryoprotektivums, beruht während des Tiefgefrierens auf einer Reduktion der Membranveränderungen verglichen mit Lösungen, denen wenig oder kein Kryoprotektivum zugegeben wurde (FARRANT u. MORRIS 1973).
Nach FARRANT (1965) dürfen Kryoprotektiva während der Kühlung nicht toxisch wirken.
Aus diesem Grund müssen sie nach dem Tiefgefrieren aus den Zellen entfernt werden, da sie bei wärmeren Temperaturen für die Zelle toxisch werden können (FRIEDLER et al. 1988).
2.2.1. Penetrierende Gefrierschutzmittel
Das Charakteristikum penetrierender Kryoprotektiva ist nach MERYMAN (1971) und LEIBO (1988) die Fähigkeit, durch eine Zellmembran hindurchzuströmen. Dies wird durch ein geringes Molekulargewicht ermöglicht. Penetrierende Kryoprotektiva dürfen auch in hohen Konzentrationen, die notwendig sind, um eine exzessive Eisbildung zu verhindern, nicht toxisch sein. Die Verbindung muß die Zelle penetrieren, um ihre kryoprotektive Wirkung zu entfalten, denn ansonsten wird die Zelle osmotisch dehydriert. Hohe intrazelluläre Elektrolytkonzentrationen wären die Folge (MERYMAN 1971).
Nach dem Hinzufügen des Kryoprotektivums besteht ein Osmolaritätsunterschied zwischen intra- und extrazellulärer Lösung, denn das Kryoprotektivum erhöht die Osmolarität der extrazellulären Lösung. Der Embryo schrumpft anfänglich durch das Ausströmen von Wasser, um ein Equilibrium zwischen intra- und extrazellulärer Lösung zu erreichen. Das Schrumpfen des Embryos wird so lange fortgesetzt, bis das Ausströmen von Wasser mit dem Einströmen von Kryoprotektivum im Gleichgewicht steht (SCHNEIDER u. MAZUR 1984; LEIBO 1989).
Je permeabler ein Embryo gegenüber einem gegebenen Kryoprotektivum ist, desto geringer ist das anfängliche Schrumpfen.
Der Grad der Penetration eines Kryoprotektivums in eine Zelle ist abhängig von deren Permeabilitätskoeffizienten für das Kryoprotektivum, von dem Gradienten zwischen intra- und extrazellulärer Konzentration des Kryoprotektivums, sowie von der Temperatur und der Zelloberfläche. Zudem haben jeder Embryo, Spezies und Entwicklungsstadium eigene Permeabilitätscharakteristika (SCHNEIDER u. MAZUR 1984; FRIEDLER et al. 1988).
Die Equilibrierung verläuft bei höheren Temperaturen schneller als bei niedrigen Temperaturen. Die Equilibrierung von Rinderembryonen wird normalerweise bei 20-25°C Raumtemperatur durchgeführt (DE LEEUW et al. 1991).
2.2.1.1. Glycerin
Glycerin (s. Tab.1) wurde erstmals von POLGE et al. (1949) als Kryoprotektivum beim Tiefgefrieren von Geflügelsperma eingesetzt. Beim Vergleich der Überlebensraten (ÜR) nach dem Tiefgefrieren von Rinderembryonen mit 1,0 M Glycerin und 1,5 M Dimethylsulfoxid (DMSO) konnte kein signifikanter Einfluß des Kryoprotektivums entdeckt werden (BILTON 1980). Jedoch wurde Glycerin dem DMSO vorgezogen, da es auch in sehr hohen Konzentrationen innerhalb von Zellen kaum toxisch wirkt (MERYMAN 1971).
Bei weiteren Versuchen sowohl mit Rinderembryonen (BOUYSSOU u. CHUPIN 1982;
PRATHER et al. 1987) als auch mit Mäuseembryonen (FALGE et al. 1982; RALL u. POLGE 1984; TAKEDA et al. 1987) wurde nachgewiesen, daß Glycerin in Konzentrationen von 1,3- 1,4 M dem DMSO in Konzentrationen von 1,3-1,5 M als Kryoprotektivum beim konventionellen Tiefgefrieren überlegen ist. RALL u. POLGE (1984) begründeten dies damit, daß Glycerin-Lösungen eine höhere Viskosität als DMSO-Lösungen haben. Daher sei bei Embryonen in Glycerin im Vergleich zu solchen in DMSO bei Temperaturen unter 0°C die Bildung eines metastabilen, glasartigen Zustands wahrscheinlicher. Der mögliche schädigende Effekt durch Bildung von intrazellulärem Eis wird dadurch verringert.
Glycerin wird beim konventionellen Tiefgefrieren gewöhnlich in Konzentrationen von 1-2 M verwendet. MERRY et al. (1983) untersuchten die in vitro-ER (Entwicklungsrate) von Mäuseembryonen nach dem Tiefgefrieren in drei verschiedenen Glycerin-Konzentrationen mit schrittweisem Ausverdünnen. Dabei unterschieden sich die in vitro-ER der Embryonen (49, 44 und 52%) nach Tiefgefrieren in 1,0 M, 1,4€M und 1,8 M Glycerin nicht signifikant voneinander.
LEHN-JENSEN (1986) verglich verschiedene Glycerin-Konzentrationen (0,5 M, 1,0 M und 1,4 M) beim Tiefgefrieren von Tag 6½-7½-Rinderembryonen. Dabei stellte er fest, daß die Kryoprotektion bei einer Glycerin-Konzentration von 0,5 M nicht ausreichend war. Bei Verwendung von 1,0 bzw. 1,4 M Glycerin war die Kryoprotektion gut, wobei kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Konzentrationen entdeckt werden konnte.
Tab. 1: Physikalisch-chemische Eigenschaften penetrierender Kryoprotektiva
Glycerin DMSO Ethylenglykol Propanediol
dreiwertiger Alkohol mit 2 primären und 1 sekundären OH-Gruppe1
CH2OH CHOH CH2OH 2 Molekulargewicht:
92,12
Siedepunkt:
290°C2
farblose, klare, sirup- artige, süß
schmeckende Flüssigkeit1
mit Wasser und Ethanol in jedem Verhältnis mischbar, jedoch nicht in Ether1
Sulfoxid, das durch Oxidation von Dialkylsulfiden entsteht1
H3C-SO-CH32
Molekulargewicht:
78,12
Siedepunkt:
189°C2
farblose, hygroskopische (wasserbindende) Flüssigkeit 1
mit Wasser und Alkohol mischbar1
zweiwertiger Alkohol3
HOH2C-CH2OH 2
Molekulargewicht:
62,12
Siedepunkt:
198°C2
farblose, visköse, süß schmeckende
Flüssigkeit, stark hygroskopisch2
mit Wasser und Ethanol mischbar, jedoch fast unlöslich in Ether1
zweiwertiger Alkohol1
CH3-CHOH-CH2OH 2
Molekulargewicht:
76,12
Siedepunkt:
188°C2
farb- und geruchlose, ölige Flüssigkeit mit süßlichem
Geschmack1
in jedem Verhältnis mit Wasser, Alkohol und Ether mischbar1
1 BEYER u. WALTER (1984)
2 NEUMÜLLER (1987)
3 CHRISTEN (1972)
Damit bestätigte er die Ergebnisse von KENNEDY et al. (1983), die ebenfalls keine signifikanten Unterschiede bei den Überlebensraten zwischen den Glycerin-Konzentrationen 1,0 und 1,4 M fanden. WARE u. BOLAND (1987) verglichen verschiedene Glycerin- Konzentrationen beim Tiefgefrieren von Schafembryonen mit anschließendem Ausverdünnen mit dem nicht penetrierenden Kryoprotektivum Sucrose. Hierbei erwies sich eine Glycerin- Konzentration von 2,8 M unabhängig von der Geschwindigkeit des Ausverdünnens mit Sucrose als toxisch.
Kryoprotektiva wie Glycerin und DMSO permeieren die Zelle nicht so schnell wie Wasser (VOELKEL u. HU 1992a). Die Zeit, die das Kryoprotektivum beim Influx bis zum Erreichen einer bestimmten Konzentration in die Zelle mit Equilibration an die extrazellulären Verhältnisse benötigt, wird als Equilibrierungszeit bezeichnet. LEHN-JENSEN (1986) verglich die unterschiedlichen Diffusionsraten von DMSO und Glycerin bei 6½-7½ Tage alten Embryonen. Er stellte fest, daß die Embryonen in PBS (Phosphat-Buffered-Solution) ca.
15 min zur Equilibrierung in 1,4 M Glycerin, aber 20 min in 1,5 M DMSO benötigen (bei 20°C). Die Rinderembryonen in 1,4 M Glycerin schrumpften dabei auf 45-50% ihres isotonischen Ausgangsvolumen, wenn mit einer niedrigen Gefrierrate von < 0,8°C/min bis - 25°C gekühlt wird.
PAVEL (1985) kam bei dem Vergleich zweier Equilibrierungszeiten von Rinderembryonen in 1,0 M Glycerin zu dem Schluß, daß eine Verlängerung von 10-15 min auf 20-35 min keinen Einfluß auf die Überlebensraten nach Transfer hat.
Verschiedene Autoren untersuchten die Möglichkeit der Equilibrierung von Rinderembryonen in 10% Glycerin (entspricht 1,4 M Glycerin) / PBS in einem Schritt. Nach CHUPIN u.
PROCUREUR (1984) ist es möglich, Rinderblastozysten in einem Schritt von 10-30 min in 1,4 M Glycerin zu equilibrieren. Ein starkes Schrumpfen der Embryonen wurde nach dem Einsetzen in 1,4 M Glycerin beobachtet, dem eine Reexpansion durch den Influx von Wasser innerhalb von 10-15 min folgte. Die Entwicklungsfähigkeit der Tag 7-Rinderembryonen wurde durch die One-Step-Hinzugabe von 1,4 M Glycerin nicht gesenkt. Es wurde ein erhöhter Anteil von Embryonen mit Schäden der Zona pellucida beobachtet, die aber anschließend keinen weiteren Einfluß auf die Entwicklungskapazität in vivo und in vitro hatten (NIEMANN 1985).
Auch FRANKS et al. (1986) konnten keine Einfluß der Art des Hinzufügen des Kryoprotektivums (One Step-Hinzufügen oder schrittweises Hinzufügen) auf die Überlebensfähigkeit der Embryonen feststellen.
THONON (1995) hingegen verglich die Überlebensraten von IVF-Embryonen (IVF = in vitro- Fertilisation) beim Tiefgefrieren in 10% Glycerin und erhielt beim schrittweisen Hinzufügen höhere Überlebensraten als beim Hinzufügen in einem Schritt.
Die Permeabilität von Glycerin ist im Vergleich zu anderen penetrierenden Kryoprotektiva geringer (SZELL et al. 1989; TACHIKAWA et al. 1993). Bei der Übertragung von in Glycerin equilibrierten Embryonen in isotonischer PBS-Lösung kommt es zu einem Einströmen von Wasser. Die Zellen schwellen an und lösen sich auf. Infolgedessen müssen die Embryonen nach dem Auftauen in mehreren Schritten oder mit Hilfe eines nicht penetrierenden Kryoprotektivums ausverdünnt werden (SCHNEIDER u. MAZUR 1984).
Die Trächtigkeitsraten nach Transfer von in 10% Glycerin tiefgefrorenen in vivo gewonnenen Rinderembryonen lagen im Bereich von 40,5-69,6%, die von in vitro produzierten Rinderembryonen deutlich niedriger (ELSDEN et al. 1982; NELSON u. NELSON 1988;
HRUSKA 1991; HASLER et al. 1995; KLING 1997). Einen Überblick der Überlebensraten von Rinderembryonen nach kontrolliertem Tiefgefrieren mit Glycerin gibt Tabelle 2.
Glycerin wird aber auch in Kombination mit anderen Kryoprotektiva bei der Vitrifikation und in multimolaren Konzentrationen beim ultraschnellen Gefrieren eingesetzt (BIELANSKY u.
HARE 1988; ALI u. SHELTON 1993b; GUITIERREZ et al. 1993a).
Tab. 2: Überlebensraten von Rinderembryonen nach konventionellem Tiefgefrieren bei Verwendung von Glycerin als Kryoprotektivum und dem Ausverdünnen von Glycerin in mehreren Schritten mit oder ohne Sucrose oder in einem Schritt mit Sucrose
Autoren Entwicklungs- stadium oder Embryonenalter
Konzentration des Glycerins
Ausverdünnungs- schritte
Konzentration der Sucrose
Überlebensraten
BOUYSSOU u.
CHUPIN 1982
Blastozysten 1,4 M 6 Schritte 0,0 M 56,0% ÜR (nach 24 h IVC)
NIEMANN et al. 1982
Blastozysten 1,0 M 1,0 M
5 Schritte 3 Schritte
0,0 M 0,5 M
53,6% ÜR (nach 24 h IVC) 83,3% ÜR (nach 24 h IVC) KENNEDY et
al. 1983
d7 - d9- Embryonen
1,0 M 1,4 M
6 Schritte 6 Schritte
0,0 M 0,0 M
60,0% ÜR (nach 12 - 14 h IVC) 52,0% ÜR (nach 12 - 14 h IVC) NIEMANN
1985
1,4 M 1,0 M
3 Schritte 3 Schritte
0,3 M 0,5 M
51,0% TR 40,5% TR BIELANSKY
et al. 1986
Morulae u.
Blastozysten
1,5 M 1,5 M
6 Schritte 1 Schritt
0,0 M 1,0 M
17,0% ÜR (nach 24 h IVC) 32,0% ÜR (nach 24 h IVC) DEL CAMPO
et al. 1990
d7-Embryonen 1,5 M 1,5 M
3 Schritte 1 Schritt
0,3 M 1,0, 0,5 u. 0,3 M
79,0% ÜR (nach 24 h IVC) 67,0, 72,0 bzw. 58,0% ÜR (nach 24 h IVC)
HRUSKA 1991 d7-Embryonen 1,5 M 1 Schritt 1,1 M 49,0% TR
LANDSVERK et al. 1992
Morulae u.
Blastozysten
1,4 M 1,4 M
3 Schritte 1 Schritt
0,25 M 1,0 M
44,0% TR 63,0% TR PALASZ et al.
1992
Morulae u. frühe Blastozysten
1,5 M 1,5 M
1 Schritt (in Paillette) 1 Schritt (in Paillette)
0,5 M 1,0 M
39,2% ÜR 43,5% ÜR HASLER et al.
1995
d7- u. d8-IVP- Embryonen
1,4 M 4 Schritte 0,3 M 42,0 bzw. 20,0% TR
THONON et al.
1995
IVP-Blastozysten 1,4 M (+ 0,25 M Suc) 1,4 M
1 Schritt 4 Schritte
0,25 M 0,0 M
27,7% ÜR (nach 24 h IVC) 60,7% ÜR (nach 24 h IVC) LOONEY et al.
1996
d6,5 - d7,5- Embryonen
1,4 M 4 Schritte 0,3 M 69,6% TR
KLING 1997 1,4 M 4 Schritte 0,3 M 49,02% TR
ARRESEIGOR et al. 1998
Morulae u.
Blastozysten
1,4 M 1,4 M
3 Schritte 1 Schritt
0,3 M 1,0 M
45,9% TR 47,2% TR Abkürzungen:
IVP = in vitro-Produktion d = Tag
Suc = Sucrose TR = Trächtigkeitsrate
ÜR = Überlebensraten(Anteil Embryonen ohne sichtbare morphologische IVC = in vitro-Kultur
Schäden an Gesamtzahl der tiefgefrorenen / aufgetauten Embryonen nach IVC (NIEMANN et al. 1982))
2.2.1.2. Dimethylsulfoxid (DMSO)
Die Schutzwirkung von DMSO (physikalisch-chemische Eigenschaften s. Tab. 1) beim Tiefgefrieren von Zellen wurde zum ersten Mal von LOVELOCK und BISHOP (1959) beschrieben. Beim ersten erfolgreichen Tiefgefrierversuch, den WHITTINGHAM et al. (1972) mit Mäuseembryonen durchführten, erschien DMSO dem Glycerin überlegen. BANK u.
MAURER (1974) und MAURER u. HASEMAN (1976) benutzten es erfolgreich zum Tiefgefrieren von Kaninchenembryonen, WILLADSEN et al. (1978) und BILTON ( 1980) zum Tiefgefrieren von Rinderembryonen und TROUNSON u. MOHR (1983) zum Tiefgefrieren von humanen Embryonen.
DMSO dringt in die embryonalen Zellen nicht so schnell wie Wasser ein (VOELKEL u. HU 1992a), im Vergleich zum Glycerin jedoch schneller (TROUNSON u. MOHR 1983; AGCA et al. 1997). Eine wichtige Eigenschaft des DMSO ist laut MERYMAN (1971) seine vollständige Penetration in die Zellen. Dies ist nach MIYAMOTO et al. (1998) für die Kryoprotektion auch notwendig, da DMSO seinen Schutz allein in der extrazellulären Lösung nicht entfalten kann.
Eine DMSO-Konzentration von 1 M bietet nach LEIBO u. MAZUR (1978) noch keine ausreichende Kryoprotektion. Andere Autoren unterstützten mit ihren Ergebnissen diese Aussage, in dem sie eine Konzentration von min. 1,5 M DMSO bei den verschiedenen Spezies beim konventionellen Tiefgefrieren für notwendig halten (s.Tab.3) (BANK u. MAURER 1974;
FORGRAVE et al. 1977 und WILLADSEN 1980).
Die Veränderungen von Osmolarität und pH-Wert im Vergleich zu PBS zeigen, daß DMSO in Konzentrationen, die für eine Kryoprotektion erforderlich sind, einen größeren osmotischen Streß und größere Veränderungen des pH-Werts als Glycerin verursacht (LEHN-JENSEN 1980) und somit schneller als Glycerin toxisch wirkt (FRIEDLER et al. 1988). Bei vergleichenden Untersuchungen von DMSO und Glycerin beim konventionellen Tiefgefrieren konnte bei Mäuseembryonen (FALGE et al. 1982) und bei Rinderembryonen (WILLADSEN
1980; BOUYSSOU u. CHUPIN 1982; LEHN-JENSEN 1984) eine Verbesserung der Überlebensraten durch den Einsatz von Glycerin erreicht werden.
DMSO besitzt eine große Fähigkeit zur Glasbildung (FRIEDLER et al. 1988; VALDEZ et al.
1992). Daher ist es eine bevorzugte Komponente in Vitrifikationslösungen (ISHIMORI et al.
1992 u. 1993; VICENTE u. GARCIA-XIMENEZ 1994).
(DMSO) als Kryoprotektivum Autoren Entwicklungsstadium o.
Embryonenalter
Konzentration Ausverdünnungs- methode
Überlebens- raten
Bemerkungen LEHN-JENSEN u.
GREVE 1978
expandierte Blastozysten 1,5 M DMSO 43,8% TR
WILLADSEN et al.
1978
späte Morulae u. frühe Blastozysten
1,5 M DMSO 6 Schritte ER: 3/17
TR: 3/10 BILTON 1980 Morulae u. frühe
Blastozysten
1,5 M DMSO 6 Schritte 28,6% TR
SCHNEIDER et al.
1980
d6½-8-Embryonen 1,5 M DMSO 6 Schritte 29,0% TR
TERVIT u.
ELSDEN 1981
Morulae - expandierte Blastozysten
1,5 M DMSO 6 Schritte 25,0% TR
BOUYSSOU u.
CHUPIN 1982
Blastozysten 1,5 M DMSO 6 Schritte 31,0 bzw. 16,0%
ÜR
nach 24 bzw.
48 h IVC FRANKS et al.
1985
Blastozysten 1,5 M DMSO 1 o. 3 Schritte 25,4% ÜR nach 12 h IVC LEHN-JENSEN
1986
kompakte Morulae - expandierte Blastozysten
1,5 M DMSO 1 Schritt mit 1 M Suc 22,0% ÜR PRATHER et al.
1987
späte Morulae -
expandierte Blastozyste
1,5 M DMSO 6 Schritte o. 3 Schritte mit 0,5 M Suc
49,1% ÜR ÜR nach 12 h IVC VOELKEL u. HU
1992a
d7-7½-Embryonen 1,5 M DMSO direktes Ausverdünnen in PBS
35, 35 bzw. 25%
ÜR
nach 24, 48 bzw.
72 h IVC
Abkürzungen: TR = Trächtigkeitsrate ER = Entwicklungsrate
Suc = Sucrose IVC = in vitro-Kultur
ÜR = Überlebensrate
2.2.1.3. Propanediol
Propanediol (s. Tab.1) besitzt eine höhere Tendenz zur Bildung eines glasartigen Zustands als Glycerin oder DMSO. Dadurch senkt es die Menge an intrazellulärem Eis, die während des langsamen Tiefgefrierens gebildet wird (RENARD u. BABINET 1984; FRIEDLER et al.
1988). Bei Embryonen werden überwiegend Konzentrationen von 1,5-1,6 M Propanediol eingesetzt (SUZUKI et al. 1990).
Die Substanz kommt überwiegend bei Embryonen und Oozyten von Mäusen und Menschen zur Anwendung, wo die Eignung als Kryoprotektivum bei Embryonen durch zahlreiche Untersuchungen dokumentiert wurde (RENARD u. BABINET 1984; HERNANDEZ- LEDEZMA et al. 1988; KO u. THRELFALL 1988; HERNANDEZ-LEDEZMA u. WRIGHT 1990, SHAW et al. 1995).
Hingegen zeigen die Ergebnisse verschiedener Untersuchungen nur eine geringe Eignung von Propanediol für die Kryoprotektion von Rinderembryonen. Beim Vergleich verschiedener Kryoprotektiva (Ethylenglykol, DMSO und Glycerin) mit Propanediol lagen die in vitro- Überlebensraten mit Propanediol nach konventionellem Tiefgefrieren und direktem Ausverdünnen von Rinderembryonen sowie nach ultraschnellem Tiefgefrieren in Konzentrationen von 3 M deutlich unter denen der anderen Kryoprotektiva (VOELKEL u. HU 1992a, GUTIERREZ et al. 1993b). Auch im Vergleich von Propanediol mit Ethylenglykol beim Tiefgefrieren von in vitro produzierten Rinderembryonen wurde mit Propanediol eine deutlich niedrigere Schlupfrate als mit Ethylenglykol erzielt (TAKAGI et al. 1994b). Beim Vergleich des Einflußes verschiedener Kryoprotektiva auf die Überlebensfähigkeit von ICM (inner cell mass)-Zellen von in vitro produzierten Rinderembryonen erwies sich Propanediol toxischer als Glycerin und Sucrose, Ethylenglykol und Methylcellulose (TAKAGI et al.
1994a). Die Überlebensraten von Rinderembryonen nach konventionellem Tiefgefrieren mit Propanediol finden sich in Tabelle 4.
Propanediol erwies sich auch bei alleiniger Verwendung in hohen Konzentrationen bei der Vitrifikation von Mäuseembryonen als toxisch. Als Komponente in einer Vitrifikationslösung (VS 1), die aus penetrierenden (DMSO, Acetamid, Propanediol) und nicht penetrierenden Kryoprotektiva (Polyethylenglykol) bestand, trug es hingegen dazu bei, die Konzentration der übrigen Kryoprotektiva zu senken (RALL u. FAHY 1985; FRIEDLER et al. 1988). Auch bei IVF-Rinderblastozysten wurde nach Equilibrierung in 40% Propanediol, Ethylenglykol oder Glycerin jeweils mit 30% Ficoll und 0,5 M Sucrose für 2 min mit Propanediol eine deutlich niedrigere Schlupfrate (24%) als bei den anderen beiden Kryoprotektiva erreicht (TACHIKAWA et al. 1993). GAJDA u. SMORAG (1993) hingegen konnten bei der Vitrifikation von Kaninchenembryonen durch Erhöhung der Propanediol-Konzentration von 35 auf 50% eine Steigerung der Überlebensraten von 1-Zell- wie auch 2-Zell- Kaninchenembryonen erzielen.
(PROH) als Kryoprotektivum Autoren Entwicklungsstadium
o. Embryonenalter
Konzentration des Kryoprotektivums
Ausverdünnungs- methode
Überlebensraten Bemerkungen RENARD et al.
1981a
d8-Blastozysten 2,0 M PROH 40,0% SR SR nach 20 h IVC
SUZUKI et al.
1990
d7-Embryonen 1,6 M PROH DT mit 0,2 M Suc in Paillette
61,0% TR
SEIDEL et al.
1992
d7-Embryonen 1,0 M PROH DT 40,0% TR
TAKAGI et al.
1993
Blastozysten u. expan- dierte Blastozysten
1,6 M PROH direktes Ausver- dünnen in PBS
31,0, 41,5 bzw.
40,0% SR
IVP, nach 10, 20 u.
40 min Equilibrierung, SR zu geschlüpften
Blastozysten TAKAGI et al.
1994b
Blastozysten u. expan- dierte Blastozysten
1,6 M PROH direktes Ausver- dünnen in PBS
51,2 bzw. 40,0%
SR bei d7- bzw.
d8-Embryonen
IVP
YAMAMOTO et al. 1996
Blastozysten 1,6 M PROH direktes Ausver- dünnen in PBS
94,0% ÜR bzw.
77,0% SR
IVP
Abkürzungen: SR = Schlupfrate IVP = in vitro-Produktion
IVC = in vitro-Kultur ÜR = Überlebensrate
DT = Direkttransfer PBS = Phosphat-Buffered-Solution
2.2.1.4. Ethylenglykol
Ethylenglykol besitzt ein niedrigeres Molekulargewicht als Glycerin, DMSO und Propanediol (s. Tab.1). Dies ist Voraussetzung für eine schnelle Penetration von Ethylenglykol in die Zelle hinein und aus der Zelle heraus. Diese hohe Permeabilität und die darausfolgende geringere Toxizität auch bei hohen Konzentrationen sind wichtige Vorteile gegenüber anderen Kryoprotektiva (MAHMOUDZADEH et al. 1993; CSEH et al. 1997).
Die kryoprotektive Wirkung von Ethylenglykol wurde erstmals beim kontrollierten Tiefgefrieren von 8-Zell-Mäuse- und Rattenembryonen gezeigt (MIYAMOTO u. ISHIBASHI 1977). In zahlreichen Untersuchungen wurden die Überlebensraten von Embryonen vom Rind und auch vom Schaf nach konventionellen Tiefgefrieren mit Ethylenglykol oder Glycerin verglichen. Dabei erhielt man bei Verwendung von Ethylenglykol im Vergleich zur Verwendung von Glycerin gleichwertige oder höhere Überlebensraten (COCERO et al. 1988;
LANGE 1995; KLING 1997; BEAL et al. 1998).
VOELKEL u. HU (1992a; 1992b) verwendeten Ethylenglykolkonzentrationen zwischen 1,0- 2,0 M beim konventionellen Tiefgefrieren von Rinderembryonen im Stadium von Morula bis zur expandierten Blastozyste. Dabei erwies sich eine Konzentration von 1,5 M Ethylenglykol als am geeignetsten. STREICHER (1998) erhielt nach konventionellem Tiefgefrieren von in vitro produzierten Rinderembryonen ähnliche Ergebnisse. Er verwendete 10% (= 1,8 M) und 20% (= 3,6 M) Ethylenglykol. Nach in vitro-Kultur war die Schlupfrate bei Verwendung von 10% Ethylenglykol (46,3%) höher als bei Verwendung von 20% Ethylenglykol (24,5%).
SOMMERFELD u. NIEMANN (1999) equilibrierten in vitro produzierte Tag 7- Rinderblastozysten für 10 min in Ethylenglykol-Lösungen mit Konzentrationen von 1,8 bis 8,9 M bei Raumtemperatur. Mit 98% wurde die höchste Schlupfrate nach 72 h in vitro-Kultur bei einer Konzentration von 3,6 M Ethylenglykol erzielt. Nach Equilibrieren und Ausverdünnen in einem Schritt erwies sich 3,6 M Ethylenglykol auch beim konventionellem Tiefgefrieren von in vitro produzierten Rinderembryonen als die optimale Konzentration.
Ethylenglykol diffundiert schneller als Glycerin durch die Zellmembran. Die in vitro- Überlebensraten von Schafembryonen wurden nach Tiefgefrieren mit 1,5 M Ethylenglykol nicht durch die unterschiedliche Anzahl von Stufen bei der Equilibrierung und auch bei der Ausverdünnung beeinflußt (McGINNIS et al. 1989). Da Ethylenglykol auch bei höheren Temperaturen eine weitaus geringere toxische Wirkung als Glycerin aufwies, kann der aufwendige und schrittweise Ausverdünnungsvorgang des Kryoprotektivums nach dem Auftauen entfallen. Ein Direkttransfer der mit Ethylenglykol tiefgefrorenen Rinderembryonen ist möglich (VOELKEL u. HU 1992b). Die Praktikabilität (weniger Zeit- und Materialaufwand) wurde in mehreren Untersuchungen bei Rinderembryonen mit guten Ergebnissen bestätigt (Mc INTOSH u. HAZELAGER 1994; BRACKE et al. 1995; DOCHI et al. 1995; JANOWITZ u. HERMANNS 1995; LANGE 1995). Tabelle 5 zeigt Überlebensraten von Rinderembryonen nach konventionellem Tiefgefrieren bei Verwendung von Ethylenglykol.
Ethylenglykol wird sowohl beim konventionellen Tiefgefrieren wie auch bei der Kryokonservierung durch direktes Überführen in flüssigen Stickstoff (Vitrifikation und ultraschnelles Gefrieren) verwendet. Auch bei der Vitrifikation erwies es sich im Vergleich zu anderen Kryoprotektiva als weniger toxisch. Bei Rinderembryonen konnten mit einer Vitrifikationslösung, die Ethylenglykol enthielt (7,15 M Ethylenglykol, 2,5 M Ficoll und 0,3 M Sucrose) und in einem Schritt hinzugefügt wurde, deutlich höhere in vitro-Überlebensraten als mit anderen Vitrifikationslösungen, bestehend aus DMSO, Acetamid, Propanediol und Polyethylenglykol bzw. Glycerin und Propanediol, erreicht werden (MAHMOUDZADEH et al. 1993). Mit einer Lösung, die 40% Ethylenglykol enthielt und der ein Makromolekül (30%
Ficoll) sowie ein nicht penetrierendes Kryoprotektivum (0,5 M Sucrose) beigefügt wurden, konnten Mäuseembryonen und in vitro produzierte Rinderembryonen erfolgreich kryokonserviert werden (KASAI et al. 1990; TACHIKAWA et al. 1993; MARTINEZ et al.
1998).
Die Verwendung von Ethylenglykol als penetrierendes Kryoprotektivum in einer Vitrifikationslösung, bestehend aus 6,0 M Ethylenglykol und 1,8 M Glycerin, wird als Grund für die guten Überlebensraten nach Vitrifikation von Schafembryonen angesehen. Nach
Transfer von jeweils zwei Embryonen auf einen Empfänger lag die Trächtigkeitsrate bei 55%
für Morulae und 62% für Blastozysten (ALI u. SHELTON 1993a).
Kryoprotektivum
Autoren Entwicklungsstadium o. Embryonenalter
Konzentration des Kryoprotektivums
Ausverdünnungs- verfahren
Überlebens- raten
Bemer- kungen VOELKEL u. HU
1992b
Morulae - expandierte Blastozysten
1,5 M EG DT 50,0% TR
McINTOSH u.
HAZELEGER 1994
Morulae u. Blastozysten 1,5 M EG DT 59,0% TR
BRACKE et al.
1995
1,5 M EG DT 57,7% TR
DOCHI et al.
1995
Morulae u. Blastozysten 1,8 M EG
1,8 M EG + 0,25 M Suc DT DT
69,0% TR 52,0% TR
CSEH et al. 1995 d7-d10-Embryonen 1,8 M EG direkt in PBS 40,0-73,6% ÜR IVP
JANOWITZ u.
HERMANNS 1995
1,5 M EG DT 55,8% TR
LANGE 1995 Morulae u. Blastozysten 1,5 M EG DT 58,2% TR
RODRIGUES et al. 1995
d7-u. d8-Blastozysten 1,5 M EG 3,6 M EG
direkt in PBS
in 1,8 M EG + 1,0 M Suc
68,0 bzw. 70,0% ÜR 87,0% ÜR,
73,0% ER
IVP
HASLER et al.
1996
1,5 M EG direkt in PBS 68,0 bzw. 60,0% ER IVP
LOONEY et al.
1996
1,5 M EG DT 50,0% TR
KLING 1997 Morulae u. Blastozysten 1,5 M EG DT 50,8% TR
SOMMERFELD 1997
expandierte Blastozysten 3,6 M EG DT 23,8% TR IVP
YANG et al. 1997 Blastozysten u.
expandierte Blastozysten
1,8 M EG
1,8 M EG + 0,1 M Suc
direkt in PBS 60,9% SR 45,8% SR
IVP
ARRESEIGOR et al. 1998
Morulae u. Blastozysten 1,5 M EG DT 47,4% TR
BEAL et al. 1998 DT 59,6% TR
LANE 1998 Blastozysten 1,5 M EG DT 29,0% TR IVP
STREICHER 1998
Blastozysten 1,8 M EG,
1,8 M EG + 0,2 M Suc, 3,6 M EG
in PBS + 0,3 M Suc 46,3% SR 37,5% SR 24,5% SR
IVP
MARTINEZ et al.
1999
Morulae u. Blastozysten 1,5 M EG (+ 0,1 M bzw.
0,3 M Suc)
DT 29,0, 39,0 bzw
29,0% TR
Abkürzungen: EG = Ethylenglykol
DT = Direkttransfer TR = Trächtigkeitsrate Suc = Sucrose
ÜR = Überlebensrate ER = Entwicklungsrate IVP = in vitro-Produktion SR = Schlupfrate
d = Tag
PBS = Phosphat-Buffered-Solution
Andere Untersucher erreichten durch Kombination von Ethylenglykol mit DMSO gute Überlebensraten bei der Vitrifikation von Embryonen verschiedener Spezies (ISHIMORI et al.
1992; ISHIMORI et al. 1993; VICENTE u. GARCIA-XIMENEZ 1994; VICENTE u.
VIUDES-DE-CASTRO 1997; LANE et al. 1998). Dabei wurden Ethylenglykol bzw. DMSO in einer Konzentration von 20-25% eingesetzt.
Eine 40% (= 7,2 M) Ethylenglykol-Lösung erlaubte eine Vitrifikation von Rinderembryonen, eine Lösung mit 37,5% gewährleistete jedoch keine ausreichende Vitrifikation (DARVELID et al. 1994). Durch Hinzufügen eines Makromoleküls konnte dies verbessert werden. VAJTA et al. (1996) hielten eine alleinige Verwendung von Ethylenglykol in hohen Konzentrationen, wie sie bei der Vitrifikation notwendig ist, für zu toxisch. Dagegen erzielte SOMMERFELD (1997) nach Vitrifikation von IVP-Rinderembryonen mit 7,2 M Ethylenglykol eine gute in vitro-Entwicklungsrate.
Eine gute Kryoprotektion von Ethylenglykol konnte auch bei ultraschnellem Gefrieren von Mäuse- und Rinderembryonen nachgewiesen werden. Hohe in vitro-Überlebensraten wurden beim ultraschnellen Tiefgefrieren von Ein-Zell-Mäuseembryonen nach 10 min Equilibrierung in 3 M Ethylenglykol mit 0,25 M Sucrose erreicht (RAYOS et al. 1992). Nach ultraschnellem Gefrieren von expandierten Mäuseblastozysten waren die Schlupfraten bei Verwendung von 7 M Ethylenglykol im Vergleich zu 7 M Propanediol nach vorausgegangenem Dehydrieren mit Sucrose deutlich höher (NOWSHARI u. BREM 1998). In vitro produzierte Rinderembryonen wurden mit 20% Ethylenglykol und 0,3 M Sucrose bzw. Trehalose ultraschnell tiefgefroren und anschließend direkt übertragen. Nach Transfer von je zwei Embryonen auf einen Empfänger wurden zwei der vier Empfänger trächtig, und nach in vitro-Kultur lagen die Schlupfraten bei 63 bzw. 64% (MATSUOKA et al. 1995).
2.2.2. Nicht penetrierende Gefrierschutzmittel
Nicht penetrierende Gefrierschutzmittel dringen nicht in die Zellen ein, sondern üben ihre Schutzwirkung im extrazellulären Raum aus. Dabei werden sie nur in niedrig molaren Konzentrationen eingesetzt und sind deshalb auch weniger toxisch als penetrierende Gefrierschutzmittel (NIEMANN u. MEINECKE 1993). Diese nicht penetrierenden Kryoprotektiva werden auch während der Equilibrierungsphase genutzt, um die Dehydration zu unterstützen, aber auch während der Ausverdünnungsphase, um ein zelluläres Anschwellen zu begrenzen (FRIEDLER et al. 1988).
Nach MERYMAN (1971) liegt der Einfluß der nicht penetrierenden Kryoprotektiva darin, die Zellmembranen zu befähigen, gelöste Stoffe unter osmotischen Streß reversibel penetrieren zu lassen.
SEIDEL (1989) sieht die Wirkung der nicht penetrierenden Kryoprotektiva schon vor Beginn der Kühlung. Durch die Zugabe von 0,2-0,3 M Sucrose kommt es zu einer Vordehydrierung und das Umsetzen in flüssigen Stickstoff kann schon bei höheren Temperaturen erfolgen, da eine geringere Dehydration während des langsamen Kühlens notwendig ist.
Der Einsatz von nicht penetrierenden Kryoprotektiva soll besonders bei großen Kühlraten effektiv sein, da hier eine schnelle Dehydrierung der Zellen notwendig ist (MERYMAN et al.
1977).
2.2.2.1. Sucrose
Sucrose gehört zur Gruppe der nicht penetrierenden Gefrierschutzmittel (physikalisch- chemische Eigenschaften s. Tab.6). Ein wichtiges Einsatzgebiet der Sucrose liegt im Entfernen der penetrierenden Gefrierschutzmittel aus den aufgetauten Embryonen. Es kommt zum Einströmen von Wasser in den Embryo, wenn die extrazelluläre Konzentration des penetrierenden Kryoprotektivums verringert wird. Dies geschieht beim Umsetzen in eine hypoosmolare Lösung, z. B. wenn Embryonen, equilibriert in 1,5 M Glycerin, direkt in PBS (Phosphat-Buffered-Solution) umgesetzt werden. Wasser fließt dann sehr schnell in den Embryo ein. Durch dieses Anschwellen kann der Embryo geschädigt werden. So lange das maximal tolerierbare Volumen des Embryos nicht überschritten wird, kommt es jedoch zu keiner Schädigung. Mäuseblastozysten tolerieren das ca. 2,7-fache ihres isotonischen Volumens für 30 min bei 23°C (SCHNEIDER u. MAZUR 1984).
Sucrose dient hier als osmotischer Puffer, in dem sie der anfangs hohen intrazellulären Osmolarität des penetrierenden Kryoprotektivums entgegenwirkt. Durch die Verringerung der extrazellulären Konzentration des penetrierenden Kryoprotektivums kontrolliert die Sucrose- Lösung den Grad des Anschwellens des Embryos. Das Kryoprotektivum verläßt die Zelle.
Dadurch wird das osmotische Equilibrium aufrechterhalten. Währenddessen verliert der Embryo Wasser und schrumpft. Beim Gebrauch von Sucrose kann der Embryo bis auf 25%
seines Ausgangsvolumens schrumpfen. Nach dem Umsetzen in physiologisches Medium oder Kulturmedium erreicht er dann wieder sein ursprüngliches Volumen (SZELL u. SHELTON 1986; VOELKEL u. HU 1992a).
Die Reaktion der Embryonen auf die Sucrose-Lösung (Schrumpfen gefolgt von Reexpansion) ist ein Zeichen für die normale Funktion der Zellmembran und kann als Indikator für die Lebensfähigkeit der Embryonen gewertet werden (BIELANSKY et al. 1986).
Besonders häufig wird Sucrose in isomolarer Konzentration beim Ausverdünnen von Glycerin eingesetzt. So ist z. B. eine 1,12 M Sucrose-Lösung isomolar zu einer 1,5 M Glycerin-Lösung (SCHNEIDER u. MAZUR 1984)
Sucrose Trehalose Ficoll PVA PVP aus einem Glucose- und
Fructose-Molekül bestehendes Disaccharid;
wirkt nicht reduzierend, da beide Hydroxylgruppen durch Glykosidbindungen blockiert sind1 (BEYER
u.WALTER 1984)
C12H22O11 2 (NEUMÜLLER 1987)
Molekulargewicht:
342,32
Schmelzpunkt:
185°C2
geruchloses, weißes, kristallines Pulver, schmeckt sehr süß2 leicht löslich in Wasser, wenig löslich in Alkohol, unlöslich in Ether2
Disaccarid, das aus zwei Glucosebausteinen besteht und wie Sucrose nicht zu den
reduzierenden Zuckern gehört (ARNI 1998)
C12H22O11•2H2O 2 Molekulargewicht:
378,32
Schmelzpunkt:
97°C2
farblos, süß schmeckend
2
löslich in Wasser und heißem Alkohol, unlöslich in Ether2
aus Sucrose und Epichlorhydrin hergestelltes,
hydrophiles Polymer2
Molekulargewicht:
70000 (Ficoll 70) bzw.
400000 (Ficoll 400)2
schwach gelbe, nicht ganz klare Flüssigkeit
(Produktinformation Ficoll 400, Fa.
Sigma, St. Louis, USA)
entsteht durch Umesterung des Polyvinylesters mit Methanol1 (BEYER u.
WALTER 1984)
Polymerisate der allgemeinen Formel:
-(CH(OH)-CH2)-n 2
Molekulargewicht:
18000-2000002
handelsübliches PVA ist ein weißes bis elfenbein- farbenes Pulver2
leicht in Wasser löslich, bildet visköse Lösung, in den meisten organischen Lösungsmitteln nicht löslich2
inertes (reaktionsträges) Polymer (Wegner 1996)
mit der allgemeinen Formel:2
-(CH-CH2)-n
N
O mittleres relatives Molekulargewicht:
250001
Glastemperatur
(Temperatur, bei der ein amorpher Festkörper aus dem flüssigen in den Glaszustand übergeht und umgekehrt): 175°C2 weißes, hygroskopisches Pulver; löst sich in Wasser unter leicht saurer Reaktion ebenso wie in Alkohol gut, jedoch nicht in Ether2
Glycerin kann stufenweise mit oder ohne Sucrose ausverdünnt werden. Eine Vereinfachung und zeitliche Verkürzung des Ausverdünnungsprozesses wird durch das Ausverdünnen mit Sucrose in einem Schritt erreicht (NIEMANN 1983). Dies konnte mit gleich guten oder besseren Ergebnissen durch Untersuchungen bei Rinderembryonen belegt werden (s. Tab.2).
Die Überlebensraten waren hoch, wenn eine Konzentration von 1,0 M Sucrose zum Ausverdünnen des Glycerins in einem Schritt verwendet wurde. MERRY et al. (1983) erzielten nach Ausverdünnen mit 1,0 M Sucrose nach dem Tiefgefrieren von Mäuseembryonen mit 1,0 M Glycerin in vitro-Entwicklungsraten zu expandierten Blastozysten von 60,5%. Beim Tiefgefrieren mit 1,5 M Glycerin und Ausverdünnen mit 1,0 M Sucrose entwickelten sich 87,0% der frühen Mäuseblastozysten zu expandierten Blastozysten (HERNANDEZ- LEDEZMA et al. 1988b). DEL CAMPO et al. (1990) erreichten nach Ausverdünnen von 1,5 M Glycerin mit 1,0 M bzw. 0,5 M Sucrose in vitro-Überlebensraten von Rinderembryonen von 64 bzw. 71%. In Versuchen von SUZUKI et al. (1990) überlebten in vitro 82 bzw. 88%
der Rinderembryonen das Ausverdünnen von 1,4 M Glycerin nach dem Tiefgefrieren mit 0,4 bzw. 0,8 M Sucrose. Bei niedrigeren Konzentrationen sanken auch die Überlebensraten.
MAPLETOFT et al. (1989) untersuchten den Einfluß verschiedener Sucrose-Konzentrationen auf die in vitro-Überlebensfähigkeit von frisch gewonnenen Mäuseembryonen. Dabei wurde die Temperatur (20 bzw. 35°C) und die Zeit (10 oder 30 min), die die Embryonen dieser Lösung ausgesetzt waren, berücksichtigt. Der Einfluß von Temperatur und Zeit auf die Überlebensfähigkeit der Embryonen war bei einer 0,5 M Sucrose-Lösung nur gering. Bei Verwendung der 1,0 M Sucrose-Lösung nahmen die Überlebensraten bei Erhöhung der Temperatur und Verlängerung der Equilibrierungszeit ab. Bei Equilibrierung in 2,0 M Sucrose wurde die in vitro-Überlebensfähigkeit stark reduziert.
TAKEDA et al. (1987) stellten nach Ausverdünnen des Glycerins aus 8-Zell-Mäuseembryonen mit zunehmender Sucrose-Konzentration (0,0-1,3 M) auch eine steigende Zahl von Embryonen mit Schäden der Zona pellucida fest.
Eine weitere Vereinfachung der Methode des Ausverdünnens von Glycerin mit Sucrose wurde von LEIBO (1983) beschrieben. In der Paillette befindet sich neben der Säule mit dem Embryo
im Tiefgefriermedium eine weitere Säule mit Sucrose. So kann das Ausverdünnen durch Vermischen der beiden Säulen nach dem Auftauen in der Paillette erfolgen. Diese Methode wird als One-Step-Methode bezeichnet. HOOGENKAMP (1984) und SCHUBERTH (1984) variierten das Verhältnis von Glycerin und Sucrose in der Paillette und erreichten die besten Überlebensraten bei Rinderembryonen mit einem Glycerin / Sucrose-Verhältnis von 1:2. CSEH et al. (1994) benutzten ein Glycerin / Sucrose-Verhältnis von 1:9 und erhielten eine Trächtigkeitsrate von 38% nach Transfer.
Sucrose wird auch zur Dehydration von Embryonen bei Raumtemperatur benutzt (LEHN- JENSEN 1984). MASSIP et al. (1987) hielten bei alleiniger Verwendung von Glycerin ein langsames Kühlen bis -35°C vor dem Umsetzen in flüssigen Stickstoff für notwendig. Durch Hinzugabe von 0,2-0,3 M Sucrose zur Glycerin-Lösung konnte das Umsetzen bei höheren Temperaturen und somit früher erfolgen, da die Embryonen durch die Sucrose bereits stark dehydriert waren und eine geringere Dehydration während des langsamen Kühlens benötigten (SEIDEL 1989). Nach LEIBO (1989) ist eine Dehydration durch Sucrose alleine nicht ausreichend für das Überleben der Embryonen, da Sucrose alleine keine ausreichende Kryoprotektion leistet.
Auch beim ultraschnellen Tiefgefrieren von Rinder- und Mäuseembryonen wird die Fähigkeit von Sucrose zur Dehydration von Zellen ausgenutzt. Dabei wird Sucrose in einer Konzentration von 0,25 M in Kombination mit 3 M Ethylenglykol (RAYOS et al. 1992a;
RAYOS et al. 1992b) und in einer Konzentration von 0,5 M mit 3,5 M Glycerin (THOMAS et al. 1989) eingesetzt. Nach dem Auftauen wird abermals in Sucrose ausverdünnt.
Sucrose findet als Bestandteil in Vitrifikationslösungen eine weitere Verwendung. Von KASAI et al. (1990) und KASAI (1996) wurde eine Lösung beschrieben, die Agentien aus drei verschiedenen Kategorien enthält: Ethylenglykol als penetrierendes Kryoprotektivum, das Makromolekül Ficoll und 0,5 M Sucrose als nicht penetrierende Komponenten. Sucrose reduziert in Kombination mit Ficoll die Toxizität der Lösung, da es ein schnelles Schrumpfen der Embryonen und eine Reduktion der Ethylenglykol-Konzentration in den Zellen verursacht.
TADA et al. (1993) berichteten von einer Vitrifikationsmethode mit den beiden penetrierenden Kryoprotektiva DMSO und Propanediol (je 2,75 M). Durch Zugabe von Sucrose bzw.
Raffinose (einem weiteren Disaccharid) konnte die Überlebensfähigkeit der 2-Zell- Mäuseembryonen gesteigert werden. SAITO et al. (1994) erhielten durch Zugabe von Sucrose und Dextrose zu einer Vitrifikationslösung bestehend aus Glycerin und Ethylenglykol höhere Überlebensraten nach Vitrifikation von IVP-Rinderblastozysten. KUWAYAMA et al. (1994a) und KUWAYAMA (1995) fügten einer Vitrifikationslösung aus Glycerin und Ethylenglykol Sucrose und Eigelb hinzu. Dadurch wurden hohe in vitro-Überlebensraten von in vitro produzierten Rinderblastozysten (73%) nach Ausverdünnen in der Paillette erreicht.
2.2.2.2. Trehalose
Trehalose (s. Tab.6) ist neben der Sucrose ein weiteres Disaccharid, das in der Kryokonservierung eingesetzt wird.
SMORAG et al. (1990) untersuchten den Einfluß von Sucrose und Trehalose auf die Überlebensfähigkeit von Zwei-Zell-Kaninchenembryonen. Dabei waren die in vitro- Entwicklungsraten zu Morula- und Blastozystenstadien sowohl bei 20°C wie auch 38°C bei Verwendung von 1,45 M Trehalose deutlich höher (53,2 gegenüber 15,9% bzw. 55,5 gegenüber 0,0%) als bei Verwendung von 2,0 M Sucrose. Dies wurde auf einen besseren stabilisierenden Einfluß der Trehalose auf die Zellmembranen zurückgeführt, der jedoch spezies- und zellstadiumabhängig zu sein scheint.
Bei unreifen Rinderoozyten wurde eine Beeinträchtigung der Entwicklungsfähigkeit nach dem Tiefgefrieren durch Trehalose und Sucrose beobachtet. Nur sehr wenige (6%) Oozyten konnten nach Auftauen in vitro gereift werden (NIEMANN 1991a).
Bei der Vitrifikation von unreifen Rinderoozyten konnte die Konzentration von Trehalose ohne Einfluß auf die Überlebensfähigkeit bis auf 1,0 M erhöht werden, während Sucrose in dieser Konzentration zu einem erhöhten Anteil degenerierter Oozyten führte (ARAV et al. 1991).
Trehalose wurde als Komponente in der Vitrifikationslösung bei der Vitrifikation von IVF- Rinderblastozysten verwendet. Mit 40% Ethylenglykol, 0,3 M Trehalose und 20%
Polyvinylpyrrolidon konnten Schlupfraten von 43% erreicht werden (SAHA et al. 1996).
KRAG et al. (1985) setzten Sucrose oder Trehalose in Kombination mit Glycerin bei Mäuseembryonen und MATSUOKA et al. (1995) in Kombination mit Ethylenglykol bei in vitro produzierten Rinderembryonen ein. Es konnten keine Unterschiede bei den Überlebensraten beim Gebrauch von Sucrose oder Trehalose festgestellt werden. Mit der Kombination DMSO und Trehalose konnte ROBERTSON et al. (1989) beim ultraschnellen Tiefgefrieren von Mäuseembryonen bessere Resultate erzielen als mit der Kombination DMSO und Sucrose.
2.2.2.3. Ficoll
Ficoll ist ein nicht organisches Makromolekül (s. Tab.6). Es erlaubt eine Reduktion der Konzentration des penetrierenden Kryoprotektivums bei der Vitrifikation, was toxische und osmotische Effekte verringert. Durch Hinzugabe von Ficoll kann die für die Vitrifikation von in vitro produzierten Rinderembryonen benötigte Konzentration eines penetrierenden Kryoprotektivums gesenkt werden. Eine 40% v/v Ethylenglykol-Lösung erlaubt eine Vitrifikation. Eine Lösung mit einer Ethylenglykol-Konzentration von 37,5% v/v erwies sich für eine vollständige Vitrifikation als nicht ausreichend. Wird der Lösung jedoch ein Makromolekül, z. B. 15% Ficoll hinzugefügt, ist bereits mit einer 37,5% v/v Ethylenglykol- Lösung eine Vitrifikation möglich (DARVELID et al. 1984).
KASAI et al. (1990) und PALASZ et al. (1997) zeigten, daß durch Ficoll eine Rekristallisation während des Erwärmens verhindert wird. Ficoll wurde besonders bei der Vitrifikation in Kombination mit Ethylenglykol und Sucrose zuerst von KASAI et al. (1990) bei Mäuseembryonen, später auch bei Rinderembryonen eingesetzt (MIYAKE et al. 1993; ZHU et al. 1993; KASAI 1996; PALASZ et al. 1997). Dabei wurden Konzentrationen von 15-30%
verwendet.
Auch beim ultraschnellen Tiefgefrieren können Makromoleküle wie Ficoll (oder auch PVP oder PVA) Serum erfolgreich ersetzen. Jedes Makromolekül beeinflußt die Penetrationsrate des Kryoprotektivums anders, so daß unterschiedliche Equilibrierungszeiten gewählt werden müssen (GUTIERREZ et al. 1993b).
2.2.2.4. Polyvinylpyrrolidon (PVP) und Polyvinylalkohol (PVA)
PVP und PVA sind Makromoleküle und gehören ebenfalls zu den nicht penetrierenden Kryoprotektiva (s. Tab.6).
WHITTINGHAM (1971) hielt PVP für ein wirksames Kryoprotektivum beim Tiefgefrieren von Mäuseembryonen. Er erzielte bei Verwendung von 8-Zell-Embryonen und frühen Blastozysten Entwicklungsraten zum Blastozystenstadium von 69,1%. Bei anderen Autoren galt PVP wegen seiner Toxizität in hohen Konzentrationen in Embryo-Kryoprotektivum- Mischungen als nicht nutzbar (WILMUT 1972; FRIEDLER et al. 1988).
4% PVP bzw. 4% PVA wurden als Ersatz für eine Serumzugabe als chemisch definierte Makromoleküle beim Tiefgefrieren von Rinderembryonen mit 10% Glycerin verwendet. Nach schrittweisem Ausverdünnen mit Sucrose lag die Trächtigkeitsrate nach Zugabe von PVA und PVP mit 31 bzw. 25% deutlich unter denen bei Verwendung von FCS (fetal calf serum) und BSA (bovine serum albumin). Hier wurden Trächtigkeitsraten von 57 bzw. 58% erreicht. Die Handhabung der Embryonen, die mit PVA und PVP tiefgefroren wurden, war schwieriger, da diese leichter an den Pipetten klebten. Dadurch kam es beim Herausfließen der Embryonen aus den Pailletten, besonders bei Verwendung von PVP, zu Verlusten oder Schäden der Embryonen (SEIDEL et al. 1990).
Beim Einsatz von PVA statt Serum neben Ethylenglykol beim kontrollierten Tiefgefrieren und bei der Vitrifikation beobachteten SOMMERFELD u. NIEMANN (1999) ein Absinken der Überlebensraten von in vitro produzierten Rinderembryonen. Bei der Vitrifikation von in vitro produzierten Rinderembryonen wurden neben 40% Ethylenglykol und 11,3% Trehalose PVP in verschiedenen Konzentrationen (0-12%) eingesetzt. Dabei wurden bei Verwendung von 12% PVP die höchsten Entwicklungs- und Schlupfraten erzielt. Von Makromolekülen wie PVP wird angenommen, daß sie ihre Schutzwirkung während der Vitrifikation und dem Auftauen entfalten, obwohl sie die embryonalen Zellen nicht penetrieren können. Vermutlich bedecken sie empfindliche Membranen und verhindern so die Denaturierung durch konzentrierte Salzlösungen, verzögern das Eiswachstum und verringern die Eiskristallbildung, da sie Wasser binden können (SAHA et al. 1996).
KOBAYASHI et al. (1994) setzten PVP bei der Kryokonservierung der extrem kälteempfindlichen Schweineembryonen ein. Bei Verwendung von 7% PVP in Kombination mit 8,0 M Ethylenglykol bei der Vitrifikation überlebten 41, 61 bzw. 23% der Blastozysten, der expandierten bzw. der geschlüpften Blastozysten nach 24 h in vitro-Kultur.
2.3. Tiefgefrierverfahren
Bei den Tiefgefrierverfahren werden kontrollierte Tiefgefrierverfahren, ultraschnelles Tiefgefrieren und die Vitrifikation unterschieden. Beim ultraschnellen Tiefgefrieren und bei der Vitrifikation handelt es sich um eine Nonequilibrium-Kryokonservierung. Der Embryo wird dem Kryoprotektivum nur für kurze Zeit ausgesetzt, so daß nicht genügend Zeit bleibt, ein Equilibrium zwischen intra- und extrazellulärer Lösung zu erreichen. Die Embryonen werden vor der Kühlung dehydriert, indem man sie einer Mischung aus penetrierenden und nicht penetrierenden Kryoprotektiva aussetzt (LEIBO 1989).
Zunächst wurden Glasampullen zum Verpacken der Embryonen verwendet, die später dann durch Plastikpailletten ersetzt wurden. Die Überlebensfähigkeit der Embryonen in Plastikpailletten entsprachen denen in Glasampullen (BIELANSKY et al. 1985). Die Pailletten erwiesen sich aber als geeigneter für Tiefgefrieren, Lagerung und Transfer von Embryonen (MASSIP et al. 1982).
Dulbeccos Phosphat Buffered Saline (DPBS), beschrieben von WHITTINGHAM (1971), wird meist als Basismedium für das Tiefgefrieren verwendet. Es werden häufig 20% Blutserum oder BSA (bovines serum albumin) hinzugefügt (MOORE u. BILTON 1977; WILLADSEN 1980).
