Versuche zur Vitrifikation equiner Spermatozoen im Vergleich zur konventionellen Tiefgefrierung mit und ohne Verwendung von
Kryoprotektiva
INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
- Doctor medicinae veterinariae - (Dr.med.vet.)
vorgelegt von
Daphne Maria Rani Behrendt Essen
Hannover 2009
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. H. Sieme Klinik für Pferde
Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken
1. Gutachter: Prof. Dr. H. Sieme
2. Gutachter: Prof. Dr. A.-R. Günzel-Apel
Tag der mündlichen Prüfung: 14.05.2009
Meinen Eltern
Meinen Eltern
Meinen Eltern
Meinen Eltern
1 Einleitung... 1
2 Literaturübersicht... 3
2.1 Kryosensitivität von Zellen... 3
2.1.1 Aufbau des Hengstspermiums ... 3
2.1.1.1 Die Plasmamembran ... 4
2.1.1.2 Der Spermienkopf ... 6
2.1.1.3 Das Halsstück ... 6
2.1.1.4 Der Spermienschwanz ... 7
2.1.2 Zellschäden durch Kryokonservierung ... 9
2.1.2.1 Kälteschock... 9
2.1.2.2 Gefrierschäden und Schäden durch den Auftauprozess... 13
2.1.2.3 Unterschiede in der Kryosensitivität verschiedener Spezies und Individuen ... 15
2.2 Kryoprotektiva ... 18
2.2.1 Einteilung der Kryoprotektiva ... 19
2.2.1.1 Permeable Kryoprotektiva... 19
2.2.1.2 Nicht-permeable Kryoprotektiva... 22
2.2.2 Zellschädigende Effekte von Kryoprotektiva ... 22
2.3 Konventionelle Kryokonservierung ... 23
2.3.1 Historische Entwicklung ... 23
2.3.2 Grundlagen und Strategien von slow-cooling-Protokollen... 24
2.4 Vitrifikation als Alternative zur konventionellen Kryokonservierung... 25
2.4.1 Definition und historische Entwicklung der Vitrifikation ... 26
2.4.2 Prinzip und Vorgehensweise der Vitrifikation ... 29
2.4.3 Trägersysteme für die Vitrifikation... 33
2.4.4 Die Bedeutung von Kühl- und Aufwärmraten ... 35
2.4.5 Vitrifikation von Spermatozoen... 36
3 Material und Methoden... 40
3.1 Allgemeine Angaben ... 40
3.1.1 Versuchstiere ... 40
3.1.2 Gewinnung der Ejakulate ... 41
3.2 Untersuchung der Ejakulate unmittelbar nach der Gewinnung ... 41
3.2.1 Makroskopische Untersuchung der Ejakulate ... 41
3.2.2 Mikroskopische Untersuchung der Ejakulate ... 41
3.2.3 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen... 42
3.3 Weitere Verarbeitung der Ejakulate für Vorversuch 1 ... 42
3.3.1 Aufbereitung... 42
3.3.2 Kryokonservierung ... 43
3.3.2.1 Konventionelle Kryokonservierung... 44
3.3.2.2 Vitrifikationsähnliche Kryokonservierung mit Pailletten ... 44
3.3.2.3 Vitrifikation mit Hilfe von VitriPlugs... 45
3.3.3 Schema des Versuchsaufbaus für Vorversuch 1 ... 47
3.4 Weitere Verarbeitung des Ejakulats für Vorversuch 2 ... 48
3.4.1 Aufbereitung... 48
3.4.2 Kryokonservierung ... 49
3.4.2.1 Konventionelle Kryokonservierung... 50
3.4.2.2 Vitrifikationsähnliche Kryokonservierung... 50
3.4.2.3 Vitrifikation mit Hilfe von Cryoloops... 50
3.4.3 Schema des Versuchsaufbaus für Vorversuch 2 ... 51
3.5 Weitere Verarbeitung der Ejakulate für die Hauptversuche... 52
3.5.1 Aufbereitung... 52
3.5.2 Kryokonservierung ... 53
3.5.2.1 Konventionelle Kryokonservierung... 53
3.5.2.2 Vitrifikationsähnliche Kryokonservierung... 53
3.5.3 Schema des Versuchsaufbaus der Hauptversuche ... 54
3.6 Auftauen der Proben und Untersuchung der Proben nach dem Auftauen . 55 3.6.1 Mikroskopische Untersuchungen ... 55
3.6.2 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen... 56
3.6.2.1 Untersuchung des akrosomalen Status und der Plasmamembranintegrität ... 57
4 Ergebnisse ... 61 4.1 Vorversuch 1 ... 61 4.1.1 Ethylenglycolgehalt ... 62 4.1.1.1 Einfluss des Ethylenglycolgehaltes auf die Motilität, die Vitalität und die Akrosomintegrität der Spermatozoen in Vorversuch 1 ... 62 4.1.2 Gefriermethode ... 64 4.1.2.1 Einfluss der Gefriermethode auf die Motilität, die Vitalität und die Akrosomintegrität der Spermatozoen in Vorversuch 1... 64 4.1.2.2 Einfluss der verwendeten Tröpfchengröße sowie des angewendeten Einfrierverfahrens mit Hilfe von VitriPlugs auf die Motilität, die Vitalität und die Integrität der Spermatozoen in Vorversuch 1 ... 66 4.1.3 Bedeutung der in Vorversuch 1 erzielten Ergebnisse für den Versuchsaufbau im Hauptversuch... 66 4.2 Vorversuch 2 ... 66 4.2.1 Aufbereitungsverfahren ... 67 4.2.1.1 Einfluss des Aufbereitungsverfahrens auf die Vitalität, die Akrosomintegrität und die Motilität der Spermatozoen in Vorversuch 2... 67 4.2.2 Gefriermethode ... 70 4.2.2.1 Einfluss der Gefriermethode auf die Vitalität, die Akrosomintegrität und die Motilität der Spermatozoen in Vorversuch 2 ... 70 4.2.3 Glycerol ... 72 4.2.3.1 Einfluss der Verwendung von Glycerol auf die Vitalität, die Motilität und die Akrosomintegrität der Spermatozoen in Vorversuch 2 ... 72 4.2.4 Bedeutung der in Vorversuch 2 erzielten Ergebnisse für den Versuchsaufbau im Hauptversuch... 74 4.3 Hauptversuch ... 74 4.3.1 Relativer Anteil der Varianz an der Gesamtvarianz von Individuum und Ejakulat in allen untersuchten Parametern (Vitalität, Akrosomintegrität, Motilität, Spermienchromatinstruktur) im Hauptversuch ... 74 4.3.2 Aufbereitungsverfahren ... 75
4.3.2.1 Einfluss des Aufbereitungsverfahrens auf die Motilität der
Spermatozoen im Hauptversuch... 75
4.3.2.2 Einfluss des Aufbereitungsverfahrens auf den akrosomalen Status der Spermatozoen im Hauptversuch... 82
4.3.3 Einfluss des Aufbereitungsverfahrens auf die Spermienchromatinstruktur der Spermatozoen im Hauptversuch ... 84
4.3.4 Gefriermethoden ... 86
4.3.4.1 Einfluss der Gefriermethode auf die Motilität der Spermatozoen im Hauptversuch... 86
4.3.5 Glycerol ... 88
4.3.5.1 Einfluss von Glycerol auf die Vitalität, die Motilität, die Akrosomintegrität und die Spermienchromatinstruktur der Spermatozoen im Hauptversuch... 88
4.3.5.2 Einfluss der empirischen Tiefgefriereignung auf die Vitalität, die Motilität, die Akrosomintegrität und die Spermienchromatinstruktur der Spermatozoen im Hauptversuch... 91
5 Diskussion ... 93
5.1 Einfluss des Kryoprotektivums ... 93
5.1.1 Einfluss des Ethylenglycolgehaltes ... 93
5.1.2 Einfluss von Glycerol... 94
5.2 Einfluss der Gefriermethode... 98
5.3 Einfluss des Aufbereitungsverfahrens ... 105
5.4 Einfluss der empirischen Tiefgefriereignung ... 109
5.5 Schlussbetrachtung... 110
6 Zusammenfassung ... 112
7 Summary ... 114
8 Literaturverzeichnis ... 116
9 Anhang ... 144
9.1 Zusammensetzung des INRA 82-Verdünners... 144
9.4 Zusammensetzung des TALP-Mediums ... 145
9.5 Herstellung der PercollTM-Komponenten ... 146
9.6 Aufbereitungsprotokoll Vorversuch 1... 148
9.7 Aufbereitungsprotokoll Vorversuch 2... 151
9.8 Aufbereitungsprotokoll Hauptversuch... 154
Abb. Abbildung
bzw. beziehungsweise
° C Grad Celsius
ca. circa
Cm Zentimeter
CPA Permeable Kryoprotektiva
Cv Konzentration permeabler Kryoprotektiva
d day : < engl. > Tag
DFI DNA-Fragmentations-Index
d.h. das heißt
DNA Desoxyribonukleinsäure
Fa. Firma
Filt. Filtration
FITC Fluorescein-Isothiocyanat
et al. et alii :< lat. > und andere
h hour : < engl. > Stunde
INRA 82 Magermilchverdünner (s.Anhang)
l Liter
LN2 flüssiger Stickstoff
min Minute
ml Milliliter
Mio. Millionen
mOsm Milliosmol
n Anzahl
P Poise
p Wahrscheinlichkeit für die Nullhypothese
Paill. Pailletten
PI Propidiumiodid
® eingetragenes Warenzeichen
SCSA sperm chromatin structure assay
TG-Sperma Tiefgefriersperma
Tg Glasübergangstemperatur
U/min Umdrehungen pro Minute
µl Mikroliter
V vorwärtsbeweglich
VSL velocity straight linear
VCL velocity curve linear
VAP velocity average path
vit. ähnl. vitrifikationsähnlich
z.B. zum Beispiel
Zentr. Zentrifugation
z.T. zum Teil
1 Einleitung
Seit der zufälligen Entdeckung der kryoprotektiven Wirkung von Glycerol durch POLGE et al. im Jahre 1949 wurden viele Fortschritte auf dem Gebiet der Kryokonservierung erzielt. Die künstliche Besamung mit Tiefgefriersperma hat in der Pferdezucht in den letzten Jahren deutlich an Bedeutung gewonnen, so dass die Kryokonservierung von Spermatozoen mittlerweile zur gängigen Praxis in der equinen Reproduktionsmedizin geworden ist. Sie ermöglicht nicht nur den Erhalt genetisch wertvollen Materials, sondern hat auch in der alltäglichen Praxis Bedeutung. So bleibt durch die Kryokonservierung das Sperma von Hengsten unabhängig von Turniereinsätzen oder Krankheiten jederzeit einsetzbar. Die Verbreitung von sexuell übertragbaren Krankheiten wird eingedämmt. Der internationale Handel von Sperma wird durch die Kryokonservierung deutlich vereinfacht. Tiefgefrorenes Sperma kann über Ländergrenzen hinweg auch über längere Zeiträume transportiert werden und der aufwendige, kostenintensive und mit Risiken verbundene Transport von Stuten oder Hengsten wird unnötig.
Doch trotz aller Fortschritte werden mit kryokonserviertem Sperma im Vergleich zu flüssigkonserviertem Sperma immer noch schlechtere Befruchtungsergebnisse erzielt. Die Zellvitalität ist deutlich reduziert (MÜLLER 1982, KLUG 1989, VIDAMENT et al. 1999) und bis zu 50 % der Spermienpopulation überleben den Prozess der Kryokonservierung nicht. Konventionelle Gefriermethoden, die bei einigen Hengsten zu guten Ergebnissen führen, sind auf andere Individuen nicht anzuwenden. Bei 9 % der Hengste ist das Sperma nicht zur Tiefgefrierung geeignet (VIDAMENT 2005).
Wesentlich für die Schädigung der Zellen während der konventionellen Kryokonservierung sind zum einen Schäden durch intrazelluläre Eisbildung, zum anderen Lösungseffekte durch die Konzentrierung intrazellulär gelöster Stoffe (MAZUR 1970). Der Einsatz kryoprotektiver Subtanzen soll diesen Effekten vorbeugen bzw. ihren Einfluss mindern. Bis heute ist Glycerol bei der Kryokonservierung von Spermatozoen das am meisten verwendete Kryoprotektivum, das aber neben seinen zellschützenden Eigenschaften auch toxische Eigenschaften gegenüber den Zellen entfalten kann.
Neben konventionellen Methoden zur Kryokonservierung, die ein langsames, schrittweises Herunterkühlen der Zellen zum Prinzip haben, gibt es Ansätze, die ein extrem schnelles Abkühlen der Zellen zum Ziel haben. Dadurch soll die intrazelluläre Eisbildung vermieden werden. Dieser Prozess wird als Vitrifikation bezeichnet. Doch während die konventionellen Methoden bei der Kryokonservierung von Spermatozoen Erfolge erzielen konnten, ließen weitere Erfolge auf dem Gebiet der Vitrifikation von Spermatozoen nach den ersten erfolgreichen Versuchen von LUYET und HODAPP (1938) lange auf sich warten. Dabei liegen die Vorteile, die die Vitrifikation mit sich brächte, auf der Hand. Die Zeit- und Kostenersparnis gegenüber konventionellen Methoden ist offensichtlich. Die Vermeidung intrazellulärer Eisbildung könnte zudem zu verbesserten Auftauraten bei Individuen mit schlechter Tiefgefriereignung verhelfen.
2002 schließlich gelang es NAWROTH et al. , humane Spermatozoen ohne Verwendung von Kryoprotektiva zu vitrifizieren. 2004(b) vitrifizierte die Forschungsgruppe um ISACHENKO et al. humane Spermatozoen in Abwesenheit von Kryoprotektiva. Diese Ergebnisse schüren die Hoffnung, ein praxistaugliches Vitrifkationsprotokoll zur Kryokonservierung von Spermatozoen auch equiner Spezies entwickeln zu können.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das konventionelle Einfrierverfahren mit einem vitrifikationsähnlichen Verfahren zu vergleichen. Des Weiteren sollte berücksichtigt werden, ob der Einsatz von Glycerol der Kryokonservierung zugute kommt oder eine Kryokonservierung ohne die Verwendung eines Kryoprotektivums zu vergleichbaren Ergebnissen führt. Verglichen wurden die Motilität der Spermatozoen, ihre Membranintegrität, ihr akrosomaler Status und ihre Spermienchromatinstruktur.
2 Literaturübersicht
2.1 Kryosensitivität von Zellen
Der Prozess des Kühlens und Gefrierens führt zu Veränderungen an der Zelle, die eine Beeinträchtigung ihrer Integrität und Funktionsfähigkeit zur Folge haben können.
Die Erfolgsraten variieren dabei in Abhängigkeit von den unterschiedlichen Zelltypen. Bis heute sind die Gründe hierfür nicht bis ins Detail geklärt. Der Erfolg der Kryokonservierung korreliert negativ mit der Komplexität des biologischen Systems, das diesem Prozess unterzogen werden soll (CRITSER et al. 2002). Während des Kryokonservierungsprozesses werden die Zellen einer Vielzahl von Stressoren ausgesetzt. Im Wesentlichen kann man sie in mechanische, thermische und chemische Stressoren einteilen. Das Zusammenspiel dieser Stressoren hat, je nach Zellart, einen unterschiedlich nachhaltigen Einfluss auf die Zelle. Sowohl beim Einfrier- als auch beim Auftauvorgang können sich durch diese Einflüsse beim Kühlprozess hervorgerufene Schäden weiter manifestieren. So wurden während der Kryokonservierung von Spermatozoen auftretende Zellschäden auf Temperaturänderungen, Eiskristallbildung, oxidativen und osmotischen Stress, Veränderungen der Spermienmembran, DNA-Schädigung und die Zelltoxizität der Kryoprotektiva zurückgeführt (WATSON 2000).
Zum Verständnis der Veränderungen, die sich an einer Zelle vollziehen, ist es nötig, sich mit ihrem Aufbau auseinanderzusetzen.
2.1.1 Aufbau des Hengstspermiums
Das Spermium ist eine hochspezialisierte Zelle, die ihre Fähigkeit zu Wachstum, Reparatur, Zellteilung und Biosynthese in der abschließenden Phase der Spermatogenese verliert und nun ausschließlich dem Zwecke der Fertilisation dient (YOSHIDA 2000).
Das insgesamt 61-86 µm lange equine Spermium lässt sich in zwei Abschnitte gliedern:
1.) Kopf 2.) Schwanz
Kopf und Schwanz sind durch ein Halsstück verbunden.
Der Kopf des Spermiums enthält die DNA. In seinem Inneren ist das Akrosom gelegen.
Der Spermienschwanz lässt sich in ein Mittel-, ein Haupt- und ein Endstück unterteilen (SETCHELL 1982).
2.1.1.1 Die Plasmamembran
Das Spermium wird von einer Plasmamembran umgeben, deren Aufbau dem Fluid- Mosaik-Modell für Biomembranen entspricht (SINGER und NICOLSON 1972).
Dieses Modell beschreibt eine Membran, die aus Lipiden und Proteinen besteht, welche in einer Doppelschicht angeordnet sind. Die Lipide, die die Grundsubstanz der Membran bilden, lassen sich in Phospholipide, Glykolipide und Cholesterin unterteilen, wobei Phosphatidylcholin das am häufigsten vorkommende Lipid ist. Die Phospholipide bestehen aus einer hydrophilen Kopfgruppe, an welche sich zwei hydrophobe Kohlenwasserstoffketten anschließen. Die Glykolipide besitzen eine hydrophile Kopfgruppe, welche ein Oligosaccharid enthält. Die an der Außenseite der Membran gelegenen Oligosaccharide erstrecken sich haarförmig in die Umgebung der Zelle, so dass die Lipiddoppelschicht unsymmetrisch wird (SCHRÖDER und DIENER 2000). Glyko- und Phospholipide sind amphipatisch, verfügen also sowohl über lipophile als auch über hydrophile Eigenschaften. In wässrigen Lösungen bilden die Lipide Doppelschichten, in denen sich die apolaren Fettsäurereste in der Membranmitte gegenüberstehen und die polaren Kopfgruppen in den Extra- oder Intrazellularraum ragen.
Zwischen den Phospholipiden eingelagert finden sich Cholesterinmoleküle, die mit den Phospholipiden den Hauptanteil der Fette stellen. Daneben findet sich noch ein
Cholesterin wesentlichen Einfluss auf die Membranfluidität hat (SCHRÖDER und DIENER 2000). Cholesterol hat einen stabilisierenden Effekt auf die Membran.
Insbesondere das Verhältnis von Cholesterol zu Phospholipiden vor allem mit mehrfach ungesättigten Fettsäureresten ist für die Membranfluidität von Bedeutung (AMANN et al. 1987). Als Membranfluidität kann dabei die Fähigkeit der Phospholipide verstanden werden, sich in lateraler Richtung zu verschieben.
Die Verteilung der Lipide ist in der äußeren und der inneren Schicht der Membran unterschiedlich. Innerhalb der Schichten kommt es in bestimmten Bereichen der Membran zu einer Anhäufung von Lipiden (GADELLA et al. 1999, FLESCH und GADELLA 2000).
Zwischen den Lipiden eingelagert sind die Proteine. Diese bilden mit etwa 50 % einen Hauptbestandteil der Membran. Bei den Proteinen können integrale und periphere Proteine unterschieden werden. Integrale Proteine werden nur durch Lösungsmittel und Detergenzien aus der Membran entfernt. Sie fungieren als Poren und Kanäle bzw. als Rezeptoren in der Membran. Periphere Proteine hingegen können in Verdünnungsmedien löslich sein. Sowohl periphere als auch integrale Proteine der Zellmembran verfügen häufig über Kohlenhydratseitenketten. Diese sind meist negativ geladen und können Verbindungen mit anderen Proteinen oder Glykoproteinen aus dem die Spermien umgebenden Medium eingehen (AMANN et al. 1987).
Es bestehen Unterschiede zu Plasmamembranen somatischer Zellen (WATERHOUSE et al. 2006). Der Cholesteringehalt der Membran ist im Kopfbereich des Spermiums besonders hoch, so dass durch die membranstabilisierende Wirkung des Cholesterins die Membranfluidität in diesem Bereich stark herabgesetzt ist (ROVAN 2001). Des Weiteren ist der Anteil ungesättigter Fettsäuren in den Phospholipiden relativ hoch.
Die Plasmamembran des Hengstes besteht zu 57 % aus Phospholipiden, zu 37 % aus Cholesterin und zu 6 % aus Glykolipiden (GADELLA et al. 2001). In Vergleich dazu besteht beispielsweise die Plasmamembran des Ebers zu 67 % aus Phospholipiden, zu 25 % aus Neutrallipiden und zu 8 % aus Glykolipiden (VOS et al.
1994).
Die Plasmamembran dient nicht nur der Abgrenzung des Spermiums, sondern auch der Kommunikation mit seiner Umwelt.
2.1.1.2 Der Spermienkopf
Die Grundlage des Spermienkopfes bildet der stark kondensierte Zellkern mit dem haploiden Chromosomensatz (LOVE und KENNEY 1998). Die vorderen zwei Drittel des Kerns werden vom Akrosom bedeckt (akrosomaler Bereich). Die der Plasmamembran angenäherte Membran ist die äußere Akrosommembran, die kernnahe Membran ist die innere Akrosommembran. Sie umgeben die akrosomale Matrix. Das Akrosom enthält vor allem hydrolytische Enzyme. Am Äquatorialsegment gehen die beiden Membranen ineinander über. Zwischen innerer akrosomaler Membran und Kernmembran befindet sich der subakrosomale Raum.
Der nicht vom Akrosom bedeckte Teil des Spermienkopfes (postakrosomaler Bereich) wird von der postakrosomalen Scheide bedeckt, die eine Spezialisierung der Zellmembran darstellt.
2.1.1.3 Das Halsstück
Die Basalplatte stellt die Verbindung zwischen Spermienkopf und Spermienschwanz her, über die das Halsstück an den Spermienschwanz angeheftet ist.
Das Halsstück des Spermienschwanzes ist eine gelenkartige Verbindung zwischen Spermienkopf und Spermienschwanz. Das proximale Zentriol ist noch erkennbar, während aus dem distalen Zentriol die beiden zentralen Tubuli und die neun peripheren Doppeltubuli hervorgegangen sind, welche zusammen das Axonema bilden.
2.1.1.4 Der Spermienschwanz 2.1.1.4.1 Das Mittelstück
Im Bereich des Mittelstücks legen sich um das Axonema neun Außenfibrillen. Um diese herum windet sich schraubenartig eine einfache Schicht Mitochondrien (ROVAN 2001).
Die Mitochondrien besitzen eine glatte äußere Membran und ein stark gefältelte innere Membran. Über die Glykolyse und die oxidative Phosphorylierung synthetisieren sie ATP und dienen damit der Energiebereitstellung der Zelle.
Das Hauptstück macht den größten Anteil des Spermienschwanzes aus. Durch eine Umfangsabnahme der Fibrillen verjüngt sich das Hauptstück und ist von einer Schicht fibrillärer Proteine umgeben. Diese wird als Ringfaserscheide bezeichnet und besteht aus zwei durch Ringfasern verbundenen Halbschalen.
2.1.1.4.2 Das Endstück
Das Endstück besteht aus dem Achsenfaden und ist vom Plasmalemm umgeben.
Die Spermatozoen verschiedener Spezies unterscheiden sich in Form und Größe, aber auch in der Zusammensetzung der Plasmamembran.
Hengstspezifische Charakteristika sind asymmetrische Köpfe, ein abaxialer Schwanzansatz, ein relativ geringes Volumen des Akrosoms und die Anwesenheit von Mikrotubuli im Bereich des Halses (HANCOCK 1957, DOTT 1975).
Abb. 2.1: Aufbau eines Spermiums (modifiziert nach GADELLA et al. 2001) A: Darstellung der einzelnen Abschnitte des Spermiums
B: Darstellung der Subdomänen der Plasmamembran des Spermienkopfes 1. Plasmamembran, 2. äußere akrosomale Membran, 3. akrosomaler Inhalt, 4. innere akrosomale Membran, 5. Kernmembran, 6. Kern, 7. Verbindungsstück, 8. Mitochondrien, 9. proximaler Teil des Schwanzes (Mittelstück), 10. Schlussring, 11. distaler Teil des Schwanzes (Hauptstück und Endstück), 12. Ringfaserscheide, 13-15: Akrosom,
13. Apikalsegment, 14. prääquatoriales Segment, 15. äquatoriales Segment, 16. postäquatoriales Segment
___________________________
Größenangaben einzelner Abschnitte equiner
Spermatozoen
_______________________
Kopf (L) 7 µm Mittelstück (L) 10 µm Mittelstück (Ø) 0,9 µm Hauptstück (L) 40 µm Hauptstück (Ø) 0,6 µm Endstück (L) 4 µm _______________________
A B
2.1.2 Zellschäden durch Kryokonservierung
Wie bereits angesprochen, werden Zellen während des Kryokonservierungsprozesses thermischen, mechanischen und chemischen Stressoren ausgesetzt. Mit dem Prozess der Kryokonservierung durchläuft eine Zelle im Wesentlichen drei Phasen: die Phase der Kühlung, die Phase der Tiefgefrierung und die Phase des Auftauens. In jeder dieser Phasen kann die Zelle Schäden erleiden, die den einzelnen Phasen zuzuordnen sind.
2.1.2.1 Kälteschock
Kälteschock ist definiert als ein permanenter Schaden, der durch das Herabkühlen auf niedrige, nicht aber Gefrier-Temperaturen entsteht (GHETLER et al. 2005).
Werden Spermien von +20° C auf +1° C gekühlt, so vo llziehen sich an ihnen ab einer Temperatur von +15° C zum Teil irreversible V eränderungen (WATSON 2000).
Studien ergaben, dass kälteschockbedingte Veränderungen bei equinen Spezies insbesondere in einem Temperaturbereich von 19° C b is 8° C auftreten (MORAN et al. 1992).
Hinweisgebend dafür, dass eine derartige Schädigung der Spermien stattgefunden hat, sind der Verlust der Membranintegrität und der Zellfunktion (BWANGA et al.
1991), eine Motilitätsabnahme und abnorme Bewegungsmuster der Spermatozoen, sowie der Verlust der Akrosomintegrität (WATSON 2000). Der Zellmetabolismus sinkt und es kommt zu einem Verlust von Lipiden (DARIN-BENNETT et al. 1973).
Durch den Kälteschock werden die Membransysteme der Spermatozoen wesentlich in Mitleidenschaft gezogen. Es treten Veränderungen an der Membranstruktur und somit auch der Membranintegrität auf (ARAV et al. 1996, ZERON et al. 1999).
Üblicherweise zeichnen sich Membranen durch eine von Zelltyp zu Zelltyp unterschiedliche hohe Fluidität aus. Dabei beeinflussen zwei Faktoren im Wesentlichen die Membranfluidität. Zum einen wird sie durch den relativen Gehalt an Phospholipiden und Cholesterol beeinflusst. Ein hoher Anteil an Phospholipiden bedeutet auch eine größere Membranfluidität, während ein hoher Cholesterol-Anteil zur Stabilisierung der Membran beiträgt. Zum anderen wird die Membranfluidität
durch die Temperatur beeinflusst. Die Abkühlung der Membran hat eine Formveränderung der Phospholipide zur Folge, welche den Phasenübergang vom flüssigen zum kristallinen Zustand bedingt. Die Streckung der Fettsäuren verursacht eine Zusammenballung der Phospholipide. Die Temperatur, bei der der Phasenübergang einer Membran eintritt, ist abhängig von der Struktur ihrer Lipide.
Je länger die Fettsäureketten sind, desto höher ist die für den Phasenübergang nötige Temperatur. Da die Lipidklassen einer Membran unterschiedliche Phasenübergangstemperaturen besitzen, erreichen während des Prozesses der Kühlung einige Membranregionen bereits einen kristallinen Zustand, während sich andere Regionen noch in einem flüssigen Stadium befinden. In dem kristallinen Zustand der Membran ist es den Molekülen nicht möglich, sich in der Membran frei zu bewegen. In den noch flüssigen Membranregionen kommt es zu einer Aggregation integraler Proteine, was eine erhöhte Membranpermeabilität zur Folge hat, ein Umstand, der den Verlust metabolischer Funktionen nach sich zieht (AMANN und PICKETT 1987).
Die an die Phospholipide gelagerten Fettsäurereste bilden eine hydrophobe Barriere, durch die Wasser und gelöste Stoffe nur mit Schwierigkeiten diffundieren können.
Üblicherweise ist die Passage hydrophiler Moleküle also nur über Kanäle in der Zellmembran möglich und wird dementsprechend in Membranregionen, die keine derartigen Kanäle oder Poren aufweisen, nicht beobachtet. Wird die Membran geschädigt, so kommt es zu einer Umstrukturierung der Phospholipide. Dadurch wird eine Passage von Molekülen ermöglicht, die physiologischerweise nicht, oder nur in einem geringen Maße möglich wäre (AMANN und PICKETT 1987).
Die unter physiologischen Bedingungen relativ gleichmäßig in der Membran verteilten Phospholipide garantieren ein gewisses Maß an Stabilität. Diese Verteilung entspricht jedoch nicht ihrer eigentlichen Affinität. So haben Phosphatidylcholin und Sphingomylin eine Affinität zur äußeren Schicht der Lipiddoppelschicht, während Phosphoethanolamin eine Affinität zur inneren Schicht besitzt. Während des Kühlprozesses kann es zu einer Manifestation dieser Affinitäten kommen, so dass
die Phospholipide eine hexagonale Anordnung annehmen können (Hexagonal-II- Phasen). Diese Veränderungen führen zu einer Störung der Funktion und der Permeabilität der Membran (HAMMERSTEDT et al. 1990).
A planare Konfiguration
B Hexagonale Konfiguration
Abb. 2.2: Schematische Darstellung polymorpher Phasen von Lipiden in biologischen Membranen (nach HAMMERSTEDT et al. 1990)
A planare Konfiguration: hydrophile Kopfgruppen nach außen gerichtet, hydrophobe Kohlenwasserstoffketten nach innen gerichtet; die Membran wirkt dadurch als Barriere für polare Moleküle B Hexagonal-II-Phase: zylindrische Anordnung, bei der die hydrophilen Kopfgruppen nach innen und die hydrophoben Kohlenwasserstoffketten nach außen gerichtet sind; die Membran bildet so nur eine schwache Barriere für polare Moleküle. Einige Phospholipidklassen in Spermienmembranen bilden die Hexagonal-II-Phasen nach Kälteschock
Phospholipide und Cholesterol
Fettsäureketten
Fettsäureketten
Phospholipide und Cholesterol
In den kristallinen Domänen der gekühlten Membran ist es zur Aggregation von Lipiden mit ähnlicher Struktur gekommen, die zuvor zufällig in der Membran verteilt waren. Dadurch wird ihr Vermögen zur Interaktion mit assoziierten Proteinen und anderen Lipiden beeinflusst. Die Verbindungsstellen der bereits kristallinen und der noch flüssigen Regionen der Membran stellen Schwachpunkte dar, die anfällig für Fusion und Ruptur sind und permeabel für Ionen werden können (HAMMERSTEDT et al. 1990).
Am Spermienkopf sind zunächst eine Schädigung der Plasmamembran und dann eine Schädigung der Akrosommembran zu bemerken. WATSON et al. (1987) konnten eine messbare akrosomale Expansion oder Schwellung darstellen, die hinweisgebend dafür ist, dass es in diesem Bereich zu einer Läsion der Membran gekommen ist, da Zellmembranen unter physiologischen Bedingungen nicht dehnungsfähig sind. Die akrosomale Membran wird während der Kühlung Prozessen unterworfen, die denen der Akrosomreaktion ähneln. Ursächlich dafür ist die intrazelluläre Akkumulation von Kalzium. Diese ist auf eine bei herabgesetzter Temperatur verminderte Aktivität ATP-abhängiger Pumpen zurückzuführen. So arbeitet die Natrium-Kalium-Pumpe nicht so effektiv, wie dies bei Körpertemperatur der Fall ist, was in der Konsequenz zu einer intrazellulären Anhäufung von Natrium führt, während die Konzentration an Kalium sinkt. Durch diese Vorgänge kommt es wahrscheinlich zu einer partiellen Depolarisation der Zelle, in der Folge zum Öffnen spannungsabhängiger Kalzium-Kanäle und damit zu einem Kalzium-Einstrom in die Zelle (WATSON 2000). Möglicherweise führt die intrazelluläre Ansammlung von Kalzium zur Aktivierung der Phospholipase und damit zu einer vermehrten Hydrolyse von Phospholipiden, was wiederum zusammen mit der damit einhergehenden Ansammlung freier Fettsäuren zu einer erhöhten Permeabilität der Membranen von Mitochondrien und Zellen führen kann. Die Membranpermeabilität wurde bereits durch die Veränderung der Lipidstruktur erhöht. Die Verschiebung der Ionenverhältnisse verstärkt diesen Einfluss noch. Die Folge dieser Prozesse ist der Zelltod (AMANN und PICKETT 1987). Die intrazelluläre Kalziumakkumulation hat
Kapazitationszeit kryokonservierter Spermien verkürzt sich, einhergehend mit Veränderungen in der Architektur der Membranlipide, der Permeabilität der Membran und einer reduzierten Effektivität homöostatischer Enzyme. Diese kapazitationsähnlichen Veränderungen können einen Einfluss auf die Interaktion der Spermien mit den epithelialen sowie den Immunzellen des weiblichen Genitaltraktes nehmen und so nachfolgend ihre Fertilität beeinflussen (WATSON 2000).
Auch die mitochondrialen Membranen werden durch den Abkühlungsprozess in Mitleidenschaft gezogen. Die Schädigung der Mitochondrien bedeutet eine Beeinträchtigung des Energiestoffwechsels der Spermatozoen. Auf den entstehenden Energiemangel kann der Abfall der Motilität zurückgeführt werden (WATSON 2000).
Zu den genannten Veränderungen kommen peroxidative Schädigungen (AITKEN 1995), für die die Spermienmembranen aufgrund ihres hohen Gehaltes an ungesättigten Fettsäuren (PARKS und LYNCH 1992) besonders empfänglich sind.
ALVAREZ und STOREY (1992) wiesen einen mit dem Prozess der Kryokonservierung zusammenhängenden Rückgang der Aktivität des Enzyms Superoxid Dismutase nach, welches für den Schutz vor Lipid-Peroxidation notwendig ist.
2.1.2.2 Gefrierschäden und Schäden durch den Auftauprozess
Typischerweise entspricht der Kurvenverlauf der Überlebensrate von Zellen, die mit verschiedenen Kühlraten eingefroren werden, einem umgekehrten U: Sowohl sehr langsame als auch sehr schnelle Kühlraten haben eine reduzierte Überlebensrate zur Folge, während im mittleren Bereich der Kühlgeschwindigkeit die maximale Überlebensrate erzielt wird. Von dieser Beobachtung ausgehend stellten MAZUR et al. (1972) die Hypothese auf, dass zwei unterschiedliche Mechanismen ursächlich für Zellschäden nach Kryokonservierung sind.
Im Falle von langsamen Kühlraten sehen sie die Ursache in dem Anstieg der Konzentration gelöster Stoffe im extrazellulären Raum und der damit einhergehenden Deydratation der Zelle. Die Dehydratation der Zelle als Mechanismus zum Ausgleich des osmotischen Ungleichgewichtes mit dem
steigt. Es kommt zu einer pH-Wert-Absenkung und zu einer Sättigung und Präzipitation der Salze (MAZUR 1970), ein Vorgang, der schon 1953 von LOVELOCK bei humanen Erythrozyten beschrieben und als „Lösungseffekt“
bezeichnet wurde. Der Mechanismus, über den osmotische und Lösungseffekte zum Zelltod führen, ist dabei noch nicht abschließend geklärt. LOVELOCK (1953) erwägt als Ursache die Denaturierung von Lipoproteinen und die damit einhergehende Lysis der Zellmembran. MERYMAN (1970) postulierte als Ursache für die Schädigung von Zellen während des Einfrier- und Auftauvorgangs ihre Unfähigkeit, ab einem kritischen minimalen Zellvolumen noch weiter zu schrumpfen. Dieses Zellvolumen beträgt in etwa 55 % des normalen isotonischen Zellvolumens (MERYMAN 1970).
Da kein weiteres Wasser aus den Zellen austreten kann, kommt es zum Aufbau osmotischer Druckdifferenzen, die die Membran schädigen.
Im Falle von schnellen Kühlraten hingegen soll der mechanische Schaden durch intrazellulär wachsende Eiskristalle verantwortlich für den Zelltod sein. Bedingt durch das intrazelluläre Wachstum kommt es zur Ruptur von Plasmamembranen und der Membranen zahlreicher intrazellulärer Organellen (MAZUR 1977).
Abgesehen von diesen beiden Mechanismen kann auch die mechanische Interaktion extrazellulären Eises und der Zelle eine Rolle bei ihrer Schädigung spielen. Durch die Eisbildung im extrazellulären Medium bilden sich Kanäle mit ungefrorenem Wasser, in denen die Zellen in Suspension bleiben. Durch weitere Abkühlung werden diese Kanäle in fortschreitendem Maße enger. Je nach Größe der ungefrorenen Wasserfraktion kommt es zu mehr oder minder starken Interaktionen zwischen Zelle und Eiskristallen. Die Zellen werden zusammengedrängt und deformiert (RAPATZ et al. 1966). Je mehr extrazelluläres Wasser ungefroren bleibt, desto größer sind die Überlebenschancen für die Zelle. Wie viel extrazelluläres Wasser ungefroren bleibt, ist abhängig von der Temperatur und der initialen Salzkonzentration des Suspensionsmediums.
Kleinste, bei hohen Einfriergeschwindigkeiten intrazellulär gebildete Eiskristalle sind äußerst instabil und unterscheiden sich von größeren Eiskristallen durch einen
tritt vor allem dann auf, wenn nach einer hohen Einfriergeschwindigkeit eine langsame Auftaurate gewählt wird (MAZUR 1984). Dementsprechend sollte die Auftaurate immer in Abhängigkeit von der zuvor verwendeten Kühlgeschwindigkeit gewählt werden, um so die Schäden zu minimieren, die durch die Rekristallisation oder den Salz- und Wassertransport über die Membran auftreten können (HAMMERSTEDT et al. 1990). Der mit dem Auftauprozess einhergehende Wassereinstrom in die Zelle kann ebenfalls zu Membranrupturen führen.
2.1.2.3 Unterschiede in der Kryosensitivität verschiedener Spezies und Individuen
Die Erfolge bei der Kryokonservierung von Zellen variieren nicht nur zwischen verschiedenen Zelltypen, sondern sind offensichtlich auch abhängig von Spezies und Individuum (KUMAR et al. 2003). Da die Zellmembranen wesentlich durch den Prozess der Kryokonservierung in Mitleidenschaft gezogen werden, scheint die unterschiedliche Beschaffenheit von Zellmembranen verschiedener Zelltypen und Spezies ein Schlüssel zu ihrer differierenden Kryosensitivität zu sein.
Die Membraneigenschaften werden im Wesentlichen durch die Länge der Fettsäuren-Acyl-Ketten und die Anzahl und Position der Doppelbindungen innerhalb der Phospholipide beeinflusst (STUBBS und SMITH 1984, ARAV et al. 2000). Der Cholesterolgehalt und das Verhältnis von ungesättigten zu gesättigten Fettsäuren bestimmt die Lipidphasenübergangstemperatur von Membranen. Hohe Konzentrationen mehrfach ungesättigter Fettsäuren führen zu einer bei niedrigen Temperaturen flüssigeren Membran (also einem Phasenübergang bei niedrigeren Temperaturen), die weniger sensibel gegenüber Kälteschock ist (QUINN 1985, WHITE 1993). GIRAUD et al. (2000) stellten fest, dass eine höhere Überlebensrate von motilen oder lebensfähigen Spermatozoen einhergeht mit einer höheren Membranfluidität. Die Bestimmung der Membranfluidität von Spermatozoen in einer frischen Probe kann also dazu dienen, die Reaktion dieser Spermatozoen auf einen Kryokonservierungsprozess vorherzusagen.
Für Phospholipide innerhalb der Membran equiner Spermatozoen liegt die
liegen die Temperaturen der Lipidphasenübergänge von Phospholipiden innerhalb der Spermienmembran von Ebern, Bullen und Geflügel bei 24,0° C, 25,4° C und 24,5° C (PARKS und LYNCH 1992). Ähnliche Verhältnis se finden sich bei den Phasenübergangstemperaturen für Glykolipide. Für equines Sperma gilt hier eine Temperatur von 33,4° C, während der Phasenübergang bei Ebern bei 36,2° C und bei Bullen bei 42,8° C liegt (PARKS und LYNCH 1992) . Diese Unterschiede in der Höhe der Phasenübergangstemperatur scheinen ein Grund für die unterschiedliche Kryosensitivität der Spermatozoen zu sein.
Ausgehend von der Annahme, dass die Lipidphasenverschiebung in der Membran wesentlich für den Kälteschock der Zellen ist, kann angenommen werden, dass eine Korrelation zwischen der Lipidkomposition der Spermienmembran und der Anfälligkeit der entsprechenden Spermatozoen gegenüber dem Kälteschock besteht.
Kälteschock hat stärkere Auswirkungen, wenn die Sterolkonzentration in der Spermienmembran niedrig, der Anteil ungesättigter Fettsäuren hingegen hoch ist (DARIN-BENNETT et al. 1973, WHITE und DARIN-BENNETT 1976). Auch DE LEEUW et al. (1990) nahmen an, dass es einen Zusammenhang zwischen der Lipidzusammensetzung und der Asymmetrie von Membranen und der unterschiedlichen Kälteresistenz von Spermatozoen verschiedener Spezies gibt.
Kennzeichnend für den Kälteschock ist ein messbarer Kalziumausstrom, der bei kältesensibleren Spezies zum Ende der Phasenverschiebung abrupt ansteigt. Bei Membranen mit einem hohen Cholesterolgehalt ist dieser Ausstrom nicht zu verzeichnen. Die Anfälligkeit von Plasmamembranen gegenüber
Lipidphasenübergängen während des Kühlprozesses ist umgekehrt proportional zu ihrem Cholesterolanteil. Humane Spermatozoen, die relativ kälteresistent sind, verfügen über einen hohen Sterolanteil in der Spermienmembran. Der
Cholesterolgehalt in Spermatozoen von Bullen und Schafböcken ist gegenüber dem von Hasen und Menschen niedriger. Die erstgenannten Spezies reagieren
empfindlicher auf den Kühlprozess als die letztgenannten Spezies (DROBNIS et al.
1993).
abzuhängen. Dabei können die verschiedenen Spezies zwei Klassen zugeordnet werden: einer mit einem hohen Verhältnis ungesättigter zu gesättigten Fettsäuren und einer mit einem niedrigen Verhältnis ungesättigter zu gesättigten Fettsäuren.
Bullen, Schafböcke und Eber, die zu den kältesensiblen Spezies zählen, haben ein höheres Verhältnis ungesättigter zu gesättigten Fettsäuren (>2,5), während die kälteresistenteren Spezies Hasen, Hunde und Menschen ein niedrigeres Verhältnis aufweisen (~1) (WHITE 1993). Laut einer Studie von ARAV et al. (2000) weisen die Membranlipidprofile von Spermatozoen kältesensibler Spezies einen höheren Anteil mehrfach ungesättigter Fettsäuren auf, während das Verhältnis von mehrfach ungesättigten Fettsäuren zu gesättigten Fettsäuren bei den relativ kälteresistenten Bienenspermatozoen am größten ist.
Form und Größe des Spermienkopfes können weitere Faktoren sein, die die Kryosensitivität von Spermatozoen beeinflussen (WATSON 2000). Vergleichende Studien verschiedener Säugetierspezies von NAUK (1991) haben ergeben, dass zwischen der Größe des Spermienkopfes und der Kryostabilität eine negative Korrelation besteht. Dies erklärt die verhältnismäßig geringe Kryosensitivität humaner Spermatozoen im Vergleich zu der anderer Spezies wie etwa dem Hengst.
Humane Spermien zeichnen sich durch minimale Größenparameter und maximale Kryostabilität aus (GILMORE et al. 1997).
Die osmotische Toleranz von Spermatozoen unterscheidet sich zum Teil deutlich zwischen verschiedenen Spezies. Im Vergleich zu murinen und humanen Spermatozoen verfügen equine Spermatozoen über eine eher eingeschränkte osmotische Toleranz (GAO et al. 1995, WILLOUGHBY et al. 1996), die mit der von Eberspermatozoen vergleichbar ist (GILMORE et al. 1998). In einer Arbeit von LOVELOCK und POLGE (1954) wurde der Schutzeffekt des Glycerols näher untersucht. Als Hauptursache für die Schädigung der Zelle während des Prozesses der Tiefgefrierung wurden die hohen Salzkonzentrationen postuliert, die dadurch zustande kommen, dass Wasser in Form von Eis entfernt wird. Dabei stellten sie fest, dass es für jede Spezies eine charakteristische Salzkonzentration gibt, oberhalb derer irreversible Schäden auftreten.
Neben der unterschiedlichen Kryosensitivität verschiedener Spezies ist bei der Kryokonservierung von Spermatozoen auch mit erheblichen intraspezifischen interindividuellen Schwankungen zu rechnen. Besonders bei equinem Sperma treten große interindividuelle Differenzen in Bezug auf die Qualität des erzeugten kryokonservierten Spermas auf. Immerhin 9 % der Hengstpopulation eignen sich auch heute nicht für die Tiefgefrierung (VIDAMENT 2005). Bis heute sind diese starken Differenzen bezüglich der Kryosensitivität von Spermatozoen vor allem innerhalb einer Spezies und sogar eines Individuums nicht hinreichend zu erklären (AMANN und PICKETT 1987, VIDAMENT et al. 1997, VIDAMENT 2005). Ein grundlegenderes Verständnis der hier beteiligten Mechanismen ist nötig, um die Verfahren zur Kryokonservierung von Spermatozoen verschiedener Spezies und Individuen zu optimieren (HOLT 2000).
2.2 Kryoprotektiva
Schon 1908 wurde der positive Effekt von Kryoprotektiva auf die Kryostabilität von Pflanzen beschrieben (MAKSIMOV 1913). Dabei finden sowohl permeable Kryoprotektiva wie Glycerol als auch nicht-permeable Kryoprotektiva wie Saccharose Erwähnung.
Damit eine Substanz effektiv als Kryoprotektivum genutzt werden kann, muss sie vor allem zwei Eigenschaften besitzen:
1.) Sie muss eine Zelle vor Schäden schützen, die als Folge des Einfrierprozesses zu werten sind
2.) Sie muss in der Konzentration, in der sie angewandt wird so wenig wie möglich, idealerweise also keine Toxizität gegenüber der Zelle besitzen (SQUIRES et al. 2004).
Die Zelltoxizität einer kryoprotektiven Substanz setzt sich zusammen aus der chemischen Toxizität und der osmotischen Toxizität. Die osmotische Toxizität wird dadurch hervorgerufen, dass die Substanz eine Zellmembran im Vergleich zu Wasser langsamer passiert (GAO et al. 1995). Wasser verlässt aufgrund des
osmotischen Potentials des Kryoprotektivums die Zelle, wodurch der intrazelluläre Raum konzentriert wird.
Allen Stoffen mit kryoprotektiven Eigenschaften, egal welcher Gruppe sie im Weiteren zuzuordnen sind, sollte es eigen sein, Wasserstoffbrücken bilden zu können (DOEBBLER 1966). Ausdruck der Wasserstoffbindungskapazität einer Schutzsubstanz ist die Reduktion der Salzkonzentration zu jeder gegebenen Temperatur, die eine intrazelluläre Kristallisierung und irreversible Membrandenaturierung verhindert (ROWE 1966).
2.2.1 Einteilung der Kryoprotektiva
Eine Einteilung der Kryoprotektiva anhand ihrer Penetrationsfähigkeit erfolgte schon früh (KAROW und WEBB 1965, ROWE 1966, MERYMAN 1971a).
Permeable Kryoprotektiva sollten eine intrazelluläre Wirkung entfalten, während den nicht-permeablen Kryoprotektiva eine extrazelluläre Wirkungsweise zugeschrieben wurde (ROWE 1966). Für beide Gruppen jedoch sind ihre kolligativen Eigenschaften von Bedeutung, wobei ihre Wasserstoffbindungskapazität eine besondere Rolle spielt (MERYMAN 1971a).
2.2.1.1 Permeable Kryoprotektiva
In der Gruppe der permeablen Kryoprotektiva ist wohl als erstes Glycerol zu nennen.
POLGE et al. (1949) entdeckten mehr zufällig aufgrund einer falsch etikettierten Flasche die Schutzwirkung von Glycerol bei der Tiefgefrierkonservierung von Spermatozoen – eine Entdeckung, die im Weiteren die erfolgreiche Kryokonservierung von Zellen, Organismen und Geweben ermöglichte und eine Vielzahl von Studien nach sich zog, die sich mit der protektiven Wirkung von Glycerol befassten. Glycerol ist der Trivialname von Propantriol bzw. Propan-1,2,3-triol und stellt einen dreiwertigen Alkohol dar. Anstelle der früher gebräuchliche Endung –in, die eigentlich bei der Bezeichnung von Aminen verwendet wird, wurde die korrekte Endung –ol eingeführt, die für einen Alkohol steht. Glycerol ist bei Raumtemperatur farb- und geruchlos und besitzt eine große Viskosität und Hygroskopie. Sein
süßlicher Geschmack hat in Verbindung mit seiner Viskosität zu seinem Namen geführt, der sich aus dem griechischen Wort glykýs = süß und dem lateinischen Wort cera = Wachs zusammensetzt.
LOVELOCK (1953) schrieb die schützende Wirkung des Glycerols seinen kolligativen, also den von seiner Teilchenzahl abhängenden Eigenschaften zu, die in Beziehung zu seinem Salzpuffer-Effekt stehen. Dieser Gedanke des Salzpuffer- Effektes wurde in einer Arbeit von LOVELOCK und POLGE (1954) wieder aufgenommen. Da die Zellen während des Einfrierens und Auftauens einer starken Konzentrierung der gelösten Teilchen ausgesetzt werden und diese Konzentrierung offensichtlich maßgeblich an der Schädigung der Zelle beteiligt ist, wird der protektive Charakter des Glycerols über seinen Salzpuffer-Effekt erklärt.
Der kryoprotektive Mechanismus des Glycerols ist bis heute nicht abschließend geklärt (HOLT 2000). Zwar handelt es sich bei Glycerol um ein membrangängiges Kryoprotektivum, das von der Zelle, abhängig von der Temperatur, innerhalb von Minuten aus dem umgebenden Medium aufgenommen wird. Dennoch wird sein gefrierschützender Einfluss auch seiner extrazellulären Wirkung zugeschrieben.
Durch Herabsetzung des Gefrierpunktes des extrazellulären Mediums verbleiben während des Gefrierprozesses größere Kanäle mit Anteilen ungefrorenen Mediums, in denen die Zellen verbleiben (BERNDTSON und FOOTE 1972, AMANN und PICKETT 1987). Zudem wird durch die Anwesenheit von Glycerol die Elektrolytkonzentration und damit der Lösungseffekt verringert (HOLT 2000). Bei Verwendung von Glycerol wird bei Temperaturen unterhalb des Gefrierpunktes von Wasser weniger Eis gebildet, so dass dadurch die Erhöhung der Salzkonzentrationen in Grenzen gehalten wird (LOVELOCK 1953).
Die intrazelluläre Wirkung des Glycerols scheint unter anderem darin zu bestehen, dass es Einfluss auf die zytoplasmatische Viskosität hat und diese herabsetzt.
Dadurch werden alle Diffusionsprozesse beeinflusst (HAMMERSTEDT und GRAHAM 1992). Dabei scheint die zytoplasmatische Viskosität von vorneherein von Spezies zu Spezies zu differieren, so dass es wahrscheinlich ist, dass auch der
Dehydratisierungsgrad und die Elektrolytkonzentration in Grenzen gehalten. ALMLID und JOHNSON (1988) postulierten einen extrazellulär wirksamen Plasmamembranschutz von Glycerol, den ALVAREZ und STOREY (1993) bestätigten.
Durch den Einsatz von Glycerol war es zwar möglich, Sperma durch Tiefgefrierung zu konservieren, dennoch ließ sich durch verminderte Motilitätswerte nach dem Auftauen auf seinen eben auch toxischen Einfluss schließen. Diese Tatsache gab Anlass dazu, alternative Kryoprotektiva zu testen, die eine ebenso große kryoprotektive Wirkung wie Glycerol entfalten würden, jedoch einen geringeren toxischen Effekt hätten. Neben anderen Alkoholen, wie DMSO (Dimethylsulfoxid) und Ethylenglycol, kamen hier auch Amide zum Einsatz. SQUIRES et al. (2004) verglichen in einer Studie Glycerol mit alternativen Kryoprotektiva, die ein geringeres Molekulargewicht und damit eine höhere Membranpermeabilität als Glycerol (Molekulargewicht = 92,09) aufwiesen. Sie kamen zu dem Ergebnis, dass Methylformamid und Dimethylformamid (Molekulargewicht von DMSO = 78,13) Spermien ebenso effektiv wie Glycerol vor Kryoschäden schützen, aufgrund ihrer höheren Membranpermeabilität jedoch weniger osmotischen Schaden anrichten.
Ebenfalls zu der Gruppe der permeablen Kryoprotektiva zählt Ethylenglycol.
Ethylenglycol weist mit 62,07 ein niedrigeres Molekulargewicht als Glycerol auf und verfügt über eine hohe Permeabilität. Seine Toxizität ist verhältnismäßig gering.
Ethylenglycol findet vor allem bei der Kryokonservierung von Embryonen Verwendung, wo aufgrund der geringen Toxizität zum Teil auf eine schrittweise Inkubation verzichtet wird.
In Kombination mit einem Eidotter-Verdünner ist Glycerol immer noch das bei der Kryokonservierung von humanem Sperma bei weitem am häufigsten verwendete Kryoprotektivum (ROYERE et al. 1996, SANTIANI et al. 2005). Beim Hengst wird es in Konzentrationen von 2,5 % bis 9 % eingesetzt (SAMPER und MORRIS 1998).
2.2.1.2 Nicht-permeable Kryoprotektiva
Zu den nicht-permeablen Kryoprotektiva zählen Zucker wie Saccharose, Glucose, Fructose, Sorbitol, Trehalose oder Raffinose, sowie Polyvinylpyrrolidon und verschiedene Proteine.
Schon 1971 untersuchte MERYMAN die Schutzwirkung nicht-penetrierender Kryoprotektiva und kam zu dem Schluss, dass ihre Wirkung auf einen Membraneffekt zurückzuführen sei, der ab einer gewissen Osmolarität des Suspensionsmediums den reversiblen Ein- und Austritt gelöster Substanzen in die bzw. aus der Zelle verursacht und dadurch osmotische Gradienten ausgleicht.
Durch Zugabe dieser Stoffe kann die nötige Konzentration anderer permeabler Kryoprotektiva gesenkt werden. Bei Verwendung nicht permeabler Kryoprotektiva wird der osmotische Druck des extrazellulären Raumes erhöht, so dass mehr Wasser die Zelle verlässt. Dadurch wird die Zelle den toxischen Effekten der Kryoprotektiva weniger lange ausgesetzt (ISACHENKO et al. 2003).
2.2.2 Zellschädigende Effekte von Kryoprotektiva
Neben dem kryostabilisierenden Effekt von Kryoprotektiva darf der zellschädigende Effekt dieser Stoffe nicht außer Acht gelassen werden. Die Zugabe von Kryoprotektiva setzt die Zellen einem osmotischen Stress aus, der sich zum Beispiel in einer verminderten Motilität wieder aufgetauter Spermien äußert. Dabei wird von einer durchschnittlichen Minderung der Motilität von 50 % ausgegangen, wobei dieser Wert von Probe zu Probe starken Schwankungen unterliegen kann (CRITSER et al. 1988, GAO et al. 1995, HOLT 1997, 2000, KATKOV et al. 1998).
HAMMERSTEDT und GRAHAM (1992) stellten dar, dass mit Geflügelspermatozoen, die mit hohen Konzentrationen an Kryoprotektiva tiefgefroren wurden, verminderte Trächtigkeitsraten erzielt wurden. Um diesen toxischen Effekt zu minimieren, erfolgt bei slow-cooling-Protokollen eine langsame und schrittweise Zugabe von Kryoprotektiva. Einige dieser Effekte sind auf eine direkte Schädigung der Zelle, auf osmotisch bedingte Schädigung, aber auch auf eine veränderte Interaktion der
Spermatozoen mit dem weiblichen Genitaltrakt zurückzuführen (AMANN und PICKETT 1987).
Das intrazellulär vorliegende Glycerol muss nach dem Auftauen wieder die Zelle verlassen. Dies kann zum einen durch eine Verdünnung der Spermiensuspension mit einem glycerolfreien Medium erfolgen, zum anderen führt die Insemination der aufgetauten Spermiendosis zu einer Verdünnung mit Flüssigkeiten im weiblichen Genitaltrakt. Da Glycerol jedoch 30 bis 60 Mal langsamer durch die Spermamembran diffundiert als Wasser, kommt es aufgrund des osmotischen Gefälles zunächst zu einem Wassereinstrom, durch den die Spermien bis auf ein Doppeltes ihrer normalen Größe anschwellen können. Dieser Anstieg des Zellvolumens kann sich schädigend auf die Spermatozoen auswirken (GRAHAM 1996).
2.3 Konventionelle Kryokonservierung
2.3.1 Historische Entwicklung
Der erste Bericht, der sich mit der Kryokonservierung von Spermatozoen befasst, datiert aus dem Jahr 1776. Der italienische Priester Abbe Lazáro Spallanzani beschrieb darin den Erhalt der Motilität von humanen, equinen und Froschspermatozoen, die 30 Minuten im Schnee abkühlt und dann wieder aufgetaut worden waren (SPALLANZANI 1776). 1866 kam MANTEGAZZA wie schon seinerzeit SPALLANZANI zu dem Ergebnis, dass Spermien durch Temperatursenkung konserviert werden können. "Wenn Samenflüssigkeiten für mehr als vier Tage ohne sichtbare Veränderung bei Eisschmelztemperaturen konserviert werden können, mutmaße ich, dass es in der Zukunft Wissenschaftlern gelingen wird, die Rassen von Pferden, vollblütigen Hengsten, Bullen und anderem Vieh zu verbessern. Es wird möglich sein, eine künstliche Befruchtung mit gefrorener Samenflüssigkeit durchzuführen. Es könnte zur Wirklichkeit werden, dass Ehemänner, die in den Krieg ziehen und dort sterben, durch Hinterlegung von Samenflüssigkeit ihre Frauen auch nach ihrem Tod befruchten und so rechtmäßige Söhne haben." 1949 gelang es POLGE et al. unter Verwendung von Glycerol erstmals, erfolgreich Sperma einzufrieren.
Das erste Kalb, das aus einer Besamung mit kryokonserviertem Sperma entstanden ist, wurde 1951 geboren (STEWART 1951).
Das erste aus einer künstlichen Befruchtung mit kryokonserviertem Sperma entstandene Fohlen kam 1957 zur Welt (BARKER und GANDIER 1957).
2.3.2 Grundlagen und Strategien von slow-cooling-Protokollen
Der Temperaturverlauf im Gefriergut lässt sich in drei Abschnitte gliedern. Im ersten Abschnitt liegt das zu gefrierende Gut noch in flüssiger Form vor. Es erfolgt eine Kühlung auf +5° C bei relativ niedrigen Kühlraten. Equine Spermatozoen sind vor allem in einem Temperaturbereich von 18° C bis 8° C empfindlich (MORAN et al.
1992, DROBNIS et al. 1993). Im temperatursensitiven Bereich haben sich Kühlraten von 0,05 – 0,1° C als optimal erwiesen (DOUGLAS-HAM ILTON et al. 1984, KAYSER et al. 1992). Nach dieser Anpassungsphase folgt die kontrollierte Tiefgefrierung auf -196° C. Der Temperaturbereich zwischen 0° C und -1 0° C ist der für die Eiskristallbildung kritische Bereich (CHECK et al. 1994, MAZUR und KOSHIMOTO 2002). Die Phase der Unterkühlung findet in einem Temperaturbereich von 0° C bis -5° C statt. In einem Temperaturbereich von -6° C b is -15° C setzt die Kristallisation ein. Dabei wird Energie in Form von Wärme frei. Im Temperaturverlauf wird dieser
„rebound effect“ als Plateau deutlich. Die Kristallisation schreitet im extrazellulären Medium schneller voran als im intrazellulären Bereich. Reines Wasser bildet Eiskristalle, während sich die gelösten Substanzen in der verbleibenden ungefrorenen Fraktion konzentrieren, so dass ein osmotischer Gradient entlang der Membran aufgebaut wird. Es entsteht ein Gefälle zwischen dem konzentrierten Extrazellularraum und dem isotonen intrazellulärem Raum (MAZUR 1963) und Wasser verlässt entlang dieses Gradienten vor allem über den Bereich des Spermienkopfes die Zelle (BAGCHI et al. 2008). Ob es zur intrazellulären Eisbildung kommt, hängt dabei von der Kühlrate ab. MAZUR beschreibt 1970 mit der sog.
Zweifaktorenhypothese die von der Kühlrate abhängenden Einflüsse auf das Gefriergut. Moderate Einfriergeschwindigkeiten von -25° C bis -40° C/Minute
Extrazellularraum. Die Zelle wird dehydriert, so dass es nicht zu einer intrazellulären Eiskristallbildung, wohl aber zu einer Erhöhung der Konzentration intrazellulär vorliegender gelöster Stoffe kommt, was als Lösungseffekt bezeichnet wird (WEITZE 1977). In der Zelle kann die Salzkonzentration dadurch bis auf den nahezu 40-fachen isotonischen Wert steigen. Bei schnellen Einfriergeschwindigkeiten von > -60°
C/Minute, besteht die Gefahr der Zellschädigung durch intrazelluläre Eisbildung.
Nicht alles Wasser kann die Zelle verlassen, so dass das intrazellulär verbleibende Wasser schließlich Eiskristalle bildet. Während des Auftauprozesses kann es in diesem Fall zur Aggregation mehrerer kleiner Eiskristalle zu größeren Kristallen kommen, ein Phänomen, das als Rekristallisation bezeichnet wird (GRAHAM 1996).
Sowohl die intrazelluläre Eisbildung bei hohen Einfriergeschwindigkeiten als auch das lange Aussetzen hoher Konzentrationen bei niedrigen Geschwindigkeiten, werden als schädlich für die Zelle angesehen, so dass ein Mittelmaß erstrebenswert erscheint (DEVIREDDY et al. 2000).
2.4 Vitrifikation als Alternative zur konventionellen Kryokonservierung
Die Vitrifikation als ultra-schnelle Einfriertechnik stellt eine Alternative zu den konventionellen Kryokonservierungstechniken dar und soll Probleme, die durch slow-cooling-Protokolle aufgeworfen werden, reduzieren bzw. vermeiden. Dazu zählen sowohl die mit slow-cooling-Protokollen verbundenen Kosten und die Dauer der Verfahren als auch die intrazelluläre Eiskristallbildung und die daraus resultierenden Zellschäden. Der Vitrifikation liegt der direkte Kontakt der Lösung, die die zu kryokonservierenden Zellen enthält, mit dem Stickstoff zugrunde. Dadurch sollen derartig hohe Kühlraten erzeugt werden, dass es zu keiner intrazellulären Eisbildung mehr kommt. Bei einem solchen Vorgehen muss beachtet werden, dass durch den direkten Kontakt mit flüssigem Stickstoff (LN2) die Gefahr der Kontamination besteht (TEDDER et al. 1995, FOUNTAIN et al. 1997, BIELANSKI et al. 2000). Um dies zu vermeiden kann zum einen der Einsatz sterilen LN2 zum
Tragen kommen, zum anderen wurde eine Vielzahl geschlossener Systeme entwickelt, die den direkten Kontakt mit LN2 vermeiden.
Die Vitrifikation bietet gegenüber traditionellen Einfriertechniken Vorteile, die die vor allem in den vergangenen zwölf Jahren stark ansteigende Zahl von Publikationen begründen.
Sie unterscheidet sich von ihnen in folgenden Punkten:
(1.) keine Eiskristallbildung, weder während des Vitrifizierens noch während des Erwärmens
(2.) höhere Konzentration des Kryoprotektivums (Embryonen, Oozyten) bzw. kein Kryoprotektivum (Spermatozoen)
(3.) geringeres Volumen des Gefriergutes (4.) höhere Kühlraten
(5.) geringerer Zeitaufwand (6.) niedrige Kosten
(7.) Einfachheit der Protokolle (LIEBERMANN2003)
2.4.1 Definition und historische Entwicklung der Vitrifikation
Vitrifikation ist ein Prozess, bei dem eine Flüssigkeit verfestigt wird, indem sie in eine nicht-kristalline Phase überführt wird. Dies geschieht durch Herabsetzung der Temperatur und starke Erhöhung der Viskosität (LUYET und HODAPP 1938).
Zuerst beschrieben wurde die Vitrifikation bereits Ende des 19. Jahrhunderts (TAMMANN 1898). Der Begründer der Kryobiologie LUYET beschrieb 1937 die Vitrifikation als Alternative zu konventionellen langsamen Kryokonservierungsverfahren (LUYET 1937a, 1937b). Ziel war die Vermeidung intrazellulärer Eisbildung, die er als mit lebenden Systemen inkompatibel bezeichnete. 1938 bestätigten erste Erfolge bei der Vitrifikation von Froschsperma seine Ansätze (LUYET und HODAPP 1938). Vier Jahre später folgte die erfolgreiche Vitrifikation von Geflügelsperma (SHAFFNER 1942).
echte Alternative zu konventionellen Kryokonservierungsprotokollen darstellen. Die Überlebensraten vitrifizierter Spermatozoen erwiesen sich als gegenüber konventionell kryokonservierten Spermatozoen als ausgesprochen gering (HOAGLAND und PINCUS 1942, SMITH 1961). Sowohl das Erreichen extrem hoher Kühlraten als auch der Schutz vor den toxischen Effekten der Kryoprotektiva stellte zum damaligen Zeitpunkt ein nicht lösbares Problem dar – ein Umstand, der zur Folge hatte, dass die Weiterentwicklung von Protokollen vorangetrieben wurde, die das langsame schrittweise Einfrieren ermöglichten.
Erst in den 80er Jahren wurden wieder Erfolge auf dem Gebiet der Vitrifikation reproduktiver Zellen bekannt. RALL und FAHY (1985) veröffentlichten Ergebnisse, aus denen hervorging, dass ihnen durch Vitrifikation eine eiskristallfreie Art der Kryokonservierung von Mausembryonen gelungen war. Dabei verwendeten sie hohe Konzentrationen von Kryoprotektiva und relativ niedrige Kühl- und Wärmeraten. Die Vitrifikation von Spermatozoen jedoch bereitete weiterhin Schwierigkeiten.
Techniken, die zur Vitrifikation von Embryonen angewandt und weiterentwickelt wurden, ließen sich nicht ohne weiteres auf die Vitrifikation von Spermatozoen übertragen. Grund hierfür waren vor allem die hohen Konzentrationen an Kryoprotektiva und die damit einhergehenden osmotischen und zytotoxischen Effekte (GILMORE et al. 1997). Die Kombination permeabler und nicht-permeabler Kryoprotektiva in hohen Konzentrationen (30-50 %) wurde als Voraussetzung für die Möglichkeit einer erfolgreichen Vitrifikation von Zellen betrachtet (FAHY 1988). Mit der Veröffentlichung erfolgreicher Vitrifikationsergebnisse Mitte der 80er Jahre folgten eine Vielzahl weiterer Veröffentlichungen auf dem Gebiet der Vitrifikation, die nun wieder als Alternative zu den teuren und zeitaufwendigen slow-cooling- Protokollen ernst genommen werden konnte. Die meisten Veröffentlichungen beziehen sich dabei jedoch auf die Vitrifikation großer reproduktiver Zellen, wie Embryonen und Oozyten.
2002 stellten NAWROTH et al. eine Studie vor, die die Möglichkeit beschrieb, Spermatozoen mit einer reduzierten Menge permeabler und nicht-permeabler Kryoprotektiva zu vitrifizieren. 2004(b) vitrifizierten ISACHENKO et al. humane Spermatozoen ohne Verwendung von Kryoprotektiva mit unterschiedlichen Kühlraten
(bis 7,2x105 ° C/min vers. 150-250 ° C/min). Es folgte eine von ISACHENKO et al.
(2004a) veröffentlichte Studie, die konventionell, also langsam eingefrorene humane Spermatozoen mit vitrifizierten Spermatozoen in Bezug auf ihre DNA-Integrität und ihre Motilität vergleichen sollte. Zudem wurde ein Vergleich zwischen Proben mit und ohne Verwendung von Kryoprotektiva angestellt. Das Ergebnis waren vergleichbare Resultate zwischen der Gruppe der mit Kryoprotektiva konventionell eingefrorenen Spermatozoen und den ohne Kryoprotektiva vitrifizierten Spermatozoen (ISACHENKO et al. 2004a).
Eine 2005 veröffentlichte Studie von ISACHENKO et al. verglich vier Methoden zur Vitrifikation von humanen Spermatozoen bei hohen Auftauraten. Auch hier fanden Kryoprotektiva keine Verwendung. Alle vier Methoden führten zu befriedigenden Ergebnissen, wobei die Verwendung von „open pulled straws“ und „standard open pulled straws“ im Vergleich zu „Cryoloops“ und „droplets“ mit Hinblick auf eine mögliche Kontamination durch Stickstoff als die geeigneteren Trägersysteme erschienen, da durch sie der unmittelbare Kontakt mit Stickstoff umgangen wird.
Die alleinige Verwendung nicht-permeabler Kryoprotektiva wird als weitere Möglichkeit der erfolgreichen Vitrifikation von Spermatozoen in Betracht gezogen.
HOSSAIN und OSUAMKPE (2007) stellten Versuche an, bei denen die besten Ergebnisse mit 100 mM Saccharose erzielt wurden. Die Motilität nach dem Auftauen war zwar mäßig (< 30 %), die Membranintegrität der untersuchten Spermatozoen erwies sich dafür als befriedigend (~ 50 %). MORRIS et al. (2006, 2007) kamen zu dem Schluss, dass bei der schnellen Kryokonservierung von humanem und equinem Sperma osmotische Imbalancen während des Auftauprozesses ursächlich für Zellschäden sind. Anzeichen für intrazelluläre Eisbildung wurden nicht gefunden.
2008 schließlich wurde eine weitere Studie von ISACHENKO et al. veröffentlicht, die den akrosomalen Status und die mitochondriale Aktivität von vitrifiziertem humanem Sperma untersuchte, bei dessen Vitrifikation Saccharose Verwendung fand. Dabei stellten sie keinen Unterschied in Bezug auf Kapazitation und Akrosomreaktion zwischen der Kontrollgruppe und der Gruppe der mit Saccharose vitrifizierten Proben
2.4.2 Prinzip und Vorgehensweise der Vitrifikation
Unter Vitrifikation im physikalischen Sinne versteht man die Solidifikation einer Lösung während des Kühlens, nicht durch Überführen in einen kristallinen Zustand, sondern durch eine extreme Zunahme der Viskosität. Die Lösung nimmt einen glasartigen Zustand ein (FAHY et al. 1984). Während des Prozesses der Vitrifikation haben die Moleküle aufgrund der hohen Kühlraten keine Möglichkeit, die für den gefrorenen Zustand einer Lösung typische Gitterstruktur zur Bildung von Kristallen einzunehmen, sondern sie erstarren sozusagen in einem ungeordneten Zustand.
Daher wird im Rahmen der Vitrifikation auch von „Vitrifizieren und Erwärmen“ und nicht von „Einfrieren und Auftauen“ wie im Zusammenhang mit traditionellen Einfrierverfahren gesprochen (LIEBERMANN 2003).
Durch das schnelle Abkühlen unter die Glasübergangstemperatur (Tg) einer Flüssigkeit wird die Kristallisation unterdrückt und die Flüssigkeit unterkühlt. Dieser thermodynamische Zustand ist metastabil und die Viskosität der Flüssigkeit steigt an.
Der aus dem Prozess der Vitrifikation hervorgehende Festkörper ist amorph und unterscheidet sich in seiner Struktur kaum von der ihm zuzuordnenden Flüssigkeit.
Abb. 2.3: Zwei 150 µl große Tropfen in flüssigem Stickstoff (LN2) (LIEBERMANN 2003) (A): „Dulbeccos phosphatgepuffertes Saline“ mit Eiskristallbildung; (B): Mixtur aus 20 % Ethylenglykol (EG) und Dimethylsulfoxid (DMSO) bildet einen glasähnlichen, amorphen Zustand ohne Eiskristalle.
Der Punkt, an dem die Glasübergangstemperatur erreicht wird, ist definiert als der Punkt, an dem das Material eine Viskosität von 1013 P besitzt. Die Umwandlung einer Flüssigkeit in ein Glas ist also mehr ein kinetischer als ein thermodynamischer Prozess (YAVIN und ARAV 2007).
Liegen die Temperatur des Phasenübergangs und des Glasübergangs einer Lösung nahe beieinander, so erleichtert dies die Vitrifikation (YAVIN und ARAV 2007).
Im Wesentlichen hängt der Erfolg eines Vitrifikationversuches von drei Faktoren ab, die sich durch die folgende Gleichung in ihrer Abhängigkeit voneinander vereinfacht darstellen lassen:
Wahrscheinlichkeit Kühl- und Auftaurate x Viskosität = –––––––––––––––––––––––––––
der Vitrifikation Probenvolumen
Aus dieser Formel ist zu ersehen, dass es drei Wege gibt, die Vitrifikation einer Flüssigkeit zu erreichen:
1.) Erhöhung der Kühlrate 2.) Erhöhung der Viskosität
3.) Reduktion des Probenvolumens
Eine Erhöhung der Viskosität lässt sich über die Verwendung hoher Konzentrationen an Kryoprotektivum erzielen. Die Konzentration des Kryoprotektivums und die Abkühlrate stehen in indirekt proportionaler Beziehung zueinander. Mit steigender Konzentration des Kryoprotektivums sinkt die kritische Geschwindigkeit des Abkühlens und Auftauens, die nötig ist, um eine Eiskristallbildung zu vermeiden. Im Umkehrschluss bedeutet das, dass die Konzentration an Kryoprotektiva mit steigender Abkühl- und Auftaurate gesenkt werden kann. Die Verwendung hoher Konzentrationen von Kryoprotektiva würde zwar zu einer Erhöhung der Viskosität der Lösung führen, ist aber wegen der toxischen und hypertonen Effekte der Kryoprotektiva vor allem im Bereich der Kryokonservierung von Spermatozoen nur begrenzt praktikabel.
