Bei der ultraschnellen Methode werden die Embryonen wie bei der Vitrifikation direkt in flüssigen Stickstoff eingetaucht. Jedoch werden hier im intra- und extrazellulären Medium kleine Eiskristalle gebildet. Es werden penetrierende (2,0 - 3,5 M) und nicht penetrierende Kryoprotektiva (0,2 - 0,5 M) verwendet (NIEMANN 1991b). Durch das nicht penetrierende Kryoprotektivum im extrazellulären Medium werden die Zellen schon vor dem Tiefgefrieren teilweise dehydriert und so eine intrazelluläre Eisbildung reduziert oder verhindert (MAZUR 1990).
Zunächst konnten nur Mäuseembryonen mit guten Überlebensraten tiefgefroren werden. Einen Überblick gibt Tabelle 10. MATSUOKA et al. (1995) berichteten über die erfolgreiche Anwendung bei in vitro produzierten Rinderembryonen. Bei einer Equilibrierungstemperatur von 5°C konnten mit 20% Ethylenglykol und 0,3 M Trehalose bzw. 0,3 M Sucrose Schlupfraten von 64 bzw. 63% erreicht werden.
GUTIERREZ et al. (1993a) verglichen den Einfluß verschiedener penetrierender Kryoprotektiva in einer Konzentration von 3,0 M in Kombination mit 0,25 M Suc auf die Überlebensraten von Mäusemorulae. Die in vitro-Entwicklungsrate von Glycerin und Ethylenglykol war signifikant höher (76,1 bzw. 79,5%) als die nach Verwendung von Propanediol (43,6%).
NOWSHARI u. BREM (1998) verglichen die Entwicklungsraten von expandierten Mäuseblastozysten beim alleinigen Gebrauch von Ethylenglykol oder Propanediol in verschiedenen Konzentrationen. Eine Konzentration von 7,0 M erwies sich am effektivsten.
Die Schlupfraten beim Ethylenglykol waren dabei höher als beim Propanediol (84 bzw. 78%).
TROUNSON et al. (1987) hielten beim ultraschnellen Tiefgefrieren von Mäuseembryonen mit einer Kombination von DMSO und Sucrose eine Equilibrierungszeit von 2-2½ min für ausreichend.
RAYOS et al. (1992b) bestimmten die optimale Equilibrierungszeit von Mäuseembryonen in 3,0 M Ethylenglykol und 0,25 M Sucrose. Die höchsten Entwicklungsraten wurden bei einer Equilibrierungsdauer von 10 min festgestellt. Bei längeren Equilibrierungszeiten von 20 bzw.
40 min sanken die Entwicklungsraten. Bei verlängerten Equilibrierungszeiten kam es zu höheren intrazellulären Konzentrationen von Ethylenglykol. Eine osmotische Schädigung der Embryonen durch den schnellen Einfluß von Wasser beim Ausverdünnen des Kryoprotektivums nach dem Auftauen wurde wahrscheinlicher (LEIBO 1989).
Mit 25% Propanediol und 0,25 M Sucrose konnten ZHIMING et al. (1990) Mäuseoozyten ultraschnell tiefgefrieren. Eine anschließende in vitro-Reifung von morphologisch normalen Oozyten war möglich.
Tab.10: Überlebensraten von Mäuseembryonen nach ultraschnellem Tiefgefrieren
81,0% ER ER zu expandierten Blastozysten nach 72 h TAKAHASHI u.
KANAGAWA (1990)
Morulae 2,0 M Gly + 0,25 M Lactose 2 Schritte, mit 0,5 M Suc
1-Zell-Embryonen 3,0 M EG + 0,25 M Suc 2 Schritte, mit Suc
67,2% ER ER zu expandierten Blastozysten, 10 min
Abkürzungen: Gly = Glycerin Suc = Sucrose EG = Ethylenglykol
Proh = Propanediol PBS = phosphate buffered saline IR = Implantationsrate
ER = Entwicklungsrate ÜR = Überlebensrate SR = Schlupfrate
2.3.4. Auftaumethoden
Das Überleben der Embryonen hängt neben der Kühlrate ebenso von der Auftaurate ab.
Mäuseembryonen, langsam mit -0,3°C/min auf Temperaturen zwischen -78 und -269°C gekühlt, wurden mit Raten von 4, 25, 215 und 450°C/min aufgetaut. Die höchsten Überlebensraten der Embryonen wurden mit Auftauraten von 4 bzw. 25°C/min erreicht
(WHITTINGHAM et al. 1972). RIDHA u. DUKELOW (1985) verglichen die Überlebensraten von Hamsterembryonen nach schnellem und langsamen Auftauen. Die Embryonen wurden zunächst langsam mit
-0,33°C/min auf -85°C gekühlt und dann in flüssigen Stickstoff umgesetzt. Das Auftauen erfolgte mit Raten von 90 bzw. 1,5°C/min. Die Überlebensraten der 1- bis 8-Zellembryonen waren bei den langsam aufgetauten Embryonen signifikant höher als bei den schnell aufgetauten Embryonen. Zu ähnlichen Ergebnissen kamen auch WILMUT (1972) bei Mäuseembryonen und WILLADSEN et al. (1976) bei Schafembryonen. Je langsamer Embryonen gekühlt werden, um so langsamer müssen sie auch aufgetaut werden, um eine maximale Überlebensfähigkeit zu erhalten (LEIBO u. MAZUR 1978).
Schnell tiefgefrorene, ultraschnell tiefgefrorene sowie vitrifizierte Embryonen benötigen auch ein schnelles Auftauen (> 300°C/min). Die nach langsamen Kühlen auf -25 bis -45°C verbleibende konzentrierte intrazelluläre Flüssigkeit geht beim Umsetzen in flüssigen Stickstoff in einen metastabilen, glasartigen Zustand über. Beim langsamen Auftauen ist genügend Zeit zur Kristallisation (Devitrifikation) der glasartigen intrazellulären Flüssigkeit. Dies führt zu niedrigeren Überlebensraten. Beim schnellen Auftauen bleibt keine Zeit zur Kristallisation. 8-Zell-Mäuseembryonen wurden in 1,5 M Glycerin equilibriert und nach dem Tiefgefrieren mit unterschiedlichen Raten aufgetaut. Embryonen, die langsam auf Temperaturen von -20 bis -40°C gekühlt wurden und anschließend in flüssigen Stickstoff umgesetzt wurden, überlebten langsames Auftauen (2°C/min) nach 48 h in vitro-Kultur nur zu 4-25%. Es überlebten jedoch 74% der Embryonen, die langsam bis auf -25°C gekühlt wurden und anschließend schnell (mit 500°C/min) aufgetaut wurden (RALL u. POLGE 1984). Die Devitrifikation läuft auch beim langsamen Auftauen nach der Vitrifikation ab.
Kleine Eiskristalle, wie sie beim schnellen oder ultraschnellen Tiefgefrieren entstehen, haben eine größere Oberflächenenergie und sind thermisch instabil. Beim langsamen Auftauen verwandeln sie sich in größere schädigende Kristalle. Dieser Vorgang wird als Rekristallisation bezeichnet. Beim schnellen Auftauen schmelzen die instabilen kleinen Kristalle, bevor sie die Chance zum Wachsen haben (MAZUR 1965; BANK 1973; RALL et al. 1980).
RALL et al. (1980) und RALL (1981) konnten drei wesentliche Ereignisse beim langsamen Auftauen von schnell gekühlten Embryonen beobachten. Bei ca. -85°C konnte ein sogenanntes
„flashing“ (Devitrifikation), bei ca. -55°C eine weitere Verdunklung des Zytoplasmas (Rekristallisation) und bei ca. -40°C ein Verschwinden des dunklen kristallinen Materials im Zytoplasma (Schmelzen des Eises) beobachtet werden.
Das schnelle Auftauen der Pailletten geschieht meist im Wasserbad. ELSDEN et al. (1982) verglichen die Trächtigkeitsraten nach dem Transfer von Rinderembryonen, die nach dem Tiefgefrieren im 25 oder 37°C warmen Wasserbad aufgetaut wurden. Die Trächtigkeitsraten lagen nach dem Auftauen bei 37°C über denen bei 25°C (36,5 bzw. 23,5%). Bei Rinderembryonen, die mit Glycerin oder DMSO tiefgefroren und bei 27 bzw. 37°C im Wasserbad aufgetaut wurden, konnten keine Unterschiede bei den Überlebensraten beobachtet werden (PRATHER et al. 1987). SEIDEL et al. (1990) froren Rinderembryonen mit einem Medium ein, dem Makromoleküle zugefügt wurden. Die Pailletten wurden 20 sec im Wasserbad bei 37°C oder zunächst 6 sec in der Luft und dann 20 sec im Wasserbad bei 37°C aufgetaut. Nach dem Auftauen in der Luft und im Wasserbad konnte mit 46% eine höhere Trächtigkeitsrate als nach alleinigem Auftauen im Wasserbad (41% Trächtigkeitsrate) erzielt werden.
Nach Tiefgefrieren von 8-Zell-Mäuseembryonen und schnellem Auftauen konnte eine maximale Überlebensrate erreicht werden, wenn das langsame Kühlen bei einer Umsetztemperatur von -40°C beendet wurde. Dadurch wurde das Verfahren weniger zeitaufwendig (WHITTINGHAM 1981).
2.3.5. Ausverdünnungsmethoden
Die meisten Kryoprotektiva müssen aufgrund ihrer Toxizität bei wärmeren Temperaturen vor der Kultur oder vor dem Transfer aus den Embryonen entfernt werden. Aufgetaute Zellen enthalten eine große Konzentration an Kryoprotektiva. Sie schwellen durch Wassereinfluß osmotisch an, wenn sie in physiologisches Medium oder Kulturmedium zurückverbracht werden. Ergebnisse in Bezug auf die Überlebensfähigkeit und das Volumen von Mäuseembryonen zeigen, daß man eine Ausverdünnungsmethode wählen sollte, bei der das Embryonenvolumen unter 200% und über 50% des isotonischen Volumens gehalten werden kann (MAZUR u. SCHNEIDER 1986).
Dazu gibt es zwei verschiedene Möglichkeiten. Beim schrittweisen Ausverdünnen reduziert man die Konzentration des Kryoprotektivums im extrazellulären Medium durch Umsetzen der Embryonen in Lösungen mit absteigender Konzentration des Kryoprotektivums. Dabei wird das Anschwellen der Zellen in tolerierbaren Grenzen gehalten.
Das zweite Verfahren, das ein Überschreiten des isotonischen Zellvolumens verhindert, ist das Ausverdünnen in einer hypertonischen Lösung mit nicht penetrierenden Kryoprotektivum. Die nicht penetrierende Substanz hält die extrazelluläre Osmolarität konstant. Ein schädliches Anschwellen der Zellen wird verhindert, und das intrazelluläre Kryoprotektivum strömt aus der Zelle hinaus. Wenn ausreichend Kryoprotektivum die Zelle verlassen hat, kann diese wieder in isotonisches physiologisches Medium gegeben werden, ohne daß das Volumen über die tolerierbare Größe hinausgeht (LEIBO u. MAZUR 1978; MAZUR 1985).
2.3.5.1. Schrittweises Ausverdünnen von Glycerin
Embryonen besitzen eine geringe Permeabilität gegenüber Glycerin (SZELL et al. 1989).
Glycerin kann durch ein aufeinanderfolgendes Umsetzen der Embryonen in Lösungen mit niedrigeren Glycerin-Konzentrationen ausverdünnt werden. So kann 1,5 M Glycerin in 6 Schrittem mit Konzentrationsunterschieden von je 0,25 M Glycerin (1,25 M, 1,0 M, 0,75 M,
0,5 M, 0,25 M und 0 M) aus dem Embryo entfernt werden (BIELANSKI et al. 1985).
Verschiedene Autoren verwendeten zwischen 3 und 6 Ausverdünnungsschritte (s. Tab.11).
Tab.11: Überlebensraten von Embryonen nach konventionellem Tiefgefrieren und schrittweisem Ausverdünnen ohne Sucrose (1,4 M Glycerin = 10% Glycerin)
Autoren Spezies Konzentration
PETTIT 1985 Rind 10% 6 56,0, 53,0
bzw. 58,0%
Rind 1,4 M 6 61,0% TR d7-Embryonen
Abkürzungen:
ÜR = Überlebensrate TG = Tiefgefrieren
ER = Entwicklungsrate IVC = in vitro-Kultur
TR = Trächtigkeitsrate Blasto = Blastozysten
SR = Schlupfrate d = Tag
Eine andere Möglichkeit ist es, den Embryo in eine Sucrose-Lösung zu überführen (s. Abb.3).
Der Embryo zeigt kein übermäßiges Anschwellen, schrumpft aber fortschreitend, wenn das Kryoprotektivum den Embryo verläßt. Das Schrumpfen und Anschwellen von Embryonen während des Ausverdünnens ist ein vorläufiges Anzeichen dafür, daß sie das Tiefgefrieren überlebt haben. Es zeigt an, daß die Zellmembranen normal funktionieren (SCHNEIDER u.
MAZUR 1984).
Gute Überlebensraten wurden beim Ausverdünnen des Embryos in mehreren Schritten in Lösungen mit absteigenden Glycerin-Konzentrationen erreicht. Diese Lösungen enthielten neben dem Glycerin Sucrose in Konzentrationen von 0,3-1,0 M. NIEMANN et al. (1981a;
1982) verglichen die in vitro-Überlebensraten von Rinderblastozysten nach Ausverdünnen in 5 Schritten ohne Sucrose und nach Ausverdünnen in zwei Schritten mit 0,5 M Sucrose. Die
Abb.3: Schematische Darstellung einer kalkulierten Volumenveränderung von Rinderblastozysten bei stufenweiser oder direkter (über Sucrose) Entfernung von
1,5 M Glyzerin (Nach SCHNEIDER und MAZUR, 1984; zit.
NIEMANN und MEINECKE, 1993)