Nicht penetrierende Gefrierschutzmittel dringen nicht in die Zellen ein, sondern üben ihre Schutzwirkung im extrazellulären Raum aus. Dabei werden sie nur in niedrig molaren Konzentrationen eingesetzt und sind deshalb auch weniger toxisch als penetrierende Gefrierschutzmittel (NIEMANN u. MEINECKE 1993). Diese nicht penetrierenden Kryoprotektiva werden auch während der Equilibrierungsphase genutzt, um die Dehydration zu unterstützen, aber auch während der Ausverdünnungsphase, um ein zelluläres Anschwellen zu begrenzen (FRIEDLER et al. 1988).
Nach MERYMAN (1971) liegt der Einfluß der nicht penetrierenden Kryoprotektiva darin, die Zellmembranen zu befähigen, gelöste Stoffe unter osmotischen Streß reversibel penetrieren zu lassen.
SEIDEL (1989) sieht die Wirkung der nicht penetrierenden Kryoprotektiva schon vor Beginn der Kühlung. Durch die Zugabe von 0,2-0,3 M Sucrose kommt es zu einer Vordehydrierung und das Umsetzen in flüssigen Stickstoff kann schon bei höheren Temperaturen erfolgen, da eine geringere Dehydration während des langsamen Kühlens notwendig ist.
Der Einsatz von nicht penetrierenden Kryoprotektiva soll besonders bei großen Kühlraten effektiv sein, da hier eine schnelle Dehydrierung der Zellen notwendig ist (MERYMAN et al.
1977).
2.2.2.1. Sucrose
Sucrose gehört zur Gruppe der nicht penetrierenden Gefrierschutzmittel (physikalisch-chemische Eigenschaften s. Tab.6). Ein wichtiges Einsatzgebiet der Sucrose liegt im Entfernen der penetrierenden Gefrierschutzmittel aus den aufgetauten Embryonen. Es kommt zum Einströmen von Wasser in den Embryo, wenn die extrazelluläre Konzentration des penetrierenden Kryoprotektivums verringert wird. Dies geschieht beim Umsetzen in eine hypoosmolare Lösung, z. B. wenn Embryonen, equilibriert in 1,5 M Glycerin, direkt in PBS (Phosphat-Buffered-Solution) umgesetzt werden. Wasser fließt dann sehr schnell in den Embryo ein. Durch dieses Anschwellen kann der Embryo geschädigt werden. So lange das maximal tolerierbare Volumen des Embryos nicht überschritten wird, kommt es jedoch zu keiner Schädigung. Mäuseblastozysten tolerieren das ca. 2,7-fache ihres isotonischen Volumens für 30 min bei 23°C (SCHNEIDER u. MAZUR 1984).
Sucrose dient hier als osmotischer Puffer, in dem sie der anfangs hohen intrazellulären Osmolarität des penetrierenden Kryoprotektivums entgegenwirkt. Durch die Verringerung der extrazellulären Konzentration des penetrierenden Kryoprotektivums kontrolliert die Sucrose-Lösung den Grad des Anschwellens des Embryos. Das Kryoprotektivum verläßt die Zelle.
Dadurch wird das osmotische Equilibrium aufrechterhalten. Währenddessen verliert der Embryo Wasser und schrumpft. Beim Gebrauch von Sucrose kann der Embryo bis auf 25%
seines Ausgangsvolumens schrumpfen. Nach dem Umsetzen in physiologisches Medium oder Kulturmedium erreicht er dann wieder sein ursprüngliches Volumen (SZELL u. SHELTON 1986; VOELKEL u. HU 1992a).
Die Reaktion der Embryonen auf die Sucrose-Lösung (Schrumpfen gefolgt von Reexpansion) ist ein Zeichen für die normale Funktion der Zellmembran und kann als Indikator für die Lebensfähigkeit der Embryonen gewertet werden (BIELANSKY et al. 1986).
Besonders häufig wird Sucrose in isomolarer Konzentration beim Ausverdünnen von Glycerin eingesetzt. So ist z. B. eine 1,12 M Sucrose-Lösung isomolar zu einer 1,5 M Glycerin-Lösung (SCHNEIDER u. MAZUR 1984)
Sucrose Trehalose Ficoll PVA PVP aus einem Glucose- und
Fructose-Molekül bestehendes Disaccharid;
wirkt nicht reduzierend, da beide Hydroxylgruppen durch Glykosidbindungen blockiert sind1 (BEYER
u.WALTER 1984) schmeckt sehr süß2 leicht löslich in Wasser, wenig löslich in Alkohol, unlöslich in Ether2
Disaccarid, das aus zwei Glucosebausteinen besteht und wie Sucrose nicht zu den
löslich in Wasser und heißem Alkohol, unlöslich in Ether2
aus Sucrose und Epichlorhydrin hergestelltes,
hydrophiles Polymer2
Molekulargewicht:
70000 (Ficoll 70) bzw.
400000 (Ficoll 400)2
schwach gelbe, nicht ganz klare Flüssigkeit
(Produktinformation Ficoll 400, Fa.
Sigma, St. Louis, USA)
entsteht durch Umesterung des Polyvinylesters mit Methanol1 (BEYER u.
WALTER 1984) ein weißes bis elfenbein-farbenes Pulver2
leicht in Wasser löslich, bildet visköse Lösung, in den meisten organischen
(Temperatur, bei der ein amorpher Festkörper aus dem flüssigen in den Glaszustand übergeht und umgekehrt): 175°C2 weißes, hygroskopisches Pulver; löst sich in Wasser unter leicht saurer Reaktion ebenso wie in Alkohol gut, jedoch nicht in Ether2
Glycerin kann stufenweise mit oder ohne Sucrose ausverdünnt werden. Eine Vereinfachung und zeitliche Verkürzung des Ausverdünnungsprozesses wird durch das Ausverdünnen mit Sucrose in einem Schritt erreicht (NIEMANN 1983). Dies konnte mit gleich guten oder besseren Ergebnissen durch Untersuchungen bei Rinderembryonen belegt werden (s. Tab.2).
Die Überlebensraten waren hoch, wenn eine Konzentration von 1,0 M Sucrose zum Ausverdünnen des Glycerins in einem Schritt verwendet wurde. MERRY et al. (1983) erzielten nach Ausverdünnen mit 1,0 M Sucrose nach dem Tiefgefrieren von Mäuseembryonen mit 1,0 M Glycerin in vitro-Entwicklungsraten zu expandierten Blastozysten von 60,5%. Beim Tiefgefrieren mit 1,5 M Glycerin und Ausverdünnen mit 1,0 M Sucrose entwickelten sich 87,0% der frühen Mäuseblastozysten zu expandierten Blastozysten (HERNANDEZ-LEDEZMA et al. 1988b). DEL CAMPO et al. (1990) erreichten nach Ausverdünnen von 1,5 M Glycerin mit 1,0 M bzw. 0,5 M Sucrose in vitro-Überlebensraten von Rinderembryonen von 64 bzw. 71%. In Versuchen von SUZUKI et al. (1990) überlebten in vitro 82 bzw. 88%
der Rinderembryonen das Ausverdünnen von 1,4 M Glycerin nach dem Tiefgefrieren mit 0,4 bzw. 0,8 M Sucrose. Bei niedrigeren Konzentrationen sanken auch die Überlebensraten.
MAPLETOFT et al. (1989) untersuchten den Einfluß verschiedener Sucrose-Konzentrationen auf die in vitro-Überlebensfähigkeit von frisch gewonnenen Mäuseembryonen. Dabei wurde die Temperatur (20 bzw. 35°C) und die Zeit (10 oder 30 min), die die Embryonen dieser Lösung ausgesetzt waren, berücksichtigt. Der Einfluß von Temperatur und Zeit auf die Überlebensfähigkeit der Embryonen war bei einer 0,5 M Sucrose-Lösung nur gering. Bei Verwendung der 1,0 M Sucrose-Lösung nahmen die Überlebensraten bei Erhöhung der Temperatur und Verlängerung der Equilibrierungszeit ab. Bei Equilibrierung in 2,0 M Sucrose wurde die in vitro-Überlebensfähigkeit stark reduziert.
TAKEDA et al. (1987) stellten nach Ausverdünnen des Glycerins aus 8-Zell-Mäuseembryonen mit zunehmender Sucrose-Konzentration (0,0-1,3 M) auch eine steigende Zahl von Embryonen mit Schäden der Zona pellucida fest.
Eine weitere Vereinfachung der Methode des Ausverdünnens von Glycerin mit Sucrose wurde von LEIBO (1983) beschrieben. In der Paillette befindet sich neben der Säule mit dem Embryo
im Tiefgefriermedium eine weitere Säule mit Sucrose. So kann das Ausverdünnen durch Vermischen der beiden Säulen nach dem Auftauen in der Paillette erfolgen. Diese Methode wird als One-Step-Methode bezeichnet. HOOGENKAMP (1984) und SCHUBERTH (1984) variierten das Verhältnis von Glycerin und Sucrose in der Paillette und erreichten die besten Überlebensraten bei Rinderembryonen mit einem Glycerin / Sucrose-Verhältnis von 1:2. CSEH et al. (1994) benutzten ein Glycerin / Sucrose-Verhältnis von 1:9 und erhielten eine Trächtigkeitsrate von 38% nach Transfer.
Sucrose wird auch zur Dehydration von Embryonen bei Raumtemperatur benutzt (LEHN-JENSEN 1984). MASSIP et al. (1987) hielten bei alleiniger Verwendung von Glycerin ein langsames Kühlen bis -35°C vor dem Umsetzen in flüssigen Stickstoff für notwendig. Durch Hinzugabe von 0,2-0,3 M Sucrose zur Glycerin-Lösung konnte das Umsetzen bei höheren Temperaturen und somit früher erfolgen, da die Embryonen durch die Sucrose bereits stark dehydriert waren und eine geringere Dehydration während des langsamen Kühlens benötigten (SEIDEL 1989). Nach LEIBO (1989) ist eine Dehydration durch Sucrose alleine nicht ausreichend für das Überleben der Embryonen, da Sucrose alleine keine ausreichende Kryoprotektion leistet.
Auch beim ultraschnellen Tiefgefrieren von Rinder- und Mäuseembryonen wird die Fähigkeit von Sucrose zur Dehydration von Zellen ausgenutzt. Dabei wird Sucrose in einer Konzentration von 0,25 M in Kombination mit 3 M Ethylenglykol (RAYOS et al. 1992a;
RAYOS et al. 1992b) und in einer Konzentration von 0,5 M mit 3,5 M Glycerin (THOMAS et al. 1989) eingesetzt. Nach dem Auftauen wird abermals in Sucrose ausverdünnt.
Sucrose findet als Bestandteil in Vitrifikationslösungen eine weitere Verwendung. Von KASAI et al. (1990) und KASAI (1996) wurde eine Lösung beschrieben, die Agentien aus drei verschiedenen Kategorien enthält: Ethylenglykol als penetrierendes Kryoprotektivum, das Makromolekül Ficoll und 0,5 M Sucrose als nicht penetrierende Komponenten. Sucrose reduziert in Kombination mit Ficoll die Toxizität der Lösung, da es ein schnelles Schrumpfen der Embryonen und eine Reduktion der Ethylenglykol-Konzentration in den Zellen verursacht.
TADA et al. (1993) berichteten von einer Vitrifikationsmethode mit den beiden penetrierenden Kryoprotektiva DMSO und Propanediol (je 2,75 M). Durch Zugabe von Sucrose bzw.
Raffinose (einem weiteren Disaccharid) konnte die Überlebensfähigkeit der 2-Zell-Mäuseembryonen gesteigert werden. SAITO et al. (1994) erhielten durch Zugabe von Sucrose und Dextrose zu einer Vitrifikationslösung bestehend aus Glycerin und Ethylenglykol höhere Überlebensraten nach Vitrifikation von IVP-Rinderblastozysten. KUWAYAMA et al. (1994a) und KUWAYAMA (1995) fügten einer Vitrifikationslösung aus Glycerin und Ethylenglykol Sucrose und Eigelb hinzu. Dadurch wurden hohe in vitro-Überlebensraten von in vitro produzierten Rinderblastozysten (73%) nach Ausverdünnen in der Paillette erreicht.
2.2.2.2. Trehalose
Trehalose (s. Tab.6) ist neben der Sucrose ein weiteres Disaccharid, das in der Kryokonservierung eingesetzt wird.
SMORAG et al. (1990) untersuchten den Einfluß von Sucrose und Trehalose auf die Überlebensfähigkeit von Zwei-Zell-Kaninchenembryonen. Dabei waren die in vitro-Entwicklungsraten zu Morula- und Blastozystenstadien sowohl bei 20°C wie auch 38°C bei Verwendung von 1,45 M Trehalose deutlich höher (53,2 gegenüber 15,9% bzw. 55,5 gegenüber 0,0%) als bei Verwendung von 2,0 M Sucrose. Dies wurde auf einen besseren stabilisierenden Einfluß der Trehalose auf die Zellmembranen zurückgeführt, der jedoch spezies- und zellstadiumabhängig zu sein scheint.
Bei unreifen Rinderoozyten wurde eine Beeinträchtigung der Entwicklungsfähigkeit nach dem Tiefgefrieren durch Trehalose und Sucrose beobachtet. Nur sehr wenige (6%) Oozyten konnten nach Auftauen in vitro gereift werden (NIEMANN 1991a).
Bei der Vitrifikation von unreifen Rinderoozyten konnte die Konzentration von Trehalose ohne Einfluß auf die Überlebensfähigkeit bis auf 1,0 M erhöht werden, während Sucrose in dieser Konzentration zu einem erhöhten Anteil degenerierter Oozyten führte (ARAV et al. 1991).
Trehalose wurde als Komponente in der Vitrifikationslösung bei der Vitrifikation von IVF-Rinderblastozysten verwendet. Mit 40% Ethylenglykol, 0,3 M Trehalose und 20%
Polyvinylpyrrolidon konnten Schlupfraten von 43% erreicht werden (SAHA et al. 1996).
KRAG et al. (1985) setzten Sucrose oder Trehalose in Kombination mit Glycerin bei Mäuseembryonen und MATSUOKA et al. (1995) in Kombination mit Ethylenglykol bei in vitro produzierten Rinderembryonen ein. Es konnten keine Unterschiede bei den Überlebensraten beim Gebrauch von Sucrose oder Trehalose festgestellt werden. Mit der Kombination DMSO und Trehalose konnte ROBERTSON et al. (1989) beim ultraschnellen Tiefgefrieren von Mäuseembryonen bessere Resultate erzielen als mit der Kombination DMSO und Sucrose.
2.2.2.3. Ficoll
Ficoll ist ein nicht organisches Makromolekül (s. Tab.6). Es erlaubt eine Reduktion der Konzentration des penetrierenden Kryoprotektivums bei der Vitrifikation, was toxische und osmotische Effekte verringert. Durch Hinzugabe von Ficoll kann die für die Vitrifikation von in vitro produzierten Rinderembryonen benötigte Konzentration eines penetrierenden Kryoprotektivums gesenkt werden. Eine 40% v/v Ethylenglykol-Lösung erlaubt eine Vitrifikation. Eine Lösung mit einer Ethylenglykol-Konzentration von 37,5% v/v erwies sich für eine vollständige Vitrifikation als nicht ausreichend. Wird der Lösung jedoch ein Makromolekül, z. B. 15% Ficoll hinzugefügt, ist bereits mit einer 37,5% v/v Ethylenglykol-Lösung eine Vitrifikation möglich (DARVELID et al. 1984).
KASAI et al. (1990) und PALASZ et al. (1997) zeigten, daß durch Ficoll eine Rekristallisation während des Erwärmens verhindert wird. Ficoll wurde besonders bei der Vitrifikation in Kombination mit Ethylenglykol und Sucrose zuerst von KASAI et al. (1990) bei Mäuseembryonen, später auch bei Rinderembryonen eingesetzt (MIYAKE et al. 1993; ZHU et al. 1993; KASAI 1996; PALASZ et al. 1997). Dabei wurden Konzentrationen von 15-30%
verwendet.
Auch beim ultraschnellen Tiefgefrieren können Makromoleküle wie Ficoll (oder auch PVP oder PVA) Serum erfolgreich ersetzen. Jedes Makromolekül beeinflußt die Penetrationsrate des Kryoprotektivums anders, so daß unterschiedliche Equilibrierungszeiten gewählt werden müssen (GUTIERREZ et al. 1993b).
2.2.2.4. Polyvinylpyrrolidon (PVP) und Polyvinylalkohol (PVA)
PVP und PVA sind Makromoleküle und gehören ebenfalls zu den nicht penetrierenden Kryoprotektiva (s. Tab.6).
WHITTINGHAM (1971) hielt PVP für ein wirksames Kryoprotektivum beim Tiefgefrieren von Mäuseembryonen. Er erzielte bei Verwendung von 8-Zell-Embryonen und frühen Blastozysten Entwicklungsraten zum Blastozystenstadium von 69,1%. Bei anderen Autoren galt PVP wegen seiner Toxizität in hohen Konzentrationen in Embryo-Kryoprotektivum-Mischungen als nicht nutzbar (WILMUT 1972; FRIEDLER et al. 1988).
4% PVP bzw. 4% PVA wurden als Ersatz für eine Serumzugabe als chemisch definierte Makromoleküle beim Tiefgefrieren von Rinderembryonen mit 10% Glycerin verwendet. Nach schrittweisem Ausverdünnen mit Sucrose lag die Trächtigkeitsrate nach Zugabe von PVA und PVP mit 31 bzw. 25% deutlich unter denen bei Verwendung von FCS (fetal calf serum) und BSA (bovine serum albumin). Hier wurden Trächtigkeitsraten von 57 bzw. 58% erreicht. Die Handhabung der Embryonen, die mit PVA und PVP tiefgefroren wurden, war schwieriger, da diese leichter an den Pipetten klebten. Dadurch kam es beim Herausfließen der Embryonen aus den Pailletten, besonders bei Verwendung von PVP, zu Verlusten oder Schäden der Embryonen (SEIDEL et al. 1990).
Beim Einsatz von PVA statt Serum neben Ethylenglykol beim kontrollierten Tiefgefrieren und bei der Vitrifikation beobachteten SOMMERFELD u. NIEMANN (1999) ein Absinken der Überlebensraten von in vitro produzierten Rinderembryonen. Bei der Vitrifikation von in vitro produzierten Rinderembryonen wurden neben 40% Ethylenglykol und 11,3% Trehalose PVP in verschiedenen Konzentrationen (0-12%) eingesetzt. Dabei wurden bei Verwendung von 12% PVP die höchsten Entwicklungs- und Schlupfraten erzielt. Von Makromolekülen wie PVP wird angenommen, daß sie ihre Schutzwirkung während der Vitrifikation und dem Auftauen entfalten, obwohl sie die embryonalen Zellen nicht penetrieren können. Vermutlich bedecken sie empfindliche Membranen und verhindern so die Denaturierung durch konzentrierte Salzlösungen, verzögern das Eiswachstum und verringern die Eiskristallbildung, da sie Wasser binden können (SAHA et al. 1996).
KOBAYASHI et al. (1994) setzten PVP bei der Kryokonservierung der extrem kälteempfindlichen Schweineembryonen ein. Bei Verwendung von 7% PVP in Kombination mit 8,0 M Ethylenglykol bei der Vitrifikation überlebten 41, 61 bzw. 23% der Blastozysten, der expandierten bzw. der geschlüpften Blastozysten nach 24 h in vitro-Kultur.
2.3. Tiefgefrierverfahren
Bei den Tiefgefrierverfahren werden kontrollierte Tiefgefrierverfahren, ultraschnelles Tiefgefrieren und die Vitrifikation unterschieden. Beim ultraschnellen Tiefgefrieren und bei der Vitrifikation handelt es sich um eine Nonequilibrium-Kryokonservierung. Der Embryo wird dem Kryoprotektivum nur für kurze Zeit ausgesetzt, so daß nicht genügend Zeit bleibt, ein Equilibrium zwischen intra- und extrazellulärer Lösung zu erreichen. Die Embryonen werden vor der Kühlung dehydriert, indem man sie einer Mischung aus penetrierenden und nicht penetrierenden Kryoprotektiva aussetzt (LEIBO 1989).
Zunächst wurden Glasampullen zum Verpacken der Embryonen verwendet, die später dann durch Plastikpailletten ersetzt wurden. Die Überlebensfähigkeit der Embryonen in Plastikpailletten entsprachen denen in Glasampullen (BIELANSKY et al. 1985). Die Pailletten erwiesen sich aber als geeigneter für Tiefgefrieren, Lagerung und Transfer von Embryonen (MASSIP et al. 1982).
Dulbeccos Phosphat Buffered Saline (DPBS), beschrieben von WHITTINGHAM (1971), wird meist als Basismedium für das Tiefgefrieren verwendet. Es werden häufig 20% Blutserum oder BSA (bovines serum albumin) hinzugefügt (MOORE u. BILTON 1977; WILLADSEN 1980).