Alter des Empfängertiers (Rind oder Kuh)

Gly-3 62 24 38,7

Gly-1 104 88 84,6^A

EG/DT 132 60 45,5^A

EG/OCM 72 28 38,0

EG/1 Suc 5 -

-EG/0,5 Suc 37 9 24,3^B

A,B; = p < 0,05

4.1.6. Alter des Empfängertiers (Rind oder Kuh)

Wie aus Abbildung 13 ersichtlich wurden 863 Embryonen auf Rinder übertragen, 179 auf Kühe.

Bei Rindern wurde mit 50,5% eine signifikant bessere Trächtigkeitsrate erzielt als bei Kühen (35,8 %).

Abb.13: Trächtigkeitsergebnisse in Abhängigkeit vom Empfängertier (Rind oder Kuh)

179

Vergleicht man die Trächtigkeitsraten beim Empfängertier zwischen Glycerin und Ethylenglykol (Tab.33), so findet man beim Rind (53,3 bzw. 46,9%) eine höhere Trächtigkeitsrate als bei der Kuh (40,4 bzw. 31,1%).

Tab.33: Trächtigkeitsergebnisse in Abhängigkeit vom Gefrierschutzmittel und Empfängertier (Rind / Kuh)

Gefrierschutz-mittel

Rind / Kuh Embryonen gesamt n

trächtige Empfänger n

%

Glycerin Rind 486 259 53,3

Kuh 89 36 40,4

EG Rind 377 177 46,9

Kuh 90 28 31,1

Differenziert man beim Ethylenglykol zwischen den verschiedenen Füllungen der Pailletten mit unterschiedlichem Mediumvolumen (Anzahl von Säulen) (Tab.34), so waren die Trächtigkeitsraten bei Rindern höher als bei Kühen. Nur bei einer Füllung der Paillette mit drei Säulen und einem Volumenverhältnis Kulturmedium zu Tiefgefriermedium von 2:1 waren die Trächtigkeitsraten bei Rind und Kuh ähnlich (45,4 bzw. 43,6%).

Tab.34: Trächtigkeitsergebnisse in Abhängigkeit von den verschiedenen Füllungen der Pailletten mit unterschiedlichem Mediumvolumen (Anzahl der Säulen) bei Verwendung

von Ethylenglykol und Empfängertier (Rind / Kuh)

Anzahl der Säulen n

Rind / Kuh Embryonen gesamt

n

trächtige Empfänger n

%

3 Rind 108 49 45,4

Kuh 32 14 43,6

4 Rind 45 21 46,7

Kuh 12 3 25,0

5 Rind 224 107 47,8

Kuh 46 11 23,9

5. Diskussion

Die Kryokonservierung von Rinderembryonen wird in der Praxis im Rahmen des Embryotransfers als ein etabliertes biotechnologisches Verfahren eingesetzt. Der Anteil tiefgefrorener Rinderembryonen an den Transfers betrug 1998 weltweit mehr als 50%

(THIBIER 1999). Dabei wurde im Laufe der Jahre überwiegend Glycerin als Gefrierschutzmittel verwendet. Mit diesem Kryoprotektivum konnten stabile Trächtigkeitsraten von ca. 50% erreicht werden, die denen nach Frischtransfer nahe kommen.

Zunächst wurde das Glycerin schrittweise mit abnehmenden Konzentrationen ausverdünnt.

Eine Stabilisierung der Überlebensraten konnte durch das Hinzufügen von Sucrose zum Ausverdünnungsmedium erreicht werden (NIEMANN 1985; LOONEY et al. 1996).

Von LEIBO (1983) und RENARD et al. (1983) wurde die One-Step-Methode eingeführt. Bei dieser Methode wird der in der Paillette mit Glycerin eingefrorene Embryo nach dem Auftauen mit der bis dahin getrennt gehaltenen Sucrose-Lösung vermischt und anschließend direkt übertragen. Die Ergebnisse des Versuchs führten zu einem verstärkten Einsatz dieser Methode in der Praxis. Sie konnten jedoch nicht immer bestätigt werden, woraufhin sich diese Methode nicht durchsetzen konnte (GÖRLACH 1997b; JANOWITZ 1997).

Glycerin wird mit Erfolg in einem Schritt mit Sucrose unter mikroskopischer Kontrolle ausverdünnt. (HRUSKA 1991; LANDSVERK et al. 1992; ARRESEIGOR et al. 1998).

VOELKEL u. HU (1992a) entwickelten ein Verfahren zum Direktransfer von Embryonen, wobei mit Ethylenglykol als Gefrierschutzmittel eingefroren wurde. Diese Methode wurde von den Embryotransfer-Einrichtungen aufgrund der guten Ergebnisse, der Praktikabilität und geringeren Kosten angenommen. Jedoch kommt es beim Einsatz dieses Verfahrens unter Feldbedingungen zu größeren Variationen bei den Trächtigkeitsergebnissen (GÖRLACH 1997a, POKORNY u. POKORNY 1997).

Bei der vorliegenden Arbeit handelt es sich um eine retrospektive Analyse verschiedener Ausverdünnungsmethoden von Kryoprotektiva bei Rinderembryonen nach dem Tiefgefrieren.

Ziel der Arbeit war es, Variationen des Ausverdünnens von Ethylenglykol nach dem Tiefgefrieren mit den Ergebnissen nach Verwendung von Glycerin zu vergleichen. Neben dem

Direkttransfer wurden Methoden ausgewählt, in denen das Ethylenglykol direkt in Medium oder in einem Schritt mit 0,5 M oder 1 M Sucrose ausverdünnt wurde. Der Einfluß ausgewählter Parameter wie Embryonenqualität, Entwicklungsstadium, Gefriergerät, Empfängerqualität und Alter des Empfängertiers (Rind / Kuh) wurde auch untersucht.

Die Daten von 1066 tiefgefrorenen und übertragenen Embryonen wurden im Rahmen eines kommerziellen Embryotransferprogramms unter Praxisbedingungen gewonnen. Es wurden keine weiteren Embryonen nach einer Methode aufgetaut, wenn sich bereits bei einer kleinen Gruppengröße besonders schlechte Trächtigkeitsraten zeigten (z.B. beim Ausverdünnen des Ethylenglykols mit 1 M Sucrose), da es sich um ein kommerzielles Embryotransfer-Programm handelte. Es gab keine echten Versuchsbedingungen, jedoch stützen sich die Ergebnisse auf ein relativ großes Datenmaterial.

Insgesamt konnte bei den 1066 Transfers unabhängig vom Gefrierschutzmittel eine Trächtigkeitsrate von 48,2% erzielt werden. Diese lag knapp unter den für Morulae und Blastozysten angestrebten 50-60% (NIEMANN u. MEINECKE 1993). Es wurden jedoch im Rahmen des kommerziellen Programms auch Embryonen mäßiger und schlechter Qualität übertragen. Aus dieser Sicht erscheint das Ergebnis zufriedenstellend.

Bei Verwendung von Glycerin wurde das Gefrierschutzmittel nach dem Auftauen entweder in drei Schritten (Gly-3) oder in einem Schritt (Gly-1) mit Sucrose ausverdünnt.

ARRESEIGOR et al. (1998) erzielten beim schrittweisen Ausverdünnen des Glycerins mit je 0,3 M Sucrose eine nahezu gleiche Trächtigkeitsrate (45,9%) wie beim Ausverdünnen in einem Schritt mit 1 M Sucrose (47,2%). Dieser Befund stimmt mit dem der eigenen Untersuchungen überein, denn die Trächtigkeitsraten beim Ausverdünnen des Glycerins in drei Schritten und in einem Schritt waren ähnlich (s. Tab.19).

Beim Ausverdünnen des Glycerins in einem Schritt wurde eine Sucrose-Konzentration von 0,5 M verwendet. DEL CAMPO et al. (1990) verwendeten ebenfalls 0,5 M Sucrose zum Ausverdünnen in einem Schritt. Sie erzielten hierbei nach 24 h in vitro-Kultur (IVC) eine

Überlebensrate von 72% und konnten keinen signifikanten Unterschied zur Verwendung von 1,0 M Sucrose bei dieser Methode feststellen. Hingegen beobachteten MERRY et al. (1983) und HERNANDEZ-LEDEZMA et al. (1988b), daß die Überlebensraten beim Ausverdünnen von Glycerin mit Sucrose in einem Schritt aus Mäuseembryonen bei einer Konzentration kleiner als 1,0 M Sucrose sanken. Sie schlugen eine Sucrose-Konzentration von 1,0 - 1,8 M bzw. 1,0 oder 1,25 M Sucrose vor.

Die Trächtigkeitsrate mit Glycerin, ausverdünnt in drei Schritten (Gly-3), unterschied sich nicht signifikant von der bei Verwendung von Ethylenglykol mit Direkttransfer (EG/DT) (54,7 bzw.

49,6%). Dies stimmt mit den Ergebnissen von LANGE (1995), KLING (1997) und ARRESEIGOR et al. (1998) überein, die ebenfalls keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Methoden feststellten. VOELKEL u. HU (1992b) und LOONEY et al. (1996) erzielten jedoch mit Glycerin, ausverdünnt in drei Schritten, eine signifikant bessere Trächtigkeitsrate als nach dem Direkttransfer von Rinderembryonen mit Ethylenglykol als Kryoprotektivum (62 bzw. 39% und 69,6 bzw. 50,0%).

In den eigenen Untersuchungen war kein Unterschied beim Trächtigkeitsergebnis nach Ausverdünnen mit der Methode Gly-1 und EG/DT (50,4% bzw. 49,6%) festzustellen. Dies entspricht dem Ergebnis von ARRESEIGOR et al. (1998), die beim Ausverdünnen von Glycerin in einem Schritt eine Trächtigkeitsrate von 47,2% und beim EG/DT eine Trächtigkeitsrate von 47,4% erreichten.

Beim Tiefgefrieren von Schafembryonen mit Ethylenglykol erwies sich ein Ausverdünnen mit Sucrose in mehreren Schritten als förderlich (TERVIT u. GOOLD 1984).

McGINNIS et al. (1993) wendeten es ebenfalls bei Schafembryonen an und erzielten auch beim Ausverdünnen in einem Schritt mit 1,0 M Sucrose gute Ergebnisse. Diese Ergebnisse stehen im Widerspruch zu den eigenen Resultaten beim Ausverdünnen des Ethylenglykols mit 0,5 bzw.

1,0 M Sucrose bei Rinderembryonen. Hier sanken die Trächtigkeitsraten bei Verwendung von 0,5 M Sucrose und noch deutlicher bei Verwendung von 1,0 M Sucrose im Vergleich zum Direkttransfer ab. STREICHER (1998) erreichte nach dem Tiefgefrieren von in

vitro-Rinderembryonen mit 1,8 M Ethylenglykol und Ausverdünnen in einem Medium, dem 0,3 M Sucrose zugefügt wurden, eine Schlupfrate von 46,3%. Die Schlupfrate sank auf 37,5%, wenn dem Ethylenglykol bereits vor dem Tiefgefrieren 0,2 M Sucrose zugefügt und mit 0,3 M Sucrose ausverdünnt wurde. Den Grund dafür vermutete er in einem Wirkungsverlust des eigentlichen Kryoprotektivums Ethylenglykol durch die zunehmende Osmolarität.

DOCHI et al. (1995) fügten dem Ethylenglykol vor dem Tiefgefrieren von Rinderembryonen Sucrose hinzu und verglichen die Trächtigkeitsrate nach Direkttransfer (52%) mit der von Embryonen, die nur mit Ethylenglykol tiefgefroren wurden (69%). Das Hinzufügen von Sucrose hatte keinen positiven Effekt. SOMMERFELD (1997) konnte nachweisen, daß ein Ausverdünnen von Ethylenglykol-Konzentrationen bis zu 3,6 M bei in vitro-Embryonen ohne Sucrose in einem Schritt möglich ist. Bei der Vitrifikation von in vitro-Embryonen in einer Lösung mit Ethylenglykol und Sucrose hatte das Ausverdünnen mit Sucrose unter Zusatz von Eigelb einen positiven Einfluß auf die in vitro-Überlebensraten (KUWAYAMA et al. 1994a).

Auch ein Ausverdünnen in der Paillette soll mit diesem Verfahren möglich sein.

Beim Gebrauch von Ethylenglykol wurden drei verschiedene Füllungen der Pailletten verwendet (s. Kap. 3.3.3., Abb.: 6, 7 und 8), um so den Einfluß der unterschiedlichen Volumina an Ethylenglykol-Lösung, die beim Direkttransfer in den Uterus des Empfängers gelangen, und die daraus resultierenden unterschiedlichen Konzentrationen des Ethylenglykols beim Ausverdünnen während des Direkttransfers auf die Trächtigkeitsraten zu untersuchen.

Ein größeres Volumen des Kulturmediums in der Paillette hat ein geringeres Volumen an Ethylenglykol-Lösung zur Folge. Das Kulturmedium soll beim Direkttransfer die Ethylenglykol-Konzentration nach dem Auftauvorgang im Embryo und seiner Umgebung herabsetzen und dafür sorgen, daß eine geringer konzentrierte Ethylenglykol-Lösung in den Uterus des Empfängers gelangt und dort lokale Effekte auf das Endometrium reduziert werden (VOELKEL u. HU 1992a).

Beim Tiefgefrieren der Embryonen mit Ethylenglykol konnte kein signifikanter Einfluß der unterschiedlichen Paillettenfüllungen und Volumina an Kulturmedium und Ethylenglykol-Lösung auf die Trächtigkeitsraten festgestellt werden. Es konnten keine signifikanten Unterschiede bei den Trächtigkeitsergebnissen zwischen den unterschiedlichen Füllungen der

Pailletten in Abhängigkeit von der Embryonenqualität, dem Entwicklungsstadium und dem Alter des Empfängertieres (Rind oder Kuh) gefunden werden. VOELKEL u. HU (1992b) verwendeten beim Tiefgefrieren mit Ethylenglykol und anschließendem Direkttransfer unterschiedliche Füllungen der Pailletten. Im Gegensatz zur vorliegenden Untersuchung wurde bei einer Variante nur Ethylenglykol in der Paillette aufgezogen. Die andere Variante entspricht der Paillettenfüllung mit drei Säulen in der vorliegenden Untersuchung. Bei der Variante mit einer Ethylenglykol-Säule wurden 39% und bei der mit Mediumsäulen in der Paillette 50%

Trächtigkeiten nach Transfer erreicht. Auch bei der Anwendung der One-Step-Methode dokumentierten SCHUBERTH (1984) und PAVEL (1985) einen Einfluß der unterschiedlichen Volumenverhältnisse von Glycerin-Tiefgefriermedium zum Sucrose-Ausverdünnungsmedium (1:9 bzw. 1:2) auf die Trächtigkeitsraten. Bei einem Glycerin / Sucrose-Verhältnis von 1:2 lag die Trächtigkeitsrate bei 52,9%, bei einem Glycerin / Sucrose-Verhältnis von 1:9 bei nur 31,3% (SCHUBERTH 1984). Im Gegensatz dazu erhielt PAVEL (1985) bei gleichen Volumenverhältnissen nahezu gegensätzliche Ergebnisse (1:2 = 31% Trächtigkeitsrate; 1:9 = 47% Trächtigkeitsrate).

Zahlreiche Autoren untersuchten den Einfluß der Embryonenqualität auf die Überlebensfähigkeit von Embryonen. NIEMANN (1983) und GODKIN et al. (1987) stellten für sehr gute Embryonen signifikant bessere Trächtigkeitsraten fest. PRATHER et al. (1987) stellten unabhängig von den verwendeten Kryoprotektiva (Glycerin oder DMSO) und den Ausverdünnungsmethoden ebenfalls eine höhere in vitro-Überlebensrate für Klasse 1- und 2-Embryonen gegenüber Klasse 3-2-Embryonen fest (64,8 bzw. 67,8% gegenüber 29,1%). Bei einem Vergleich von konventionellem Tiefgefrieren mit Vitrifikation wurde über signifikant bessere Überlebensraten beim konventionellem Tiefgefrieren für Embryonen der Klasse 1 als für Embryonen der Klasse 2 und 3 berichtet (DE LEEUW et al. 1991). Diese Ergebnisse stimmen mit denen der eigenen Untersuchungen überein, bei denen für Klasse 1-Embryonen signifikant höhere Trächtigkeitsraten als für Klasse 2-Embryonen erzielt wurden. Bei einem Feldversuch von ARRESEIGOR et al. (1998) wurden 1070 Embryonen mit 1,4 M Glycerin bzw. 1,5 M EG tiefgefroren und in einem oder drei Schritten ausverdünnt bzw. direkt

übertragen. Auch hier wurde ein deutlicher Einfluß der Embryonenqualität auf die Trächtigkeitsrate von tiefgefrorenen Embryonen durch Trächtigkeitsraten von über 50% bei Klasse 1- und 2-Embryonen aber nur 31,2% bei Klasse 3-Embryonen nachgewiesen. Bei in vitro-produzierten Rinderblastozysten wurden durch HAN et al. (1994) unabhängig vom verwendeten Kultursystem nach konventionellem Tiefgefrieren mit 10% Glycerin mit sehr guten und guten Embryonen signifikant bessere in vitro-Überlebensraten als bei mäßigen und schlechten Embryonen erzielt.

Mit den Trächtigkeitsergebnissen in Abhängigkeit von der Embryonenqualität der eigenen Untersuchungen konnten die Aussagen von LINDNER u. WRIGHT (1983) und LEHN-JENSEN (1986), eine morphologische Beurteilung von Embryonen vor dem Tiefgefrieren ermögliche eine Vorhersage der Ergebnisse nach Kryokonservierung und Transfer, bestätigt werden.

Eine in vitro-Kultur nach dem Auftauen (24 bzw. 48 h) stellt eine andere Möglichkeit zur Beurteilung der Lebensfähigkeit der Embryonen dar. Der Übergang von einem Entwicklungsstadium in das nächste, z. B. Weiterentwicklung zur geschlüpften Blastozyste, zeugt von einer guten Vitalität der Embryonen (WHITTINGHAM 1980). Jedoch nehmen die Trächtigkeitsraten nach einer in vitro-Kultur der Embryonen vor dem Transfer ab (HAHN et al. 1978; RENARD et al. 1978).

Färbetechniken mit Fluoreszenzfarbstoffen sind eine weitere Möglichkeit zur Analyse der Embryonenqualität nach dem Auftauen. Hierzu zählen die Färbung mit membranpermeablen 3´6´-Fluorescein-Diacetyl (FDA) und 4´6´-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI), das intakte Zellmembranen nicht passieren kann. Mit dieser Technik ist die Unterscheidung lebender und toter Zellen möglich, und bei sachgerechter Anwendung tritt keine Beeinträchtigung der Entwicklungsfähigkeit der Embryonen auf (NIEMANN et al. 1981b). Mit der von SOMMERFELD (1997) angewandten Färbemethode mit Ethidium homodimer und Calcein nach HAUGLAND u. LARISO (1994) war eine genaue Bestimmung der Gesamtzellzahl sowie von Zellen mit oder ohne Zellmembrandefekte möglich. Die morphologische Klassifizierung der Embryonen kann durch diese Fluoreszenztests erheblich objektiviert werden (NIEMANN et al. 1981b). Die Durchführbarkeit unter Praxisbedingungen erscheint jedoch sehr schwierig.

Ein Ziel der eigenen Untersuchungen war es den Einfluß verschiedener methodischer Parameter auf die Embryonenqualität und damit auf die Überlebensfähigkeit der Embryonen während des Tiefgefrierens zu beurteilen. Dazu wurde auch die Veränderung der Embryonenqualität durch das Tiefgefrieren in Abhängigkeit von der Embryonenqualität vor dem Einfrieren untersucht.

Beim Betrachten der Veränderung während des Tiefgefrierens konnte ein signifikanter Einfluß der Embryonenqualität vor dem Einfrieren aufgezeigt werden. Der Anteil der Embryonen, die nach dem Auftauen eine schlechtere Qualität aufwiesen als vor dem Einfrieren war bei Embryonen der Klasse 2 und 3 signifikant höher als bei Embryonen der Klasse 1. Dies unterstreicht die Aussage von KENNEDY et al. (1983), daß Embryonen sehr guter Qualität das Tiefgefrieren besser überleben als solche mit nur guter bzw. mäßiger Qualität. In ihren Versuchen wiesen mehr Klasse 3-Embryonen (65%) als solche der Klasse 2 und 1 (25 bzw.

9%) nach dem Auftauen eine schlechtere Qualität (Klasse 4) auf. Die Ergebnisse zeigen, daß infolge des Tiefgefrierens bei Klasse 2- und 3-Embryonen kaum Trächtigkeitsraten zu erzielen sind, die mit denen beim Frischtransfer vergleichbar sind.

Nach LEHN-JENSEN (1984), SREENAN u. DISKIN (1987) und MUNAR et al. (1989) lagen die Trächtigkeitsraten nach Transfer von tiefgefrorenen Embryonen um 10% niedriger als die nach Transfer von frischen Embryonen. MUNAR et al. (1989) erzielten nach Transfer von ca.

3000 Embryonen beim Frischtransfer eine Trächtigkeitsrate von 65,8% und beim Transfer von tiefgefrorenen Embryonen eine Trächtigkeitsrate von 55,0%. In neueren Arbeiten konnten nach dem Tiefgefrieren von Rinderembryonen Trächtigkeitsraten von 50-60% erreicht werden, die denen nach Frischtransfer nahekommen (NIEMANN 1995).

Wenn man die Trächtigkeitsraten in Abhängigkeit vom verwendeten Kryoprotektivum und der Embryonenqualität betrachtet (Tab.22), so verschlechterten sie sich bei Verwendung von Glycerin und Ethylenglykol mit Abnahme der Embryonenqualität. Möglicherweise könnten die Trächtigkeitsraten von 33,8 bzw. 37,5% mit nur guten bzw. mäßigen Embryonen nach dem Tiefgefrieren mit Glycerin ein Hinweis dafür sein, daß Glycerin bei diesen Embryonenqualitäten eine bessere Kryoprotektion entfaltet als Ethylenglykol. Das Tiefgefrieren mit 10% Glycerin und anschließendem Ausverdünnen mit 0,5 M Sucrose in einem Schritt scheint für qualitativ

nicht sehr gute Embryonen ein schonendes Verfahren zu sein. Ethylenglykol und die zugehörigen Ausverdünnungsverfahren erwiesen sich dagegen für das Tiefgefrieren von Embryonen der Klasse 2 und 3 als nur bedingt geeignet. Dies widerspricht den Ergebnissen von KLING (1997), der bei seinen Ergebnissen zwischen guten und mäßigen Embryonen unterschied. Während die Trächtigkeitsraten mit guten Embryonen bei Verwendung von Glycerin 62,6% und bei Verwendung von Ethylenglykol 51,0% betrugen, lagen sie mit mäßigen Embryonen bei Verwendung von Ethylenglykol mit 51,2% deutlich höher als bei Verwendung von Glycerin (43,5%).

Die Frage der Überlebensfähigkeit unterschiedlicher Entwicklungsstadien nach Tiefgefrieren und Auftauen wird in der Literatur nicht einheitlich beantwortet. Nach LINDNER u. WRIGHT (1983) hat das Entwicklungsstadium der Embryonen nur einen geringen Einfluß auf die Trächtigkeitsrate.

Andere Untersucher konnten ebenfalls keinen signifikanten Einfluß des Entwicklungsstadiums auf die Trächtigkeitsrate feststellen (NELSON u. NELSON 1988), auch wenn jüngere Stadien (Morulae bzw. beginnende Blastozysten) eine höhere Trächtigkeitsrate als Blastozysten (49,9 bzw. 50,0% gegenüber 44,2%) aufwiesen (FALGE et al. 1990). Bei den eigenen Untersuchungen war kein signifikanter Einfluß des Entwicklungsstadiums auf die Trächtigkeitsraten feststellbar, auch wenn mit Morulae eine etwas höhere Trächtigkeitsrate als mit beginnenden Blastozysten und Blastozysten erzielt wurde (s. Abb.11). Nach KLING (1997) sind Morulae für die Gefrierkonservierung zu bevorzugen, da sowohl bei Verwendung von Glycerin wie auch bei Verwendung von Ethylenglykol mit Morulastadien höhere Trächtigkeitsraten erreicht wurden. MARTINEZ et al. (1999) erzielten beim Tiefgefrieren von Rinderembryonen mit Ethylenglykol und Sucrose ebenfalls höhere Trächtigkeitsraten mit Morulae. Beim Tiefgefrieren von Mäuseembryonen erhielten MASSIP et al. (1984) höhere Überlebensraten bei Morulae als bei beginnenden Blastozysten, Blastozysten und expandierten Blastozysten. Sie vermuteten als Ursache strukturelle Unterschiede zwischen Morulae und Blastozysten. Blastozysten besitzen eine mit Flüssigkeit gefüllte Blastocoelhöhle. Diese mit der Entwicklung von der beginnenden zur expandierten Blastozyste zunehmende

Flüssigkeitsmenge kann einen Einfluß auf die Überlebensrate nach dem Auftauen haben.

Beginnende Blastozysten mit weniger Flüssigkeit überlebten besser als expandierte Blastozysten mit großem Blastocoel. In Morulastadien befindet sich das Wasser intrazellulär.

Diese Eigenschaft kann ein anderes Verhalten beim Tiefgefrieren bedingen. Während WILLADSEN (1980) als Grund für geringere Überlebensraten der expandierten Blastozysten ebenfalls ein großes Blastocoel vermutete, sah NIEMANN (1982; 1983) die Ursache für deutlich niedrigere Trächtigkeitsraten der expandierten Blastozysten in einer erhöhten Empfindlichkeit der peripher gelegenen einschichtigen Trophoblastzellage gegenüber dem schnellen Tiefgefrier- und Auftauprozeß.

Zu einem anderen Ergebnis kam NOHNER (1986), der nach Tiefgefrieren und Transfer von Rinderembryonen mit Blastozysten ein besseres Trächtigkeitsergebnis als mit Morulae erzielte.

HAN et al. (1994) untersuchten die Überlebensraten von in vitro produzierten Rinderembryonen nach Tiefgefrieren mit 10% Glycerin und Ausverdünnen mit Sucrose. Die Überlebensraten von expandierten Blastozysten waren höher als die von beginnenden Blastozysten und Blastozysten. Auch bei einem Vergleich von konventionellem Tiefgefrieren mit der Vitrifikation stiegen die Überlebensraten von in vitro produzierten Rinderembryonen beim konventionellen Tiefgefrieren mit dem Entwicklungsstadium. Mit geschlüpften Embryonen wurde eine höhere Überlebensrate als mit Blastozysten und expandierten Blastozysten erreicht (DINNYES et al. 1995).

In den eigenen Untersuchungen konnte bei den Trächtigkeitsergebnissen in Abhängigkeit vom Entwicklungsstadium und vom Gefrierschutzmittel ein signifikanter Unterschied festgestellt werden. Bei Verwendung von Glycerin wurden mit Morulae höhere Trächtigkeitsraten als bei Verwendung von Ethylenglykol erzielt (s. Tab.25). Die Differenz zwischen den Trächtigkeitsraten bei Verwendung der beiden Kryoprotektiva ist vergleichbar mit der in der Arbeit von KLING (1997), auch wenn hier die Trächtigkeitsraten für Morulae höher liegen.

Bei Verwendung von Glycerin wurde in diesem Entwicklungsstadium eine Trächtigkeitsrate von 75,8% und bei Verwendung von Ethylenglykol eine Trächtigkeitsrate von 63,3% erzielt.

LE GAL et al. (1993) verglichen die Überlebensraten von Blastozysten und Morulae bei Ziegen mit Ethylenglykol und Glycerin als Kryoprotektiva. Bei Morulae wurde die in

vitro-Entwicklungsrate durch das Ausverdünnen des Ethylenglykols mit Sucrose gesenkt. Die in vitro-Entwicklungsrate betrug 14% mit Sucrose und 41% ohne Sucrose. Bei Blastozysten hingegen hatte das Ausverdünnen des Ethylenglykols mit Sucrose keinen Einfluß auf die in vitro-Entwicklungsrate. Sie betrug mit Sucrose 64% und ohne Sucrose 67%. Bei Verwendung von Morulae und dem Ausverdünnen des Ethylenglykols mit 0,5 M Sucrose war die Trächtigkeitsrate bei den eigenen Untersuchungen signifikant niedriger als beim Direkttransfer nach Verwendung von Ethylenglykol. Dieser Einfluß war bei den beginnenden Blastozysten nicht nachweisbar.

Neben den zuvor genannten Einflußfaktoren wurde auch der Einfluß der verwendeten Gefriergeräte untersucht. Sowohl das Gerät der Firma „Haake“ auf Alkoholbasis wie auch

„Cryocell 1200“ der Firma „Sylab“ auf Stickstoffbasis werden regelmäßig zur Funktionsüberprüfung an die Hersteller eingeschickt.

WARE u. BOLAND (1987) fanden beim Vergleich eines Gerätes auf Stickstoffbasis mit einem Alkoholgerät beim Tiefgefrieren von Schafembryonen und anschließender in vitro-Kultur keine Unterschiede zwischen den Überlebensraten. Auch NIEMANN (1991a) berichtete von fast gleich hohen Trächtigkeitsraten nach Tiefgefrieren von Rinderembryonen mit transportablen Gerät auf Stickstoffbasis (59,4%) und einem Alkoholgerät (60,0%). Auch in den eigenen Auswertungen konnte kein signifikanter Unterschied bezüglich der Ergebnisse zwischen den beiden Geräten festgestellt werden. Die Trächtigkeitsraten bei der Verwendung des Gerätes auf Stickstoffbasis lagen mit 48,6% etwas höher als die bei Verwendung des Alkoholgerätes (42,5%). Die etwas niedrigeren Trächtigkeitsraten beim Alkoholgerät können durch veränderte Gefrierraten bedingt sein. Die Gefrierraten können durch Bildung von Kondenswasser und durch einen nicht exakten Alkoholspiegel beeinflußt werden. Der Alkoholspiegel muß immer wieder überprüft werden, da der Alkohol mit der Zeit verdampft (NIEMANN 1991a).

Der Vergleich der Anteile an Embryonen, deren Qualität sich während des Tiefgefrierens im Alkoholgerät oder im Gerät auf Stickstoffbasis verschlechterte, ergab hingegen einen signifikanten Unterschied (s. Tab.29). Die Anzahl der Embryonen, deren Qualität während der

Kryokonservierung abnahm, war im Gerät auf Stickstoffbasis signifikant niedriger als im Alkoholgerät. Dies hatte jedoch keinen Einfluß auf die Trächtigkeitsraten.

Betrachtet man die Ergebnisse bezüglich der Korrelation von Kryoprotektivum und Gefriergerät, so ergaben sich für Glycerin-Embryonen im Gerät auf Stickstoffbasis signifikant bessere Ergebnisse als für Ethylenglykol-Embryonen (s. Tab.30). Ergebnisberichte zu dem in

Betrachtet man die Ergebnisse bezüglich der Korrelation von Kryoprotektivum und Gefriergerät, so ergaben sich für Glycerin-Embryonen im Gerät auf Stickstoffbasis signifikant bessere Ergebnisse als für Ethylenglykol-Embryonen (s. Tab.30). Ergebnisberichte zu dem in

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