Expression der Ca2+-Kanäle ECaC1 und ECaC2 im Dünndarm von Saug- und Absetzferkeln

Expression der Ca

-Kanäle ECaC1 und ECaC2 im Dünndarm von Saug- und Absetzferkeln

INAUGURAL-DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades eines

Doktors der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Thomas Hinterding

aus Krefeld

Hannover 2002

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. B. Schröder

1. Gutachter: Prof. Dr. B. Schröder 2. Gutachter: Prof. Dr. U. Ebert

Tag der mündlichen Prüfung: 22. November 2002

Gefördert durch die H. WILHELM SCHAUMANN STIFTUNG

Für meine Eltern

Karl & Maria

Hinterding

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 1

2 Literaturübersicht 2

2.1 Biologische Bedeutung von Calcium im Säugetierorganismus 2

2.2 Regulation der zellulären Ca²⁺-Homöostase 2

2.3 Regulation der systemischen Ca²⁺-Homöostase 3

2.4 Alimentäre Ca²⁺-Aufnahme 5

2.5 Mechanismen des intestinalen Ca²⁺-Transports 6

2.5.1 Parazellulärer Ca²⁺-Transport 6

2.5.2 Transzellulärer Ca²⁺-Transport 7

2.6 Neonatale Entwicklung des Gastrointestinaltrakts 12

2.7 Besonderheiten des transzellulären Ca²⁺-Transports bei Saugferkeln 14

3 Material und Methoden 15

3.1 Versuchstiere 15

3.2 Probenentnahmen 16

3.2.1 Probenentnahme für die Präparation von Bürstensaummembranvesikeln 16

3.3 Präparation der Bürstensaummembranvesikel 17

3.3.1 Prinzip 17

3.3.2 Durchführung 17

3.3.3 Präparationspuffer 19

3.4 Messung der Aufnahmeraten in die Bürstensaummembranvesikel 21

3.4.1 Puffer für die Aufnahmestudien 21

3.4.2 Kalkulation von [Ca²⁺]f 22

3.4.3 Studien zur zeitabhängigen Glucose-Aufnahme 23 3.4.4 Studien zur zeitabhängigen Calcium-Aufnahme 23 3.4.5 Studien zur konzentrationsabhängigen Calcium-Aufnahme 25 3.4.6 Kalkulation der kinetischen Kenngrößen der Ca²⁺-Aufnahme 26

3.4.7 Ermittlung des Vesikelvolumens 27

3.5 Protein- und Enzym-Bestimmungen im Mukosahomogenat

und in der Vesikelsuspension 28

3.5.1 Protein 28

3.5.1.1 Prinzip 28

3.5.1.2 Durchführung 28

3.5.2 Aktivität der alkalische Phosphatase (AP) 29

3.5.2.1 Prinzip 29

3.5.2.2 Durchführung 29

3.5.3 Aktivität der Na⁺/K⁺-ATPase 29

3.5.3.1 Prinzip 29

3.5.3.2 Durchführung 30

3.6 Gesamt-RNA-Isolierung und DNase-Verdau 30

3.6.1 Prinzip 31

3.6.2 Durchführung 31

3.7 cDNA-Synthese 32

3.7.1 Prinzip 32

3.7.2 Durchführung 32

3.8 Polymerasekettenreaktion (PCR) 33

3.8.1 Prinzip 33

3.8.2 Durchführung 35

3.9 Darstellung der DNA auf einem Agarosegel 36

3.9.1 Prinzip 36

3.9.2 Durchführung 36

3.10 Isolierung der PCR-Produkte 37

3.10.1 Prinzip 37

3.10.2 Durchführung 37

3.11 Ligation der PCR-Produkte 38

3.11.1 Prinzip 38

3.11.2 Durchführung 38

3.12 Transformation der Bakterien 39

3.12.1 Prinzip 39

3.12.2 Durchführung 39

3.13 Plasmidpräparation 40

3.13.1 Prinzip 40

3.13.2 Durchführung 40

3.14 Restriktionsverdau 41

3.14.1 Prinzip 41

3.14.2 Durchführung 41

3.15 Sequenzierung 41

3.16 mRNA-Isolierung 42

3.16.1 Prinzip 42

3.16.2 Durchführung 42

3.17 Northern-Blot 43

3.17.1 Prinzip 43

3.17.2 Größenfraktionierung der RNA in einem denaturierenden Agarosegel 43 3.17.3 Übertragen der RNA auf eine Nitrocellulosemembran 44 3.17.4 Erstellung von spezifischen, radioaktiv markierten Sonden 46 3.17.5 Hybridisierung der RNA mit den radioaktiv markierten Sonden 47

3.17.6 Darstellung der RNA 48

3.17.7 Auswertung der Northern-Blots 48

3.18 Real-Time-PCR 49

3.18.1 Prinzip 49

3.18.2 Durchführung 50

3.18.3 Auswertung der Real-Time-PCR 52

3.19 Chemikalien 53

3.20 Statistik 54

4 Ergebnisse 55

4.1 Effekte des Alters der Versuchstiere auf die Ca²⁺-Aufnahme

in BSMV 55

4.1.1 Charakterisierung der BSMV 55

4.1.2 Ca²⁺-Aufnahmeraten in die BSMV 60

4.2 Ergebnisse der PCR 65

4.3 Teilsequenz des ECaC im konservierten Bereich 66

4.4 Teilsequenz des ECaC1 im hypervariablen Bereich 67

4.5 Teilsequenz des ECaC2 im hypervariablen Bereich 69

4.6 Northern-Blots mit verschiedenen Sonden entlang der Darmachse 72

4.6.1 Northern-Blot mit der „ECaC-Sonde“ 72

4.6.2 Northern-Blot mit der „ECaC1-Sonde“ 73

4.7 Ergebnisse der Real-Time-PCR bei Saug- und Absetzferkeln 74

5 Diskussion 79

5.1 Untersuchungen zur Funktion der Ca²⁺-Kanäle 79 5.2 Untersuchungen zur Struktur der Ca²⁺-Kanäle 84 5.3 Untersuchungen zur Quantifizierung der Ca²⁺-Kanäle 85 5.4 Schlussbetrachtung und Ausblick 86

6 Zusammenfassung 88

7 Summary 90

8 Literaturverzeichnis 92

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

ATP Adenosintriphosphat as antisense

ave average bp Basenpaare

BSMV Bürstensaummembranvesikel Ca²⁺ Calcium in ionisierter Form [Ca²⁺]ges Gesamt- Ca²⁺-Konzentration [Ca²⁺]f Konzentration freier Ca²⁺-Ionen

cDNA komplementäre DNA (complementary DNA) cpm Impulse pro Minute (counts per minute)

Ct-Wert der Ct-Wert gibt an, wie viele Zyklen in der PCR für den jeweiligen Ansatz gebraucht werden, bis das Fluoreszenzsignal einen definierten Schwellenwert überschritten hat (cycle; threshold)

dCTP 2`Desoxycytidin-5`triphosphat DMSO Dimethylsulphoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure (desoxyribonucleic acid) dNTP 2`Desoxyribonucleosid-5`triphosphat

DTT Dithiothreitol

EDTA Ethylen-Diamin-tetra-Essigsäure (-Acetic-Acid)

EGTA Ethylen-Glykol-bis (β-Aminoethylether)^-N,N´^-tetra-Essigsäure (-Acetic-Acid) g Zentrifugalbeschleunigung

GM Größenmarker

HEPES 4-(2-Hydroxy-Ethyl)-1-Piperazin-Ethan-Sulfonsäure Kap. Kapitel

Km Michaelis-Menten-Konstante; gibt die Menge an Substrat an, die für die halbmaximale Transportrate notwendig ist

LB-Medium Luria-Bertani-Medium

MOPS 3-(N-Morpholino)Propansulfonsäure µCi mikro Curie (1 Ci = 37 x 10⁹ Bq) mRNA Boten-RNA (messenger-RNA) p Irrtumswahrscheinlichkeit

PCR Polymerase Kettenreaktion (polymerase chain reaction) PMCA Plasmamembran-Calciumpumpe

PTH Parathormon

RNA Ribonukleinsäure (ribonucleic acid)

rpm Umdrehungen pro min (rounds per minute) RT Raumtemperatur

RT-PCR Reverse Transcriptase-PCR

s sense

SEM Standardfehler des Mittelwertes (standard error of the mean) SDS Sodiumdodecylsulfat

spez. A. spezifische Aktivität

Tris Tris (Hydroxymethyl) Aminomethan VDR Vitamin D-Rezeptor

Vmax maximale Transportkapazität

v/v Volumen zu Volumen w/v Gewicht zu Volumen

1 EINLEITUNG

Beim Schwein ist das Duodenum wichtigster Ort der aktiven Ca²⁺-Absorption, der damit wesentlich an der Aufrechterhaltung der Calcium-Homöostase beteiligt ist. Dieser Prozess ist zunächst in der frühen postnatalen Lebensphase bis etwa zur 4. Lebenswoche unabhängig von Calcitriol, dem klassischen Vitamin D-Hormon, kommt aber anschließend mehr und mehr unter Kontrolle dieses Hormons. Über den physiologischen Sinn dieser postnatalen Anpassung kann bislang nur diskutiert werden.

Für viele Spezies wurde gezeigt, dass Ca²⁺ durch einen aus mindestens drei Einzelschritten bestehenden Mechanismus vom Darmlumen durch die Enterozyten zur Blutseite transportiert wird. Im ersten Teilschritt, der für den transzellulären Ca²⁺-Transport wahrscheinlich geschwindigkeitsbestimmend ist, tritt Ca²⁺ entlang eines chemischen Gradienten über die Bürstensaummembran durch Ca²⁺-Kanäle in die Zelle ein. Im zweiten Teilschritt wird Ca²⁺

auf bisher nicht genau geklärte Weise unter Beteiligung von Calbindin-D9k durch das Cytosol transportiert. Die Ausschleusung aus der Zelle durch die basolaterale Membran wird durch die ATP-abhängige Plasmamembran-Calciumpumpe vermittelt und stellt den dritten Teilschritt dar.

Beim Menschen und bei der Ratte konnten vor kurzem jeweils zwei verschiedene Ca²⁺- Kanäle kloniert werden, die eine 75%ige Aminosäurenidentität zueinander aufwiesen. Es gibt Hinweise darauf, dass ECaC1 und ECaC2 im Dünndarm möglicherweise in unterschiedlichem Maße durch Calcitriol reguliert werden können.

Der intestinale Ca²⁺-Transport beim Schwein ist bislang noch nicht mit molekularbiologischen Methoden untersucht worden. Die Erkenntnisse solcher Untersuchungen zum Ca²⁺-Transport berechtigen jedoch zu der Annahme, dass auch beim Schwein Ca²⁺-Kanäle an der duodenalen Ca²⁺-Absorption beteiligt sind. Daher war es das primäre Ziel der vorliegenden Untersuchungen, dieser Hypothese nachzugehen. Dazu sollten zunächst die für Human- und Rattenproben beschriebenen molekularbiologischen Methoden zur Darstellung von Ca²⁺-Kanälen auf mRNA-Ebene für den Schweinedarm adaptiert werden.

Anschließend sollte der Frage nachgegangen werden, ob eine veränderte Expression von ECaC1 und/oder ECaC2 mit dem Wechsel vom calcitriol-unabhängigen zum calcitriol-

2 LITERATURÜBERSICHT

2.1 Biologische Bedeutung von Calcium im Säugetierorganismus

Das Erdalkalielement Calcium ist aufgrund seiner multiplen Aufgaben eines der wichtigsten kationischen Mengenelemente im Säugetierorganismus. Als essenzielles Strukturelement für die Knochen und Zähne ist es genauso von Bedeutung, wie als Second messenger innerhalb von Zellen. In der Funktion als Second messenger beeinflusst Calcium in ionisierter Form (Ca²⁺) zum Beispiel die präsynaptische Ausschüttung von Neurotransmittern, die molekularen Mechanismen der Muskelkontraktion (VAN BREEMEN u. SAIDA 1989), sowie die Sekretionstätigkeit bestimmter exo- und endokriner Drüsen (MUALLEM 1989). Eine weitere wichtige Rolle spielt Ca²⁺ in der Blutgerinnung als Aktivator der Thrombokinase (MORIN 1980) und auch beim epithelialen Transport von z. B. Natrium, Kalium und Chlorid wirkt Ca²⁺ regulatorisch mit (DONOWITZ u. WELSH 1986).

2.2 Regulation der zellulären Ca

-Homöostase

Die Konzentration an freien Ca²⁺-Ionen [Ca²⁺]f im Cytosol der ruhenden Zelle liegt bei vielen Zelltypen in etwa bei 10^-7 bis 10^-8 mol^.l^-1 und steigt im stimulierten Zustand um bis zu 2 Zehnerpotenzen an (CAMPBELL 1988), was als funktionelles Signal interpretiert werden kann (NEMERE und NORMAN 1991). Zur Aufrechterhaltung der Second messenger- Funktion muss [Ca²⁺]f wieder auf die Ausgangskonzentration zurückgeführt werden. Dies geschieht durch primär aktiven Transport mit Hilfe der Adenosintriphosphat (ATP)- abhängigen Ca²⁺-Pumpen oder durch erleichterte Diffusion mittels des 3Na⁺/Ca²⁺- Austauschers. Dabei kann Ca²⁺ entweder in Zellorganellen, wie die Mitochondrien und das endoplasmatische Retikulum oder in den Extrazelluärraum transportiert werden (CARAFOLI 1987). Zur Regulation des [Ca²⁺]f kann dieses an Ca²⁺-bindende Proteine gebunden werden.

Ein ubiquitär vorkommendes Protein mit hoher Ca²⁺-Affinität ist das Calmodulin, das z. B. in

glatten Muskelzellen oder in den Mikrovilli von Enterozyten gefunden wird (GRAND et al.

1979, GLENNEY u. WEBER 1980). Enterozyten sind täglich mit relativ großen Mengen an Ca²⁺ konfrontiert, das das Cytosol passieren muss, ohne dass die Second messenger-Funktion eingeschränkt werden darf. Um dies zu gewährleisten, stehen der Darmschleimhautzelle spezifische Ca²⁺-bindende Proteine zur Verfügung, die auf Grund ihrer Abhängigkeit vom Vitamin D-Hormon Calbindin-D genannt werden (TAYLOR u. WASSERMAN 1967, CORRADINO u. WASSERMAN 1968, WAREMBOURG et al. 1986). Dabei induziert Calcitriol nach Bindung an den kernständigen Vitamin D-Rezeptor (VDR) die Bildung von Calbindin-D, wobei sich auf Grund des Molekulargewichtes 2 Typen unterscheiden lassen, nämlich Calbindin-D9k und –D28k (NORMAN et al. 1999). Im Vogelintestinum wurde das Calbindin-D28k nachgewiesen, das je Molekül 4 Moleküle Ca²⁺ binden kann (WASSERMAN u. TAYLOR 1966). Das Calbindin-D9k, das nur 2 Moleküle Ca²⁺ binden kann, wurde dagegen im Säugetierintestinum gefunden (JOHNSON u. KUMAR 1994). Man nimmt an, dass durch die Bindung an das Calbindin die Second messenger-Funktion des Ca²⁺ trotz des gleichzeitigen Ca²⁺-Transports weitestgehend unbeeinflusst bleibt (FEHER et al. 1992, SCHRÖDER et al. 1996).

2.3 Regulation der systemischen Ca

-Homöostase

Die Ca²⁺-Konzentrationen im Blutplasma bei Schweinen variieren unter physiologischen Bedingungen in Abhängigkeit vom Alter, von der Rasse und vom Geschlecht, wobei bei weiblichen Tieren der Reproduktionszustand mit entscheidend ist. Auch individuelle Schwankungen und Beeinflussungen durch den Ca²⁺-Gehalt des Futters sind beschrieben worden (SCHRÖDER 1996). So liegt der Plasmacalciumspiegel beim adulten Schwein bei 2,3 bis 2,8 mmol^.l^-1 und beim Ferkel während der Saugperiode zwischen 2,7 und 3,1 mmol^.l^-1 (KOLB 1989). Calcium wird im Blutplasma zu etwa 40 % in Komplexverbindungen oder an Proteine (z. B. Albumine, Globuline) gebunden. Für die Ca²⁺-Homöostase im Organismus ist nur das ionisiert vorliegende Calcium (etwa 60 %) von Relevanz (BROWN 1991).

Für die hormonelle Regulation des Plasmacalciumspiegels sind das Parathormon (PTH), Calcitonin und Calcitriol, der biologisch aktive Metabolit des Vitamins D3, von

Knochen, der Darm, die Nieren und die Nebenschilddrüsen (AUDRAN u. KUMAR 1985, NORMAN 1987, DELUCA 1986, BROWN 1991). Abbildung 1 beschreibt in einer Übersicht die Beeinflussungen und Anpassungsmechanismen zur Regulation der Ca²⁺-Homöostase.

PTH ist ein Peptidhormon, das bei niedrigen Plasmacalciumspiegel aus der Nebenschilddrüse ausgeschüttet wird, und eine erhöhte renal-tubuläre Absorption von Ca²⁺ (BINDELS et al.

1991), eine erhöhte Mobilisation von Ca²⁺ aus dem Knochen und eine verstärkte Biosynthese von Calcitriol in den proximalen Tubulusepithelzellen der Niere bewirkt (KOVARIK 1983).

Calcitonin, ein Peptidhormon, wird bei einem erhöhten Plasmacalciumspiegel überwiegend aus den C-Zellen der Nebenschilddrüse freigesetzt. Calcitonin vermindert die Mobilisation von Ca²⁺ aus dem Knochen (PECHET et al. 1967) und die renale Absorption (ZUO et al.

1997) und wirkt somit der PTH-Wirkung entgegen. Ein Einfluss von Calcitonin auf die intestinale Ca²⁺-Absorption konnte bis jetzt nicht nachgewiesen werden.

Vitamin D ist ein Steroidhormon und wird entweder als Ergocalciferol (Vitamin D2) aus der pflanzlichen Nahrung, als Cholecalciferol (Vitamin D3) aus tierischer Nahrung aufgenommen oder im Körper selbst unter Einfluss von ultraviolettem Licht in der Haut aus Provitamin D3

synthetisiert. Vitamin D2 und D3 bzw. deren Metaboliten wirken im Säugetierorganismus über den gleichen Mechanismus (NORMAN u. ROSS 1979). Vom Vitamin D3 sind mehr als 37 Metaboliten unter physiologischen Bedingungen bekannt (HENRY u. NORMAN 1984, 1991), wobei die biologisch aktivste Form für den intestinalen Ca²⁺-Transport das Calcitriol ist (FAVUS 1985, NEMERE u. NORMAN 1990). Calcitriol (1α,25-Dihydroxyvitamin D3

oder 1α,25-Dihydroxychole-calciferol) entsteht aus Vitamin D3, das in der Leber am C25- Atom und in der Niere am C1-Atom hydroxyliert wird. Calcitriol stimuliert die aktive Absorption von Ca²⁺ aus dem Darm und fördert in Anwesenheit von PTH sowohl die Absorption von Ca²⁺ in der Niere, als auch die Auflösung von Hydroxylapatit aus der Knochenmatrix (HARMEYER u. KAUNE 1988).

Es sind weitere Substanzen, die die Ca²⁺-Homöostase beeinflussen, beschrieben worden, doch sind deren Bedeutung sowie deren Wirkmechanismen bislang unklar. Zu diesen Substanzen gehören das PTHrP (parathyroid hormone-related protein) (BLIND et al. 1993), das Prolaktin (PAHUJA und DELUCA 1981) und das Stanniocalcin (MADSEN et al. 1998).

Abbildung 1: Mechanismen zur Regulation der systemischen Ca²⁺-Homöostase ( Hochregulation, Herunterregulation)

Hypercalcämie Hypocalcämie

Nebenschilddrüse

PTH

Nebenschilddrüse

PTH Calcitonin

Niere Calci-

triol CaRenale²⁺- Exkre- tion

Niere Renale Calci- Ca²⁺- triol Exkre-

tion

Knochen

Ca²⁺-Mobilisation

Knochen

Ca²⁺-Mobilisation

Ca

Normocalcämie

Darm

Ca²⁺-Absorption

Darm

Ca²⁺-Absorption

2.4 Alimentäre Ca

-Aufnahme

Calcium wird dem Organismus überwiegend über die Aufnahme fester Nahrung zugeführt, da der Gehalt an Ca²⁺ im Wasser meist weit unter 40 mg^.l^-1 liegt. Der tägliche Ca²⁺-Bedarf eines Saugferkels liegt bei 0,8-1,1 g pro kg Körpermasse (KIRCHGESSNER 1997) und kann über die Sauenmilch gedeckt werden, die etwa 2,3 g Calcium pro Liter enthält (MEYER u.

KAMPHUES 1990). Der Ca²⁺-Bedarf eines adulten Schweines wird in der Regel vollständig über die handelsübliche Fütterung gedeckt, wenn in dem Futtermittel 0,55 bis 0,80 % Ca²⁺

enthalten sind (BEESON et al. 1953). Das entspricht einer täglichen Gabe von 11 bis 15 g für ein 35 bis 100 kg schweres Schwein (OLTJEN et al. 1979).

Die Ca²⁺-Absorption im Magen des Schweines ist vernachlässigbar. Die Nettoabsorption findet fast vollständig (über 90 %) im Dünndarm statt, wobei dem proximalen Teil die größte Bedeutung zukommt (PARTRIDGE 1978). Die Befunde bezüglich der Ca²⁺-Absorption im Dickdarm sind sehr widersprüchlich und reichen von einer täglichen Ca²⁺-Nettosekretion von 1,9 g bis zu einer gleichhohen Nettoabsorption (SAUER et al. 1982, LARSEN u.

SANDSTRÖM 1993). Die Ca²⁺-Aufnahme über den gesamten Darm variiert je nach Autor von 3,0 bis 5,3 g pro Tag bei einer Aufnahme von 9,2 bis 15,1 g (HENNING et al. 1988, LARSEN u. SANDSTRÖM 1993). Dies führt zu einer scheinbaren Verdaulichkeit des Calciums von etwa 34 %.

2.5 Mechanismen des intestinalen Ca

-Transports

Der intestinale Ca²⁺-Transport kann prinzipiell parazellulär und/oder transzellulär verlaufen.

Die quantitativen Anteile dieser Transportwege an der Ca²⁺-Nettoabsorption sind unter In- vivo-Bedingungen nicht geklärt.

2.5.1 Parazellulärer Ca

-Transport

Der parazelluläre Transport verläuft passiv und ist nicht sättigbar. Er nimmt mit der luminalen Ca²⁺-Konzentration linear zu und ist außerdem abhängig vom elektrischen Gradienten zwischen der luminalen und basolateralen Seite des Epithels (PANSU et al. 1983a). Diese Transportform kann über den gesamten Darmtrakt nachgewiesen werden (PANSU et al.

1981), findet sich aber vor allem im distalen Dünndarm (NELLANS 1990, BRONNER 1992).

Sie kann aber auch im proximalen Dünndarm in gleichem Ausmaß auftreten, wenn entsprechend hohe Ca²⁺-Konzentrationen vorliegen (PANSU et al. 1983b). Eine besondere Bedeutung hat der parazelluläre Transport anscheinend bei jungen Ratten. Bei In-situ- Untersuchungen mit ligierten Darmschlingen wurde festgestellt, dass neugeborene Ratten bis zum 3. Lebenstag fast ausschließlich auf parazellulärem Wege transportieren. Während der Zeit bis zum 35. Lebenstag verliert der passive Transport an Bedeutung und stagniert auf niedrigem Niveau (PANSU 1983a, b).

2.5.2 Transzellulärer Ca

-Transport

Der transzelluläre Transport ist sättigbar und stellt einen aktiven Vorgang dar. Er erfolgt im proximalen Dünndarm, vor allem in Duodenum (PANSU et al. 1981, FAVUS 1985) und ist auch beim Saugferkel nachzuweisen (SCHRÖDER et al. 1993). Dabei wird Ca²⁺ durch einen aus mindestens drei Einzelschritten bestehenden Mechanismus vom Darmlumen durch die Enterozyten zur Blutseite transportiert (Abbildung 2). In dem ersten Teilschritt tritt Ca²⁺

durch die Bürstensaummembran in die Zelle ein, im zweiten Teilschritt wird Ca²⁺ durch das Cytosol transportiert. Die Ausschleusung aus der Zelle durch die basolaterale Membran stellt den dritten Teilschritt dar (KAUNE et al. 1992, SCHRÖDER et al. 1998a, VAN OS 1987, TIMMERMANS et al. 1991).

ECaC1 ?

ECaC2

Lumen Enterozyt Blut

PMCA

Ca²⁺

Ca²⁺

Calcitriol

VDR

?

?

Ca²⁺

CAL

+

+

-

Abbildung 2: Modell der aktiven Ca²⁺-Absorption im Dünndarm (CAL = Calbindin-D9k, PMCA = Plasmamembran-Calciumpumpe, VDR = Vitamin D-Rezeptor).

Der Eintritt von Ca²⁺ in die Zelle erfolgt sowohl entlang eines chemischen Gradienten mit einer Ca²⁺-Konzentration im Darmlumen im millimolaren Bereich (FULLMER 1992) und einer Ca²⁺-Konzentration im Zellinneren, die um den Faktor 1000 bis 10000 niedriger ist (Kap. 2.2), als auch entlang eines elektrischen Gradienten mit einer intra/extrazellulären Potentialdifferenz von etwa 50 mV (FULLMER 1992). Aufgrund des elektrochemischen Gradienten erfordert dieser Schritt keine Energie, doch kann Ca²⁺ aufgrund der Ladung nicht in ausreichendem Maße ohne spezifische Transportsysteme wie z. B. Kanäle, durch die Lipiddoppelschicht gelangen. Es gibt sichere Hinweise darauf, dass dieser Schritt für die Ca²⁺-Aufnahme geschwindigkeitslimitierend ist (HOENDEROP et al. 1999b, 2000c).

Untersuchungen von KAUNE et al. (1992) haben gezeigt, dass sich die Ca²⁺-Aufnahmen in Bürstensaummembranvesikel durch Verapamil, einem Antagonisten der spannungsgesteuerten Ca²⁺-Kanäle vom L-Typ, die aus erregbaren Zellen bekannt sind, hemmen ließen. Bei Ratten wurde der Effekt des Verapamils ebenfalls beschrieben (MILLER u. BRONNER 1981), doch muss aufgrund der hohen eingesetzten Konzentration des Kanalblockers auch ein unspezifischer Effekt auf das Epithel diskutiert werden. Beim Kaninchen konnte ein Ca²⁺-Kanal (ECaC), der Verapamil-insensitiv ist, kloniert werden.

Dieser Kanal wurde im proximalen Dünndarm, in der Plazenta und in den distalen Abschnitten des Nephrons nachgewiesen (HOENDEROP et al. 1999a, b). Bei der Ratte wurde ein Ca²⁺-Transportprotein (CaT1) mit einer 75%igen Homologie zum ECaC aus dem Dünndarm kloniert. Eine Northern-Blot Analyse zeigte seine Präsenz auf mRNA-Ebene im Duodenum, proximalen Jejunum, Caecum und Colon (PENG et al. 1999).

Da bei der Ratte das Homologon zum ECaC (bezeichnet als ECaC1, ISHIBASHI et al. 2000 bzw. CaT2, PENG et al. 2000b), bei der Maus das Homologon zum CaT1 (bezeichnet als CaT) (SUZUKI et al. 2000) und beim Menschen sowohl das Homologon zum ECaC (MÜLLER et al. 2000b), als auch zum CaT1 (PENG et al. 2000a) kloniert wurden und beide Proteine als Ca²⁺-selektive Ionenkanäle funktionieren (HOENDEROP et al 2001), werden im folgenden die homologen Transportproteine zum ECaC als ECaC1 und die homologen Transportproteine zum CaT1 als ECaC2 bezeichnet. Diese Transportproteine, ECaC1 und ECaC2, werden den „TRP cation channels“ (transient receptor potential cation channels) zugeordnet und sind Bestandteil der Unterfamilie TRPV. Der ECaC1 wird auch als TRPV5 und der ECaC2 als TRPV6 bezeichnet (MONTELL et al. 2002).

Der ECaC1 hat bei den verschiedenen Spezies eine primäre Aminosäurensequenz von 724 (Ratte) bis 730 (Mensch und Kaninchen) Aminosäuren bei einer mRNA-Größe von 2190 (Mensch) bis 4860 (Ratte) Basenpaaren (HOENDEROP et al. 1999a, MÜLLER et al. 2000b, ISHIBASHI et al. 2000). Der ECaC2 hat bei den verschiedenen Spezies eine primäre Aminosäurensequenz von 726 (Mensch) bis 730 (Maus) Aminosäuren bei einer mRNA- Größe von 2850 (Maus) bis 2955 (Ratte) Basenpaaren (PENG et al. 1999, 2000b, SUZUKI et al. 2000). Beide Transporter haben 6 transmembranale Domänen und eine Porenregion zwischen den Membrandurchgängen 5 und 6 (Abbildung 3). In diesen Bereichen besteht die höchste Homologie zwischen den verschiedenen ECaC. Sie unterscheiden sich aber in den für die Regulation wichtigen Bereichen mutmaßlicher Glycosylierungsstellen und in den

„Ankyrin-Repeats“, die für die Verankerung am Cytoskelett in der apikalen Membran wichtig sind. In besonderem Maße lassen sich Unterschiede im Bereich des N- und C-terminalen Ende finden (HOENDEROP et al. 1999a, 2000a, b, PENG et al. 1999).

Lumen

Zytosol

1 2 3 4 5 6 P

C N

A A

A

Abbildung 3: Modell des ECaC (Epithelial Calcium Channel) in der Zellmembran (1-6 = transmembranale Domänen, A = Ankyrin-Repeats, C = C-terminales Ende, N = N-terminales Ende, P = Porenregion; MÜLLER et al. 2000b, modifiziert).

Die Km-Werte als Maß für die Spezifität des Ca²⁺-Transports durch ECaC unterscheiden sich deutlich sowohl bei den verschiedenen Transportproteinen als auch zwischen den Spezies.

Die bekannten Km-Werte für die einzelnen Transportproteine, die bisher alle über die Ca²⁺- Aufnahmen in ECaC-exprimierende Oozyten von Xenopus laevis bestimmt wurden, variieren

beim ECaC1 von 0,2 mmol^.l^-1 (HOENDEROP et al. 1999a) bis 0,66 mmol^.l^-1 (PENG et al.

2000b) und beim ECaC2 von 0,25 mmol^.l^-1 (PENG et al. 2000a) bis 0,44 mmol^.l^-1 (PENG et al. 1999). In Studien zur Ca²⁺-Aufnahme mit BSMV wurden Km-Werte für den Gesamt-Ca²⁺- Transport ermittelt. Dabei hat KAUNE 1992 für das Schwein eine Km von 0,03 mmol^.l^-1 ermittelt. Diese liegt in der gleichen Größenordnung wie die Km-Werte für den Menschen (GHISHAN et al. 1989), Ratten und Hamster (SCHEDL u. WILSON 1985, WILSON et al.

1989). MILLER u. BRONNER haben allerdings 1981 eine apparente Km für die Ratten von 0,27 mmol^.l^-1 beschrieben und für Hühner lag der Km-Wert bei 0,54 mmol^.l^-1 (LIANG et al.

1986).

Wie die einzelnen Transportproteine reguliert werden, ist noch weitgehend unklar. RT-PCR Analysen mit unterschiedlichen Humangeweben haben erbracht, dass beide Kanaltypen in Calbindin-D enthaltenden Geweben coexprimiert werden, wie z. B. im Dünndarm, Plazenta und Pankreas (HOENDEROP et al. 2001). Dieser Befund könnte auf eine Regulation von ECaC1 und/oder ECaC2 durch das Calcitriol/VDR-System hindeuten. Eine ausschließliche Expression von ECaC1 wurde für die Niere, das Colon und das Gehirn festgestellt, während sich im Magen nur ECaC2 nachweisen ließ. In der Promotorregion des ECaC1 wurde eine Struktur ermittelt, die vier Vitamin D-abhängige Elemente sowohl nach CARLBERG 1995 als auch nach CHRISTAKOS et al. 1996 enthält (MÜLLER et al. 2000a). Der ECaC2 ist im Darm insensitiv gegenüber Vitamin D (PENG et al. 1999, BARLEY et al. 2001), jedoch reagiert die ECaC2-Expression in Caco-2-Zellen signifikant auf den Zusatz von Vitamin D3

(WOOD et al. 2001). Im Gegensatz dazu schließen WEBER et al. (2001) für beide Transporter eine Beeinflussung durch Vitamin D aus und postulieren eine Regulation über extrazelluläres Calcium. Andererseits weisen Studien an zwei verschiedenen VDR-Knockout- Mäusemodellen auf eine Beeinflussung von ECaC1 und ECaC2 durch Calcitriol hin (VAN CROMPHAUT et al. 2001), jedoch konnten WEBER et al. 2001 dies nicht durch Studien an Mäusen mit einem mutierten und dadurch funktionsunfähigen VDR bestätigen.

Die Funktion von ECaC1 und ECaC2 wird durch die intrazelluläre Ca²⁺-Konzentration insofern reguliert (HOENDEROP et al. 1999b, SUZUKI et al. 2000, NILIUS et al. 2001a), als eine Reduktion der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration den Ca²⁺-Einstrom in die Zelle fördert, während ein Anstieg der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration die ECaC-Aktivität inhibiert (YUE et al. 2001). Extrazelluläres Ca²⁺ kann die Expression der Transportproteine

beeinflussen (WEBER et al. 2001) und in HEK293-Zellen führte extrazelluläres Ca²⁺ in physiologischen Konzentrationen zu einer schnellen und reversiblen Abnahme der ECaC- Aktivität (NILIUS et al. 2000, 2001b, VENNEKENS et al. 2000). Beide Transportproteine lassen sich durch Rutheniumrot hemmen, wobei der ECaC1 eine 100fach höhere Sensitivität für den Blocker als der ECaC2 hat (HOENDEROP et al. 2001). ECaC2 lässt sich bis zu 15 % durch Verapamil hemmen (PENG et al. 1999). In exokrinen Geweben wurde ein Protein beschrieben, dass eine sehr hohe Homologie zu den bekannten Sequenzen des ECaC1 bzw.

des ECaC2 hat. Es wurde daher als CaT-like bezeichnet und scheint aber ausschließlich eine Bedeutung im Zusammenhang mit der Malignität von Prostataentartungen zu haben (WISSENBACH et al. 2001, NIEMEYER et al. 2001). Dieses Protein kann durch Calmodulin und Proteinkinase C reguliert werden, indem Calmodulin an das Protein bindet bzw. diese Bindungsstelle durch die Proteinkinase C phosphoryliert wird (NIEMEYER et al. 2001).

Diese potentiellen Phosphorylierungsstellen wurden auch im ECaC1 bzw. ECaC2 identifiziert (HOENDEROP et al. 1999a, PENG et al. 1999).

Beim 2. Schritt des transzellulären Ca²⁺-Transports, der Durchschleusung durch das Cytosol, muss simultan die Second messenger-Funktion des freien Ca²⁺ erhalten bleiben. Es wird angenommen, dass dies überwiegend dadurch erreicht wird, dass Ca²⁺ an Calbindin-D gebunden wird (SCHRÖDER et al. 1996). In dieser Form kann Ca²⁺ etwa 70-mal schneller durch die Zelle diffundieren als bei freier Diffusion (BRONNER et al. 1986). Die genauen Vorgänge sind zur Zeit nicht geklärt.

Nach einem weiteren Modell werden Ca²⁺-Ionen in Vesikel verpackt oder an diese gebunden durch das Cytosol transportiert. Dieser als Transcaltachia bezeichnete Effekt wurde als „Fast Response“ auf Calcitriol beobachtet und wird wahrscheinlich unter Einbeziehung des Cytoskeletts über spezifische Membranrezeptoren vermittelt. Die physiologische Bedeutung dieses Vorganges ist allerdings noch umstritten (NEMERE et al. 1986, NEMERE u.

NORMAN 1988, 1990, NEMERE u. FARACH-CARSON 1998, NEMERE et al. 2000, NORMAN et al. 1999, SCHWARTZ et al. 2002).

Die Ausschleusung des Ca²⁺ durch die basolaterale Membran als Finalschritt der Ca²⁺-

Plasmamembranale Ca²⁺-Pumpen (PMCA) transportieren Ca²⁺ unter ATP-Verbrauch. Bei mit Vitamin D behandelten Küken, die vorher Vitamin D freie Nahrung erhielten, konnte dieser Mechanismus stimuliert werden (WASSERMAN et al. 1992a, b), während Untersuchungen an duodenalen Enterozyten von Ratte und Schwein einen Vitamin D-Effekt nicht bestätigen konnten (VAN CORVEN et al. 1987a,b, KAUNE et al. 1990). In den basolateralen Membranen von Enterozyten wurde außerdem ein 3Na⁺/Ca²⁺-Austauscher nachgewiesen, der jedoch in quantitativer Hinsicht von untergeordneter Relevanz zu sein scheint (VAN OS 1987, KAUNE et al. 1992).

2.6 Neonatale Entwicklung des Gastrointestinaltrakts

Während der postnatalen Entwicklung des Magen-Darm-Traktes zeigen sich zahlreiche morphologische und funktionelle Veränderungen, die einerseits altersabhängig, andererseits aber auch alimentär bedingt sein können. Diese Vorgänge können sich prinzipiell auch auf den Ca²⁺-Transport auswirken.

Bis zum 3. Lebenstag nimmt die Masse des Dünndarms um 72 % zu, was in einer Zunahme der Dünndarmlänge und Schleimhautmasse begründet ist (XU et al. 1992), ohne das Verhältnis der Schleimhautoberfläche zum Körpergewicht wesentlich zu verändern (BUDDINGTON et al. 2001). In den ersten Lebenstagen nehmen die einzelnen Zotten sowohl in ihrer Länge als auch in ihrem Umfang zu, wobei die Zottenlänge ab der 2. bis 5. Woche wieder abnimmt und in dieser Zeit die Krypten etwas tiefer werden, was auf eine vermehrte Zellproliferation hinweist (XU et al. 1992, CERA et al. 1988). Durch die Reduktion der Zottenlänge und die gleichzeitige stärkere Ausprägung der Krypten verringert sich das Längenverhältnis von Zotte zu Krypte in den ersten drei Lebenswochen um den Faktor 3 (MOON 1971). Da die Zellen der Darmschleimhaut von den Stammzellen der Krypten gebildet werden, erklärt dies die Altersabhängigkeit der Lebensdauer der Enterozyten. Die mittlere Lebensdauer der Enterozyten beträgt bei neugeborenen Ferkeln etwa 7 bis 10 Tage (MARTINSSON u. JÖNSSON 1976, MOON 1971) und bei 4 Wochen alten Ferkeln etwa 2 bis 4 Tage (MOON 1971, KOLDOVSKY et al. 1966). Im apikalen Bereich der Enterozyten des gesamten Dünndarms zeigen sich beim Saugferkel bis zur 4. Lebenswoche charakteristische Vakuolisierungen (MOON 1972), in denen größere Mengen an

Immunglobulinen nachgewiesen wurden (KÖMÜVES u. HEATH 1992). Während sich die morphologischen Veränderungen im Dünndarm schnell entwickeln und in besonderem Maße vom Alter des Tieres abhängig sind (CERA et al. 1988), entwickelt sich der Dickdarm langsam und hängt vor allem von der Fütterung insbesondere der Umstellung der reinen Milchfütterung in der Saugperiode auf die faserreiche Fütterung ab (MCCANCE 1974).

Dennoch beeinflusst die Fütterung auch die Morphologie des Dünndarm insofern, dass nach dem Absetzen eine deutliche Abnahme der Zottenlänge und Zunahme der Kryptentiefe einsetzt (HAMPSON 1986). Die Zottenform ändert sich von fingerförmig beim Saugferkel nach zungen- oder blattförmig beim abgesetzten Tier (HALL u. BYRNE 1989) und kann ebenfalls durch verschiedene Futterbestandteile bzw. Futterzubereitungen modifiziert werden (DUNSFORD et al. 1989, MILLER et al. 1984, KELLY et al. 1990).

Die in der postnatalen Phase ablaufenden Veränderungen auf funktioneller Ebene insbesondere auf die Anpassung der Transportvorgänge für die Hauptnährstoffe und Mineralstoffe sind mindestens so komplex wie die morphologischen Veränderungen. Es soll an dieser Stelle nicht näher darauf eingegangen werden, stattdessen wird auf die umfangreichen Arbeiten zur postnatalen Entwicklung des Schweinedarms der Arbeitsgruppe um R.K. Buddington hingewiesen (BUDDINGTON u. DIAMOND 1989, PUCHAL u.

BUDDINGTON 1992, BUDDINGTON 1994, BUDDINGTON u. MALO 1996, ZHANG et al. 1997, 1998, BUDDINGTON et al. 2001).

2.7 Besonderheiten des Ca

-Transports bei Saugferkeln

Bei neugeborenen Ferkeln wurde im Gegensatz zu den Absetzferkeln, bei denen die intestinale Ca²⁺-Absorption deutlich durch Calcitriol stimuliert wurde, gezeigt, dass die aktive Ca²⁺-Absorption im vorderen Dünndarm in den ersten 2 bis 4 Lebenswochen nicht oder nur partiell durch das Calcitriol/VDR-System kontrolliert wird (KAUNE et al. 1990, SCHRÖDER et al. 1990, 1993). In den ersten 10 Lebenstagen ist nicht nur der vordere Dünndarm, sondern auch das Ileum zur aktiven Ca²⁺-Resorpion befähigt (RADDE et al.

1980). Bei milchfrei ernährten Saugferkeln ist der aktive Ca²⁺-Transport signifikant erniedrigt, was auf eine calcitrophische Wirkung bestimmter Milchinhaltsstoffe hinweist (KLEIN 1999). Sowohl im Duodenum als auch im Jejunum wurde eine Abnahme der aktiven Ca²⁺-Absorption bei 15 bis 35 Tage alten Ferkeln nach dem Absetzen im Vergleich zu 1 bis 14 Tage alten Saugferkeln nachgewiesen, jedoch war dieser Alterseffekt nicht signifikant (RADDE et al. 1980).

Über den genauen Mechanismus der Ca²⁺-Absorption und die einzelnen Teilschritte beim Saugferkel ist relativ wenig bekannt. Ferkel mit unphysiologisch niedrigem Plasma- Calcitriolspiegel, wie z. B. bei Neugeborenen mit angeborenem Calcitriolmangel, können Ca²⁺ in der gleichen Größenordnung resorbieren wie gesunde Tier mit physiologischen Plasma-Calcitriolspiegel (LACHENMAIER-CURRLE u. HARMEYER 1988, SCHRÖDER et al. 1998a). Ob die Durchschleusung von Ca²⁺ durch die Zelle bei Schweinen dieses Alters weniger von calcitriol-induziertem Calbindin abhängig ist, oder ob noch andere Mechanismen eine Rolle spielen ist nicht geklärt. Untersuchungen an Küken und jungen Ratten haben Hinweise auf eine Beteiligung von Mikrotubuli und Actinfilamenten gegeben (NEMERE et al. 1984, NASSAR et al. 1988), die möglicherweise auch beim Saugferkel eine Rolle spielen (SCHRÖDER et al. 1998b).

3. MATERIAL UND METHODEN

3.1 Versuchstiere

Bei den verwendeten Schweinen handelte es sich um Kreuzungen der Rassen Deutsches Edelschwein und Pietrain aus dem Lehr- und Forschungsgut Ruthe der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Dabei standen drei Altersgruppen zur Verfügung (Tabelle 1). Die Saugferkel waren zwischen 5 und 6 Tage alt und wogen zwischen 2,1 und 2,8 kg. Bis zum Zeitpunkt der Schlachtung wurden sie bei der Muttersau gehalten und ausschließlich mit Muttermilch ernährt. Die Absetzferkel waren 60 Tage alt und wogen zwischen 8,1 und 11,7 kg. Sie wurden nach der dritten Woche abgesetzt und mit handelsüblichem Ferkel-Starter Futter ernährt. Die Mastferkel waren zwischen 88 und 117 Tage alt und wogen zwischen 16,8 und 25,5 kg. Sie wurden mit handelsüblichem Anfangsmastfutter ernährt.

Tabelle 1: Lebendgewicht und Alter der Versuchstiere zum Zeitpunkt der Schlachtung.

(x ± SEM, n = Anzahl der Tiere)

Gruppe n Alter [Tage] Gewicht [kg]

Saugferkel 5 5,2 ± 0,2 2,4 ± 0,1

Absetzferkel 5 60 ± 0 10,0 ± 0,6 Mastferkel 5 102,4 ± 4,7 19,2 ± 1,6

3.2 Probenentnahmen

Die Tiere wurden durch einen Bolzenschuss betäubt und anschließend durch Eröffnen der Arteriae carotides communes, der Venae jugulares externae und internae entblutet. Danach wurde die Bauchhöhle eröffnet und das gesamte Darmkonvolut entnommen.

3.2.1 Probenentnahme für die Präparation von Bürstensaummembran- vesikeln

Für die Herstellung der Bürstensaummembranvesikel (BSMV) wurde das restliche Duodenum, je nach Größe des Tieres, mit einer Länge von 15 bis 80 cm, caudal der Entnahmestelle für die RNA-Präparation (Kap. 3.2.2) entnommen. Der Darmabschnitt wurde mit eiskalter physiologischer Kochsalzlösung (NaCl 0,9 % w/v) gespült, am Mesenterial- ansatz eröffnet und in etwa 10 cm lange Stücke geschnitten, die in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und bis zur Präparation der Vesikel bei mindestens –70 °C gelagert wurden. Das Gewebe der Saugferkel wurde maximal drei Tage bis zur Präparation aufbewahrt. Das Gewebe der übrigen Ferkel wurde nicht länger als 5 Wochen eingefroren.

3.2.2 Probenentnahme für die RNA-Präparation

Es wurden jeweils die ersten 10 cm des Duodenums, des Jejunums, des Ileums, des proximalen Colons sowie des distalen Colons entnommen, am Mesenterialansatz aufgeschnitten und in eiskalter physiologischer Kochsalzlösung partikelfrei gespült. Danach wurde das Darmstück mit der serosalen Seite auf eine Glasplatte gelegt und mittels zweier Objektträger wurde die Darmwand im Bereich der Tunica mucosa, bestehend aus Lamina epithelialis mucosae und Lamina propria mucosae, von der Lamina muscularis mucosae, der Tela submucosa, der Tunica muscularis und von der Lamina serosa (soweit noch vorhanden) getrennt. Die Mucosa wurde in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und bis zur weiteren Verwendung bei mindestens –70 °C gelagert. Die restlichen Darmschichten wurden verworfen.

3.3 Präparation der Bürstensaummembranvesikel

Die verschiedenen Membranen der Zelle, die nach mechanischem und osmotischem Aufbrechen der Zellen bzw. Abtrennen der schweren Organellen zurückbleiben, so dass sie in unterschiedlichem Maße mit Magnesiumionen aggregieren. Dieser Umstand kann bei geeigneter Zentrifugation dazu verwendet werden, verschiedene Membranfraktionen voneinander zu trennen.

3.3.2 Durchführung

Die Präparation der BSMV erfolgte nach einer modifizierten Mg²⁺-EGTA- Präzipitationsmethode mit Differentialzentrifugation (KAUNE el al. 1992, SCHRÖDER et al.

1998c). Abbildung 4 gibt die Präparationsschritte in einer Übersicht wieder.

Das Gewebe wurde 24 Stunden vor der Präparation bei –20 °C gelagert, um den Auftauvorgang zu beschleunigen. Die gesamte Präparation erfolgte anschließend bei 0-4 °C auf Eis. Zwischen 3,5 und 40 g Gewebe wurden mit der gleichen Menge an Präparationspuffer I aufgetaut. Anschließend wurden die Enterozyten mit einem Vibro Mixer (E1; Chemap AG, CH-8604 Volketswil) 10 min bei höchster Stufe von der Darmwand gelöst.

Die Flüssigkeit wurde durch ein herkömmliches Haushaltssieb gegeben und mit der 4fachen Menge (bezogen auf das Volumen des Präparationspuffers I) H2O nachgespült. Dadurch konnten die Enterozyten osmotisch aufgebrochen werden. Die Darmreste im Sieb wurden verworfen und die Zellsuspension in einem Küchenmixer (Turboblender, Modell D70, Moulinex) dreimal je 1 min auf der 4. Stufe homogenisiert. Bei dem Material der Saugferkeln wurde der letzte Schritt durch eine zweimalige Homogenisierung mit dem Ultraturrax (Heidolph DIAX 900, Stufe 5, Heidolph Instruments, D-91126 Schwabach) von je 30 s ersetzt. Nach jedem Homogenisierungsschritt wurde der entstandene Schaum, nachdem er sich 1 min abgesetzt hatte, mit einer Wasserstrahlpumpe abgesaugt. Nach Entnahme von bis zu 1 ml Homogenat, zur Bestimmung des anfänglichen Proteingehaltes und der

Ausgangsenzymaktivitäten, wurde dem restlichen Homogenat MgCl2 bis zu einer Endkonzentration von 10 mmol^.l^-1 unter langsamem Rühren hinzugefügt und 15 min inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Homogenat 15 min lang bei 3295 g und 4 °C zentrifugiert (Zentrifuge RC5C, Sorvall Instruments, Du Pont Company, Wilmington Delware 19898, USA; Rotor GSA), das Pellet verworfen und der Überstand 33 min lang bei 16270 g und 4 °C zentrifugiert. Bei den Saugferkeln wurde das Homogenat 15 min bei 2987 g und 4 °C (Rotor SS34) und der entstandene Überstand 30 min bei 26890 g zentrifugiert. Nach dieser Zentrifugation wurde der Überstand verworfen und das Pellet mit der dreifachen Menge Präparationspuffer II, in Bezug auf die eingesetzte Gewebemenge, jedoch maximal 35 ml, in einem Elvehjem-Potter (Potter S 30; B. Braun, D-34212 Melsungen) mit 10 Schüben bei 1500 rpm homogenisiert. Diesem Homogenat wurde MgCl2 bis zu einer Endkonzentration von 10 mmol^.l^-1 unter langsamem Rühren hinzugefügt und 15 min inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Homogenat 15 min bei 2987 g und 4 °C zentrifugiert (Rotor SS34), das Pellet verworfen und der Überstand 30 min bei 26890 g und 4 °C zentrifugiert. Diesmal wurde der Überstand verworfen, das Pellet mit 30 ml Vesikelpuffer in einem Elvehjem-Potter mit 10 Schüben bei 1500 rpm homogenisiert und das Homogenat 40 min bei 26890 g und 4 °C zentrifugiert. Das entstandene Pellet wurde unter Zugabe von 0,7 bis 3 ml Vesikelpuffer mit einer 1 ml-Spritze (Kanüle 0,45 x 0,23 mm) homogenisiert. Es wurden bis zu 500 µl Vesikelsuspension zur Bestimmung der Endproteinkonzentration und Enzymaktivitäten entnommen und bei –20 °C gelagert. Der Rest der Vesikelsuspension wurde in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und bis zur weiteren Verwendung bei mindestens –70 °C gelagert. Die Vesikelsuspension der Saugferkel wurde nicht eingefroren, sondern unmittelbar bei den Aufnahmestudien eingesetzt.

3.3.3 Präparationspuffer

Präparationspuffer I 300 mmol^.l^-1 D-Mannit 12 mmol^.l^-1 Tris, basisch

5 mmol^.l^-1 EGTA HCl (1 mol^.l^-1)Æ pH 7,4 bei 4 °C

Präparationspuffer II 60 mmol^.l^-1 D-Mannit 2,4 mmol^.l^-1 Tris, basisch

1 mmol^.l^-1 EGTA HCl (1 mol^.l^-1)Æ pH 7,4 bei 4 °C

Vesikelpuffer 100 mmol^.l^-1 D-Mannit 100 mmol^.l^-1 KCl

10 mmol^.l^-1 HEPES

Tris, basisch (1 mol^.l^-1)Æ pH 7,4 bei 20 °C

Enterozyten gewinnen

Zellen mit hypoosmotischem Schock aufbrechen

Zellsuspension homogenisieren

Proben für Protein- und Enzymbestimmung

1. MgCl2-Fällung

Pellet verwerfen 1. Zentrifugation,

15 min bei 3295 g

Überstand

Neuen Überstand verwerfen 2. Zentrifugation,

33 min bei 16270 g

Pellet resuspendieren 2. MgCl2-Fällung

Neues Pellet verwerfen 3. Zentrifugation,

15 min bei 2987 g

Überstand

Neuen Überstand verwerfen 4. Zentrifugation,

30 min bei 26890 g

Pellet resuspendieren

5. Zentrifugation,

40 min bei 26890 g Überstand verwerfen

Pellet resuspendieren

Proben für Protein- und Enzymbestimmung

Suspension in flüssigem Stickstoff tiefgefrieren

Abbildung 4: Schematische Darstellung der Mg²⁺-EGTA-Präzipitation zur Anreicherung von Bürstensaummembranen bei nicht mehr milchernährten Schweinen (g bezieht sich auf r = rave, Zeitangaben beziehen sich auf die gesamte Zentrifugationsdauer)

3.4 Messung der Aufnahmeraten in die Bürstensaummembranvesikel

Die BSMV der Absetz- und der Mastferkel wurden bei RT aufgetaut. Die Aufnahmestudien wurden bei RT durchgeführt. Vor dem Einsatz der Vesikelsuspension wurde diese nochmals mittels 1 ml-Spritze (Kanüle 0,45 x 0,23 mm) homogenisiert. Je Messpunkt wurde der Inkubationsansatz mit der Vesikelsuspension im Verhältnis 60 µl zu 20 µl versetzt und auf einem Schüttler (Heidolph Reax 2000, Heidolph Instruments, D-91126 Schwabach) durchmischt. Nach der Inkubation wurden bis zu 100 µl entnommen und die Ca²⁺-Aufnahme durch Zugabe von 1 ml eiskalter Stopp-Lösung (Kap. 3.4.1) beendet. Anschließend wurden die Vesikel durch Schnellfiltration (Cellulose-Nitrat-Filter, Porengröße 0,65 µm, Sartorius, D- 55555 Göttingen) von dem Reaktionsmedium getrennt, das Reaktionsgefäß mit 1 ml eiskalter Stopp-Lösung gespült und der Filter nochmals zweimal mit je 5 ml eiskalter Stopp-Lösung nachgespült. Die Filter wurden mit 4,3 ml Szintillationsflüssigkeit gemischt und die Aktivität in einem Flüssigkeitsszintillationsmessgerät (Tri-Carb 2500; Canberra Packard GmbH, D- 63266 Dreieich) bestimmt. Die Zähldauer betrug stets 10 min. Der statistische Zählfehler betrug 2-3 %. Alle Proben wurden in Doppelbestimmung gemessen.

3.4.1 Puffer für die Aufnahmestudien

Transportpuffer-NaCl 200 mmol^.l^-1 D-Mannit (zweifach konzentriert) 200 mmol^.l^-1 NaCl

20 mmol^.l^-1 HEPES Tris, basisch (1 mol^.l^-1)Æ pH 7,4 bei 20 °C

Transportpuffer-KCl 200 mmol^.l^-1 D-Mannit (zweifach konzentriert) 200 mmol^.l^-1 KCl

20 mmol^.l^-1 HEPES Tris, basisch (1 mol^.l^-1)Æ pH 7,4 bei 20 °C

Stopp-Lösung 5 mmol^.l^-1 D-Mannit

150 mmol^.l^-1 NaCl/KCl 10 mmol^.l^-1 HEPES Tris, basisch ( 1 mol^.l^-1)Æ pH 7,4 bei 4 °C

CaCl2-Stammlösung 10 mmol^.l^-1

Valinomycin in Methanol 500 µmol^.l^-1 A23187 in DMSO 1 mg^.ml^-1 EGTA in H2O 10 mmol^.l^-1

Glucose in H2O 0,5 mmol^.l^-1

3.4.2 Kalkulation von [Ca

]

[Ca²⁺]f wurde mit Hilfe des Computerprogrammes Chelator ermittelt (SCHOENMAKERS et al. 1992). Die Gesamt-Ca²⁺-Konzentrationen [Ca²⁺]ges in Bezug auf [Ca²⁺]f sind unter den Bedingungen der Inkubationsansätze in Tabelle 2 wiedergegeben. Der Anteil an Ca²⁺-Ionen, der durch die Applikation des Radiotracers ⁴⁵Ca zusätzlich in den Inkubationsansatz verbracht wurde, musste berücksichtigt werden und wurde deshalb über die spezifische Aktivität (spez. A.) der Tracer-Stammlösung ermittelt:

X [mCi] ^. 1000

Ca-Konzentration [mmol^.l^-1]: .

durch Zugabe von ⁴⁵Ca 40,08 [g^.mol^-1] ^. spez. A. [mCi^.mg^-1] ^. Volumen [ml]

Tabelle 2: Vergleich der Gesamt-Ca²⁺-Konzentrationen [Ca²⁺]ges mit den freien Ca²⁺- Konzentrationen [Ca²⁺]f unter den Bedingungen im Inkubationsansatz mit 0,5 mmol^.l^-1 EGTA.

[Ca²⁺]ges [mmol^.l^-1] 0,5107 0,5278 0,5893 0,8998 1,2499 2,5 4,5 [Ca²⁺]f [mmol^.l^-1] 0,015 0,03 0,09 0,4 0,75 2,0 4,0

3.4.3 Studien zur zeitabhängigen Glucose-Aufnahme

Für die zeitabhängigen Messungen der Glucose-Aufnahmen wurde zum Zeitpunkt t = 0 min 570 µl Inkubationsansatz mit 190 µl Vesikelsuspension versetzt und durchmischt. Nach 0,5, 1, 2, 3, 5 60 und 180 min wurden je 100 µl entnommen und wie in Kap. 3.4 beschrieben weiter bearbeitet.

Es wurden Aufnahmestudien in An- und Abwesenheit von Na⁺-Ionen im extravesikulären Kompartiment durchgeführt.

Aus zweifach konzentriertem Transportpuffer (KCl bzw. NaCl), Glucose-Stammlösung und radioaktiv markierter ³H-Glucose (~10 µCi bzw. 0,37 x 10⁶ Bq) wurde der Inkubationsansatz mit einem Gesamtvolumen von 1,5 ml hergestellt. Die Endkonzentration für Glucose betrug 10 µmol^.l^-1.

Zur Bestimmung der Gesamtaktivität je Probe wurden 75 µl Inkubationsansatz direkt mit Szintillationsflüssigkeit gemischt und gemessen.

Zur Bestimmung des Leerwertes wurden 75 µl Inkubationsansatz analog zu den Proben filtriert und gemessen.

Die Glucose-Aufnahmen in die BSMV als Funktion der Zeit werden in nmol Glucose je mg Protein angegeben. Die Berechnung der Glucoseaufnahmen erfolgte analog zu der Berechnung der Calciumaufnahmen (siehe Kap. 3.4.4).

3.4.4 Studien zur zeitabhängigen Calcium-Aufnahme

Für die zeitabhängigen Messungen der Ca²⁺-Aufnahmen wurde zum Zeitpunkt t = 0 min 570 µl Inkubationsansatz mit 190 µl Vesikelsuspension versetzt und durchmischt. Nach 0,5, 1, 2, 6, 10 und 60 min wurden je 100 µl entnommen und wie in Kap. 3.4 beschrieben weiter bearbeitet.

Es wurden Aufnahmestudien in An- und Abwesenheit des Calcium-Ionophors A23187 durchgeführt.

Aus zweifach konzentriertem Transportpuffer-KCl, EGTA-Stammlösung, Valinomycin- Stammlösung, A23187-Stammlösung bzw. DMSO, Ca²⁺-Stammlösung und radioaktivem

45Ca (~50 µCi bzw. 2,05 x 10⁶ Bq) wurde der Inkubationsansatz mit einem Gesamtvolumen von 1,5 ml hergestellt. Die Endkonzentrationen betrugen für EGTA 0,5 mmol^.l^-1, für Valinomycin 5 µmol^.l^-1, für A23187 10 µg^.ml^-1 und für [Ca²⁺]f 0,03 mmol^.l^-1.

Zur Bestimmung der Gesamtaktivität je Probe wurden 75 µl Inkubationsansatz direkt mit Szintillationsflüssigkeit gemischt und gemessen.

Zur Bestimmung des Leerwertes wurden 75 µl Inkubationsansatz analog zu den Proben filtriert und gemessen.

Die Ca²⁺-Aufnahme (CA) in die BSMV als Funktion der Zeit werden in nmol Ca²⁺ je mg Protein angegeben und lassen sich nach folgender Formel berechnen:

(cpmP-cpmL) ^. [Ca²⁺]f

CA =

cpmT. Pr mit

cpmP = gezählte Zerfälle pro Minute in der Probe [cpm], cpmL = gezählte Zerfälle pro Minute im Leerwert [cpm],

[Ca²⁺]f = Konzentration an ionisiertem, freiem Ca²⁺ je Probe [µmol^.l^-1], cpmT = Gesamtaktivität je Probe [cpm],

Pr = Proteinkonzentration im Inkubationsansatz [mg^.l^-1].

Die Ca²⁺-Aufnahmen in Abhängigkeit der Inkubationsdauer können durch eine exponentielle Sättigungskurve der Gleichung y = a ^. (1-e^-kt) annähernd beschrieben und damit die Parameter a und k sowie der Standardfehler ermittelt werden. Dazu wurde das Programm „GraphPad Prism“ (ISI, Philadelphia, USA; www.graphpad.com) benutzt.

3.4.5 Studien zur konzentrationsabhängigen Calcium-Aufnahme

Für die Messungen der Ca²⁺-Aufnahme als Funktion der [Ca²⁺]f wurde zum Zeitpunkt t = 0 min 60 µl Inkubationsansatz mit 20 µl Vesikelsuspension versetzt und durchmischt. Nach 0,5 min wurde die Reaktion gestoppt und wie in Kap. 3.4 beschrieben weiter bearbeitet.

Es wurden Aufnahmestudien in An- und Abwesenheit des Calcium-Ionophors A23187 durchgeführt.

Aus zweifach konzentriertem Transportpuffer (KCl), EGTA-Stammlösung, A23187- Stammlösung bzw. DMSO, Ca²⁺-Stammlösung und radioaktivem ⁴⁵Ca (~40 µCi bzw.

1,48 x 10⁶ Bq) wurden die Inkubationsansätze mit einem Gesamtvolumen von je 1,2 ml hergestellt. Die Endkonzentrationen betrugen für EGTA 0,5 mmol^.l^-1, für A23187 10 µg^.ml^-1 und für [Ca²⁺]f 0,015; 0,03; 0,09; 0,4; 0,75; 2 und 4 mmol^.l^-1 (Tabelle 2). In Anwesenheit von A23187 wurde ein Ansatz mit 0,03 mmol^.l^-1 an [Ca²⁺]f untersucht.

Zur Bestimmung der Gesamtaktivität je Probe wurden je 60 µl Inkubationsansatz direkt mit Szintillationsflüssigkeit gemischt und gemessen.

Zur Bestimmung des Leerwertes wurden je 60 µl Inkubationsansatz analog zu den Proben filtriert und gemessen.

3.4.6 Kalkulation der kinetischen Kenngrößen der Ca

-Aufnahme

Die Ca²⁺-Aufnahmeraten in Abhängigkeit von [Ca²⁺]f wurden mit Hilfe eines Algorithmus des Programmpakets „GraphPad Prism“ (ISI, Philadelphia, USA) ermittelt. Dabei wurde folgende Formel zu Grunde gelegt:

Vmax. [Ca²⁺]f

Ca²⁺-Aufnahme = + U ^. [Ca²⁺]f

Km + [Ca²⁺]f

mit

Vmax = Maximum der sättigbaren Aufnahme [nmol^.mg^-1], Km = Michaelis-Menten-Konstante [mmol^.l^-1],

[Ca²⁺]f = Konzentration des freien Calciums [mmol^.l^-1], U = nicht sättigbarer Anteil der Ca²⁺-Aufnahme.

Dies ermöglicht die Kalkulation von Vmax und Km im Sinne einer typischen Michaelis- Menten-Kinetik.

3.4.7 Ermittlung des Vesikelvolumens

Aus der Glucoseaufnahme zum Equilibriumszeitpunkt nach 180 min Inkubation wurde das Vesikelvolumen berechnet. Das Vesikelvolumen wird in µl^.mg^-1 Protein angegeben und errechnet sich durch Anwendung folgender Formeln:

VA cpmp - cpmL

VV = ; VA = ^. AV ; P = Pr ^. AV

P cpmT

mit

VV = Vesikelvolumen [µl^.mg^-1], VA = Vesikelvolumen im Ansatz [µl],

cpmp = gezählte Zerfälle pro Minute in der Probe beim Ausgleichswert [cpm], cpmL = gezählte Zerfälle pro Minute im Leerwert [cpm],

cpmT = gezählte Zerfälle pro Minute im Gesamtansatz je Probe [cpm], P = Proteinmenge im Ansatz [mg],

Pr = Proteinkonzentration im Ansatz [mg^.l^-1], AV = Ansatzvolumen [ml].

3.5

Protein- und Enzym-Bestimmungen im Mukosahomogenat und in der Vesikelsuspension

3.5.1

Protein

Der Farbstoff Coomassie Brilliant Blue G 250 hat die Eigenschaft, sich im sauren Milieu an Protein zu binden. Das ursprünglich rote Kation wird durch die Bindung als blaues Anion stabilisiert, was zu einer Verschiebung des Absorptionsmaximums von 465 nm nach 595 nm führt. Somit kann die Menge des gebildeten Farbstoffes bei 595 nm photometrisch bestimmt werden. Die Menge des gebildeten Farbstoffes ist dabei proportional zur Proteinmenge. Vor der Farbreaktion wird den Proben oberflächenaktives Saponin zugegeben, um möglichst alle Proteinbindungsstellen zugänglich zu machen.

3.5.1.2 Durchführung

Die Proteinbestimmung erfolgte nach der von BRADFORD (1976) beschriebenen Methode.

Das Farbstoffkonzentrat wurde 1:5 mit H2O verdünnt. Fünfzig µl der Probe wurden mit 50 µl 1%igem Saponin versetzt und 20 min bei 20 °C inkubiert. Nach Zugabe von 2,5 ml verdünntem Farbkonzentrat wurde die Probe erneut 20 min bei 20 °C inkubiert. In gleicher Weise wurde mit einer Standardreihe aus bovinem γ-Globulin aus Plasma sowie H2O als Leerwert verfahren. Danach wurden die Proben im Photometer (DU^®-8 Spectrophotometer;

Beckman Instruments GmbH, D-80807 München) bei 595 nm gegen den Leerwert gemessen.

Schließlich wurden den Proben Proteinwerte auf der linearen Regressionsgeraden der Standardreihe zugeordnet.

3.5.2 Aktivität der alkalische Phosphatase (AP) 3.5.2.1 Prinzip

Die AP hat die Eigenschaft p-Nitrophenylphosphat hydrolytisch in p-Nitrophenyl und Phosphat zu spalten. Die entstandene Menge an gelbem p-Nitrophenyl ist proportional zur Aktivität der AP und kann photometrisch bei 405 nm gemessen werden.

3.5.2.2 Durchführung

Die Bestimmung der Aktivität der AP erfolgte nach der von KAWADE (1964) beschriebenen Methode. Je 50 µl Probe wurden mit 3 ml AP-Puffer (1,02 mol^.l^-1 Diethanolamin, 0,51 mmol^.l^-1 MgCl2, 10 mmol^.l^-1 Na-Nitrophenylphosphat, mit HCl auf pH 9,8 eingestellt) versetzt und gemischt. Im Photometer (Kap. 3.5.1.2) wurde nach 1, 2 und 3 min die Extinktion bei 405 nm gegen Luft gemessen. Zur Berechnung wurde die Differenz der Extinktion pro Minute mit dem versuchsinternen Faktor 3300 bei 1 cm Schichtdicke entsprechend dem Lambert-Beerschen Gesetz multipliziert. Daraus ergab sich die Einheit U^.l^-1, die anschließend in U^.g^-1 Protein umgerechnet wurde.

3.5.3 Aktivität der Na

/K

-ATPase 3.5.3.1 Prinzip

Ouabain hat die Eigenschaft, spezifisch die Aktivität der Na⁺/K⁺-ATPase zu hemmen.

Üblicherweise wird durch die intakte ATPase-Aktivität anorganisches Phosphat frei gesetzt, das in saurer Lösung mit Molybdat Phosphormolybdänsäure bildet, die zu Molybdänblau reduziert werden kann. Die Extinktion dieses blauen Farbkomplexes wird bei 609 nm photometrisch gemessen. Die Aktivität der Na⁺/K⁺-ATPase entspricht der Differenz der ATPase-Aktivität mit und ohne Ouabainzusatz.