3. MATERIAL UND METHODEN
3.4 Messung der Aufnahmeraten in die Bürstensaummembranvesikel
Die BSMV der Absetz- und der Mastferkel wurden bei RT aufgetaut. Die Aufnahmestudien wurden bei RT durchgeführt. Vor dem Einsatz der Vesikelsuspension wurde diese nochmals mittels 1 ml-Spritze (Kanüle 0,45 x 0,23 mm) homogenisiert. Je Messpunkt wurde der Inkubationsansatz mit der Vesikelsuspension im Verhältnis 60 µl zu 20 µl versetzt und auf einem Schüttler (Heidolph Reax 2000, Heidolph Instruments, D-91126 Schwabach) durchmischt. Nach der Inkubation wurden bis zu 100 µl entnommen und die Ca2+-Aufnahme durch Zugabe von 1 ml eiskalter Stopp-Lösung (Kap. 3.4.1) beendet. Anschließend wurden die Vesikel durch Schnellfiltration (Cellulose-Nitrat-Filter, Porengröße 0,65 µm, Sartorius, D-55555 Göttingen) von dem Reaktionsmedium getrennt, das Reaktionsgefäß mit 1 ml eiskalter Stopp-Lösung gespült und der Filter nochmals zweimal mit je 5 ml eiskalter Stopp-Lösung nachgespült. Die Filter wurden mit 4,3 ml Szintillationsflüssigkeit gemischt und die Aktivität in einem Flüssigkeitsszintillationsmessgerät (Tri-Carb 2500; Canberra Packard GmbH, D-63266 Dreieich) bestimmt. Die Zähldauer betrug stets 10 min. Der statistische Zählfehler betrug 2-3 %. Alle Proben wurden in Doppelbestimmung gemessen.
3.4.1 Puffer für die Aufnahmestudien
Transportpuffer-NaCl 200 mmol.l-1 D-Mannit (zweifach konzentriert) 200 mmol.l-1 NaCl
20 mmol.l-1 HEPES Tris, basisch (1 mol.l-1)Æ pH 7,4 bei 20 °C
Transportpuffer-KCl 200 mmol.l-1 D-Mannit (zweifach konzentriert) 200 mmol.l-1 KCl
20 mmol.l-1 HEPES Tris, basisch (1 mol.l-1)Æ pH 7,4 bei 20 °C
Stopp-Lösung 5 mmol.l-1 D-Mannit
150 mmol.l-1 NaCl/KCl 10 mmol.l-1 HEPES Tris, basisch ( 1 mol.l-1)Æ pH 7,4 bei 4 °C
CaCl2-Stammlösung 10 mmol.l-1
Valinomycin in Methanol 500 µmol.l-1 A23187 in DMSO 1 mg.ml-1 EGTA in H2O 10 mmol.l-1
Glucose in H2O 0,5 mmol.l-1
3.4.2 Kalkulation von [Ca
2+]
f[Ca2+]f wurde mit Hilfe des Computerprogrammes Chelator ermittelt (SCHOENMAKERS et al. 1992). Die Gesamt-Ca2+-Konzentrationen [Ca2+]ges in Bezug auf [Ca2+]f sind unter den Bedingungen der Inkubationsansätze in Tabelle 2 wiedergegeben. Der Anteil an Ca2+-Ionen, der durch die Applikation des Radiotracers 45Ca zusätzlich in den Inkubationsansatz verbracht wurde, musste berücksichtigt werden und wurde deshalb über die spezifische Aktivität (spez. A.) der Tracer-Stammlösung ermittelt:
X [mCi] . 1000
Ca-Konzentration [mmol.l-1]: .
durch Zugabe von 45Ca 40,08 [g.mol-1] . spez. A. [mCi.mg-1] . Volumen [ml]
Tabelle 2: Vergleich der Gesamt-Ca2+-Konzentrationen [Ca2+]ges mit den freien Ca2+ -Konzentrationen [Ca2+]f unter den Bedingungen im Inkubationsansatz mit 0,5 mmol.l-1 EGTA.
[Ca2+]ges [mmol.l-1] 0,5107 0,5278 0,5893 0,8998 1,2499 2,5 4,5 [Ca2+]f [mmol.l-1] 0,015 0,03 0,09 0,4 0,75 2,0 4,0
3.4.3 Studien zur zeitabhängigen Glucose-Aufnahme
Für die zeitabhängigen Messungen der Glucose-Aufnahmen wurde zum Zeitpunkt t = 0 min 570 µl Inkubationsansatz mit 190 µl Vesikelsuspension versetzt und durchmischt. Nach 0,5, 1, 2, 3, 5 60 und 180 min wurden je 100 µl entnommen und wie in Kap. 3.4 beschrieben weiter bearbeitet.
Es wurden Aufnahmestudien in An- und Abwesenheit von Na+-Ionen im extravesikulären Kompartiment durchgeführt.
Aus zweifach konzentriertem Transportpuffer (KCl bzw. NaCl), Glucose-Stammlösung und radioaktiv markierter 3H-Glucose (~10 µCi bzw. 0,37 x 106 Bq) wurde der Inkubationsansatz mit einem Gesamtvolumen von 1,5 ml hergestellt. Die Endkonzentration für Glucose betrug 10 µmol.l-1.
Zur Bestimmung der Gesamtaktivität je Probe wurden 75 µl Inkubationsansatz direkt mit Szintillationsflüssigkeit gemischt und gemessen.
Zur Bestimmung des Leerwertes wurden 75 µl Inkubationsansatz analog zu den Proben filtriert und gemessen.
Die Glucose-Aufnahmen in die BSMV als Funktion der Zeit werden in nmol Glucose je mg Protein angegeben. Die Berechnung der Glucoseaufnahmen erfolgte analog zu der Berechnung der Calciumaufnahmen (siehe Kap. 3.4.4).
3.4.4 Studien zur zeitabhängigen Calcium-Aufnahme
Für die zeitabhängigen Messungen der Ca2+-Aufnahmen wurde zum Zeitpunkt t = 0 min 570 µl Inkubationsansatz mit 190 µl Vesikelsuspension versetzt und durchmischt. Nach 0,5, 1, 2, 6, 10 und 60 min wurden je 100 µl entnommen und wie in Kap. 3.4 beschrieben weiter bearbeitet.
Es wurden Aufnahmestudien in An- und Abwesenheit des Calcium-Ionophors A23187 durchgeführt.
Aus zweifach konzentriertem Transportpuffer-KCl, EGTA-Stammlösung, Valinomycin-Stammlösung, A23187-Stammlösung bzw. DMSO, Ca2+-Stammlösung und radioaktivem
45Ca (~50 µCi bzw. 2,05 x 106 Bq) wurde der Inkubationsansatz mit einem Gesamtvolumen von 1,5 ml hergestellt. Die Endkonzentrationen betrugen für EGTA 0,5 mmol.l-1, für Valinomycin 5 µmol.l-1, für A23187 10 µg.ml-1 und für [Ca2+]f 0,03 mmol.l-1.
Zur Bestimmung der Gesamtaktivität je Probe wurden 75 µl Inkubationsansatz direkt mit Szintillationsflüssigkeit gemischt und gemessen.
Zur Bestimmung des Leerwertes wurden 75 µl Inkubationsansatz analog zu den Proben filtriert und gemessen.
Die Ca2+-Aufnahme (CA) in die BSMV als Funktion der Zeit werden in nmol Ca2+ je mg Protein angegeben und lassen sich nach folgender Formel berechnen:
(cpmP-cpmL) . [Ca2+]f
CA =
cpmT. Pr mit
cpmP = gezählte Zerfälle pro Minute in der Probe [cpm], cpmL = gezählte Zerfälle pro Minute im Leerwert [cpm],
[Ca2+]f = Konzentration an ionisiertem, freiem Ca2+ je Probe [µmol.l-1], cpmT = Gesamtaktivität je Probe [cpm],
Pr = Proteinkonzentration im Inkubationsansatz [mg.l-1].
Die Ca2+-Aufnahmen in Abhängigkeit der Inkubationsdauer können durch eine exponentielle Sättigungskurve der Gleichung y = a . (1-e-kt) annähernd beschrieben und damit die Parameter a und k sowie der Standardfehler ermittelt werden. Dazu wurde das Programm „GraphPad Prism“ (ISI, Philadelphia, USA; www.graphpad.com) benutzt.
3.4.5 Studien zur konzentrationsabhängigen Calcium-Aufnahme
Für die Messungen der Ca2+-Aufnahme als Funktion der [Ca2+]f wurde zum Zeitpunkt t = 0 min 60 µl Inkubationsansatz mit 20 µl Vesikelsuspension versetzt und durchmischt. Nach 0,5 min wurde die Reaktion gestoppt und wie in Kap. 3.4 beschrieben weiter bearbeitet.
Es wurden Aufnahmestudien in An- und Abwesenheit des Calcium-Ionophors A23187 durchgeführt.
Aus zweifach konzentriertem Transportpuffer (KCl), EGTA-Stammlösung, A23187-Stammlösung bzw. DMSO, Ca2+-Stammlösung und radioaktivem 45Ca (~40 µCi bzw.
1,48 x 106 Bq) wurden die Inkubationsansätze mit einem Gesamtvolumen von je 1,2 ml hergestellt. Die Endkonzentrationen betrugen für EGTA 0,5 mmol.l-1, für A23187 10 µg.ml-1 und für [Ca2+]f 0,015; 0,03; 0,09; 0,4; 0,75; 2 und 4 mmol.l-1 (Tabelle 2). In Anwesenheit von A23187 wurde ein Ansatz mit 0,03 mmol.l-1 an [Ca2+]f untersucht.
Zur Bestimmung der Gesamtaktivität je Probe wurden je 60 µl Inkubationsansatz direkt mit Szintillationsflüssigkeit gemischt und gemessen.
Zur Bestimmung des Leerwertes wurden je 60 µl Inkubationsansatz analog zu den Proben filtriert und gemessen.
3.4.6 Kalkulation der kinetischen Kenngrößen der Ca
2+-Aufnahme
Die Ca2+-Aufnahmeraten in Abhängigkeit von [Ca2+]f wurden mit Hilfe eines Algorithmus des Programmpakets „GraphPad Prism“ (ISI, Philadelphia, USA) ermittelt. Dabei wurde folgende Formel zu Grunde gelegt:
Vmax. [Ca2+]f
Ca2+-Aufnahme = + U . [Ca2+]f
Km + [Ca2+]f
mit
Vmax = Maximum der sättigbaren Aufnahme [nmol.mg-1], Km = Michaelis-Menten-Konstante [mmol.l-1],
[Ca2+]f = Konzentration des freien Calciums [mmol.l-1], U = nicht sättigbarer Anteil der Ca2+-Aufnahme.
Dies ermöglicht die Kalkulation von Vmax und Km im Sinne einer typischen Michaelis-Menten-Kinetik.
3.4.7 Ermittlung des Vesikelvolumens
Aus der Glucoseaufnahme zum Equilibriumszeitpunkt nach 180 min Inkubation wurde das Vesikelvolumen berechnet. Das Vesikelvolumen wird in µl.mg-1 Protein angegeben und errechnet sich durch Anwendung folgender Formeln:
VA cpmp - cpmL
VV = ; VA = . AV ; P = Pr . AV
P cpmT
mit
VV = Vesikelvolumen [µl.mg-1], VA = Vesikelvolumen im Ansatz [µl],
cpmp = gezählte Zerfälle pro Minute in der Probe beim Ausgleichswert [cpm], cpmL = gezählte Zerfälle pro Minute im Leerwert [cpm],
cpmT = gezählte Zerfälle pro Minute im Gesamtansatz je Probe [cpm], P = Proteinmenge im Ansatz [mg],
Pr = Proteinkonzentration im Ansatz [mg.l-1], AV = Ansatzvolumen [ml].
3.5