Untersuchungen zur Funktion der Ca 2+ -Kanäle

Die BSMV wurden in Anlehnung an eine für Absetzferkel etablierte Methode von Enterozyten des Duodenums mittels Mg²⁺-Präzipitation und Differentialzentrifugation hergestellt (KAUNE et al. 1992, SCHRÖDER et al. 1998c). In zahlreichen Arbeiten wurde schon zuvor der Ca²⁺-Transport in BSMV sowohl bei Schweinen (KASSIANOFF 1989, KAUNE 1992, SCHRÖDER et al. 1998a, DAHL 1999) als auch bei anderen Spezies untersucht (RASMUSSEN et al. 1979, WILSON u. LAWSON 1980, MILLER u. BRONNER 1981, SHULTZ et al. 1982, BIKLE et al. 1983, KREUTTER et al. 1984, SCHEDL u.

WILSON 1985, LIANG et al. 1986, GHISHAN et al. 1989, WILSON et al. 1989). Generell hat sich dabei ergeben, dass die BSMV eine große Oberfläche für den Stoff- und Flüssigkeitstransport bieten und dass sie eine für die Versuchsdauer ausreichende mechanische Stabilität aufweisen. Durch die Isolierung der Bürstensaummembranen unter weitgehendem Ausschluss bzw. Abreicherung anderer Zellkomponenten können die

Vorgänge an der apikalen Zellmembran solitär betrachtet und beschrieben werden. Durch die Trennung zwischen intra- und extravesikulärem Kompartiment können die Transportbedingungen variiert und die Wirkungen verschiedener Substanzen auf den betrachteten Transportvorgang untersucht werden. Dazu müssen in den Präparationsschritten die Bürstensaummembranen gegenüber anderen Membranfragmenten wie z. B. denen der basolateralen Zellseite ausreichend angereichert werden.

Die Anreicherung der Bürstensaummembranen als Qualitätsmerkmal der BSMV-Präparation lässt sich mit Hilfe von membrantypischen Leitenzymen bestimmen, die in dem Ausgangshomogenat und der Vesikelsuspension bestimmt und miteinander verglichen werden (MIRCHEFF u. WRIGHT 1976). Als Leitenzym für die Bürstensaummembranen wurde die Aktivität der alkalischen Phosphatase gemessen, die im Mittel um das 12fache angereichert werden konnte, wobei kein Unterschied zwischen den unterschiedlich alten Ferkeln auftrat.

Ähnliche Anreicherungen wurden auch in anderen Arbeiten über den Schweinedarm ermittelt (KELJO et al. 1985, BRANDIS et al. 1987, KASSINOFF 1989, KAUNE et al. 1992, HATTENHAUER 1998, DAHL 1999). Auch für weitere Spezies wurden Werte in dieser Größenordnung angegeben (Hühner: BIKLE et al. 1983, Kaninchen: DANISI et al 1984, AHEARN u. MURER 1984, Schaf: SHIRAZI-BEECHEY et al. 1991, Ziege: RÜBELT 1995). Als Leitenzym für die basolateralen Membranen wurde die Aktivität der Na⁺/K⁺ -ATPase bestimmt. Diese war im Mittel nur um das 3fache angereichert und lag somit in einem Bereich, wie er bei anderen Spezies gefunden wurde (MILLER u. BRONNER 1981, AHEARN u. MURER 1984, KELJO et al. 1985, SCHEDL u. WILSON 1985, KASSIANOFF 1989, KAUNE 1992, RÜBELT 1995, HATTENHAUER 1998). Eine gewisse Kontamination der apikalen Vesikelsuspension mit basolateralen Membranen ist bei der Präzipitation mit divalenten Kationen (Ca²⁺ oder Mg²⁺) und Differentialzentrifugation nicht zu vermeiden (MURER et al. 1989), aber entscheidend ist die deutlich höhere Anreicherung der Bürstensaummembranen gegenüber den basolateralen Membranen.

Mit Hilfe der zeitabhängigen Glucose-Aufnahme in Anwesenheit eines einwärts gerichteten Na⁺-Gradienten wurde wie von HOPFER et al. (1973, 1976) vorgeschlagen die funktionelle Integrität der BSMV bestimmt. Durch die Triebkraft des Na⁺-Gradienten wird initial mehr Glucose in die Vesikel aufgenommen als bei einem Konzentrationsausgleich zwischen extra- und intravesikulärem Kompartiment zu erwarten wäre (Abbildung 6). Diese übermäßige

Aufnahme wird als „Overshoot“ bezeichnet, dessen Maximalwert unter den gewählten Versuchsbedingungen bei den Saugferkeln nach 2 min und bei den Absetzferkeln nach 3 min erreicht war. Zu diesem Zeitpunkt war die Glucose-Aufnahme in Gegenwart des Na⁺ -Gradienten 10-mal höher als ohne Na⁺-Gradient. Der Maximalwert ist u. a. abhängig von der Inkubationstemperatur, der Lokalisation der zur Präparation genutzten Dünndarmabschnitte und dem Alter des jeweiligen Versuchstieres (BUDDINGTON u. MALO 1996). Das

„Overshoot“-Phänomen kann ausschließlich bei einem geschlossenen Kompartiment beobachtet werden. In Abwesenheit von Na⁺ gelangt die Glucose entlang ihres chemischen Gradienten per Diffusion in die Vesikel und erreicht den Maximalwert unter den vorliegenden Bedingungen nach 120 min, wenn die extra- und intravesikuläre Glucosekonzentration im Equilibrium vorliegt. Auch in Anwesenheit des Na⁺-Gradienten erfolgt während der 120-minütigen Inkubation ein Konzentrationsausgleich (Abbildung 6). Der Ausgleichswert wurde zur Bestimmung der Vesikelvolumina herangezogen, die altersunabhängig bei ca. 1 µl^.mg^-1 Protein lagen und damit eine ähnliche Größenordnung aufwiesen wie in anderen Untersuchungen mit Enterozyten beschrieben (BERNER et al. 1976, BOROWITZ u.

GHISHAN 1985, RÜBELT 1995, WALTER 1999, HATTENHAUER 1998).

Die Untersuchung der zeitabhängigen Ca²⁺-Aufnahme in An- und Abwesenheit des Ca²⁺ -Ionophors A23187 stellt prinzipiell eine weitere Möglichkeit dar, die Vesikelintegrität zu überprüfen. Werden intakte BSMV mit dem Ionophor vermischt, so werden sie permeabel für Ca²⁺ und füllen sich ungehindert. Dies führt zu einer „Ad hoc-Aufnahme“ von Ca²⁺ in die BSMV, was sich graphisch durch einen steileren Kurvenverlauf als bei der erleichterten Diffusion durch die Bürstensaummembran darstellt (Abbildung 7). Um die Integrität der Vesikel zu beurteilen, wurden regelmäßig die Ca²⁺-Aufnahmewerte nach 30 s in An- und Abwesenheit des Ca²⁺-Ionophors verglichen. Dabei ergab sich eine um das 3,3 bis 6,3fache initial höhere Ca²⁺-Aufnahme, was nur bei einem geschlossenen Kompartiment auftritt.

Erneut ergaben sich keine nennenswerten Unterschiede zwischen den Altersgruppen. Dieser Befund deckt sich mit den Schätzungen der Vesikelvolumina aus den Glucose-Ausgleichswerten, die ebenfalls keinen Alterseffekt aufwiesen (Abbildung 8).

Insgesamt ist also davon auszugehen, dass für alle Tiergruppen ausreichend angereicherte BSMV-Suspensionen mit adäquater funktioneller Integrität zur Bestimmung der kinetischen

Bei der Beurteilung der Ca²⁺-Aufnahmeraten in BSMV ist des Weiteren zu beachten, dass mittels der Schnellfiltrationsmethode zunächst der Gesamttransport ermittelt wird, der sich seinerseits aus einer sättigbaren und einer nicht sättigbaren Komponente zusammensetzt (SCHEDL u. WILSON 1985, GHISHAN et al. 1989, KAUNE 1992). Einen wichtigen Anteil an der unspezifischen Komponente des Ca²⁺-Transportes bildet die Proteinbindung von Ca²⁺, die sowohl an der Außen- als auch Innenseite der isolierten Bürstensaummembran erfolgen kann. Diese Proteinbindung wurde durch den Vergleich der aus Glucose- und Ca²⁺ -Aufnahmeversuchen berechneten Vesikelvolumina geschätzt und betrug bei MILLER u.

BRONNER (1981) 50%, bei KASSIANOFF (1989) 90 % und bei MERRIL et al. (1986) 100 %.

Die sättigbare Komponente kann im Gegensatz zur nicht sättigbaren Komponente mit dem aktiven Ca²⁺-Transport korreliert werden (SCHEDL u. WILSON 1985), und es lassen sich aus den Daten der Ca²⁺-Aufnahmeraten als Funktion von [Ca²⁺]f nach der Theorie von Michaelis-Menten die kinetischen Parameter Vmax und Km kalkulieren. Dabei muss beachtet werden, dass die „schnellen“ Ca²⁺-Aufnahmeraten innerhalb der ersten Minute für die Berechnung berücksichtigt werden, da später gemessene Werte für die gewählte Konzentration nicht mehr repräsentativ sind (GHIJSEN et al. 1987). Die apparenten Km -Werte für die Absetz- und Mastferkel lagen bei 1,1 mmol^.l^-1 und waren damit signifikant von den Km-Werten der Saugferkel verschieden, die bei 1,4 mmol^.l^-1 lagen. Ähnliche Km-Werte wurden für BSMV aus Hühnerenterozyten beschrieben (RASMUSSEN et al. 1979). Eine Überprüfung der kinetischen Daten in Scatchard-Plots zeigte eine lineare Beziehung und gab damit keinen Hinweis auf die Existenz von mehreren, sich deutlich unterscheidenden Transportsystemen. Es soll darauf hingewiesen werden, dass die hier kalkulierten Km-Werte je nach Ausmaß der Präsenz von ECaC1 oder ECaC2 bzw. Koexistenz beider Systeme in der Bürstensaummembran die Ca²⁺-Affinität entweder des einen oder anderen oder den Mittelwert beider Systeme darstellen können. Insofern können die unterschiedlichen Km -Werte als Hinweis auf die unterschiedliche Expression von ECaC1 und/oder ECaC2 bei Absetz-/Mastferkeln bzw. Saugferkeln gewertet werden. Jedoch sind die Km-Werte trotz der statistischen Unterschiede aus transporterphysiologischer Sicht so ähnlich, dass eine Unterscheidung der Ca²⁺-Kanäle anhand der Km-Werte nicht möglich ist. Hierfür müssen erfahrungsgemäß Unterschiede bei den Km-Werten von mindestens einer Zehnerpotenz

bestehen. Erst dann ist eine Unterscheidung unter Verwendung eines „Two-side-binding“-Modells (Annahme der Beteiligung von 2 unterschiedlichen Transportersystemen) rechnerisch sinnvoll und möglich. Im vorliegenden Fall wurde nach KAUNE et al. (1992) ein

„One-side-binding“-Modell zur Berechnung von Vmax und Km verwendet, dass den Gesamt-Vmax-Wert aller potenziellen Ca²⁺-Transportsysteme angibt und für den altersabhängigen Gruppenvergleich verwendet werden konnte.

Im Gegensatz zu den hier dargestellten Werten haben KAUNE et al. (1992) eine apparente Km für das Absetzferkel von 0,03 mmol^.l^-1 ermittelt. Diese Abweichung kann am Besten dadurch erklärt werden, dass bei den Untersuchungen von Kaune die Km-Werte in Anwesenheit eines vesikelauswärts gerichteten Kalium-Gradienten ermittelt wurden, was zu einer transmembranalen Potentialdifferenz (Vesikelinneres negativ) führte. Inzwischen ist gesichert, dass intestinale Ca²⁺-Kanäle spannungssensitiv sind (HOENDEROP et al. 1999b), und es ist damit davon auszugehen, dass die von KAUNE et al. vorgelegte Kalium-Spannungsklemme einen signifikanten Einfluss auf die Kinetik des Ca²⁺-Transportes hatte. Es soll an dieser Stelle darauf hingewiesen werden, dass in zukünftigen Experimenten zur Charakterisierung des Ca²⁺-Transportes über die duodenale Bürstensaummembran bei der Auswahl der Versuchsbedingungen eine Vereinheitlichung der membranalen Spannungsverhältnisse notwendig erscheint.

Für die beiden bisher bekannten Ca²⁺-Kanäle sind die Km-Werte mit ECaC-exprimierenden Oozyten von Xenopus laevis bestimmt worden. Sie variierten beim ECaC1 von 0,2 mmol^.l^-1 (HOENDEROP et al. 1999a) bis 0,66 mmol^.l^-1 (PENG et al. 2000b) und beim ECaC2 von 0,25 mmol^.l^-1 (PENG et al. 2000a) bis 0,44 mmol^.l^-1 (PENG et al. 1999), was in der Größenordnung zumindest teilweise eher den in dieser Arbeit gezeigten Km-Werten entspricht als den von KAUNE et al. beschriebenen.

Die Vmax-Werte für die Absetz- und Mastferkel lagen bei 1,89 und 2,12 nmol^.mg^-1 Protein und waren signifikant von dem Vmax-Wert der Saugferkel verschieden, der bei 3,64 nmol^.mg^-1 Protein lag, was als Hinweis auf eine erhöhte Anzahl von ECaC gewertet werden kann.

Unterstützt wird diese Annahme durch Befunde aus Versuchen mit duodenalen Epithelien in Ussing-Kammern, bei denen ein tendenziell erhöhter, transepithelialer Ca²⁺-Nettofluss beim Saugferkel gegenüber Absetzferkeln gezeigt werden konnte (SCHRÖDER et al. 1993,