Northern-Blot .1 Prinzip

Die mRNA wird in einem denaturierendem Agarosegel der Größe nach elektrophoretisch aufgetrennt. Durch Kapillarkräfte wird die RNA aus dem Gel auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Die spezifische RNA wird mit Hilfe einer radioaktiv markierten DNA-Sonde, die aus einem Stück komplementärer Basensequenz zur gesuchten RNA besteht, hybridisiert und anschließend auf einem Film sichtbar gemacht (modifizierte Methode von SOUTHERN 1975).

3.17.2 Größenfraktionierung der RNA in einem denaturierenden Agarosegel

Zur Auftrennung der mRNA nach dem Molekulargewicht wurden intramolekulare Basenpaarungen geschmolzen und die denaturierte RNA-Struktur durch Formaldehyd und Formamid fixiert. Zuvor musste die mRNA (Kap. 3.16) in H2O gelöst werden. Dazu wurde sie bei 13000 rpm (Zentrifuge, Kap. 3.16.2) und 4 °C 20 min lang zentrifugiert und der Überstand sorgfältig entfernt. Das entstandene Pellet wurde mit 500 µl Ethanol (70 % v/v) überschichtet und nach einer 3 min langen Zentrifugation bei 13000 rpm und 4 °C wurde der Überstand sorgfältig entfernt. Dieser Schritt wurde einmal wiederholt. Um das Ethanol zu entfernen, wurde die RNA in einer Vakuum-Zentrifuge (Kap. 3.16.2) in 2 min auf kleiner Stufe getrocknet. Danach wurde die pelletierte RNA zum Lösen in 800 µl H2O je Probe 15 min auf Eis inkubiert. Die gelöste RNA wurde in einem Photometer (Kap. 3.6.2) quantifiziert. Etwa 10 µg RNA wurden mit 10 µl Loading-Puffer (48 % Formamid, 17,5 % Formaldehyd (37%ig), 35 % Loading dye (RNA); v/v) versetzt, gemischt und 3 min bei 95 °C denaturiert. Anschließend wurde das Gemisch 3 min auf Eis inkubiert, um eine Renaturierung zu verhindern. Vor dem Auftragen der Proben auf das Gel wurden diese in der Zentrifuge angeschleudert.

Zur Anfertigung des Gels wurden 1 g Agarose mit 85 ml H2O zweimal in der Mikrowelle aufgekocht. Nachdem sich das Gel auf etwa 50 °C abgekühlt hatte, wurden diesem 10 ml sterilfiltrierter 10x MOPS-Puffer (0,2 mol^.l^-1 MOPS; 0,05 mol^.l^-1 EDTA-Natriumsalz; pH 5,5 bei RT) und 5,4 ml Formaldehydlösung (37 % v/v) zugesetzt und das Gel in einem Gelgießstand gegossen. Anschließend wurde ein Kamm in den Gelgießstand gehängt, so dass im Gel Taschen von etwa 25 µl Fassungsvermögen entstanden. Nachdem das Gel erstarrt war, wurde es in die Elektrophorese-Kammer (Kap. 3.9.2) überführt und mit 1x MOPS-Puffer (10x MOPS-Puffer, 1 zu 10 verdünnt) bedeckt.

Neben den Proben wurde ein kommerziell erhältlicher RNA-Größenmarker mit auf das Gel aufgetragen. Die RNA wurde bei 40 V (Spannungsgeber, Kap. 3.9.2) über 4 Stunden größenfraktioniert. Anschließend wurde der Größenmarker abgeschnitten, 10 min in Ethidiumbromidlösung und 15 min in H2O geschwenkt und über einer ultravioletten Lampe (Kap. 3.9.2) betrachtet. Zur späteren Analyse wurde der Größenmarker zusammen mit der mm-Einteilung eines Lineals abgelichtet.

3.17.3 Übertragen der RNA auf eine Nitrocellulosemembran

Das Agarosegel (Kap. 3.17.2) wurde 15 min in H2O und 15 min in 20x SSC-Puffer (3 mol^.l^-1 NaCl, 0,3 mol^.l^-1 Natriumcitrat; pH 7,0 bei RT) geschwenkt, um es von dem MOPS-Puffer zu reinigen und bereits mit dem Transfer-Puffer vorzuinkubieren. Danach wurde der Anteil, welcher die mRNA-Proben enthielt, aus dem Gesamtgel herausgeschnitten.

Eine Glaswanne wurde mit 20x SSC-Puffer gefüllt und mit einer Glasplatte abgedeckt, so dass zwei gegenüberliegende Seiten der Wanne nicht durch sie bedeckt waren. Aus Whatman-Papier (Biometra, D-37079 Göttingen) wurde eine, zuvor in den Puffer eingeweichte, Brücke luftblasenfrei über die Glasplatte gelegt, wobei die Enden der Brücke in den 20x SSC-Puffer tauchten. Das Gel wurde mit den Taschenöffnungen nach unten ebenfalls luftblasenfrei auf die Whatman-Papierbrücke gelegt und die Ränder des Gels mit Parafilm (American National Can^TM, USA) abgedeckt, um zu verhindern, dass der Transfer-Puffer an dem Gel vorbei gelangen konnte. Auf das Gel wurde eine Nitrocellulosemembran (Hybond N⁺; Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden), welche zuvor auf die exakte Größe des Gels geschnitten worden und nach Anfeuchtung mit H2O 10 min in 20x SSC-Puffer inkubiert

worden war, gelegt. Diese wurde wiederum mit 3 Lagen exakt geschnittenem Whatman-Papier, das in 20x SSC-Puffer vorgeweicht worden war, abgedeckt. Auf das Whatman-Papier wurde ein mindestens 8 cm hoher Turm aus Saugpapier (Handy Einzeltücher; Migros-Genossenschaftsbund, CH-8031 Zürich) gelegt, der mit einem Gewicht von etwa 300 g beschwert wurde. In 12 Stunden wurde die negativ geladene RNA durch Kapillarkräfte auf die positiv geladene Nitrocellulosemembran transferiert und dort kovalent gebunden. Auf der Membran wurde die Höhe der Taschen im Gel markiert, um den Startpunkt der Elektrophorese auch auf der Membran nachvollziehen zu können. Daraufhin wurde sie 10 min in 2x SSC-Puffer inkubiert. Die im Anschluß luftgetrocknete Membran wurde zwischen 2 Whatman-Papierstücke gelegt und unter Vakuum (Slab Gel Dryer SGD 2000;

Savant Instruments Inc., Holbrook, New York) 2 Stunden lang bei 80 °C getrocknet. Die Nitrocellulosemembran wurde bis zum weiteren Gebrauch bei –20 °C gelagert.

Abbildung 5: Schematische Darstellung des Kapillar-Blot-Verfahrens

Nitrocellulosemembran

Whatman-Papierbrücke Glasplatte

3x Whatman-Papier Agarosegel 20x SSC

3.17.4 Erstellung von spezifischen, radioaktiv markierten Sonden

Die radioaktiv markierten Sonden wurden nach der „Random priming“-Methode (FEINBERG u. VOGELSTEIN 1984) unter Verwendung des „Rediprime II“-Kits (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden), eines kommerziell erhältlichen Systems, hergestellt. Hierfür wurden 5 µl des PCR-Produktes der Primer, die auch für die Real-Time-PCR (Kap. 3.18) verwendet wurden, mit TE-Puffer (10 mmol^.l^-1 Tris/HCl, 1 mmol^.l^-1 EDTA, pH 8,0) auf 40 µl aufgefüllt und 5 min bei 95 °C im Wasserbad denaturiert.

Um den denaturierten Zustand der DNA zu erhalten, wurde sie anschließend sofort 5 min lang auf Eis inkubiert. Diese 40 µl wurden kurz angeschleudert (Zentrifuge, Kap. 3.6.2), zusammen mit 50 µCi (2,05 x 10⁶ Bq) α³²P-dCTP in das „Rediprime“-Reaktionsgefäß gegeben und mit TE-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 50 µl aufgefüllt. In dem Reaktionsgefäß befand sich das sogenannte Klenow-Fragment, das große Fragment der DNA-Polymerase I aus Escherichia coli. Dieses Enzym synthetisiert, nach Anlagerung von Random-Primern, unter gleichzeitigem Einbau von α³²P-dCTP den komplementären DNA-Strang. Dem Klenow-Fragment fehlt die 5`Æ3`-Exonukleaseaktivität. Dadurch ist es nicht in der Lage, das 5`-Ende der an die Matrizen-DNA gebundenen Primer zu entfernen. Da mehrere Primer an einen Strang binden, wodurch Teilsequenzen erstellt werden, entsteht ein Gemisch aus unterschiedlich langen komplementären DNA-Stücken. Das Gemisch in dem

„Rediprime“-Reaktionsgefäß wurde durch 12-maliges auf- und abpipettieren gemischt und 1 Stunde bei 37 °C im Thermomixer (Kap. 3.7.2) inkubiert. Die Reaktion wurde mit 5 µl EDTA-Lösung (0,2 mol^.l^-1) gestoppt. Zur Kontrolle der Einbaurate wurden 1 µl der Sonde mit 49 µl H2O versetzt. Fünf µl der verdünnten Sonde wurden mit 2,5 µl „Herring Sperm“ DNA (10 mg^.ml^-1), 22,5 µl H2O und 1 ml eisgekühlter Trichloressigsäure (10 % w/v) versetzt und 10 min auf Eis inkubiert, um die DNA zu fällen. Diese Probe wurde auf einen Glasfaserfilter (APFCO2500, Millipore, Irland) gegeben und zunächst 10-mal mit je 1 ml Trichloressigsäure und anschließend 10-mal mit je 1 ml Ethanol (100%ig) gewaschen. Der Filter wurde luftgetrocknet, in einem Glasszintillationsgefäß mit 12 ml Szintillationsflüssigkeit versetzt und nach sorgfältigem Schütteln im Szintillationsmessgerät (Kap. 3.4) gemessen. Die Zähldauer betrug stets 10 min. Der statistische Zählfehler betrug 2-3 %.

3.17.5 Hybridisierung der RNA mit den spezifischen, radioaktiv markierten Sonden

Um alle unspezifischen Bindungsstellen der Nitrocellulosemembran (Kap. 3.17.3) zu besetzen, wurde diese mit 200 µl „Herring Sperm“ DNA (10 mg^.ml^-1) im Prähybridisierungs-puffer (5x Denhardt`s-Reagenz, 0,1 % w/v SDS, 5x SSC, 40 % v/v Formamid) versetzt und 7 Stunden bei 42 °C im Hybridisierofen (Rolleninkubator 4020; Gesellschaft für Labortechnik mbH, D-30938 Burgwedel) prähybridisiert. Dazu wurde die „Herring Sperm“

DNA zuerst bei 95 °C 3 min lang denaturiert, dann 3 min auf Eis inkubiert und anschließend zusammen mit 15 ml Prähybridisierungspuffer auf die Membran in die Prähybridisierröhren gegeben. Die Membran wurde zuvor in der Waschlösung I (2x SSC, 0,1 % w/v SDS) vorgeweicht und mit der RNA-behafteten Seite zum Lumen der Prähybridisierröhre zeigend, luftblasenfrei an die Wand der Röhre angelegt.

Nach der Prähybridisierung wurden 5 ml Prähybridisierungspuffer mit „Herring Sperm“ DNA aus der Röhre entfernt und eine spezifische, radioaktiv markierte Sonde (Kap. 3.17.4) in den verbliebenen Puffer gegeben. Die Sonde wurde zuvor bei 95 °C 3 min lang denaturiert, 3 min auf Eis inkubiert und anschließend kurz angeschleudert (Zentrifuge: Kap. 3.6.2). Die Nitrocellulosemembran wurde 16 Stunden bei 42 °C hybridisiert.

Nach der Hybridisierung mussten eventuell unspezifisch gebundene Sondenanteile, nicht gebundene Sondenanteile und freie radioaktive Nukleotide entfernt werden. Dies wurde durch wiederholte Waschschritte mit abnehmender Salzkonzentration und zunehmender Temperatur durchgeführt, wobei sich die Stringenz in jedem Waschvorgang erhöhte. Die Stringenz kann auch über die Waschdauer beeinflusst werden. Durch eine höhere Spezifität können über einen größeren Bereich mehr Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären Basenpaaren ausgebildet werden, wodurch eine höhere Stringenz beim Waschvorgang gewählt werden kann, was zu einer höheren Spezifität und geringerem Hintergrund des resultierenden Signals führt (LOTTSPEICH und ZORBAS 1998).

Der erste Waschschritt wurde nach Abgießen der Sonde bei RT durchgeführt. Die Membran wurde im Hybridisierofen 10 min lang mit je 15 ml Waschpuffer 1 gewaschen, wobei der Puffer zweimal gewechselt wurde.

Der zweite Waschschritt wurde bei 37 °C mit dem Waschpuffer 2 (0,5x SSC, 0,1 % w/v SDS) im Hybridisierofen für eine Dauer von 10 min mit je 15 ml Puffer durchgeführt, wobei der Puffer zweimal gewechselt wurde.

Der dritte Waschschritt erfolgte analog der ersten beiden Waschschritte, jedoch mit dem Waschpuffer 3 (0,2x SSC, 0,1 % w/v SDS) bei 42 °C.

Nach diesen Waschschritten wurde die Membran zum Trocknen auf ein Whatman-Papier (Kap. 3.17.3) gelegt und in eine „Saran Wrap“ Folie eingeschlagen.

3.17.6 Darstellung der RNA

Mit Hilfe eines Phosphor-Imagers (Personal molecular imager FX, Bio-Rad Laboratories GmbH, D-80939 München) wurden die Banden auf der Nitrocellulosemembran (Kap. 3.17.5) detektiert. Dafür wurde ein mit BaFBr:Eu-Kristallen beschichteter „Film“ (Imaging Screen K 20x25 cm; Bio-Rad Laboratories GmbH, D-80939 München) auf die Membran in einer Photofilmkassette (Exposure Cassette-K, 20x25 cm; Bio-Rad Laboratories GmbH, D-80939 München) gelegt und 4 Stunden exponiert. In dieser Zeit strahlte die radioaktiv markierte Sonde ionisierende Energie ab und überführte die BaFBr:Eu-Kristalle in einen stabilen, angeregten Zustand (Eu Æ Eu²⁺). Der Screen wurde anschließend in den Phosphor-Imager verbracht, wo er von einem Laser mit einer Wellenlänge von 635 nm abgetastet wurde. Durch das Abtasten wurden die Kristalle weiter angeregt und somit in einen instabilen Zustand (Eu²⁺Æ Eu³⁺) überführt. Die Elektronen fallen in ihren Grundzustand zurück (Eu³⁺Æ Eu) und geben dabei Energie in Form von Photonen ab, die im Phosphor-Imager gemessen wird (MUELHARDT 2002).

3.17.7 Auswertung der Northern-Blots

Die Auswertung der Daten aus Kap. 3.17.6 erfolgte mit der Quantifizierungs-Software

„Quantity One“ für Windows (Bio-Rad-Laboratories GmbH, D-80939 München). Diese Software stellt die Energie, die von den BaFBr:Eu-Kristallen freigesetzt wurde, graphisch dar.

So entstehen Banden auf den RNA-Spuren, die spezifisch für die gewählte Sonde

(Kap. 3.17.4) sind. Jede dieser Banden wurde vermessen, wobei sowohl Fläche als auch die Pixeldichte (Intensität) berücksichtigt wurden. Da diese Quantifizierung der RNA abhängig von der aufgetragenen RNA-Menge ist, wurde ein interner Standard gewählt, um die Werte zu relativieren und vergleichbar zu machen. Dies führt zu einer semiquantitativen Bestimmung der spezifischen mRNA-Menge. Als interner Standard wurde das in jeder Körperzelle vorkommende β-Aktin gewählt. Jeder Blot wurde mit einer spezifischen Sonde für das β-Aktin hybridisiert und die RNA-Menge des β-Aktins ermittelt. Bei verschiedenen Tieren kann so der Quotient aus der Menge an gesuchter RNA und der Menge an β-Aktin-RNA verglichen werden.

3.18 Real-Time-PCR