Tierärztliche Hochschule Hannover
Charakterisierung der Palmitoyltransferase hZDHHC3 in Caco-2 Zellen
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Susanne Berger-Sohns
Jena
Hannover 2014
Wissenschaftliche Betreuung: 1. Prof. Dr. Hassan Y. Naim Institut für Physiologische Chemie Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachter: - Prof. Dr. Hassan Y. Naim
2. Gutachter: - Prof. Dr. med. vet. Andreas Beineke
Tag der mündlichen Prüfung: 15.05.2014
Meinen Eltern
Abkürzungsverzeichnis
A. bidest lat.: Aqua bidestillata APS Ammoniumperoxodisulfat ATP Adenosintriphosphat
BBM Bürstensaummembran (engl.: brush border membrane)
bp Basenpaar
°C Grad Celsius
cDNA komplementäre DNA (engl.: complementary DNA) CHO engl.: chinese hamster ovary (Zellen)
COS CV-origin, SV40 Zellline 1
d Tag(e)
DNA Desoxyribonukleinsäure (engl.: deoxyribonucleic acid) dNTP 2´-Desoxy-Nukleosid-5´-Triphosphat
DPP IV Dipeptidyl Peptidase IV DTT Dithiothreitol
eCFP (verbessertes) cyan fluoreszierendes Protein (engl.: enhanced cyan fluorescent protein) E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiaminteraessigsäure ER Endoplasmatisches Retikulum ERGIC ER-Golgi intermediate compartment
eYFP (verbessertes) gelb fluoreszierendes Protein (engl.: enhanced yellow fluorescent protein) FKS Fetales Kälberserum
G Gauge
g Gramm
g G-Zahl, Erdbeschleunigungskonstante
GFP grün fluoreszierendes Protein (engl.: green fluorescent protein)
H Homogenat
h lat.: hora, Stunde(n)
Hsp90 Hitzeschockprotein 90 (engl.: Heat shock protein 90) iPAT intestinale Palmitoyltransferase
K Kontrolle
kb Kilobasen (103 Basen) kDa Kilo Dalton (103 Dalton)
l Liter
LB-Medium Luria Bertani-Medium
M Marker
mA Milli-Ampere mg Milligramm (10-3 g) µl Mikroliter (10-6 Liter) min Minute(n)
ml Milliliter (10-3 Liter)
mm Millimeter (10-3 m) mmol Millimol (10-3 Mol)
Mol Stoffmenge (Einheit: mol)
n Anzahl der Merkmalsausprägung bzw. der Versuche NADP(H) Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat
ng Nanogramm (10-9 g) nm Nanometer (10-9 m)
P1 Pellet 1
P2 Pellet 2
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PAS Protein-A-Sepharose
PBS Phosphatpuffer (engl.: phosphate buffered saline)
PCR Polymerasekettenreaktion (engl.: polymerase chain reaction) PFA Paraformaldehyd
P-gp P-Glykoprotein PI Proteinaseinhibitoren
PLKC Protocatherin of the liver, kidney and colon pmol Picomol (10-12 Mol)
PSMA Prostata spezifisches Membran Antigen PVDF Polyvinyliden-Difluorid
RNA Ribonukleinsäure (RNS) (engl.: ribonucleic acid)
RNase Ribonuklease
rpm Drehzahl (engl.: revolutions per minute)
RT Raumtemperatur
RT-PCR Reverse Transkriptase-PCR
s Sekunde(n)
S1 Überstand 1(engl.: supernatant 1) S2 Überstand 2 (engl.: supernatant 2) SAP Shrimp Alkaline Phosphatase SDS Natrium (sodium)-dodecylsulfat SI Saccharase-Isomaltase
siiPAT7 iPAT Knock-Down Zelllinie 7 (generiert im Rahmen dieser Arbeit) siiPATB1 iPAT Knock-Down Zelllinie B1 (hergestellt von Arndt Rohwedder) siRNA small interfering RNA
TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethan-1,2-diamin
T-PBS Phosphatpuffer (engl.: phosphate buffered saline), mit 0,05 % Tween 20 versetzt
Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
U (Unit) Enzymaktivität (µmol Substrat/min)
V Volt
WT Wildtyp
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Anatomie des Darmepithels ... 3
Abbildung 2: Proteinbiosynthese ... 6
Abbildung 3: Verankerung von Plasmaproteinen in der Lipiddoppelschicht ... 8
Abbildung 4: Topologie von Akr1 ... 10
Abbildung 5: hZDHHC3 (Schema) ... 12
Abbildung 6: Integrale Membranproteine ... 17
Abbildung 7: Saccharase-Isomaltase (Schema) ... 18
Abbildung 8: P-Glykoprotein (Schema) ... 21
Abbildung 9: Model für die translationale Repression mittels miRNA und RNAi, beides vermittelt durch einen RNA-induzierten Interferenz Komplex (RISC). ... 24
Abbildung 10: Mikrodomänen (Rafts) in der Plasmamembran ... 27
Abbildung 11: Kontrolle der iPAT PCR aus Caco-2 RNA ... 63
Abbildung 12: Quantitative Bestimmung der DNA Mengen für den Ligationsansatz 64 Abbildung 13: Kontrolle der klonierten Konstrukte ... 65
Abbildung 14: Plasmidkarten der Konstrukte ... 66
Abbildung 15: Lokalisation von YFP-iPAT in COS-1 und CHO Zellen ... 68
Abbildung 16: Lokalisation von iPAT-Flag10 und Flag-iPAT5 in COS-1 Zellen ... 69
Abbildung 17: Radiolabeling Experiment ... 71
Abbildung 18: Kolokalisation von iPAT und SI in COS-1 Zellen ... 72
Abbildung 19: Kolokalisation von iPAT und PSMA in COS-1 Zellen ... 73
Abbildung 20: PstI Kontrollverdau der Hairpin-Klone ... 74
Abbildung 21: RT-PCR der siiPAT Klone und quantitative Auswertung der Banden 76 Abbildung 22: Auswertung der Western Blots hinsichtlich der Expression von SI(A.), DPP IV (B.) und P-gp (C.)... 78
Abbildung 23: Enzymaktivitätsbestimmung der Saccharase-Isomaltase ... 80
Abbildung 24: Western Blots der Lipid Raft Isolierungen ... 83
Abbildung 25: Quantifizierung der Saccharose Gradienten ... 84
Abbildung 26: Kotransfektion iPAT-Flag + 13 AS und YFP-PSMA in COS-1 Zellen; Plasmidkarte von iPAT-Flag + 13 AS ... 90
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Übersicht bisher identifizierter DHHC-Substrat Interaktionen ... 15 Tabelle 2: Zusammenfassung der verschiedenen DRMs ... 28
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis ... vi
Abbildungsverzeichnis ... x
Tabellenverzeichnis ... xi
Inhaltsverzeichnis ... xii
1 Einleitung ... 1
1.1 Anatomie des Dünndarms und die Bedeutung der Verdauungsenzyme ... 2
1.2 Proteinbiosynthese ... 5
1.3 Proteinmodifikationen ... 7
1.4 Die Gruppe der Palmitoyltransferasen (PATs) ... 10
1.5 hZDHHC3 – iPAT (GODZ-Golgi-spezifisches Zink Finger Protein) ... 12
1.6 Membranproteine ... 16
1.6.1 Humane Saccharase-Isomaltase (hSI) ... 18
1.6.2 Humane Dipeptidyl Peptidase IV (hDPP IV) ... 20
1.6.3 P-Glykoprotein ABCB I (P-gp)... 21
1.7 siRNA – small interfering RNA ... 23
1.8 Lipid Rafts ... 25
1.9 Zielsetzung der Arbeit ... 29
2 Material ... 30
2.1 Chemikalien und Reagenzien ... 30
2.2 Medien ... 32
2.3 Puffer und Lösungen ... 32
2.4 Kits ... 35
2.5 Marker ... 35
2.6 Enzyme ... 35
2.7 Antikörper ... 37
2.7.1 Für Westernblot ... 37
2.7.2 Für Immunpräzipitation ... 38
2.7.3 Für Immunfluoreszenz ... 39
2.8 Vektoren/Plasmide ... 40
2.9 Primer/Oligonukleotide ... 40
2.10 Zellen ... 41
2.10.1 Caco-2 ... 41
2.10.2 CHO (chinese hamster ovary)... 42
2.10.3 COS-1 (CV-origin, SV40 Zellline 1) ... 42
2.11 Geräte ... 43
2.12 Sonstige Materialien ... 43
3 Methoden ... 44
3.1 Molekularbiologische Methoden ... 44
3.1.1 RNA Isolierung ... 44
3.1.2 RT-PCR ... 44
3.1.3 cDNA Synthese ... 44
3.1.4 PCR ... 45
3.1.5 Agarose-Gelelektrophorese ... 46
3.1.6 DNA-Isolierung aus Agarosegel ... 46
3.1.7 Ligation ... 47
3.1.8 Transformation ... 48
3.1.9 Mini Präparation von Plasmid-DNA aus E. coli ... 48
3.1.10 Midi Präparation von Plasmid-DNA aus E. coli ... 49
3.1.11 Restriktionsverdau ... 50
3.1.12 siRNA Herstellung ... 51
3.2 Zellkulturmethoden ... 51
3.2.1 Zellen trypsinieren ... 51
3.2.2 Lyse der Zellen ... 52
3.2.3 stabile Transfektion ... 52
3.2.4 transiente Transfektion ... 53
3.2.5 Konfokalmikroskopie ... 54
3.3 Proteinbiochemische Methoden ... 54
3.3.1 Immunfluoreszenzfärbung ... 54
3.3.2 Immunpräzipitation ... 55
3.3.3 Lipid Raft Isolierung - Saccharose Gradient ... 56
3.3.4 SDS-PAGE ... 57
3.3.5 Western Blot ... 59
3.3.6 Radioaktivlabeling ... 60
3.3.7 Isolierung der Bürstensaummembran ... 61
3.3.8 Enzymaktivitätsbestimmung der Saccharase-Isomaltase ... 62
3.3.9 Statistik ... 62
4 Ergebnisse ... 63
4.1 Generierung der iPAT Konstrukte ... 63
4.2 Untersuchungen zur Lokalisation der iPAT in COS-1 und CHO Zellen ... 67
4.3 Kompetenzkontrolle der Konstrukte mittels Radiolabeling ... 70
4.4 Kolokalisationsexperiment: iPAT und SI ... 72
4.5 Kolokalisationsexperiment: iPAT und PSMA ... 73
4.6 iPAT Knockdown - siRNA ... 74
4.7 Die Expression von SI, P-gp und DPP IV in siiPAT Caco Zellen ... 77
4.8 Enzymaktivitätsbestimmung der Saccharase-Isomaltase ... 80
4.9 Lipid Raft Assoziation von SI, DPP IV und P-gp in Caco-WT und siiPATB1 81 5 Diskussion ... 86
5.1 Die Größe und Lokalisation eines Tags sind irrelevant bei der Prozessierung und dem Trafficking von iPAT ... 88
5.2 Die iPAT ist ein Golgi-lokalisiertes Protein ... 89
5.3 Der Einfluss der iPAT auf Expression und Membranassoziation der SI ... 91
5.4 Der Einfluss der iPAT auf die Expression von DPP IV ... 93
5.5 Der Einfluss der iPAT auf die Expression von P-gp ... 95
5.6 Der Knockdown der iPAT führt zu Änderungen der Lipid Raft Assoziation von integralen Membranproteinen ... 96
5.7 DHHC Proteine sind essentiell für die Integrität intestinaler Zellen ... 98
5.8 Ausblick ... 101
6 Zusammenfassung... 102
7 Abstract ... 104
8 Literaturverzeichnis ... 106
9 Danksagung ... 119
10 Curriculum Vitae ... 120
1 Einleitung
2004 konnten Babu et al. erstmals mit Experimenten in S. cerevisiae zeigen, dass Palmitoyltransferasen (PATs) die Addition von Palmitat an Cysteinreste eines Proteins (Palmitoylierung) katalysieren. Diese Art der Modifikation ist für viele Proteine notwendig, um mit der Zellmembran assoziieren zu können. Darauf folgende Arbeiten befassten sich mit Untersuchungen in verschiedenen Säugetierzelllinien auf das Vorhandensein dieser Proteine. Schließlich wurden 23 PATs beschrieben (MITCHELL, et al. 2006) deren nähere Charakterisierung jedoch vorwiegend in neuronalen Zellen erfolgte (FUKATA, et al. 2004; NORITAKE, et al.
2009; GREAVES, et al. 2010). Unter Anderem konnte durch verschiedene DHHC Knockout Maus-Modelle gezeigt werden, dass die PATs eine wichtige und große Bedeutung für das Nervensystem sowie für dessen Entwicklung haben (MUKAI, et al. 2008; SALEEM, et al. 2010).
Untersuchungen in intestinalen Zellen gab es bislang nur von Arndt Rohwedder, der die ersten Ergebnisse zu hZDHHC3 (iPAT) 2009 in seiner Doktorarbeit veröffentlichte. Er zeigte, dass die iPAT ein wichtiger funktioneller Bestandteil für die Aufrechterhaltung der Integrität und der Funktionalität des Darmepithels ist. Die Untersuchung von hZDHHC3 in intestinalen Zellen ist jedoch nicht nur aus Aspekten der Grundlagenforschung heraus interessant. Denn das Intestinum hat neben seiner eigentlichen Funktion als Verdauungsorgan zudem eine herausragende Bedeutung für die Immunabwehr des Körpers. Zum Einen dient ein intaktes Darmepithel als natürliche, physikalische Barriere gegenüber verschiedenster pathogener Erreger, die mit der Nahrung aufgenommen werden. Und zum Anderen enthält das Intestinum Anhäufungen lymphatischer Zellen, sogenannte Folliculi lymphatici aggregati (Peyer Plaques) in der Mucosa. Diese sind als Teil des GALT (engl. gut associated lymphoid tissue) mit dem erworbenen Immunsystem assoziiert.
Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Experimente sollen vor Allem neue Erkenntnisse über die iPAT in vorhandenes Wissen einfügen. Ein größeres Grundlagenverständnis über die Relevanz der iPAT in intestinalen Zellen ist zudem für das Erfassen des Gesamtkonzepts des Intestinaltraktes von großem Interesse.
1.1 Anatomie des Dünndarms und die Bedeutung der Verdauungsenzyme Die funktionelle Integrität des Gastrointestinaltrakts ist für jeden Organismus unerlässlich. Über ihn ist der Körper in der Lage Nährstoffe aus der Nahrung herauszulösen, aufzuspalten und anschließend aufzunehmen. Unverdauliche Bestandteile der Nahrung und toxische Nebenprodukte werden ausgeschieden. Die Aufspaltung der Nährstoffe erfolgt im Dünndarm (lat. Intestiunum tenum), der bei den Vertebraten typischerweise in drei Abschnitte gegliedert ist. Das Duodenum ist eher kurz und produziert Flüssigkeit und Mucus. In das Duodenum entleeren sich die Galle aus der Leber, sowie die Pankreassekrete (die Proteasen, Lipasen und Carbohydrasen enthalten). Das sich anschließende Jejunum bildet ebenfalls Verdauungssekrete und dient zusätzlich der Nährstoffaufnahme. Das Ileum dient vorrangig der Absorption der verdauten Nährstoffe.
Der Dünndarm besteht aus einer äußeren, von Serosa umhüllten, glatten Längsmuskelschicht und einer inneren glatten Ringmuskelschicht, die von einer fasrigen Bindegewebsschicht, der Submucosa und einer Schleimschicht, der Mucosa umgeben ist. Die Mucosa bildet die sogenannten Kerckring-Falten, die in das Dünndarmlumen hineinragen und eine Vergrößerung der Darmoberfläche bewirken.
Die 1 mm hohen, fingerförmigen Villi, die auf den Mucosafalten sitzen, enthalten jeweils ein eigenes Netz aus Blut- und Lymphgefäßen über die die Nährstoffe aufgenommen und weiter transportiert werden. Zwischen den Villi finden sich Einstülpungen, die Lieberkühn-Krypten. Das Epithel der Villi besteht aus säulenförmigen Enterozyten und dazwischen eingebetteten schleimproduzierenden Becherzellen.
Jeder Enterozyt hat eine apikale Bürstensaummembran, die aus mehreren Tausend Mikrovilli pro mm2 besteht. Diese ausgestreckten Zellfortsätze enthalten Aktinfilamente, die Querverbindungen mit Myosinfilamenten an der Basis der Mikrovilli bilden. Diese Interaktion führt zu einer rhythmischen Bewegung der Mikrovilli, durch die der Nahrungsbrei nahe der absorbierenden Oberfläche durchmischt wird. Eine bis zu 0,3 µm dicke Schicht aus sauren Mucopolysacchariden
und Glykoproteinen, die Glykocalyx, überzieht die Mikrovilli. Der Aufbau des Darmepithels ist in Abbildung 1 dargestellt und zusammengefasst.
Abbildung 1: Anatomie des Darmepithels
Übersicht des Darm- und Mikrovilliaufbaus. Links: Darstellung des Darmaufbaus; zu sehen sind die äußere Längsmuskelschicht und die innere Ringmuskelschicht, die zu- und abführenden Blutgefäße, sowie die Falten und Krypten, welche zur Oberflächenvergrößerung dienen. Mitte: Vergrößerung der Villi; zu sehen sind die zu- und abführenden Blutgefäße, die Lymphgefäße, sowie das die Villi bedeckende Darmepithel.
Rechts: Vergrößerung eines Enterozyten mit apikalen Mikrovilli. (Copyright © 2004 Pearson Education, Inc. Publishing as Benjamin Cummings)
Ein intakter anatomischer Aufbau des Darmepithels ist für den Organismus ebenso essentiell wie intakte und funktionell aktive Verdauungsenzyme. Alle Verdauungsenzyme sind Hydrolasen. Diese Enzyme spalten ihre Substrate unter Wasserverbrauch. Große Nährstoffmoleküle werden dabei in niedermolekulare Bestandteile zerlegt, die anschließend über die Darmwand aufgenommen werden können. Die drei Hauptgruppen der Verdauungsenzyme stellen die Proteasen, die Carbohydrasen und die Lipasen dar.
Die fehlerfreie Synthese und auch der fehlerfreie Transport dieser Proteine zur Bürstensaummembran sind entscheidend für deren Funktionsausübung. Hereditäre und aber auch erworbene Störungen der Proteinsynthese und der -zielsteuerung führen zu Maldigestion. Zu diesen Störungen gehören u.a. die Laktoseintoleranz (auch als Hypolaktasie oder Alaktasie bezeichnet), die Fruktoseintoleranz und die seltene congenitale Saccharase-Isomaltase Defizienz (CSID). Die Symptome dieser Erkrankungen sind dementsprechend auf unverdaute, osmotisch wirksame Di- und Oligosacchariden zurückzuführen. Experimente in iPAT Knockdown Zellen zeigten, dass eine verminderte Palmitoylierung das Trafficking intestinaler Hydrolasen negativ beeinflusst und damit einen indirekten Effekt auf die Verdauung von Kohlenhydraten und Peptiden hat (ROHWEDDER 2009).
Es gibt allerdings auch chronische Erkrankungen des Darmtraktes, wie Morbus Crohn, deren Ursache noch nicht vollständig geklärt ist. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von iPAT Knockdown Zellen ergaben ein ähnlich verändertes Bild, wie man es von Morbus Crohn Zellen kennt (ROHWEDDER 2009). Ein Mangel an palmitoylierenden Proteinen kann bei der Entstehung dieser Erkrankung ebenfalls als Ursache zur Diskussion gestellt werden.
1.2 Proteinbiosynthese
Im Nukleus eukaryotischer Zellen wird DNA in RNA transkribiert und an zytosolischen Ribosomen anschließend anhand der Messenger RNA (mRNA) in eine Aminosäuresequenz translatiert.
Man unterscheidet zwischen zwei Transportwegen, dem zytoplasmatischen Weg und dem sekretorischen Weg. Die Translation der Proteine, die in den zytoplasmatischen Weg fließen, findet an freien Ribosomen statt und wird dort komplett beendet.
Proteine die keine Zielsequenz besitzen, werden ins Zytosol abgegeben und verbleiben dort. Proteine, die dagegen eine organellspezifische Signalsequenz besitzen, werden zuerst ins Zytosol abgegeben und anschließend zu ihrem Bestimmungsort transportiert (Nukleus, Mitochondrien, Peroxisomen oder Chloroplasten).
In Abbildung 2 (1-8) ist die Proteinsynthese übersichtlich zusammengefasst dargestellt. Die mRNA für Proteine, die in den sekretorischen Weg geleitet werden sollen, kodiert für eine N-terminale, ~ 20 Aminosäure (AS) lange, ER-Signalsequenz.
Diese wird zuerst synthetisiert und führt dazu, dass nach der anfänglichen Translation der mRNA an zytosolischen Ribosomen (1+2), diese Sequenz von einem Ribonukleoproteinpartikel (SRP = engl. Signal recognition particle) erkannt und gebunden wird (3). Nachdem das SRP auch GTP gebunden hat, wird bei ungefähr 70 AS die Translation blockiert. Ein mit GTP beladener SRP-Rezeptor auf der Oberfläche des Endoplasmatischen Retikulums bindet das GTP-SRP-beladene Ribosom zusammen mit dem unfertigen Protein (4). Der Rezeptor befindet sich in der Nähe eines spezifischen Ribosomenrezeptors, auch Translokon bezeichnet.
Dieser bildet vermutlich einen Kanal, durch den der bereits synthetisierte Bereich des Proteins gefädelt wird (4). Gleichzeitig löst sich das SRP und die GTP´s hydrolysieren vom SRP und vom SRP Rezeptor (5). Die Synthese des Proteins wird am ATP betriebenen Translokon beendet und das fertige Protein ins ER abgegeben.
Die Signalsequenz wird im Inneren des ER von einer Signalpeptidase abgetrennt und die Translation beendet (7). Abschließend dissoziiert das Ribosom und wird recycelt (8).
Lysosomale Proteine und Sekretproteine werden im Lumen des ER synthetisiert.
Transmembranproteine sind mit ihrer Transmembranhelix in der ER-Membran verankert. In den Membranen des ER erfolgt die weitere Prozessierung der Proteine, die anschließend via Vesikel zu ihrem Bestimmungsort transportiert werden. Der anterograde Transport von Proteinen vom ER zum Golgi erfolgt per COPII umhüllter Vesikel. Der retrograde Transport von Proteinen vom Golgi zum ER und auch deren Transport innerhalb des Golgi erfolgt mit COPI umhüllten Vesikeln.
Zu den Proteinen, die so synthetisiert werden gehören Membranproteine des ER, des Golgi Apparates, der Plasmamembran, von Sekretvesikeln oder von Lysosomen.
Abbildung 2: Proteinbiosynthese
Zielsteuerung eukaryotischer Proteine zum Endoplasmatischen Retikulum.
Beschreibung s. Text (aus Lehninger Principles of Biochemistry S. 1069 (DAVID L. NELSON 2005)).
1.3 Proteinmodifikationen
Während ihres Transports werden die meisten Proteine auf verschiedenste Weise modifiziert. Diese Modifikationen beeinflussen die Aktivität, die Lebensspanne sowie die zelluläre Lokalisation eines Proteins. Zu den Modifikationen gehört unter anderem die Addition einer chemischen Gruppe an die freie –NH2 oder –COOH Gruppe am Ende eines Proteins oder an eine reaktive Seitenkette eines internen Restes. Bei der Glykosylierung werden Kohlenhydratketten N- bzw. O-glykosidisch an die Aminosäuren Serin, Threonin oder Asparagin der Polypeptidketten geknüpft.
Weitere Modifikation sind die (am häufigsten vorkommende) Acetylierung (die Addition von CH3CO) des N-Terminus der Proteine, die Hydroxylierung von Prolin- und Lysinresten, sowie die Phosphorylierung von Serin-, Threonin- und Tyrosinresten. Durch die Anheftung von zusätzlichen Carboxylgruppen oder die Verknüpfung mit Koenzymen z.B. mit Biotin, können Proteine ebenfalls modifiziert werden. Zu den Modifikationen gehört auch die gezielte irreversible Proteolyse von Aminosäuren, Signalpeptiden oder Präkursorproteinen. Die der Anheftung von lipophilen Verbindungen an Proteine nennt man Lipidation. Dazu gehören: die Anheftung einer Farnesylgruppe an einen Cysteinylrest (Farnesylierung), die Anheftung von Myristyl-Resten, bei der eine Amidbindung zwischen der Fettsäure und der N-terminalen Aminogruppe entsteht (N-Myristinylierung), und die Anheftung eines Phosphatidylankers (s. Abbildung 3). Diese Modifikationen sind nicht reversibel.
Palmitoylierung nennt man die Lipidation, genauer gesagt die Acylierung, wenn Palmitinsäure via Thioesterbindung an einen (oder mehrere) Cysteinrest(e) eines Proteins angeheftet (S-Palmitoylierung) wird (SMOTRYS, et al. 2004). Dies kann entweder posttranslational oder zu einem späteren Zeitpunkt stattfinden.
Abbildung 3: Verankerung von Plasmaproteinen in der Lipiddoppelschicht
a.) Zytosolische Proteine wie v-Scr sind mit der Plasmamembran über eine einzelne Fettsäurekette am N-terminalen Glycinrest des Proteins verbunden. Häufige Acylanker sind Myristinsäure (C:14) und Palmitinsäure (C:16).
b.) Andere zytosolische Proteine wie Ras und Rab Proteine werden durch Prenylierung an ein oder zwei Cysteinresten am oder in der Nähe des C-Terminus gebunden. Die Anker sind entweder Farnesyl- (C:15) oder Geranylgruppen (C:20) (beide sind ungesättigt).
c.) Der Lipidanker auf der exoplasmatischen Seite ist Glykosylphosphatidylinositol (GPI) der Phosphatidylanteil (rot) besteht aus zwei Fettsäureketten, die in die Lipidschicht hineinragen. Der Phosphoetanolamineinheit (lila) verbindet diese mit dem Protein.
Die Sechsecke stellen Zuckereinheiten dar, die je nach GPI Anker in Anzahl und Anordnung variieren.
Aus Molecular Cell Biology S. 161 (LODISH 2003)
Die Funktionen der Palmitoylierung sind zahlreich. So dienen die Verknüpfungen mit Fettsäuren der Verankerung von Proteinen in die Zellmembran, sie spielen eine Rolle bei der Proteinsortierung und bei der Regulation von Protein-Protein Interaktionen,
bei der Proteinzielsteuerung und bei der Proteinstabilität (ROCKS, et al. 2010). Die Palmitoylierung kann auch spontan in der Zelle ablaufen (Autoacylierung) (DUNCAN, et al. 1996; DIETRICH, et al. 2004).
Palmitoyliert werden sowohl polytopische Transmembranproteine als auch periphere Proteine.
Dazu gehören: Kinasen der Src Familie (PAIGE, et al. 1993; SATO, et al. 2009), Neurotransmitter Rezeptoren (KELLER, et al. 2004; HAYASHI, et al. 2009), Ras Proteine (BUSS, et al. 1986; BAUMGART, et al. 2010; EISENBERG, et al. 2013), eNOS (ROBINSON, et al. 1995; FERNANDEZ-HERNANDO, et al. 2006), SNARE (engl.: soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor attachment receptor) (HESS, et al.
1992; VAN DEN BOGAART, et al. 2013), GPCR´s (G-Protein-gekoppelte Rezeptoren) (O'BRIEN, et al. 1984; ADAMS, et al. 2011) und die α Untereinheit GTP bindender Proteine (G-Proteine) (LINDER, et al. 1993; TSUTSUMI, et al. 2009).
Der Prozess der Palmitoylierung ist schon länger bekannt. Es gibt Belege für spontane Palmitoylierung. Dabei greift die stark nukleophile SH Gruppe des Cysteins die Thioesterbindung zwischen dem Palmitat und dem Koenzym A an. Diese nicht- enzymatische Autoacylierung konnte für SNAP-25 (VEIT 2000), die α Untereinheit des G-Proteins (DUNCAN, et al. 1996) und für die PATs selbst (YANG, et al. 2010) gezeigt werden. Dass bei der Palmitoylierung Enzyme, die Palmitoyltransferasen, eine Rolle spielen ist relativ neu (BABU, et al. 2004).
Eine Besonderheit ist die Reversibilität dieser Modifikation. Diese ergibt sich aus der labilen Thioesterbindung zwischen Palmitoylgruppe und Cystein. Das ermöglicht einen dynamischen Wechsel zwischen Palmitoylierung und Depalmitoylierung.
Unterstützt wird dies durch eine kurze Halbwertszeit der PATs (SCHWEIZER, et al.
1996; STOCKLI, et al. 2004) und dem Entfernen von Palmitat durch Acyl-Protein Thioesterasen (LINDER, et al. 2003; MITCHELL, et al. 2006; GREAVES, et al.
2011a).
1.4 Die Gruppe der Palmitoyltransferasen (PATs)
Es sind 23 DHHC Proteine im Menschen bekannt, die von 23 ZDHHC Genen kodiert werden (ZDHHC1-ZDHHC24) (MITCHELL, et al. 2006). PATs sind polytopische Membranproteine, die ihre Funktion an der Cytosol-Membran Grenze ausüben. Sie haben die Fähigkeit Palmitoylgruppen an Cystein Reste von Membranproteinen per Thioester-Bindung zu knüpfen. Alle PATs haben ein gemeinsames, konserviertes Sequenz Motiv, nach dem sie auch benannt werden: DHHC - Aspartat-Histidin- Histidin-Cystein (PUTILINA, et al. 1999).
Diese cysteinreiche Domäne bildet das katalytische Zentrum der Enzyme und ist damit direkt an die Transferreaktion des Palmitats beteiligt (MITCHELL, et al. 2006).
Mutationen in diesem Bereich verhindern die enzymatische Aktivität dieser Enzyme (ROTH, et al. 2002; YANG, et al. 2010).
Die angenommene Membrantopologie zeichnet ein Bild wie es in Abbildung 4 zu sehen ist: DHHC Proteine haben 4-6 Transmembrandomänen. Die DHHC Domäne und die N- und C- terminalen Regionen befinden sich auf der zytosolischen Seite der Membran.
Abbildung 4: Topologie von Akr1
6 Transmembrandomänen (TMD´s), die DHHC Domäne (rot) befindet sich auf der zytosolischen Seite (POLITIS, et al. 2005; GREAVES, et al. 2011b).
Untersuchungen in HEK293T Zellen ergaben, dass der Großteil der DHHC Proteine im ER und im Golgi lokalisiert ist (OHNO, et al. 2006). Die Palmitoyltransferase DHHC2 ist eine der Ausnahmen. Bemerkenswerterweise lokalisiert DHHC2 (und andere PATs auch) nicht in jeder Zelle gleichsam. So lokalisiert DHHC2 im Golgi (OHNO, et al. 2006), in neuroendokrinen PC12 Zellen in der Plasmamembran (GREAVES, et al. 2010) und ist in kultivierten Hippocampuszellen mit mobilen dendritischen Vesikeln assoziiert (NORITAKE, et al. 2009). Ein umfassendes Bild über die Lokalisation sämtlicher DHHC Proteine gibt es bisher nicht.
Neuere Forschungen beschäftigen sich mit der Frage der Substratspezifität der PATs. Erste Hinweise auf eine Substratselektivität fanden Roth et. al (2006) in S. cerevisiae. Die Ergebnisse aus Koexpressionsstudien über DHHC-Substrat Interaktionen aus Säugetieren lassen annehmen, dass manche PATs sehr substratspezifisch sind, während andere PATs mehrere Substrate umsetzen. So ist bekannt, dass ZDHHC3 und ZDHHC7 spezifisch Proteine wie SNAP-25 und PSD-95 palmitoylieren (FUKATA, et al. 2004; GREAVES, et al. 2010). ZDHHC12 dagegen, zeigt Spezifität nur für den ABCA1 Transporter (SINGARAJA, et al. 2009). Die DHHC-CR ist Domäne offenbar nicht der Schlüssel für die Substratselektivität.
Experimente mit chimären Proteinen zeigten, dass ein Austausch der DHHC-CR Domäne von DHHC3 (das gegen SNAP23 aktiv ist) mit DHHC15 (palmitoyliert SNAP23 nicht) zu keiner Änderung der Aktivität von DHHC15 führte (keine Palmitoylierung von SNAP23). Dies wird unterstützt durch Untersuchungen am Huntingtin Protein. Huntingtin wird von DHHC17 palmitoyliert, aber nicht von DHHC3.
Der entscheidende Unterschied zwischen den PATs besteht in einem Ankyrin Repeat in der N-terminalen Region von DHHC17, der für die Palmitoyilierung von Huntingtin verantwortlich ist. Ein chimäres Protein aus DHHC3 mit dem Ankyrin Repeat aus DHHC17 war in der Lage Huntingtin zu palmitoylieren (SINGARAJA, et al. 2002).
Die Autoacylierung der PATs selbst scheint eine Rolle in der Regulierung der Spezifität und der Aktivität der PATs zu spielen (YANG, et al. 2010).
1.5 hZDHHC3 – iPAT (GODZ-Golgi-spezifisches Zink Finger Protein)
Die intestinale Protein Acyl Transferase (iPAT) oder Palmitoyltransferase hZDHHC3 ist ein Transmembranprotein mit einem Molekulargewicht von 37 kDa. Das enzymatisch aktive Protein besteht aus vier Transmembrandomänen und der zytosolisch lokalisierten cysteinreichen Domäne mit dem DHHC Motiv (s. Abbildung 5). Lokalisationsstudien zeigten DHHC3 hauptsächlich im Golgi Kompartiment.
Lediglich minimale Überlappungen mit dem ERGIC konnten gefunden werden (KELLER, et al. 2004; NORITAKE, et al. 2009). Die DHHC3 wird in hohem Maße in Leber, Gehirn, Milz, Lunge, Plazenta und Intestinum exprimiert.
Abbildung 5: hZDHHC3 (Schema)
ZDHHC3 hat 4 Transmembrandomänen und eine konservierte cysteinreiche Domäne, die das DHHC (Asp-His-His-Cys) Motiv enthält (DHHC-CRD).(FUKATA, et al. 2006)
Die Aktivität der PATs wird durch die Fähigkeit der PATs zur dynamischen Selbstassoziierung beeinflusst. Es wurde gezeigt, dass sich DHHC2 und DHHC3 in intakten Zellen und in Membranpräparationen dynamisch zu Homomultimeren zusammenlagern (FANG, et al. 2006; LAI, et al. 2013). Es scheint, das DHHC3 als Oligomer weniger enzymatisch aktiv ist, als Monomer. Das könnte ein möglicher Hemmmechanismus sein. So konnte gezeigt werden, dass DHHC2 und DHHC3, nach Hemmung der enzymatischen Aktivität (chemisch oder durch Mutation) vermehrt oligomerisieren. Nach Addition des Substrates Palmitoyl-CoA dissoziierten
die Oligomere wieder. Anscheinend kann die enzymatische Aktivität von DHHC3 durch Oligomerizierung moduliert werden (LAI, et al. 2013).
Im Fokus aktueller Forschungen liegen momentan die Interaktionen der PATs mit ihren Substraten. Untersuchungen in neuronalen und nicht-intestinalen Zellen, sowie in silico Screening ergaben interessante Erkenntnisse zur Substratspezifität der DHHC3:
DHHC3 palmitoyliert das Cystein-String bindendes Protein (CSP) und führt zu dessen stabiler Membranbindung (GREAVES, et al. 2008). DHHC3 palmitoyliert die 14 AS lange, cysteinreiche, zytoplasmatische Loop-Domäne der GABAA Rezeptor γ2 Untereinheit (KELLER, et al. 2004; HUANG, et al. 2009). Es wird vermutet, dass die Palmitoylierung einen Einfluss auf die Sortierung des GABAA Rezeptors zu verschiedenen (Transport) Vesikeln hat (KELLER, et al. 2004; CHEN, et al. 2007).
DHHC3 spielt auch eine Rolle bei der Palmitoylierung des AMPA-Typ Glutamat Rezeptors. Die Untereinheiten GluR1-GluR4 sind an zwei Cysteinresten palmitoyliert.
Eine am zytoplasmatischen Ende der TMD2 und die zweite am Ende der TMD4 in der Nähe des C-Terminus. Wobei DHHC3 vermutlich für die Palmitoylierung an der TMD2 verantwortlich ist (HAYASHI, et al. 2005). Interessanterweise führt eine Überexpression der DHHC3 zu einer Akkumulierung der AMPA Rezeptor Untereinheiten an den Golgi Membranen. Es wird angenommen, dass dies einen Kontrollmechanismus darstellt, der die Expression der Rezeptoruntereinheiten an der Zelloberfläche kontrolliert.
DHHC3 palmitoyliert Stathmin 2 und 3 im Golgi von Neuronen (LEVY, et al. 2011) und ist auch für die Palmitoylierung des Integrin α6/β4 Komplexes verantwortlich ist (SHARMA, et al. 2012).
Die Phosphatidylinositol 4-kinase IIα (PI4KIIα) wird von DHHC3 und DHHC7 palmitoyliert und kolokalisiert mit diesen PATs im TGN (LU, et al. 2012). Zudem konnte gezeigt werden, dass die Palmitoylierung Cholesterol abhängig ist. Dazu wurden DHHC3 und DHHC7 überexprimiert, was eine Erhöhung der Palmitoylierung von PI4KIIα zur Folge hatte. Ein Knockdown dieser PATs mit RNAi führte zu
verminderter Palmitoylierung, verminderter Membranassoziation und Lokalisation im TGN. Anschließender experimenteller Cholesterol Abbau und Übersättigung durch Verwendung von Methyl-β-Cyclodextrin zeigte eine reversible Veränderung der Assoziation von PI4KIIα mit diesen DHHC Proteinen, wie auch eine Änderung in der TGN Lokalisation und der Membranassoziation (LU, et al. 2012).
Untersuchungen in HEK293T Zellen ergaben, dass DHHC3 mit RGS4 (G-protein signaling 4, ein intrazellulärer Modulator des GPCR-mediierten Signaling) interagiert und dadurch das GPCR Signaling reguliert (WANG, et al. 2010).
Ein weiterer Hinweis darauf, dass DHHC3 an der Regulierung neuronaler Prozesse beteiligt ist, ist die Interaktion der DHHC3 mit der GluRα1 Glutamat Rezeptor Untereinheit. DHHC3 palmitoyliert den N-Terminus von PSD-95 (FUKATA, et al.
2004; MILL, et al. 2009) sowie eNOS (FERNANDEZ-HERNANDO, et al. 2006). Für die G-Protein α Untereinheit konnte außerdem gezeigt werden, dass DHHC3 für deren Pendeln zwischen Golgi Apparat und der Plasmamembran notwendig ist (MILL, et al. 2009; FUKATA, et al. 2010).
Ein weiteres Beispiel für eine regulatorische Funktion der Palmitoylierung zeigten Hines et al. (2010) in Xenopus laevis Oozyten. Hier wurde beobachtet, dass der Spannungs- und Konzentrationsabhängige Ca2+ Transport durch DHHC3 vermittelt und reguliert wird.
Greaves et al. (2010) berichten, dass DHHC3 zusammen mit DHHC7 und DHHC17 die Membranassoziation aller SNAP25/23 verbessert. Diese Proteine werden als lösliche Proteine synthetisiert und erreichen ihre Membranassoziierung per Palmitoylierung. Sie regulieren die Fusion sekretorischer Vesikel in unterschiedlichen Zelltypen.
DHHC3 palmitoyliert demnach nicht sehr spezifisch, sondern setzt ein breites Spektrum an Substraten um (Tabelle 1). Die auffallenden Überschneidungen mit den Substraten von DHHC7 ergeben sich aus der Ähnlichkeit beider PATs, die aus der Sequenz der Proteine ersichtlich ist. Zudem haben beide eine ähnliche intrazelluläre
Lokalisation (FANG, et al. 2006; GREAVES, et al. 2011b) und sind in der Lage Heterodimere zu bilden (FANG, et al. 2006).
Die Erforschung der Substrate und mögliche Interaktionen mit anderen PATs wird das Bild der vielseitigen Palmitoyltransferase DHHC3 zukünftig weiter vervollständigen (OKU, et al. 2012). Derzeitige Ergebnisse beschränken sich bislang auf neuronale und andere nicht-intestinale Zelllinien. Erste Untersuchungen zu DHHC3 in intestinalen Caco-2 Zellen wurden von Dr. Arndt Rohwedder in seiner Dissertation 2009 am Institut für Physiologische Chemie durchgeführt. Diese Untersuchungen sollen in der vorliegenden Arbeit gefestigt und unterstützt werden.
Tabelle 1: Übersicht bisher identifizierter DHHC-Substrat Interaktionen (GREAVES, et al. 2011b)
1.6 Membranproteine
Biologische Membranen enthalten meist sowohl integrale als auch periphere Membranproteine. Diese unterscheiden sich in ihrer Art der Assoziation mit der Membran. Auf der zytosolischen Seite der Zellmembran sind integrale Membranproteine entweder kovalent über Aminosäuren mit hydrophoben Seitenketten (die mit den Kohlenwasserstoffketten der Fettsäuren in Wechselwirkung treten) in die Membran integriert. Sie durchdringen dabei die gesamte Lipid- Doppelschicht. Zum Beispiel wird das Ras Protein, ein Protein mit Signalfunktion, über eine Farnesyl- und eine Palmitoylgruppe in der Membran verankert. Oder die Integrierung erfolgt über kovalent gebundene Fettsäuren. Periphere Proteine haben dagegen keinen direkten Kontakt mit der Membran. Sie binden entweder über polare Kopfgruppen der Phospholipide an die Membran oder treten in relativ schwache Wechselwirkungen mit integralen Membranproteinen. Auf der exoplasmatischen Seite der Zelle werden verschiedene hydrolytische Enzyme mittels eines Glykosylphosphatidylinositolankers mit der Membran assoziiert.
Integrale Membranproteine lassen sich in sechs Typen und drei Klassen einteilen.
Die eine Klasse ist über ein glykosyliertes Phospholipid an die extrazelluläre Oberfläche der Membran gebunden. Zu dieser Gruppe gehören z.B. Enzyme wie die alkalische Phosphatase. Die zweite Klasse ist auf der zytoplasmatischen Seite über eine kovalent gebundene Myristinsäure fixiert (N-Myristinylierung). Diese C14:0 Fettsäure ist über eine Amidbindung an einen Glycinrest am N-Terminus der Proteine gebunden (z.B. v-Src). Die dritte Klasse sind Proteine, die über einen Farnesylrest auf der zytoplasmatischen Seite der Membran fixiert sind. Diese Fixierung erfolgt über eine Thioesterbindung im C-terminalen Bereich der Proteine (z.B. p21Ras). Die sechs Membranproteintypen sind in der folgenden Abbildung 6 gezeigt und beschrieben.
Abbildung 6: Integrale Membranproteine
Die räumliche Beziehung zwischen den Protein Domänen und der Lipiddoppelschicht kann man in sechs Kategorien einteilen. Typ I und II haben jeweils nur eine Transmembrandomäne. Typ I Proteine haben ihren Amino-Terminus extrazellulär, Typ II Proteine dagegen intrazellulär. Typ III Proteine haben mehrfache Transmembranhelices in einer Polypeptidkette. In Typ IV Proteinen bilden die Transmembrandomänen verschiedener Polypeptide zusammen einen Kanal durch die Zellmembran. Typ V Proteine werden durch kovalent gebundene Lipide an der Zellmembran fixiert. Typ VI Proteine haben sowohl eine Transmembrandomäne, als auch eine zusätzliche Fixierung in der Zellmembran über einen Lipidanker (GPI-Anker). Aus Lehninger Principles of Biochemistry S. 379 (DAVID L.
NELSON 2005)
1.6.1 Humane Saccharase-Isomaltase (hSI)
Die Saccharase-Isomaltase (SI) ist ein enzymatisch aktives, Typ II Transmembranprotein der Bürstensaummembran.
Sie besteht aus zwei homologen Untereinheiten: der Saccharase Einheit mit einem Molekulargewicht von 145 kDa und der Isomaltase Einheit mit einem Molekulargewicht von 151 kDa. Das Gesamtmolekulargewicht der komplexen humanen (h) SI Form beträgt in vivo 245 kDa.
Die SI wird zuerst als ein Vorläuferprotein (pro-hSI 210 kDa) synthetisiert und kotranslational im ER N-glykosyliert. Während des relativ langsamen Transports zur apikalen Seite der Zelle, wird das Protein in seine komplexe Form prozessiert (O- Glykosylierung).
Abbildung 7: Saccharase-Isomaltase (Schema)
Die C-terminale, extrazelluläre Domäne besteht aus der Saccharase-Untereinheit, aus der Isomaltase-Untereinheit und aus der O-glykosylierten Strangdomäne. Es folgt die Transmembrandomäne und die kurze zytoplasmatische Domäne mit dem N-Terminus (nach Hunziker 1986).
Die SI besteht aus einer kurzen Zytoplasmadomäne (aus 11 AS), einer Transmembrandomäne (20 AS) und einer großen glykosylierten extrazellulären Domäne (1795 AS) (s. Abbildung 7). Letztere enthält eine Ser/Thr-reiche, 22 AS lange Strangdomäne, die als Verbindung zwischen dem globulären Protein und der Plasmamembran dient (HUNZIKER, et al. 1986).
Die apikale Sortierung der SI ist abhängig von der Transmembrandomäne und der, der Strangdomäne anhängenden O-Glykosylierung (JACOB, et al. 2000b;
SPODSBERG, et al. 2001). Die O-Glykosylierung der SI stellt zudem auch den entscheidenden Sortiermechanismus für die Lipid Raft Assoziation dar (ALFALAH, et al. 1999; WETZEL, et al. 2009) (s. Tabelle 1). Demnach ist die O-Glykosylierung auch entscheidend für die enzymatische Aktivität der SI.
Die Saccharase spaltet die α-1,2- und α-1,4- glykosidischen Bindungen der Saccharose und Maltose. Die Isomaltase spaltet die α-1,6 glykosidischen Bindungen der Isomaltose. In vivo wird die komplexe Form der SI von Pankreas Proteasen in seine beiden Untereinheiten gespalten, die jedoch miteinander assoziiert bleiben. Die Funktion der SI besteht darin, Kohlenhydrate aus der Nahrung in Einfachzucker zu spalten und sie somit dem Körper verfügbar zu machen.
1.6.2 Humane Dipeptidyl Peptidase IV (hDPP IV)
Die Dipeptidyl Peptidase IV (DPP IV), auch bekannt als CD26, ist ein N- und O- glykosyliertes Typ II Transmembranprotein. Es besteht aus einem kurzen zytoplasmatischen Teil (N-Terminus, 6 AS), einer Transmembrandomäne (22 AS) und einer extrazellulären Domäne (C-Terminus, 738 AS).
In der Bürstensaummembran liegt es als Homodimer mit einem Molekulargewicht von 124 kDa vor (JASCUR, et al. 1991). Die Dimerizierung erfolgt nach der komplexen Glykosylierung im Golgi Kompartiment. Die N- und O-Glykosylierung ist verantwortlich für die spezifische und strenge Sortierung von DPP IV zur apikalen Membran in intestinalen Zellen (ALFALAH, et al. 2002).
In Caco-2 Zellen lokalisiert DPP IV in der apikalen Membran, in verschiedenen apikalen Vesikeln, in Mikrotubuli und in der basolateralen Membran. Es konnte gezeigt werden, dass DPP IV in Caco-2 Zellen in frühe und späte Endosomen endozytiert wird. Es wird angenommen, dass die Endozytose in späte Endosomen in das Recycling von DPP IV zur Bürstensaummembran involviert ist (KLUMPERMAN, et al. 1991).
DPP IV ist mit Triton X-100 DRMs assoziiert. Alfalah et. al. konnten zeigen, dass diese Assoziation ebenfalls stark von der Glykosylierung des Proteins abhängig ist.
TritonX-100 DRMs sind reich an Cholesterol und Sphingolipiden. Eine Verminderung von Cholesterol und eine Hemmung der N- und O-Glykosylierung führen zu einer nicht-polaren Sortierung von DPP IV (ALFALAH, et al. 2002).
DPP IV wird im Endothel von Organen (z.B. der Lunge), in der Zellmembran aktivierter T-Lymphozyten (dort CD26 genannt) exprimiert und findet sich auch frei zirkulierend im Blutplasma. Es ist ein proteolytisches Enzym aus der Gruppe der Exopeptidasen. In seiner Funktion spaltet es Dipeptide vom N-Terminus von Peptiden ab. Es spaltet bevorzugt, wenn sich an zweiter Stelle der Aminosäuresequenz ein Prolin- oder ein Alaninrest befindet. DPP IV ist beteiligt an Prozessen wie der Apoptose, der Signal Transduktion, dem Glukose Metabolismus und der Immunregulation.
1.6.3 P-Glykoprotein ABCB I (P-gp)
P-gp ist ein Transmembranprotein mit einem Molekulargewicht von 170 kDa. Es besteht aus 1280 AS und gehört zu der Gruppe der ATP abhängigen ABC- Transporter (Adenosine triphosphate-binding cassette) der MDR/TAP Unterfamilie.
Es wird auch als ATP-binding cassette subfamily B member I, MDR I und PGY I bezeichnet. Humanes P-gp ist im ABCB1 oder MDR1 (multidrug resistance 1) Gen kodiert (CHEN, et al. 1986).
Das Protein besteht aus zwei homologen Hälften. Jede Hälfte enthält sechs Transmembranhelices und eine ATP-bindenden Domäne. Beide Hälften sind flexibel verknüpft. Es gibt 3 Glykosylierungsstellen an der ersten extrazytoplasmatischen Domäne der N- terminalen Hälfte (s. Abbildung 8).
Abbildung 8: P-Glykoprotein (Schema)
Zwei homologe Hälften mit jeweils sechs TMD. Die ATP bindenden Stellen, sowie der N- und der C-Terminus befinden sich auf der zytosolischen Seite. Die drei Glykosylierungsstellen befinden sich extrazytoplasmatisch an der N-terminalen Hälfte des Proteins. (FU, et al. 2012)
P-gp wird als 150 kDa großes Vorläuferprotein im ER synthetisiert. Während der Faltung assoziiert es mit Calnexin und Hsc70 (GETHING, et al. 1992). Im Golgi wird das Protein in seine reife Form (N-) glykosyliert (MOLINARI, et al. 1994).
Wie P-gp vom ER zum Golgi gelangt ist bislang ungeklärt. Auch ist noch kein Sortiermechanismus für P-gp bekannt. Wie P-gp vom Golgi zur Zellmembran gelangt ist ebenfalls noch nicht eindeutig geklärt. Belegt ist, dass P-gp direkt oder indirekt über den endosomalen Weg zur Plasmamembran gelangt. Untersuchungen in unpolaren humanen Krebszellen Zellen konnten eine Kolokalisation von P-gp mit Rab5 positiven frühen Endosomen belegen. Scheinbar hat Rab5 eine Regulationsfunktion für das Trafficking von P-gp vom endosomalen Kompartiment zur Plasmamembran in unpolaren Zellen (FU, et al. 2007b). In polaren Zellen dagegen kolokalisiert P-gp mit Rab11a-positiven Endosomen (WAKABAYASHI, et al.
2005). Am Recycling Zyklus von P-gp zwischen dem endosomalen Pool und der Plasmamembran scheint Aktin beteiligt zu sein (FU, et al. 2007a). Obwohl die Assoziation von P-gp mit Aktin nicht direkt, sondern über Ezrin, Radixin und Moesin erfolgt (LUCIANI, et al. 2002), wurde gezeigt, dass P-gp intrazellulär akkumuliert (EEA1-positiv), wenn Aktin in der Zelle gestört ist. Die Funktion von P-gp bleibt dennoch erhalten und ist demnach unabhängig von Aktin (MESZAROS, et al. 2013).
P-gp ist mit Lipid Rafts assoziiert. Wobei P-gp hauptsächlich mit Lubrol DRM´s assoziiert und nur teilweise mit Triton X-100 Rafts (LAVIE, et al. 1998).
P-gp wird in der apikalen Membran der Mukosazellen des Intestinums (THIEBAUT, et al. 1987); in den Hepatozyten und in proximalen tubulären Zellen der Niere (SCHINKEL, et al. 1997), sowie in der Nebenniere und in den epithelialen Zellen der Kapillaren, einschließlich der Blut-Hirn Schranke und der Blut-Hoden Schranke extensiv exprimiert (SCHINKEL, et al. 1997). P-gp hat die Funktion einer Efflux Pumpe. Durch Hydrolyse von ATP wird die Energie zur Verfügung gestellt, die notwendig ist, um Substrate gegen das Konzentrationsgefälle durch die Membran zu pumpen. Transportiert wird eine ganze Reihe an Substraten. Dazu gehören Phospholipide, Sterole, Gallensäuren, Peptide, metabolische Abfallprodukte und
Medikamente. Der Efflux von Krebsmedikamenten macht P-gp zu einem Schlüsselprotein in der Behandlung von Krebs. Die Überexpression von P-gp in Krebszellen (auch in hämatopoetischen Krebsarten) gehört zum Mechanismus der sogenannten multidrug resistance (MDR).
1.7 siRNA – small interfering RNA
Mit Hilfe von siRNA lässt sich die Expression eines bestimmten Proteins beeinflussen. Diesen Vorgang nennt man auch RNA Interferenz (RNAi). Im Nukleus wird die Mehrheit der Gene, die für Proteine kodieren von der RNA Polymerase II transkribiert. Das primäre mRNA Transkript wird durch Spleißen zur reifen Messenger RNA (mRNA) prozessiert und anschließend ins Zytoplasma exportiert.
Ribosomen katalysieren die Translation der mRNA in Polypeptidketten, die dann zu Proteinen gefaltet werden.
An dieser Stelle setzt das Prinzip der Stilllegung, des sogenannten Silencing von RNA an. Diese Methode ist in Abbildung 9 veranschaulicht. Small interfering RNA (siRNA) wird abgeleitet von doppelsträngiger RNA (dsRNA), die meist experimentell in die Zelle verbracht wurde. Diese doppelsträngige Präkursorform der siRNA bindet an die Dicer Ribonuklease, eine Endonuklease, die die doppelsträngige RNA in kurze Segmente schneidet. Die danach maximal 21-23 Nukleotide lange einsträngige siRNA bindet an mehrere andere Proteine. Den nun entstandenen Komplex nennt man RISC (RNA induced silencing complex). Die siRNA leitet RISC zu der passenden spezifischen mRNA und bindet dort.
Die siRNA ist komplementär zur Zielstelle, weshalb die Bindung zwischen siRNA und Ziel-mRNA sehr präzise ist. Findet eine Bindung statt, wird die mRNA gespalten und anschließend von Exonukleasen abgebaut. Im Gegensatz dazu ist microRNA nicht komplett komplementär zur mRNA. Sie bindet dennoch an die Ziel-mRNA. Diese wird nicht degradiert sondern deren Translation wird verhindert bzw. blockiert.
Abbildung 9: Model für die translationale Repression mittels miRNA und RNAi, beides vermittelt durch einen RNA-induzierten Interferenz Komplex (RISC).
Die Ribonuklease Dicer prozessiert miRNA Präkursorformen in miRNA und doppelsträngige RNA in short interfering RNA (siRNA). In beiden Fällen entsteht ein doppelsträngiges Zwischenprodukt mit 21-23 Nukleotiden pro Strang mit je zwei einzelsträngigen 3´
Nukleotidüberhängen. Ein Strang des Zwischenprodukts bildet zusammen mit verschiedenen Proteinen einen RNA-induced silencing complex (RISC). Bei der Anwendung von siRNA hybridisiert die Ziel-mRNA perfekt mit der RISC RNA. Dies führt zur Spaltung der Ziel- mRNA. Bei der Anwendung von miRNA, bildet die RISC RNA mit der ZIEL-mRNA ein Hybrid. Da die miRNA nicht komplementär zur Ziel-mRNA ist, finden sich in dem Hybrid einige Unpaarungen der Basen. Hier wird die Translation der Ziel-mRNA blockiert. Aus Molecular Cell Biology S. 519 (LODISH 2003)
1.8 Lipid Rafts
Lipid Rafts sind definiert als Mikrodomänen der Zellmembran. Sie sind kleiner als 200 nm und setzen sich aus einer Mischung von Sphingolipiden und Cholesterol zusammen (s. Abbildung 10). Sie stellen geordnete Plattformen in der eher ungeordneten sie umgebenden Membran dar, die mit Membranproteinen interagieren (SIMONS, et al. 2004). Das frühere Fluid-Mosaik Model beschreibt die biologische Membran als Lipiddoppelschicht, die als hydrophobe Barriere fungiert und in der Membranproteine beweglich verankert sind (SINGER, et al. 1972). Wie sich gezeigt hat, ist dieses Model zu einfach, da die Zellmembran weitaus komplexer aufgebaut ist.
Für gewöhnlich sind Plasmamembranen aus drei Lipidgruppen aufgebaut. Aus Glycerphospholipiden, die die Doppelschicht bilden, aus Sterolen und aus Sphingolipiden. Die Lipidkomposition der zwei Membranblätter ist sehr unterschiedlich. Die meisten Sphingolipide finden sich im exoplasmatischen Blatt, während manche Glycerophospholipide auf das inneren Blatt beschränkt bleiben (MUNRO 2003).
Die Lipide der Plasmamembran existieren in verschiedenen Phasen der Fluidität, abhängig von ihrer Lipidkomposition. Typischerweise existieren Membranen in einem flüssigen Stadium. Eine beschränkte Diffusion der locker gepackten Lipide ist dafür charakteristisch (SCHUCK, et al. 2003). Die hohe Fluidität ergibt sich aus den ungesättigten Fettsäureketten der Phospholipide. Diesen Zustand nennt man ungeordnete Phase (Lipid Disordered Phase) (BROWN, et al. 1998). Cholesterol, Sphingolipide mit gesättigten Fettsäureketten und gesättigte Glycerophospholipide haben die Fähigkeit miteinander zu assoziieren und sich dabei von der ungeordneten Phase abzugrenzen. Die Struktur ihrer hydrophoben Acylketten ermöglicht es ihnen sich näher aneinander zu legen. Daraus ergibt sich eine geordnete Struktur, die man geordnete Phase (Lipid Ordered Phase) nennt (IPSEN, et al. 1987; MUNRO 2003).
Diese Membran Mikrodomänen (Lipid Rafts) zeigen eine Lipid- und Proteinzusammensetzung, die sich von der sie umgebenden Membran unterscheidet.
Das Raft Konzept wurde lange kontrovers diskutiert, weil Beweise für deren tatsächliche Existenz in lebenden Zellen fehlten. Inzwischen konnten mittels FCS (Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie) dynamische Nanodomänen in lebenden Zellen, und interessanterweise sowohl im inneren als auch im äußeren Blatt der Membran beobachtet werden. Für deren Formation sind Sphingolipide und Cholesterol essentiell (LASSERRE, et al. 2008). Andere Untersuchungen per STED- Mikroskopie (Stimulated Emission Depletion) Far-Field Fluoreszenz Nanoskopie zeigten Nanostrukturen in der Plasmamembran lebender Zellen, in denen Sphingomyelin in einem Cholesterol beteiligten Molekularkomplex eingebunden war (EGGELING, et al. 2009). Diese Studien untermauern die Existenz der Lipid Rafts.
Lipid Rafts lassen sich biochemisch mit nicht-ionischen Detergenzien isolieren. Sie werden demnach auch als Detergenzresistente Membranen (DRMs) bezeichnet (HEERKLOTZ 2002). Das am häufigsten verwendete Detergenz ist Triton X-100.
Auch andere Detergenzien, wie Lubrol oder Tween 20 werden verwendet. Die damit isolierten DRM´s unterscheiden sich in ihrer Protein- und Lipidzusammensetzung (SCHUCK, et al. 2003). Diese Zusammensetzung ist abhängig von der intrazellulären Lokalisation und Funktion der DRM´s (CASTELLETTI, et al. 2008).
Triton X-100 unlösliche DRMs sind reich an Cholesterol und Sphingolipiden (BROWN, et al. 1998). Sie scheinen eine wichtige Rolle bei Prozessen an der Zelloberfläche zu spielen (SIMONS, et al. 1997).
Lubrol Rafts sind reich an Cholesterol, aber sie enthalten mehr Glycerophospholipide und Phosphatidylethanolamine. Der Proteingehalt ist dreimal höher als in Triton X-100 Rafts. Lubrol DRMs enthalten Membranstrukturen aus dem TGN, der Zelloberfläche, viele mit Rafts assoziierte Transmembranproteine und Proteine, die mit dem inneren Blatt der Zellmembran assoziiert sind (DELAUNAY, et al. 2008).
Tween 20 DRMs entstehen wahrscheinlich im ER, in einem frühen Schritt im sekretorischen Weg. Der Proteinanteil in diesen DRMs ist nur gering. Daraus kann geschlossen werden, dass Tween 20 Rafts nicht so eng gepackt sind wie Triton X-100 Rafts. Tween 20 unlösliche Membranen sind reich an
Phosphatidylinositol und Phosphatidylglycerol, was bezüglich der Synthese im ER plausibel ist. Man kann Tween 20 DRMs daher zur Unterscheidung zwischen apikalen und basolateralen Proteinen während früher Stadien in ihrer Biosynthese heranziehen (ALFALAH, et al. 2005). Die vorgestellten DRMs sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Lipid Rafts spielen eine große Rolle in vielen zellulären Prozessen, wie der Signaltransduktion und der Sortierung von Proteinen (BROWN, et al. 1998;
RIETVELD, et al. 1998; IKONEN 2001). Mit Lipid Rafts assoziiert sind zum Beispiel:
GPI-verankerte Proteine (VARMA, et al. 1998), GTPasen (MUNRO 2003) und Transmembranproteine wie die Saccharase-Isomaltase (JACOB, et al. 2000a). Die Assoziation von Membranproteinen mit Lipid Rafts findet entweder an der Zelloberfläche, im ER oder im Golgi Apparat statt.
Abbildung 10: Mikrodomänen (Rafts) in der Plasmamembran
Stabile Assoziationen von Sphingolipiden und Cholesterol im äußeren Blatt lassen eine Mikrodomäne entstehen, die ein wenig dicker ist als andere Membranregionen und angereichert ist mit spezifischen Membranproteinen. GPI- verankerte Proteine sind für gewöhnlich im äußeren Blatt solcher Rafts zu finden. Proteine mit einer oder mehreren kovalent gebundenen langkettigen Acylgruppen finden sich meist im inneren Blatt. Caveolin ist besonders in nach innen gewölbten Rafts zu finden, die man Caveolae nennt. Proteine mit angehängten Prenylgruppen (so wie Ras), sind meist außerhalb von Rafts lokalisiert. Aus Lehninger Principles of Biochemistry S. 385 (DAVID L. NELSON 2005)
Detergenz Kompartimente Lipid Raft Bestandteile
Assoziierte Proteine Triton X-100 Trans Golgi Network (TGN)
enthält Golgi prozessierte Formen oder ausgereifte Formen
Cholesterol und
Sphingolipiden
Saccharase- Isomaltase, GPI-Anker Proteine, Influenza HA Lubrol Im Golgi prozessierte
Formen oder ausgereifte Formen
Phosphatidyl- Cholin und Phosphatidyl- Ethanolamin
Saccharase- Isomaltase, PSMA dimere und
ausgereifte Form
(Castelletti et al., 2008) Tween20 ER und cis-Golgi (frühes
Stadium im sekretorischen Weg)
Phosphatidyl- Cholin und Phosphatidyl- Ethanolamin
apikale Proteine:
Saccharase- Isomaltase, DPPIV, LPH (Alfalah et al, 2005)
Tabelle 2: Zusammenfassung der verschiedenen DRMs
1.9 Zielsetzung der Arbeit
Die ersten Daten zu hZDHHC3 in intestinalen Caco-2 Zellen wurden 2009 von Arndt Rohwedder erhoben. Er erkannte eine mögliche Rolle der iPAT für das Trafficking intestinaler Hydrolasen und damit für die funktionelle Integrität des Dünndarmepithels. Ziel der vorliegenden Arbeit war es die vorhandenen Daten zu verifizieren und weiter zu vertiefen.
Hierzu sollte iPAT am C-Terminus mit den fluoreszierenden Proteinen YFP bzw. CFP fusioniert werden. Zusätzliche Konstrukte mit einem 3x Flag-Tag jeweils am N- oder C-Terminus sollten als Kontrolle einer möglichen sterischen Behinderung durch die fluoreszierenden Proteine dienen. Mit jedem dieser Konstrukte sollten Untersuchungen zur Lokalisation der iPAT in COS-1 und in CHO Zellen durchgeführt werden.
Es sollte zudem ein neuer iPAT Knockdown Caco-2 Klon hergestellt werden. Mit diesem neuen Klon und dem bereits vorhandenen Klon siiPATB1 sollten die Auswirkungen eines Knockdowns der iPAT auf die Expression und auf die Lipid Raft Assoziation der Hydrolasen SI und DPP IV, sowie auf das Transporterprotein P-gp im Vergleich zu Wildtyp Caco-2 Zellen untersucht werden.
Zusätzlich sollte die Enzymaktivität der SI in Wildtyp und in siiPAT Zellen näher bestimmt werden.
2 Material
2.1 Chemikalien und Reagenzien
Chemikalien/Reagenzien Hersteller
Acrylamid Rotiphorese® Gel30 Carl Roth GmbH, Karlsruhe
Agar-Agar Carl Roth GmbH, Karlsruhe
Agarose Gibco, Karlsruhe
AGQ 0080 L-[35S] Invitro Cell labelling Mix
Amersham, GE Healthcare GmbH, Solingen
Ammoniumperoxodisulfat (APS) Merck, Darmstadt
Ammoniumsulfat (NH4)2SO4 Carl Roth GmbH, Karlsruhe Ampicillin Natriumsalz Carl Roth GmbH, Karlsruhe
BIO-RAD Protein Assay Bio-Rad Laboratories GmbH, München bovines Serumalbumin (BSA) PAA Laboratories GmbH, Pasching,
Österreich
Bromphenolblau Merck, Darmstadt
Calciumchlorid (CaCl2) Merck, Darmstadt
Chloroform Carl Roth GmbH, Karlsruhe
Chloroquin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
Coomassie Brilliant Blue G-250 Merck, Darmstadt
DEAE-Dextran Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Carl Roth GmbH, Karlsruhe
(1,4)-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
Essigsäure Carl Roth GmbH, Karlsruhe
Ethanol Carl Roth GmbH, Karlsruhe
Ethidiumbromid Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
Ethylendiamintetraacetat(EDTA) Carl Roth GmbH, Karlsruhe
Glucoquant Roche Deutschland Holding GmbH,
Grenzach-Wyhlen
Glukose Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
München
Glycerol Carl Roth GmbH, Karlsruhe
Glycin Carl Roth GmbH, Karlsruhe
HEPES Carl Roth GmbH, Karlsruhe
Isopropanol Carl Roth GmbH, Karlsruhe
Kaliumacetat Carl Roth GmbH, Karlsruhe
Kaliumchlorid (KCl) Carl Roth GmbH, Karlsruhe Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) Carl Roth GmbH, Karlsruhe
Kanamycinsulfat Carl Roth GmbH, Karlsruhe
Magermilchpulver (Sucofin) TSI GmbH, Zeven
Mannitol Carl Roth GmbH, Karlsruhe
Methanol Carl Roth GmbH, Karlsruhe
Natriumacetat Carl Roth GmbH, Karlsruhe
Natriumchlorid (NaCl) Carl Roth GmbH, Karlsruhe
Natriumdeoxycholat Carl Roth GmbH, Karlsruhe
Natriumdodecylsulfat (SDS) Carl Roth GmbH, Karlsruhe Natriumhydroxid (NaOH) Carl Roth GmbH, Karlsruhe N,N,N’,N’-Tetramethylethan-1,2-diamin
(TEMED)
Carl Roth GmbH, Karlsruhe
Paraformaldehyd (PFA) Carl Roth GmbH, Karlsruhe
Penicillin/Streptomycin PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich
Phenol/Chlorform/Isoamylalkohol Carl Roth GmbH, Karlsruhe
Phosphorsäure 85 % Carl Roth GmbH, Karlsruhe
Proteinase Inhibitoren (Mix) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Protein A-Sepharose (PAS) GE Healthcare, Freiburg
Puromycin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
RNase A Carl Roth GmbH, Karlsruhe
Saccharose D(+) Carl Roth GmbH, Karlsruhe
Saponin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrat
Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) Carl Roth GmbH, Karlsruhe
Triton X-100 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
Tween 20 Carl Roth GmbH, Karlsruhe
2.2 Medien
Medium Hersteller
DMEM Low Glucose (1 g/l)
1 g/l (D-)Glukose,
10 % (v/v) FKS, 1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin
PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich DMEM High Glucose
(4,5 g/l)
4,5 g/l (D-)Glukose, 10 % (v/v) FKS, 1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin
PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich
FKS fetales Kälberserum Invitrogen, Darmstadt
LB-Medium (Luria Bertani) 1 % (w/v) NaCl, 1 % (w/v) Trypton/Pepton, 0,5 % (w/v) Hefeextrakt, pH 7.0
LB-Agar 400 ml LB-Medium, 6 g
Agar-Agar MEM – Minimum Essential
Medium
1 % (v/v)
Penicillin/Streptomycin
PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich Transfektionsmedium DMEM Low Glucose,
1 % (v/v)
Penicillin/Streptomycin
2.3 Puffer und Lösungen
Puffer/Lösung Zusammensetzung
BBM-Puffer 2mM Tris-HCL, 50mM Mannitol, ph 7,1
BBM Lysispuffer 10mM Tris-HCL, 150mM NaCl, 1% Triton
X-100, ph 7,4
Blocking Lösung 0,5 % (w/v) Saponin, 1,0 % (w/v) BSA, 0,1 % (w/v) Triton X-100 in PBS, pH 7,5 Bromphenolblau-Ladepuffer 0,25 % (w/v) Bromphenolblau,
0,25 % (w/v) Xylenxyanol, 30 % (w/v) Glycerol
Coomassie Färbelösung 85 %ige Phosphorsäure, 100g (NH4)2SO4, 1,2 g Coomassie Blue G-250, A. bidest
Coomassie Färbelösung, kolloidal 980 ml Färbelösung Coomassie, 20 ml Methanol
Fixierer 40 % Ethanol, 10 % Essigsäure
HBS-Puffer 50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1,5 mM
Na2HPO4, pH 7,1
Tris-Acetat-EDTA Puffer (TAE-Puffer) 40 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,2 M Essigsäure, pH 8,5
Laufpuffer SDS-PAGE 25 mM Tris, 250 mM Glycin, 0,01 % (w/v) SDS, pH 8,3
Lämmli Probenpuffer (3 fach) 6 % (w/v) SDS, 30 % (v/v) Glycerol, 150 mM Tris, 0,02 % (w/v)
Bromphenolblau
Lösung I 50 mM Glukose Monohydrat, 10 mM
EDTA, 25 mM Tris, pH 8,0
Lösung II 1 % (w/v) SDS, 0,2 M NaOH
Lösung III 3 M Kaliumacetat, pH 4,8 (mit
Essigsäure einstellen) Magermilch-Blockinglösung Westernblot 5 % Magermilch in 1x PBS
PBS-Puffer (Phosphate buffered saline) 0,8 % (w/v) NaCl, 0,2 % (w/v) KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, pH 7,4 Proteinase Inhibitoren pro ml (Endkonzentration): 1 mM PMSF,
100 µg Trypsin/Chymotrypsin Inhibitor, 1 µg Pepstatin, 5 µg Antipain,
5 µg Leupeptin, 1 µg Aprotinin
Quench-Puffer 50mM NH4Cl in 1x PBS
Saccharoselösung 5 % 1g Saccharose auf 20 ml, mit 1x PBS auffüllen
Saccharoselösung 30 % 18g Saccharose auf 60 ml, mit 1x PBS auffüllen
Saccharoselösung 80% 40g Saccharose auf 50 ml, mit 1x PBS auffüllen
Sammelgel Puffer 1 M Tris, pH 6,8
Standard Lyse Puffer 25 mM Tris, 50 mM NaCl, 0,5 % (w/v) Natriumdesoxycholat, 0,5 % Triton X-100 in A. bidest.
Trenngel Puffer 1,5 M Tris, pH 8,8
TE-Puffer 10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8,0
Transferpuffer 1,92 M Glycin, 0,25 M Tris, 10 % (v/v) Methanol
Triton X-100 Lysepuffer 100 mM NaCl, 50 mM Tris, 1,0 % (w/v) Triton X-100, pH 7,5
Trypsin-EDTA PAA Laboratories GmbH, Pasching,
Österreich
Tween-PBS (T-PBS): 0,05 % Tween 20 in 1x PBS
Waschpuffer I 0,5 % (w/v) Triton X-100, 0,05 % (w/v) Natriumdesoxycholat in 1x PBS
Waschpuffer II 500 mM NaCl, 125 mM Tris, 10 mM
EDTA, 0,5 % (w/v) Triton X-100, in A. bidest., pH 8,0
2.4 Kits
Name Hersteller
FuGENE® HD Transfection Reagent Promega Corporation, Madison, USA GeneClip™ U1 Hairpin Cloning Systems Promega Corporation, Madison, USA High Pure RNA Isolation Kit Roche Deutschland Holding GmbH,
Grenzach-Wyhlen jetPrime™ Polyplus transfection™ peqlab, Erlangen RevertAidTM First Strand cDNA
Synthesis Kit
Thermo Scientific Inc.
Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System
Promega Corporation, Madison, USA
2.5 Marker
Marker Hersteller
Lambda DNA/EcoRI+HindIII (Marker) Thermo Scientific Inc.
PageRuler™ Plus Prestained Protein Ladder
Fermentas GmbH, St. Leon-Rot
2.6 Enzyme
Restriktionsenzym Hersteller
BglII Fermentas, Thermo Fisher Scientific Inc.
EcoR V (Eco 32I) Fermentas, Thermo Fisher Scientific Inc.
SalI Fermentas, Thermo Fisher Scientific Inc.
PstI Fermentas, Thermo Fisher Scientific Inc.
Ligase Hersteller
T4 DNA Ligase (200 U/µl) Fermentas, Thermo Fisher Scientific Inc.
Polymerasen Hersteller
PfuUltra DNA Polymerase Stratagene, Agilent Technologies, Inc.
GoTaq® DNA Polymerase Promega, Madison, Wisconsin, USA
sonstige Enzyme Hersteller
SAP – Shrimp
Alkaline Phosphatase, 1U/µl
Fermentas, Thermo Fisher Scientific Inc.
Alle Enzyme wurden mit den empfohlenen Puffern der Hersteller verwendet.
2.7 Antikörper
2.7.1 Für Westernblot Primäre Antikörper
Name Spezies/Ursprung Verdünnung Firma/Herkunft (β-) Aktin monoklonal, Maus 1:1.000 Santa Cruz
Biotechnology Inc.
α-gfp monoklonal, Maus 1:160 Clontech, Takara Bio Company, Mountain View, Ca. USA
α-pgp C219 monoklonal, Maus
1:200 SIGNET, Covance,
Emeryville, Ca.
USA α-705 SI Hybridoma Zellkultur
Überstand
1:1.000 Gabe von Prof. M.
Colombatti,
Universität Verona Annexin-2 (HH7) Hybridoma Zellkultur
Überstand
1:2.000 UKM Münster
DPP IV Aszites 1:5000 Gabe von Prof. E.
Sterchi, Universität Bern
(Anti-) Flag – M2 monoklonal, Maus, positionsinsensitiv
1:2.000 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Flotillin-2 monoklonal, Maus 1:1.000 Santa Cruz
Biotechnology Inc.
RhoA Sc-418 monoklonal,
Maus
1:500 Santa Cruz
Biotechnology Inc.
