Interaktion zwischen Metabolismus und Transport von Pyren in Caco-2-Zellen als Modell der gastrointestinalen Barriere

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Aus dem Zentrum für Lebensmittelwissenschaften Institut für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik

- Lebensmitteltoxikologie -

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Interaktion zwischen Metabolismus und Transport von Pyren in Caco-2-Zellen als Modell der gastrointestinalen Barriere

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines DOKTORS DER VETERINÄRMEDIZIN durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Lutz Stumkat aus Hamburg

Hannover 2004

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Wissenschaftliche Betreuung: Priv.-Doz. Dr. Dr. A. Lampen

Tag der mündlichen Prüfung: 12. 5. 2004

1. Gutachter: PD Dr. Dr. A. D. Lampen

2. Gutachterin : Apl. Prof. Dr. E. M. Liebler-Tenorio

Gefördert durch die H. Wilhelm Schaumann-Stiftung

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3 ________________________________________________________________________

Inhaltsverzeichnis

Seite

1. Einleitung 13

1.1. Die Polyzyklischen Aromatischen Kohlenwasserstoffe

(PAK´s) 13

1.2. Fragestellungen der Doktorarbeit 15

2. Schrifttum 16

2.1. Enzymatische Reaktionen an PAK´s 16 2.1.1. Funktionalisierungsreaktion (Phase 1) 17 2.1.1.1 Die Enzyme des Cytochrom-P450-Systems 17

2.1.1.2. Die Epoxidhydrolasen 18

2.1.2. Konjugationsreaktion (Phase 2) 19

2.1.2.1. Sulfatierung 19

2.1.2.2. Glucuronidierung 19

2.1.2.3. Glutathionkonjugation 20

2.2. Transport 21

2.2.1. P-Glykoprotein 21

2.2.2. Multidrug resistance associated proteins (MRP´s) 22 2.2.3. Breast Cancer Resistance Protein (BCRP) 23

2.3. Pyren als Modellsubstanz 23

2.4. Verwendete Zellinien 25

2.4.1. Die Caco-2-Zelle 25

2.4.2. Der Caco-2-Klon TC7 27

2.4.3. Die MDCK II-Zelle 37

2.4.4. Die V79-Zelle 28

3. Material und Methoden 29

3.1. Material 29

3.1.1. Chemikalien 29

3.1.2. Weitere Reagenzien, Bezugsnachweis 29

(4)

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3.1.3. Zellkulturmedium und Zusätze, Bezugsnachweis 30

3.1.4. Verwendete Puffer 30

3.1.5. Verwendete Zellinien, Bezugsnachweis 31 3.1.6. Verbrauchsmaterialien und Laborhilfsmittel, Bezugsnachweis 31

3.2. Methoden 33

3.2.1. Zellkulturmethoden 33

3.2.1.1. Passagierung 33

3.2.1.2. Einfrieren von Zellen 33

3.2.1.3. Auftauen von Zellen 34

3.2.1.4. Kultivierung von Zellen in Glaspetrischalen 34

3.2.1.5. Kultivierung von Zellen im Transwell^®-System 34

3.2.2. Versuchsdurchführung 36

3.2.2.1. Versuche zum Pyrenmetabolismus 36 3.2.2.1.1. Bestimmung der Kinetik der Pyrenmetabolisierung in

Caco-2-Zellen 36 2.2.2.1.2. Induktion des Pyrenmetabolismus in Caco-2-Zellen durch

ß-Naphtoflavon 36 3.2.2.1.3. Induktion des Pyrenmetabolismus in Caco-2-Zellen (Klon TC7)

durch ß-Naphtoflavon 37 3.2.2.1.4. Bestimmung der am Pyrenmetabolismus beteiligten

Sulfotransferasen 37

3.2.2.2. Versuche zum Transport 37

3.2.2.2.1. Transport von Pyrenmetaboliten durch Caco-2-Zellen und

Induktion des Pyrenmetabolismus durch ß-Naphtoflavon 37 3.2.2.2.2. Transport von Pyrenmetaboliten durch Caco-2-Zellen und

Induktion des Pyrenmetabolismus durch verschiedene

Substanzen 38 3.2.2.2.3. Transport von Pyrenmetaboliten durch Caco-2-Zellen unter

chemischer Hemmung des Pyrenmetabolismus 39 3.2.2.2.4. Untersuchung auf Transport durch cMOAT/MRP2 in

MDCK II-Zellen 40

3.2.2.2.5. Untersuchung auf Transport durch BCRP in Caco-2-Zellen 40 3.2.3. HPLC-Analytik von Pyren und Pyrenmetaboliten 40

3.2.3.1. Probenaufarbeitung 41

(5)

5 ________________________________________________________________________

3.2.3.1.1. Festphasenextraktion 41

3.2.3.1.2. Lösungsmittelreduzierung 41

3.2.3.1.3. Abschließende HPLC-Vorbereitung 42

3.2.3.2. HPLC-Analyse 42

3.2.3.3. Auswertung 43

3.2.4. Untersuchungen zur Genregulation 45

3.2.4.1. RNS-Isolierung 45

3.2.4.2. Auftrennung der RNS durch Gelelektrophorese 47 3.2.4.3. Reverse Transkriptase- (RT-) PCR 48

3.2.4.3.1. Synthese von cDNS 48

3.2.4.3.2. PCR-Amplifizierung mit Oligonukleotiden 49

4. Ergebnisse 51

4.1. Versuche zum Pyrenmetabolismus 52 4.1.1. Bestimmung der Kinetik der Pyrenmetabolisierung in

Caco-2-Zellen 52 4.1.2. Einfluß einer Vorbehandlung mit ß-Naphtoflavon auf den

Pyrenmetabolismus in Caco-2-Zellen 55 4.1.3. Einfluß einer Vorbehandlung mit ß-Naphtoflavon auf den Pyren-

Metabolismus in Caco-2-Zellen des Klons TC7 58 4.1.4. Bestimmung der am Pyrenmetabolismus beteiligten

Sulfotransferasen 60 4.2. Versuche zum Transport 62

4.2.1. Transport von Pyrenmetaboliten durch Caco-2-Zellen und

Induktion des Pyrenmetabolismus durch ß-Naphtoflavon 62 4.2.2. Transport von Pyrenmetaboliten durch Caco-2-Zellen und

Induktion des Pyrenmetabolismus durch verschiedene

Substanzen 65 4.2.3. Transport von Pyrenmetaboliten durch Caco-2-Zellen unter

chemischer Hemmung des Pyrenmetabolismus 71 4.2.4. Untersuchung auf Transport von Pyrenmetaboliten durch

cMOAT/MRP2 in MDCK II- Zellen 75

4.2.5. Untersuchung auf Transport von Pyrenmetaboliten durch BCRP

in Caco-2-Zellen 77

(6)

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4.3. Beeinflussung der mRNS-Expression durch Pyren 79 4.3.1. Beeinflussung der mRNS-Expression

fremdstoffmetabolisierender Enzyme durch Pyren 79

4.3.1.1. CYP1A1 79

4.3.1.2. CYP1B1 81

4.3.1.3. SULT1A1 und SULT1B1 82

4.3.1.4. UGT1A6 83

4.3.2. Beeinflussung der mRNS-Expression von Transportproteinen

durch Pyren 84

4.3.2.1. MDR1 84

4.3.2.2. cMOAT/MRP2 85

5. Diskussion 86

6. Zusammenfassung 97

Summary 100

7. Literaturverzeichnis 103

Abbildungsverzeichnis

Seite Abb. 1: Strukturformeln der Polyzyklischen Aromatischen Kohlen-

wasserstoffe Pyren, Benzo[a]pyren und Chrysen 13 Abb. 2: Mutmaßliche Phase1-Reaktionswege des Pyrens 24

Abb. 3: Beispielchromatogramme 51

(7)

7 ________________________________________________________________________

Abb. 4: Kinetik der Metabolisierung von Pyren zum Pyren-1-Sulfat

durch Caco-2-Zellen 53

Abb. 5: Lineweaver-Burk-Plot der Daten aus Abb. 4 53 Abb. 6: Kinetik der Metabolisierung von Pyren zum Pyren-1-Glucuronid

durch Caco-2-Zellen 54

Abb. 7: Lineweaver-Burk-Plot der Daten aus Abb. 6 55 Abb. 8: Metabolisierung von Pyren (10 LM) zum 1-Glucuronid durch

Caco-2-Zellen in Glaspetrischalen über einen Zeitraum von

12 Stunden 56

Abb. 9: Metabolisierung von Pyren (10 LM) zum 1-Sulfat durch Caco-2-Zellen in Glaspetrischalen über einen Zeitraum von

12 Stunden 57

Abb. 10: Metabolisierung von Pyren (20 LM) zum 1-Glucuronid durch Caco-2-Zellen des Klons TC7 in Glaspetrischalen über einen

Zeitraum von 24 Stunden 58

Abb. 11: Metabolisierung von Pyren (20 LM) zum 1-Sulfat durch

Caco-2-Zellen des Klons TC7 in Glaspetrischalen über einen

Abb. 12: Metabolisierung von Pyren (20 LM) durch V79-Zellen (mit den humanen Sulfotransferasen hSULT1A1, hSULT1A2,

hSULT1A3, hSULT1B1 transfizierte bzw. nichttransfizierte (MZ-) Zellen) in Glaspetrischalen über einen Zeitraum von

24 Stunden 60

Abb. 13: Metabolisierung von Pyren-1-Hydroxid (20 LM) durch

V79-Zellen (mit den humanen Sulfotransferasen hSULT1A1, hSULT1A2, hSULT1A3, hSULT1B1 transfizierte bzw.

nichttransfizierte (MZ-) Zellen) in Glaspetrischalen über einen

Abb. 14: Metabolisierung von Pyren (10 LM) zum Pyren-1-Glucuronid und Transport dieses Metaboliten über einen Zeitraum von

24 Stunden 62

Abb. 15: Metabolisierung von Pyren (10 LM) zum Pyren-1-Sulfat und Transport dieses Metaboliten über einen Zeitraum von

24 Stunden 63

(8)

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Abb. 16: Metabolisierung von Pyren (10 LM) zum Pyren-1-Hydroxid und Transport dieses Metaboliten über einen Zeitraum von

24 Stunden 64

Abb. 17: Metabolisierung von Pyren (10 LM) durch Caco-2-Zellen im Trans-

well^®-System über einen Zeitraum von 24 Stunden 65 Abb. 18: Metabolisierung von Pyren (20 LM) zum Pyren-1-Glucuronid durch

Caco-2-Zellen und Transport dieses Metaboliten über einen

Abb. 19: Metabolisierung von Pyren (20 LM) zum Pyren-1-Sulfat durch Caco-2-Zellen und Transport dieses Metaboliten über einen

Abb. 20: Metabolisierung von Pyren (20 LM) zum Pyren-1-Glucuronid durch Caco-2-Zellen und Transport dieses Metaboliten über einen

Abb. 24: Metabolisierung von Pyren zum Pyren-1-Sulfat durch Caco-2-Zellen und Transport dieses Metaboliten über einen

(9)

9 ________________________________________________________________________

Abb. 27: Metabolisierung von Pyren (10 LM) zum Pyren-1-Sulfat durch MDCK II-Zellen und Transport dieses Metaboliten über einen

Abb. 28: Metabolisierung von Pyren (10 LM) durch MDCK II-Zellen im Trans- well^®-System über einen Zeitraum von 24 Stunden 76 Abb. 29: Metabolisierung von Pyren-1-Hydroxid (10 LM) zu

Pyren-1-Glucuronid durch Caco-2-Zellen im Transwell^®-System

über einen Zeitraumvon 9 Stunden 77

Abb. 30: Metabolisierung von Pyren-1-Hydroxid (10 LM) zu Pyren-1-Sulfat durch Caco-2-Zellen im Transwell^®-System über einen

Abb. 31: Genexpression von CYP1A1 in Caco-2-Zellen nach Behand-

lung mit Pyren 79

Abb. 32: Genexpression von CYP1A1 in Caco-2-Zellen nach Behand-

lung mit Benzo[a]pyren und Chrysen 80

Abb 33: Densitometrische Auswertung der in Abb. 32 dargestellten

Ergebnise 80

Abb. 34: Genexpression von CYP1B1 in Caco-2-Zellen nach Behand-

lung mit Pyren 81

Abb. 35: Genexpression von PST in Caco-2-Zellen nach Behandlung

mit Pyren 82

Abb. 36: Genexpression von UGT1A6 in Caco-2-Zellen nach Behand-

lung mit Pyren 83

Abb. 37: Genexpression von MDR1 in Caco-2-Zellen nach Behand-

lung mit Pyren 84

Abb. 38: Genexpression von MRP2 in Caco-2-Zellen nach Behand-

lung mit Pyren 85

Abb. 39: Schema der Metabolisierung und des Transportes von Pyren in

intestinalen Zellen 95

(10)

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Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abb.

ABC engl. ATP-binding cassette Acc.-Nr. engl. accession number

Ah-Rezeptor Arylhydrocarbon-Rezeptor M-NF alpha-Naphtoflavon

ATP Adenosin-5´-triphosphat

BCRP engl. Breast Cancer Resistance Protein

beh. behandelt

ß-NF beta-Naphtoflavon

bp Basenpaar

cDNS komplementäre Desoxyribonukleinsäure

cMOAT engl. Canalicular Multispecific Organic Anion Transporter

CYP Cytochrom P450

dATP Desoxyadenosintriphosphat dCTP Desoxycytosintriphosphat DEPC Diethylpyrocarbonat

dGTP Desoxyguanosintriphosphat

DMEM Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium DMSO Dimethylsulfoxid

dNTP Desoxynucleosidtriphosphat dTTP Desoxythymidintriphosphat

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ER Endoplasmatisches Retikulum

g Vielfaches der Erdbeschleunigung

GSH Glutathion

GST Glutathion-S-Transferase

GTC Guanidiumthiocyanat

h Stunde

HPLC engl. High Performance Liquid Chromatography hSULT humane Sulfotransferase

I3C Indol-3-Carbinol

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11 ________________________________________________________________________

i. D. innerer Durchmesser INF Indeno[1,2,3-cd]fluoranthen

Konz. Konzentration

KM Michaelis-Menten-Konstante

MC engl. Mean Counts

3-MC 3-Methylcholanthren

MDR engl. Multiple Drug Resistance

Mg Molekulargewicht

min Minute

MOPS 3-(N-Morpholino) Propansulfonsäure mRNS engl. messenger-Ribonukleinsäure

MRP engl. Multiple Resistance-associated Protein

n Probenanzahl

NADP⁺ Nicotinamid-Adenin-Dinucleotidphosphat (oxidiert) NADPH Nicotinamid-Adenin-Dinucleotidphosphat (reduziert)

NF Naphtoflavon

OD Optische Dichte

ODS Octadecylsilan

p Irrtumswahrscheinlichkeit (bei Zellen: Passagezahl) PAK Polyzyklischer Aromatischer Kohlenwasserstoff PAPS 3´-Phosphoadenosin-5´-Phosphosulfat

PBS Phosphatgepufferte Salzlösung (engl. phosphate-buffered saline)

PCR engl. polymerase chain reaction PgP P-Glykoprotein

PST Phenolsulfotransferase RLIP 76 engl. 76 kDa Ral-binding GTPase activating protein RNS Ribonucleinsäure

RT-PCR engl. reverse transcriptase-polymerase chain reaction SULT Sulfotransferase

TBHQ t-Butylhydroquinon TCDD 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-Dioxin

UGT Uridindiphosphoglucuronosyltransferase UV Ultraviolett

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V Geschwindigkeit

VMAX maximale Umsatzgeschwindigkeit

vorb./vorbeh. vorbehandelt

v/v Volumen pro Volumen

XRE engl. Xenobiotica Responsive Element

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13 ________________________________________________________________________

1. Einleitung

1.1. Die Polyzyklischen Aromatischen Kohlenwasserstoffe (PAK´s)

Das Darmepithel von Mensch und Tier erfüllt neben seiner Verdauungs- und Resorptionstätigkeit auch eine wichtige Aufgabe als Ort der Fremdstoffmetabolisierung, wobei die neugebildeten Verbindungen die Enterozyten entweder in Richtung Pfortaderblut verlassen oder in das Darmlumen zurücktransportiert werden können.

Zu den zahlreichen Fremdstoffen, mit denen der menschliche und tierische Körper konfrontiert wird, gehören die potentiell toxischen Polyzyklischen Aromatischen Kohlenwasserstoffe (PAK´s). Diese Stoffklasse, welche mehrere hundert Verbindungen umfaßt, entsteht bei unvollständiger Verbrennung organischer Substanzen. Hierbei polymerisieren vermutlich freie Kohlenstoff-, Wasserstoff- und Kohlenwasserstoffradikale zu PAK´s. Abbildung 1 zeigt die Strukturformeln von Pyren und zweier weiterer PAK´s.

Abb. 1. Strukturformeln der Polyzyklischen Aromatischen Kohlenwasserstoffe Pyren (A), Benzo[a]pyren (B) und Chrysen (C).

Als Reinsubstanzen bilden die PAK´s farblose, gelbliche, rötliche oder grünliche Kristalle.

Die geringe Flüchtigkeit und Wasserlöslichkeit der PAK´s bedingt ihren Transport über Partikel (Ruß, Staub, Pollen).

Bei der Entstehung von PAK´s kann zwischen natürlichen (Waldbrände, Vulkanismus, Inkohlungsprozeß zu Kohle und Erdöl, Biosynthese in manchen

(14)

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Pflanzen und Mikroorganismen) und vom Menschen geschaffenen Quellen unterschieden werden.

Als Beispiele für die Quellen anthropogen erzeugter PAK´s in der Umgebungsluft sind Kraftfahrzeugabgase, Heizungsanlagen, Müllverbrennung sowie Haupt- und Nebenstrom des Tabakrauches zu nennen (OEHLMANN und MARKERT, 1997).

In der Nahrung des Menschen bilden sich PAK´s beim Grillen von Lebensmitteln sowie durch Zubereitungsfehler (Anbrennen).

In der Nähe von Industrieanlagen und Verkehrswegen angebautes Gemüse kann als Folge von Luft- und Bodenkontaminationen aus Abgasen, Reifenabrieb, Teer und Asphalt hohe PAK-Konzentrationen enthalten (OEHLMANN und MARKERT, 1997).

Auch eine Verwendung von Klärschlamm und Müllkompost steigert die PAK-Gehalte von Nutzpflanzen.

Die Halbwertszeiten der PAK´s im Boden betragen Monate bis Jahrzehnte. In der Atmosphäre findet durch die UV-Strahlung der Sonne in Gegenwart von Photooxidantien (Ozon) eine Oxidation mit anschließender Ringöffnung statt.

(KOSS,1997)

Die Giftwirkung der gesamten Stoffklasse

Eine Analyse der täglichen Exposition des Menschen ergab, daß die inhalative und die orale PAK-Aufnahme sich in der gleichen Größenordnung (wenige ng bis 1 Lg pro Tag) bewegen.

Die PAK´s werden als lipophile Verbindungen über die Lungenalveolen resorbiert.

Dorthin können Partikel mit einem Durchmesser von <5 Lm gelangen.

Größere Partikel lagern sich bereits in den oberen und mittleren Atemwegen ab.

Durch die mukoziliäre Clearance und das Abschlucken von Partikeln mit dem Tracheobronchialsekret gelangen PAK´s aber auch nach Inhalation teilweise in den Gastointestinaltrakt.

Dort werden, wie Tierversuche ergaben, nur etwa 10% der aufgenommenen PAK´s resorbiert. Nach ca. einer Stunde erscheinen kleine Anteile der aufgenommenen Dosis in Gallenflüssigkeit, Urin und Lymphe, während der Hauptanteil sich auch nach 24 Stunden noch in der intestinalen Ingesta befindet. In die Gallenflüssigkeit

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Einleitung 15 ________________________________________________________________

gelangte, metabolisch konjugierte PAK´s werden nach Spaltung im Darmlumen z.T.

erneut resorbiert (enterohepatischer Kreislauf) (KOSS, 1997).

Fettgewebe, Nebennieren, Ovarien und Leber stellen die wichtigsten Depotkompartimente für PAK´s dar, ihr Nachweis ist in diesen Geweben noch nach Monaten möglich.

Eine einmalige Aufnahme einer großen Menge an PAK´s führt vermutlich durch Hemmung der DNS-Synthese zu Schädigungen von mitoseaktiven Geweben (intestinales Epithel, Gonaden, Hämatopoese) sowie der Nebennierenrinde (KOSS,1997).

1.2. Fragestellungen der Doktorarbeit

Im Zuge der vorliegenden Arbeit sollten Antworten auf die folgenden Fragen gefunden werden:

1. Findet im Darmepithel eine Metabolisierung von Pyren statt?

2. Welche Enzyme sind an einer solchen Metabolisierung beteiligt und welche Metabolite werden gebildet?

3. Werden Pyren und/oder Pyrenmetaboliten vom Darmepithel gerichtet transportiert und welche Transporter sind hierfür verantwortlich?

4. Inwieweit induziert Pyren seinen eigenen Metabolismus und/oder Transport?

5. Ist eine mögliche Interaktion zwischen Metabolismus und Transport durch weitere Substanzen (z. B. Nahrungsbestandteile) beeinflußbar?

6. Welche Gemeinsamkeiten und Unterschiede bestehen hinsichtlich Metabolismus, Transport und Induktion zwischen kanzerogenen und nichtkanzerogenen PAK´s?

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2.1. Enzymatische Reaktionen an PAK´s

Es ist seit langem bekannt, dass zahlreiche PAK’s neben ihrer Giftwirkung auch krebserregende Eigenschaften besitzen, da sie durch körpereigene Enzyme zu hochreaktiven Epoxiden metabolisiert werden. Insbesondere Dihydrodiol-Epoxide von PAK´s, welche wie Benzo[a]pyren, Chrysen und Anthracen (nicht jedoch Pyren) eine sogenannte „Bay-Region“ (Bucht zwischen vier C-Atomen bzw. drei Benzolringen) aufweisen, sind stark kanzerogen (CONNEY, 1982). Diese Metaboliten gehen u. a. kovalente Bindungen mit der freien Aminogruppe des Guanins von DNS und RNS ein (KOREEDA et al., 1977).

Eine Möglichkeit des Körpers, lipophile Fremdstoffe wie die PAK´s zu eliminieren, besteht in ihrer metabolischen Kopplung an hydrophile Verbindungen (Sulfat, Glucuronsäure, Glutathion), da die entstehenden Fremdstoffmetaboliten weit schneller über Galle und Nieren ausgeschieden werden als die unveränderten Fremdstoffe.

Das für die Funktionalisierung (Phase 1-Reaktion) bedeutsame Enzym Cytochrom P450 1A1 (s. u.) wird, wie auch CYP1A2, CYP1B1 (LI et al., 1998) und andere Enzyme, über den cytosolischen Aryl-Hydrocarbon-Rezeptor (Ah-Rezeptor) durch Benzo[a]pyren selbst induziert. Benzo[a]pyren und andere endogene (z. B.

Prostaglandine) und exogene Verbindungen (z. B. 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p- Dioxin und Indolo[3,2-b]carbazol, BJELDANES et al., 1991) binden nach Abdissoziation des Hitzeschockproteins 90 (hsp90) an diesen nahezu ubiquitär exprimierten Rezeptor (DOLWICK et al., 1993) und gelangen mit diesem in den Zellkern. Dort bewirkt der Rezeptor nach obligatorischer Dimerbildung mit dem „AhR- nuclear translocator“ (Arnt) (DOGRA et al., 1998) und Anlagerung an ein

„Xenobiotika Responsive Element“ (XRE) die verstärkte Expression des Cyp1A1- Gens (HANKINSON, 1995; SCHRENK, 1998). Wie SHIMIZU et al. (1999) zeigten, hat Benzo[a]pyren bei Langzeitapplikation auf die Haut von Mäusen kanzerogene Wirkung, nicht jedoch bei Tieren ohne Ah-Rezeptor (Ah -/-).

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Schrifttum 17 _________________________________________________________________

In unserer Arbeitsgruppe wird seit einiger Zeit untersucht, inwiefern bereits das Darmepithel als der Leber vorgeschaltete „Biochemische Barriere“ am Metabolismus von PAK´s beteiligt ist.

Diese Forschungen haben ergeben, daß der krebserregende PAK Benzo[a]pyren im menschlichen Darmepithel nicht nur einer zweischrittigen Metabolisierung unterliegt, welche unter anderem über Benzo[a]pyren-1- und Benzo[a]pyren-3-Hydroxid (Funktionalisierungsreaktion) zu Benzo[a]pyren-1- und -3-Sulfat (Konjugationsreaktion) führt, sondern daß Dünndarmenterozyten durch einen gerichteten Transport zurück in das Darmlumen noch vor dem Erreichen der Leber eine Eliminierung der beiden letztgenannten Metaboliten betreiben (BÜSEN et al., 2002). Dadurch wird die noch weitergehende Metabolisierung des Benzo[a]pyrens zum (+)-Benzo[a]pyren-7,8-dihydrodiol-9,10-Epoxid 2, dem am stärksten kanzerogenen Metaboliten, die vor allem in der Leber stattfindet, eingeschränkt, nicht jedoch verhindert, da die Eliminierung durch die Enterozyten in das Darmlumen und durch die Leber in die Gallenflüssigkeit nicht vollständig ist und sich unter den zahlreichen Reaktionsprodukten der Phase 1 auch die am stärksten kanzerogenen Metaboliten des Benzo[a]pyrens befinden (CONNEY, 1982). Die erleichterte Eliminierung der Metaboliten wird also vom Organismus mit einer gesteigerten Kanzerogenität eines Teiles von ihnen „erkauft“.

Über die Blutbahn gelangen kanzerogene Metaboliten auch in Gewebe ohne Phase 1-Enzymaktivität (Muskulatur).

2.1.1. Funktionalisierungsreaktion (Phase 1)

2.1.1.1. Die Enzyme des Cytochrom-P450-Systems

Als Enzyme der Phase 1 des Fremdstoffmetabolismus im Darmepithel sind die Cytochrom-P450–Enzyme (CYP´s) von entscheidender Bedeutung. Diese in den Membranen des glatten endoplasmatischen Retikulums (und in geringerem Umfang auch in den Mitochondrien ) fast aller tierischen Zellen (außer den reifen Erythrozyten und den Skelettmuskelzellen) sowie manchen Prokaryoten, Pflanzen und Pilzen nachgewiesene Enzymsuperfamilie katalysiert eine Vielzahl von Reaktionen an endogenen und exogenen Substraten. Die Benennung der gesamten Enzymgruppe

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erfolgte aufgrund der charakteristischen Lichtabsorption bei 450 nm Wellenlänge nach Bindung von Kohlenmonoxid an die als prosthetische Gruppe in das Enzymmolekül eingelagerte Hämgruppe.

Innerhalb der Superfamilie richtet sich die Einteilung in Familien, Subfamilien und Einzelenzyme nach den Sequenzhomologien der Proteinstränge. Bis heute werden mehr als 230 Einzelenzyme unterschieden (LEWIS, 1996).

Alle CYP´s fügen als Monooxygenasen jeweils ein einzelnes Sauerstoffatom in ein Substratmolekül ein. Das bei der Spaltung von molekularem Sauerstoff freiwerdende zweite Sauerstoffatom reagiert zu Wasser weiter. Die allgemeine Reaktionsgleichung der durch CYP´s katalysierten Redoxreaktion an einem Substrat S lautet:

NADPH+H⁺ + O2 + SH NADP⁺ + H2O + S-OH

Diese Reaktion ist an einer Vielzahl von endogenen (Fettsäuren, Steroide) und exogenen Substraten möglich, wobei sich die Substratspezifitäten der einzelnen Enzyme z. T. stark überlappen. Auch die Entstehung von Epoxiden durch Einfügung eines Sauerstoffatoms in Doppelbindungen wird durch CYP´s katalysiert.

Die zur Reduktion des im Häm enthaltenen Eisenatoms (Fe³⁺ Fe²⁺) sowie zur Spaltung des Sauerstoffmoleküls benötigten Elektronen werden den CYP’s durch ein ebenfalls in den Membranen des glatten ER enthaltenes Enzym, die CYP 450- Reduktase, einzeln zugeleitet (OKITA und MASTERS, 1997).

2.1.1.2. Die Epoxidhydrolasen

Die zweite an der Funktionalisierung beteiligte Enzymgruppe sind die Epoxidhydrolasen. Sie sind den CYP-450-Enzymen in den Membranen des Endoplasmatischen Retikulums räumlich eng benachbart, werden aber in ihrer Expression getrennt reguliert (de PIERRE und ERNSTER, 1977). Sie katalysieren die Reaktion von Wasser mit Epoxiden zu trans-Dihydrodiolen (YANG et al., 1977) und begrenzen damit den Umfang der drei anderen möglichen Reaktionen der Epoxide. Dies sind 1. die kovalente Bindung an zelluläre Bestandteile wie DNS, RNS,

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Schrifttum 19 _________________________________________________________________

Proteine und Lipide, 2. die Konjugation an Glutathion durch Glutathion-S- Transferasen und 3. die spontane Umlagerung der Epoxide zu einwertigen Alkoholen (SIMS, 1969).

Ihr Vorkommen ist in zahlreichen Geweben beschrieben, darunter der Dünndarm, ihre höchsten Konzentrationen finden sich in der Leber (de WAZIERS et al., 1990).

2.1.2. Konjugationsreaktion (Phase 2)

Die aus der Funktionalisierungsreaktion hervorgehenden Phase 1- Metaboliten sind zwar bereits hydrophiler als die Ausgangssubstanzen, bedürfen aber häufig zur Eliminierung aus dem Organismus einer Konjugation mit einem intrazellulär vorhandenen, polaren Molekül (Konjugationsagens). Als wichtige Konjugationsreaktionen sind hier die Sulfatierung, die Glucuronidierung und die Glutathionkonjugation zu nennen.

2.1.2.1. Sulfatierung

Die Sulfatierung erfolgt durch die Mitglieder der Enzymsuperfamilie der Sulfotransferasen. Diese beim Menschen u. a. in Leber, Niere, Magen, Darm, Lunge, Schilddrüse, Nebenniere, Gehirn und Ovar nachgewiesene cytosolische Enzymgruppe katalysiert die Reaktion des Cofaktors 3´-Phosphoadenosin-5´- Phosphosulfat (PAPS, aktiviertes Sulfat) mit einer großen Zahl von endogenen und exogenen Substraten, die eine Hydroxyl-, Amino- oder Sulfhydrylgruppe aufweisen, z. B. Steroide und Catecholamine (FALANY, 1997; NAGATA und YAMAZOE, 2000;

DOOLEY et al., 2000; GLATT, 2000). Dabei wird dem Substrat eine SO3-Gruppe angefügt. Der Cofaktor PAPS wird im Cytosol durch das Enzym PAPS-Synthetase aus ATP und anorganischem Sulfat gebildet.

2.1.2.2. Glucuronidierung

Eine Glucuronidierung funktionalisierter PAK´s, darunter auch Benzo[a]pyren, findet durch die an die Membranen des Endoplasmatischen Retikulums und der Perinukleären Zisterne gebundene Enzymgruppe der UDP-Glucuronosyltransferasen statt (HU und WELLS, 1992). UDP-Glucuronosyltransferasen benötigen für die Konjugationsreaktionen den Cofaktor Uridindiphosphoglucuronsäure (UDP-

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Glucuronsäure, aktivierte Glucuronsäure). Auch diese Enzymsuperfamilie metabolisiert eine Vielzahl endogener und exogener Substrate und ist wie die CYP- 450-Enzyme über den Ah-Rezeptor, aber auch unabhängig von diesem über ein sog.

„Antioxidant-responsive element“ (ARE) induzierbar (BUETLER et al., 1995;

PRIMIANO et al., 1997), z. B. durch t-Butylhydroquinon (TBHQ) (MÜNZEL et al., 1999). Ihre Mitglieder wurden im menschlichen Körper bereits in Leber, Nieren, Gehirn und Darmepithel nachgewiesen (RADOMINSKA-PANDYA et al., 1998).

Aufgrund von Sequenzhomologien und Substratpräferenzen (bei erheblichen Überlappungen) werden die menschlichen UDP-Glucuronosyltransferasen in die Familien UGT1 (Phenol- und Bilirubin- metabolisierende Isoformen) und UGT2 (Steroid-metabolisierende Isoformen) unterteilt (BURCHELL et al., 1995), wobei die Expression der Enzyme UGT1A1, 1A6 und 2B7 im menschlichen Darm gezeigt werden konnte. Eine Induktion von UDP-Glucuronosyltransferasen ist möglich, z. B.

durch 3-Methylcholanthren und Phenobarbital (HERBER et al., 1995). Ein kausaler Zusammenhang zwischen einem hereditären Mangel an UGT´s und der Entstehung von Benzo[a]pyren-DNS-Addukten wurde von VIENNEAU et al. (1995) in kutanen Fibroblasten von Ratten und Homogenaten dieser Zellen gezeigt. Genetisch bedingte Störungen der Glucuronidierung mit z.T. resultierender unkonjugierter Hyperbilirubinämie treten in unterschiedlichen Schweregraden (Gilbert-Syndrom, Crigler-Najjar-Syndrom) auch beim Menschen auf (BURCHELL und COUGHTRIE, 1989). Sie können zu einer vermehrten Bioaktivierung exogener Substanzen, z. B.

Acetaminophen, zu zytotoxischen Metaboliten führen (de MORAIS et al., 1992).

2.1.2.3. Glutathionkonjugation

Eine dritte Möglichkeit zur Konjugation von Phase-1-Metaboliten ist die durch Glutathion-S-Transferasen, eine Gruppe dimerischer Enzyme, katalysierte Reaktion zu Thiolethern mit dem Tripeptid Glutathion. Dieses wird im Körper ubiquitär im Rahmen des ]-Glutamylzyklus durch die Enzyme ]-Glutamylcystein-Synthetase und GSH-Synthetase bereitgestellt und nimmt eine zentrale Rolle bei der Abwehr von Zellschäden durch oxidativen Streß ein (MEISTER, 1991). Beim Menschen werden vier Klassen von cytosolischen GST´s (M, L, ^, _) sowie zwei membrangebundene GST´s unterschieden (BECKETT und HAYES, 1993).

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Schrifttum 21 _________________________________________________________________

PRIMIANO et al. (1995) demonstrierten an Rattenlebern die Induktion der Aktivität mehrerer cytosolischer GST´s durch das Chemoprotektivum Oltipraz (5-[2-pyrazinyl]- 4-methyl-1,2-Dithiol-3-Thion).

PETERS et al. (1989) und RANGANATHAN et al. (1991) zeigten in verschiedenen humanen Colontumoren eine gegenüber nichttumorösem Gewebe vermehrte Expression von GST-^.

2.2. Transport

Die Reaktionsprodukte der Konjugationsreaktionen (Phase 2-Metaboliten) sind dank ihrer größeren Hydrophilie leichter über Gallenflüssigkeit und Harn auszuscheiden als die unveränderten PAK´s und die Phase 1-Metaboliten. Aufgrund ihres anionischen Charakters sind sie aber nicht mehr membrangängig und bedürfen zum Verlassen der Zelle spezifischer Transportproteine. Die Familie der ABC („ATP- binding-cassette“) -Transportproteine transportiert Konjugate zahlreicher Endo- und Xenobiotika unter ATP-Verbrauch durch die Zytoplasmamembranen vieler Zellarten (LESLIE et al., 2001). Diese Enzyme eliminieren aber auch metabolisierte und unveränderte Cytostatika aus Tumorzellen. Ihr gehören mindestens 40 verschiedene Proteine in pro- und eukaryotischen Zellen an (GOTTESMAN und PASTAN, 1993).

Im menschlichen Körper sind dies das P-Glycoprotein (Pgp), die Multidrug resistance associated proteins (MRP´s) und das Breast Cancer Resistance Protein (BCRP) (DOYLE und ROSS, 2003). P-Glykoprotein und die MRP-Proteine weisen trotz vergleichbarer Funktionen im Zellstoffwechsel nur 15% Sequenzhomologie auf (KEPPLER et al.,1997).

2.2.1. P-Glykoprotein (Pgp)

P-Glykoprotein (Pgp) ist das Produkt des MDR1 (multiple drug resistance 1)-Gens und beim Menschen u. a. in Leber, Pankreas, Niere, Kapillaren des Gehirns und des Hodens, wo es zur Ausbildung der Blut-Gewebeschranken beiträgt, Nebenniere, Colon- und Jejunumepithel nachgewiesen (THIEBAUT et al.,1987; CORDON- CARDO et al.,1989; TATSUTA et al.,1992). Seine Fähigkeit zum Export vieler unterschiedlicher Substrate aus der Zelle wird als eine der Hauptursachen für das Scheitern von Chemotherapien gegen Tumoren angesehen, welche wie ihre

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Ausgangszelltypen in Leber, Pankreas, Niere oder Colon diesen Transporter konstitutiv exprimieren (KRUH et al., 1995), im Zuge ihrer malignen Transformation seine Expression begonnen haben oder damit auf die Einwirkung von Chemotherapeutika reagieren (GOTTESMAN und PASTAN, 1993).

SCHUETZ et al. (1996) zeigten, daß eine Reihe von Substanzen, z. B.

Phenobarbital, sowohl die Expression von P-Glykoprotein als auch von CYP3A4 steigern.

2.2.2. Multidrug resistance associated proteins (MRP´s)

Die Proteine der MRP-Superfamilie sind als Transmembranproteine (Mg ca. 190 kDa) in einer Vielzahl tierischer und pflanzlicher Zellen vertreten und transportieren ein breites Spektrum an Substraten, darunter Aminosäuren und Peptide, Phospholipide, Steroide, Polysaccharide und organische Anionen endogener und exogener Herkunft, darunter auch Glucuronid-, Sulfat- und Glutathionkonjugate (JEDLITSCHKY et al., 1996; BORST et al., 2000). Die Proteine der Superfamilie werden sowohl in Cytoplasmamembranen als auch in den Membranen von Zellorganellen gefunden (FLENS et al.,1996). Beim Menschen werden inzwischen acht verschiedene Transporter als MRP´s klassifiziert (MRP1-8, auch hier mit überlappenden Substratspezifitäten), von denen zumindest MRP1 und MRP2 (eine andere Bezeichnung lautet „canalicular Multispecific Organic Anion Transporter“(cMOAT), da er in der den Gallenkanälchen zugewandten Membran der Hepatozyten gefunden wurde; KEPPLER und KÖNIG, 1997) eine Rolle im Transport von Xenobiotika zugeschrieben wird. Im menschlichen Dünndarm konnten MRP1 und MRP3, die eine hohe Übereinstimmung (75%) in ihrer Aminosäuresequenz aufweisen (KOOL et al., 1997) an der basolateralen Seite der hochprismatischen Enterozyten nachgewiesen werden, cMOAT/MRP2 dagegen in den Mikrovilli der apikalen Zellmembran (SCHUETZ und SCHINKEL, 1999). Im Gegensatz zum P- Glykoprotein transportieren die MRP´s vorwiegened Sulfat-, Glucuronid- und Glutathionkonjugate bzw. führen einen Cotransport eines unkonjugierten Moleküls mit Glutathion aus (ZAMAN et al., 1995; HIROHASHI et al., 1999).

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Schrifttum 23 _________________________________________________________________

2.2.3. Breast Cancer Resistance Protein (BCRP)

DOYLE et al. (1998) beschreiben das u. a. in der Coloncarcinomzellinie S1-M1-80 (MIYAKE et al.,1999) exprimierte, für apikale Transportvorgänge verantwortliche Breast Cancer Resistance Protein (BCRP). Dieses 655 Aminosäuren umfassende ABC-Transportprotein wurde mittlerweile in einer Anzahl nicht tumorös veränderter menschlicher Zellen und Gewebe nachgewiesen (MALIEPAARD et al., 2001), u. a.

auch in der apikalen Zellmembran des Dünndarm- und Colonepithels. ZAMBER et al.

(2003) beschreiben möglicherweise funktionell relevante Punktmutationen des humanen BCRP, die Expression von BCRP-mRNS und –Protein in intestinalen Zellen ist nach ihren Ergebnissen hohen interindividuellen Schwankungen unterworfen. BCRP verleiht Tumorzellen u. a. Resistenz gegen Mitoxantron, Doxorubicin und Daunorubicin. BCRP weist allgemein erhebliche Überlappungen in der Substratspezifität mit P-Glykoprotein, MRP1 und cMOAT/MRP2 auf (ALLEN und SCHINKEL, 2002). Durch dieses Protein vermittelte Chemotherapeutikaresistenzen waren experimentell durch Fumitremorgin C (FTC) und verschiedene seiner Derivate aufhebbar (RABINDRAN et al., 2000; van LOEVEZIJN et al., 2001).

2.3. Pyren als Modellsubstanz

Der Polyzyklische Aromatische Kohlenwasserstoff Pyren (C16H10 , Molekulargewicht 202,26 Dalton) wurde als Modellsubstanz ausgewählt, da er nach Struktur und Molekülgröße als typischer Vertreter der PAK´s gelten kann, aufgrund der fehlenden

„Bay-Region“ jedoch nicht die kanzerogenen Eigenschaften hat, die manche PAK´s, vor allem Benzo[a]pyren, in den vergangenen Jahrzehnten in den Mittelpunkt des wissenschaftlichen Interesses gerückt haben.

Pyren zeigt, im Gegensatz zu Benzo[a]pyren, trotz großer Ähnlichkeit der Molekülgestalt keine Mutagenität im Ames-Test (McCANN et al., 1975). Eine fehlende Metabolisierung durch den Organismus ist jedoch nicht die Ursache für diesen Unterschied, denn Untersuchungen aus den 50er Jahren belegen eine Metabolisierung von Pyren zu Pyren-1-Hydroxid (Strukturformel siehe Abb. 2) und Pyren-1-Glucuronid in der Leber von Mäusen nach intravenöser Injektion (HARPER,

1958).

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Die Entstehung von Pyren-1-Hydroxid und 4,5-Dihydro-4,5-Dihydroxypyren in Rattenleberpräparationen sowie zusätzlich von Pyren-1,3- und -1,6-Hydroxid im gesamten Tier wurde 1970 von SIMS gezeigt.

GROVER et al. (1972) wiesen Pyren-4,5-Epoxid als metabolische Vorstufe des 4,5- Dihydro-4,5-Dihydroxypyrens in Rattenlebermikrosomen nach. Diese Autoren vermuten eine besonders schnelle Umlagerung von Pyren-1,2-Epoxid zum Pyren-1- Hydroxid als Ursache dafür, daß zwar Pyren-1-Hydroxid in ihren Versuchen als Metabolit des Pyrens nachweisbar war, nicht jedoch das Pyren-1,2-Epoxid und dessen alternatives Reaktionsprodukt Pyren-1,2-Dihydro-1,2-Diol. Diese alternativen Phase-1-Reaktionswege von Pyren sind in Abbildung 2 dargestellt.

Abb. 2. Mögliche Phase 1-Reaktionswege des Pyrens (oben) über Pyren-1,2-Epoxid (Mitte) zu Pyren- 1,2-Dihydro-1,2-Diol (unten links) und Pyren-1-Hydroxid (unten rechts).

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Schrifttum 25 _________________________________________________________________

Nach den Ergebnissen von JACOB et al. (1982) ist eine Induktion des Pyrenmetabolismus in Rattenlebermikrosomen durch Phenobarbital, Polychlorierte Biphenyle und mehrere PAK´s (darunter Benzo[a]pyren) möglich. Dabei verschieben Phenobarbital und Polychlorierte Biphenyle das Metabolitenspektrum stark in die Richtung der sog. K-Region-Metaboliten.

(Die K-Region eines PAK ist eine Region des Moleküls mit besonders stark ausgebildetem Doppelbindungscharakter, im Falle des Pyrens die C-Atome 4,5,9 und 10.)

Bei diesen Versuchen gelang auch der Nachweis von metabolisch entstandenen Pyren-Triolen und –Tetrolen.

Die durch 3-Methylcholanthren und andere Substanzen induzierbare Metabolisierung von Pyren-1-Hydroxid zum Pyren-1-Glucuronid durch Rattenlebermikrosomen und die humanen UGT´s 1A6, 1A7 und 1A9 wurde von LUUKKANEN et al. (1997; 2001) beschrieben.

Im Gegensatz zu den verschiedenen Studien zum Pyrenmetabolismus in den Lebern von Versuchstieren war das Darmepithel als Ort der Metabolisierung und des Transportes dieses PAK noch nicht Gegenstand gezielter Forschung.

Eine Untersuchung von Metabolismus- und Transportvorgängen im Darmepithel, denen Pyren einerseits und kanzerogene PAK’s wie Benzo[a]pyren andererseits unterworfen sind, sollte Schlüsse darüber zulassen, ob die für kanzerogene PAK´s beschriebenen Metabolismuswege Allgemeingültigkeit innerhalb der gesamten Stoffklasse haben.

2.4. Verwendete Zellinien

2.4.1. Die Caco-2-Zelle

Die für die Versuche im Rahmen der vorliegenden Arbeit hauptsächlich benutzte Zellinie stammt aus einem Adenokarzinom des Colons eines 72-jährigen männlichen Patienten. HIDALGO et al. (1989), BOULENC et al. (1992) und CHANTRET et al.

(1994) zeigten, das diese Zellinie für das Darmepithel typische Eigenschaften wie polare Differenzierung, Ausbildung einer hochprismatischen Zellgestalt sowie von

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Tight Junctions, Desmosomen und Mikrovilli (einschließlich ihrer Markerenzyme Alkalische Phosphatase und Sucrase-Isomaltase) aufweist.

Auf Kunststoffoberflächen (Nitrozellulose, Polycarbonat, etc.) bilden Caco-2-Zellen nach der Aussaat einen einschichtigen, geschlossenen Monolayer (DELIE und RUBAS, 1997).

ARTURSSON (1989) stellte bei der Untersuchung der passiven Diffusion unterschiedlich lipophiler Substanzen starke Übereinstimmungen zwischen dem Caco-2-Monolayer und einem In-situ-Modell des Rattenileums fest.

BOULENC et al. (1992) zeigten die Expression von CYP1A1 in Caco-2-Zellen. Eine Induktion seiner Expression über den Ah-Rezeptor durch ß-Naphtoflavon, Benzo[a]pyren, 3-Methylcholanthren und Benz[a]anthracen ist möglich, nicht jedoch eine Induktion durch Phenobarbital (ROSENBERG und LEFF, 1993; DAUJAT et al., 1996; PRUEKSARITANONT et al., 1996).

Auch die Expression von Enzymen der Unterfamilie CYP3A, nämlich von CYP3A4 (durch 1M,25-Dihydroxivitamin D3 induzierbar), CYP3A5 und CYP3A7, sowie von CYP2D6 wurde in Caco-2-Zellen festgestellt (SCHMIEDLIN-REN et al., 1997).

Die Sulfatierung von Dopamin und p-Nitrophenol durch Caco-2-Zellen und die Abhängigkeit dieser Vorgänge vom Differenzierungsstand der Zellen wurden von BARANCZYK-KUZMA et al. (1991) gezeigt, TAMURA et al. (2001) wiesen die Genexpression der humanen Sulfotransferasen SULT1A1 , SULT1A3, SULT1C1, SULT1C2, SULT1E1 und SULT2A1 in Caco-2-Zellen nach.

Die Uridin-Diphosphoglucuronosyltransferasen UGT1A6, UGT1A9 und UGT2B7 sind in Caco-2-Zellen vorhanden und induzierbar (MÜNZEL et al., 1999).

SABOLOVIC et al. (2000) fanden UGT1A3,UGT1A6 und UGT2B7 in Caco-2-Zellen.

Die Expression von UGT1A3 und UGT1A6 war in ihren Versuchen durch ß- Naphtoflavon induzierbar.

BEAUMONT et al. (1998) wiesen in diesem Zelltyp mRNS, Protein und Enzymaktivität von GST-^ sowie eine geringere Menge an GST-M -immunoreaktivem Protein nach.

Die mRNS-Transkripte der Transmembranproteine p-Glykoprotein, cMOAT/MRP2, MRP3, MRP5, MRP6 und MRP1 sowie in geringer Menge auch BCRP und MRP4 wurden in Caco-2-Zellen nachgewiesen (TAIPALENSUU et al., 2001). Pgp, cMOAT/MRP2 und BCRP sind in der Zytoplasmamembran der apikalen, die übrigen Transporter auf der basolateralen Zellseite nachgewiesen (HUNTER et al., 1993;

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Schrifttum 27 _________________________________________________________________

HIROHASHI et al., 2000). BOCK et al. (2000) zeigten eine Induktion von cMOAT/MRP2 in Caco-2-Zellen durch TBHQ, nicht jedoch durch TCDD.

2.4.2. Der Caco-2-Klon TC7

Beim Klon TC7 handelt es sich um Caco-2-Zellen, die aufgrund einer hohen Passagezahl (>198) eine Veränderung ihrer morphologischen und biochemischen Eigenschaften erfahren haben. Hierzu zählen eine gegenüber anderen Klonen gesteigerte Proliferation (20-24 Stunden anstelle von 34-36 Stunden Verdoppelungszeit), eine höhere Zelldichte nach Konfluenz und Abschluß der Zellteilung (ca. 16*10⁶ Zellen/25 cm² gegenüber 11*10⁶ Zellen/25 cm² bei herkömmlichen Caco-2-Zellen) sowie Unterschiede in der Expression von Enzymen, wie der Sucrase-Isomaltase (CHANTRET et al., 1994).

Eine für die Metabolisierung von PAK´s relevante Besonderheit dieses Caco-2- Klones besteht in der konstitutiven Expression von Cytochrom P450 3A (CARRIÈRE et al., 1994), welches in herkömmlichen Caco-2-Zellen gar nicht oder nur in geringer Menge nachweisbar ist (PRUEKSARITANONT et al., 1996).

2.4.3. Die MDCK II – Zelle

MDCK (Madin-Darby canine kidney) II – Zellen sind eine aus dem nicht tumorös veränderten Nierenepithel eines Hundes (Cocker-Spaniel) gewonnene Zellinie, die in ihrer Morphologie (Ausbildung eines einschichtigen Zellayers mit Tight Junctions, Desmosomen und Mikrovilli) dem Epithel der proximalen Nierentubuli ähnelt (MISFELDT et al., 1975; GONZALEZ-MARISCAL et al., 1984), während der eng verwandte Klon MDCK I eher dem Epithel der Sammelrohre entspricht (RICHARDSON et al., 1980).

MDCK II-Zellen weisen nur eine geringe Expression des caninen Pgp auf (SOLDNER et al., 2000).

EVERS et al. (1998) und CUI et al. (1999) gelang die stabile Transfektion von Zellen des Klons MDCK II mit dem humanen cMOAT/MRP2 – Gen, welches selektiv auf der apikalen Zellseite exprimiert wird und den so veränderten Zellen Cytostatikaresistenzen verleiht (TANG et al., 2002).

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2.4.4. Die V79 – Zelle

V79-Zellen sind eine aus Fibroblasten der Lunge des Chinesischen Hamsters spontan entstandene Zellinie, deren Morphologie (spindelförmige Zellgestalt, Faserproduktion) ihren Ursprung aus dem Bindegewebe deutlich erkennen läßt.

GLATT et al. (1990) fanden in V79-Zellen zwar Cytochrom-P450-Reduktase- und Epoxidhydrolase-, aber keinerlei Monooxygenaseaktivität (Benzo[a]pyren wird infolgedessen nicht metabolisiert) .

Diese Zellen besitzen eine hohe Aktivität von Glutathion-S-Transferasen, aber keinerlei endogene Aktivität von UDP-Glucuronosyltransferasen (EBNER und BURCHELL, 1992; OUZZINE et al., 1994) oder Enzymen der SULT-Superfamilie.

ENGST et al. (2002) gelang die Transfektion von V79-Zellen mit den Genen verschiedener humaner Sulfotransferasen und der Nachweis ihrer Aktivität.

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3. Material und Methoden

3.1. Material

3.1.1. Chemikalien

Pyren- sowie Pyren-1-Hydroxid-Stammlösungen wurden in Konzentrationen von 10, 20 und 40 mM in Aceton oder Dimethylsulfoxid (DMSO) angesetzt und bei –20°C aufbewahrt.

Pyren, seine Metaboliten, Benzo[a]pyren, Chrysen und Benzo[k]fluoranthen wurden vom Biochemischen Institut für Umweltcarcinogene, Prof. Dr. Gernot Grimmer- Stiftung, Großhansdorf, dankenswerterweise zur Verfügung gestellt, ebenso Indeno- (1,2,3-cd)-Fluoranthen als interner Standard für die Chromatographie.

Ko 143 war ein Geschenk von A. H. Schinkel, Krebsforschungsinstitut der Niederlande, Amsterdam.

3.1.2. Weitere Reagenzien, Bezugsnachweis

Aceton Aldrich, Steinheim

Chloroform Merck, Darmstadt

DMSO Fluka, Buchs, CH

Diethylpyrocarbonat (DEPC) Roth, Karlsruhe

Ethanol Merck, Darmstadt

Ethidiumbromid Merck, Darmstadt

Formaldehyd AppliChem, Darmstadt

Gelatine, Typ A Sigma, Deisenhofen Guanidinthiocyanat (GTC) Roth, Karlsruhe Indol-3-Carbinol Sigma, Deisenhofen

Isopropanol Fluka, Buchs, CH

2-Mercaptoethanol Sigma, Deisenhofen

Methanol Malinckrodt Baker, Deventer, NL 3-Methylcholanthren Sigma, Deisenhofen

M-Naphtoflavon (7,8-Benzoflavon) Sigma, Deisenhofen

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ß-Naphtoflavon (5,6-Benzoflavon) Sigma, Deisenhofen tri-Natriumcitrat-2-hydrat Merck, Darmstadt Natrium-Laurylsarcosin Sigma, Deisenhofen Oltipraz (5-[2-pyrazinyl]- McKesson BioServices, 4-methyl-1,2-Dithiol-3-Thion) San Francisco, CA, USA Penicillin-Streptomycin

(10000U bzw. 10000 Lg/ml) Gibco BRL, Eggenstein

Rifampicin Sigma, Deisenhofen

Toluol Aldrich, Steinheim

Triethylamin Fluka, Buchs, CH

Trypsin-EDTA Solution (10 x) Gibco BRL, Eggenstein

Alle Lösungsmittel und Substanzen hatten die Qualität „HPLC gradient grade“,“reinst“

oder „p. a.“.

Hochreines Wasser wurde aus einem Milli-Qplus-Wasserreinigungssystem (Millipore, Eschborn) bezogen. Für RNS-Analytik benutztes Wasser wurde gemäß den Herstellerangaben zusätzlich zur Inaktivierung von Ribonukleasen mit DEPC behandelt.

3.1.3. Zellkulturmedium und Zusätze, Bezugsnachweis

Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium (DMEM) Gibco BRL, Eggenstein Fötales Rinderserum Cytogen, Lohmar MEM (100*) Nichtessentielle Aminosäuren Gibco BRL, Eggenstein HEPES-Pufferlösung (1 M) Gibco BRL, Eggenstein 3.1.4. Verwendete Puffer

PBS-Puffer

Stoff Menge (g/l)

CaCl2 0,100

KCl 0,200

KH2PO4 0,200

MgCl2*6 H2O 0,100

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Material und Methoden 31 _________________________________________________________________

Na2HPO4* 2H2O 1,150

NaCl 8,000

Die Chemikalien wurden nach dem Abwiegen mit Milli-Qplus PF-Wasser auf 1l aufgefüllt und autoklaviert.

3.1.5. Verwendete Zellinien, Bezugsnachweis

Caco-2 (Parentale Zellinie und Klon TC7) wurden von der „European Collection of Cell Culture” (EACC) käuflich erworben.

V79 wurde freundlicherweise von Prof. Dr. H. Glatt, Deutsches Institut für Ernährung, Potsdam, MDCK II (MRP2) von P. Borst, Krebsforschungsinstitut der Niederlande, Amsterdam, zur Verfügung gestellt.

Das zur Kultivierung dieser Zellen (mit Ausnahme von Caco-2, Klon TC7) verwendete Medium bestand aus Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium nach Zusatz von 10% (v/v) Fötalem Rinderserum (bei 56°C für 30 min inaktiviert) und Penicillin/Streptomycin (100 IU/ml bzw.100 Lg/ml).

Caco-2-Zellen des Klons TC7 wurden mit Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium kultiviert, dem 20% Fötales Rinderserum, 3% HEPES-Pufferlösung (1 M), 1% MEM (100*) Nichtessentielle Aminosäuren sowie Penicillin/Streptomycin (100 IU/ ml bzw.

100 Lg/ml) zugesetzt wurden.

3.1.6. Verbrauchsmaterialien und Laborhilfsmittel, Bezugsnachweis

Einfriercontainer Nalgene, Rochester, NY, USA Einmalkanülen NORM-JECT R (0,9*40 mm) Henke-Sass Wolf GmbH, Tuttlingen Einmalspritzen NORM-JECT R (2 ml) Henke-Sass Wolf GmbH, Tuttlingen Falconröhrchen 15 und 50 ml Greiner Cellstar, Frickenhausen

Glasflaschen 30 ml Omnilab Laborzentrum, Gehrden Glaspipetten 1, 2, 5, 10, 25 ml, geeicht Brand, Wertheim

5 und 10 ml-Glasspritzen (Fortuna^®) Omnilab Laborzentrum,Gehrden

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Glaspetrischalen, 28 cm²(Duran^®) Omnilab Laborzentrum, Gehrden HPLC-Vials Agilent Technologies, Palo Alto, CA,

USA

Kryoröhrchen (2 ml) Nalgene, Rochester, NY, USA Membran-Vakuumpumpe Vakuubrand GmbH, Wertheim Mikroeinsatz für HPLC-Vials CS-Chromatographie Service,

Langerwehe

Mikroliterspritzen (25 und 250 Ll) Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz, CH ODS-Pulver (C18-Pulver) Mallinckrodt Baker, Deventer, NL Parafilm^®M American National Can^TM, Neehnah,

WI, USA

Pasteurpipetten Brand, Wertheim

Pipettierhilfe (Pipetus^®-akku) Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt PTFE-Fritten Mallinckrodt Baker, Deventer, NL Schraubkappen für HPLC-Vials Agilent Technologies, Palo Alto, CA,

USA

Schüttelapparat Titramax 100 Heidolph, Kelheim Schüttel- und Mischgerät ReaxTop Heidolph, Kelheim

Spitzkolben, 50 und 100ml (Duran^®) Omnilab Laborzentrum, Gehrden Sterilfiltereinheiten (0,2 Lm) Nalgene, Rochester, NY, USA

Transwell^®, 24 mm Durchmesser, Corning Costar Co., Cambridge, MA,

0,4 Lm Porengröße USA

Ultraschallbad Sonorex Super Bandelin electronic, Berlin AK514BH

Wasserbad GFL^® Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel

Wasserbad Laborota 2004^® Heidolph, Kelheim Zellkulturschale Greiner Cellstar, Frickenhausen Zellkulturflaschen 25 und 75 cm² Greiner Cellstar, Frickenhausen

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3.2. Methoden

3.2.1. Zellkulturmethoden

Die Kultur aller verwendeten Zellen erfolgte in einem CO2-Brutschrank (Nuaire, Sarstedt) bei einer Temperatur von 37°C, einer relativen Luftfeuchte von 95% und einem CO2-Gehalt von 5%.

Sämtliche Arbeitsschritte, welche ein Öffnen von Medium- und/oder Zellkulturgefäßen erforderten, wurden zur Vermeidung bakterieller Kontaminationen in einer Sterilwerkbank (Heto-Holten A/S, Allerød, DK) vorgenommen.

3.2.1.1. Passagierung

Ein Wechsel des Kulturmediums wurde bei den Caco-2-Zellen der parentalen Zellinie (in den folgenden Abschnitten als Caco-2-Zellen bezeichnet) und V79-Zellen alle 3-4 Tage, bei Caco-2-Zellen des Klons TC7 und MDCK II-Zellen täglich vorgenommen.

Dies geschah entweder als bloßer Mediumaustausch oder (nach Erreichen von 80- 90%iger Konfluenz der Monolayer) im Rahmen einer Passagierung der Zellen.

Die Passagierung erfolgte nach dem Absaugen des Mediums mit einer Pasteurpipette durch Auftragen von 1 ml bzw. 2 ml (bei Kulturflaschen mit 25 bzw.

75 ml Volumen) einer Trypsin-EDTA-PBS-Lösung (Endkonzentration 0,2 % Trypsin und 0,08 % EDTA) auf die Zellen. Nach einer Inkubation von etwa 5 Minuten wurden die sich makroskopisch sichtbar ablösenden Zellen in frischem, 37°C warmem Medium aufgenommen und in einem Falconröhrchen für 5 min bei 300*g zentrifugiert. Daraufhin wurden der Überstand abgesaugt und das Zellpellet in frischem Medium resuspendiert. Die Verteilung auf neue Zellkulturgefäße erfolgte im Verhältnis 1:3 bis 1:5.

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3.2.1.2. Einfrieren von Zellen

Zum Einfrieren wurden die Zellen nach Abtrypsinierung und Zentrifugation (s.o.) in 20°C warmem Einfriermedium (80% DMEM, 20% Fötales Rinderserum, 10% DMSO) resuspendiert.

Der Zellinhalt einer 75 cm² großen Zellkulturflasche wurde dabei in 5 ml Einfriermedium aufgenommen und auf 5 Kryoröhrchen verteilt.

Anschließend wurden die Röhrchen in die Vertiefungen eines auf 4°C vorgekühlten Einfriercontainers mit isopropanolgefüllter Kühlmittelkammer gestellt und über Nacht in einer Kühltruhe (-80°C, Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel) aufbewahrt. Am darauffolgenden Tag wurden die Röhrchen zur permanenten Lagerung in einen Flüssigstickstoffbehälter (-196°C, MVE Inc., Bloomington, MN, USA ) überführt.

3.2.1.3. Auftauen von Zellen

Zum Auftauen der Zellen aus einem Kryoröhrchen wurde dieses bis zur Verflüssigung seines Inhaltes in einem 37°C warmen Wasserbad geschwenkt. Dieser wurde daraufhin in ein Falconröhrchen überführt und nach tröpfchenweiser Zugabe von 10 ml 37°C warmem Medium bei 300*g zentrifugiert. Die Aussaat erfolgte in einer mit 20 ml Medium gefüllten, 75 cm²großen Zellkulturflasche.

3.2.1.4. Kultivierung von Zellen in Glaspetrischalen

Glaspetrischalen mit einer Zellkulturfläche von 28 cm² wurden nach Autoklavierung mit 3 ml einer 37°C warmen, autoklavierten Lösung von Gelatine (10 mg/ml in Milli- Qplus PF-Wasser) befüllt, um die Anheftung der Zellen zu ermöglichen. Nach 30 min wurden diese Lösung abgesaugt und die Zellsuspension eingefüllt. Das Medium wurde anschließend alle 3-4 Tage gewechselt.

3.2.1.5. Kultivierung von Zellen im Transwell^®-System

Zur Durchführung von Transportexperimenten wurden Zellen im Transwell^®-System kultiviert, einem Inkubationsgefäß, dessen Besonderheit im Vorhandensein von Doppelkammern (Wells) besteht, die nur durch die Poren (Durchmesser 0,4 Lm)

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einer waagerechten Polycarbonatmembran (Oberfläche 4,71 cm²) verbunden sind.

Nach vorherigem Befüllen der unteren (basolateralen) Kammern mit jeweils 2 ml Zellkulturmedium wurden die sechs oberen (apikalen) Kammern einer Transwell^®- Platte mit jeweils 2 ml Zellsuspension befüllt, wobei die präkonfluenten Zellen aus einer großen Zellkulturflasche (75 cm²) zur Aussaat auf eine Transwell^® benutzt wurden, was einer Zelldichte von 1,6*10⁶ Zellen/Well bzw 3,5*10⁵ Zellen/cm² Membranoberfläche entsprach.

24 Stunden nach der Aussaat wurde erstmals das Medium gewechselt, um nicht angeheftete Zellen aus der oberen Kammer zu entfernen, danach erfolgte der Mediumwechsel alle 3-4 Tage. Das in einem Well enthaltene Mediumvolumen betrug während der Kultivierung und der Versuche, sofern nicht anders angegeben, stets 4 ml, davon 2 ml in der oberen und 2 ml in der unteren Kammer.

Die Ausbildung eines geschlossenen Zellmonolayers auf der Polycarbonatmembran wurde ab dem 7. Tag nach Aussaat durch Messung des Transepithelialen Elektrischen Widerstandes (TEER) indirekt kontrolliert.

Hierfür wurde jede Transwell^® -Platte für 10 min in eine mit einem Heizblock (Biometra^® TB1 Thermoblock) auf 42°C erwärmte Wasserschale gestellt, um auch außerhalb des Brutschrankes innerhalb der Wells eine konstante Temperatur von 37°C zu erhalten.

Auf diese Weise wurde eine Veränderung des Widerstandes durch Temperaturschwankungen vermieden.

Die Widerstandsmessung erfolgte bei gleichzeitigem Eintauchen der beiden

Schenkel einer Chopstick-Elektrode in die apikale und die basolaterale Kammer einer jeden Well (ermöglicht durch drei Aussparungen (Ports) in den Wänden jeder Well) mit einem Widerstandsmeßgerät (Epithelial Voltohmmeter, World Precision

Instruments, Sarasota, FL, USA). Die Messung wurde in jedem Port doppelt durchgeführt.

Bei einem Widerstandsmeßwert von >300 g*cm²(bzw. 120 g*cm²bei Monolayern aus MDCK II-Zellen) wurde die Geschlossenheit des Zellteppichs angenommen (BÜSEN et al., 2002).

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3.2.2. Versuchsdurchführung

Die Versuche wurden unabhängig von der Art des Kulturgefäßes nach Ausdifferenzierung der Zellen am Tag 7 (MDCK II), Tag 14 (Caco-2-Zellen des Klons TC-7) oder Tag 21 (Caco-2, ausgenommen Klon TC-7) nach der Aussaat begonnen.

Während aller Inkubationen mit chemischen Induktoren, Hemmern oder PAK´s wurden die Zellkulturgefäße auf einer Schüttelapparatur sanft kreisend bewegt, um den die Aufnahme in die Zellen hemmenden Efffekt des „unstirred water layer“ zu minimieren. Mediumproben wurden nach der Entnahme unverzüglich bei –20°C eingefroren und die Zellen unter Zuhilfenahme eines Schabers von den Glasoberflächen getrennt.

3.2.2.1. Versuche zum Pyrenmetabolismus

3.2.2.1.1. Bestimmung der Kinetik der Pyrenmetabolisierung in Caco-2-Zellen

Zur Untersuchung der Frage, zu welchen Metaboliten und in welchem Umfang Caco- 2-Zellen Pyren verstoffwechseln, wurden Caco-2-Zellen (Passagezahl p50) in gelatinebeschichteten Glaspetrischalen mit unterschiedlichen Pyrenkonzentrationen inkubiert. Am 21. Tag nach der Aussaat wurde das Normalmedium in den Schalen durch jeweils 5 ml Medium ersetzt, welches Pyren (Stammlösung 10 mM in Aceton) in den Konzentrationen 2 LM, 10 LM, 25 LM, 100 LM und 200 LM) enthielt. Nach 12 Stunden Inkubation wurden Medien und Zellen von den Schalen abgenommen und auf Pyren und seine Metaboliten untersucht.

3.2.2.1.2. Induktion des Pyrenmetabolismus in Caco-2-Zellen durch ß-Naphtoflavon Eine mögliche Beeinflussung des Pyrenmetabolismus durch das Flavonoid ß- Naphtoflavon, einen über den Ah-Rezeptor wirksamen CYP1A1- (ZHANG et al., 1997), CYP1A2- (SHEN et al., 1998; RUNGE et al., 2000) und CYP1B1-Induktor (KRUSEKOPF et al., 2003), wurde geprüft, indem Caco-2-Zellen (p48) in kleinen Glaspetrischalen am 21. Tag nach Aussaat in der Hälfte der Gefäße für 24 Stunden mit 50 LM ß-Naphtoflavon (Stammlösung 50 mM in DMSO) und nach

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Mediumwechsel in allen Gefäßen für 2, 4, 8 und 12 Stunden mit 10 LM Pyren (Stammlösung 10 mM in Aceton) inkubiert wurden.

3.2.2.1.3. Induktion des Pyrenmetabolismus in Caco-2-Zellen (Klon TC7) durch ß- Naphtoflavon

In Glaspetrischalen kultivierte Caco-2-Zellen des Klons TC7 (p32) wurden am 14.

Tag nach Aussaat zur Hälfte mit 5 ml einer Lösung von 50 LM ß-Naphtoflavon (Stammlösung 50 mM in DMSO) inkubiert, in den übrigen Schalen erfolgte ein normaler Mediumwechsel. Nach 24 Stunden wurden diese Medien in allen Schalen durch 5 ml einer Lösung von 20 LM Pyren (Stammlösung 20 mM in DMSO) in Medium ersetzt. Die Medien wurden nach 4, 8, 12 und 24 Stunden abgenommen.

3.2.2.1.4. Bestimmung der am Pyrenmetabolismus beteiligten Sulfotransferasen Zur Beantwortung der Frage, welche der verschiedenen humanen Sulfotransferasen am Metabolismus von Pyren beteiligt sind, wurden stabil mit den Genen für 4 humane Sulfotransferasen (hSULT1A1*Arg, hSULT1A2*1, hSULT1A3 und hSULT1B1) transfizierte V79-Zellen sowie V79-Kontrollzellen (MZ) in gelatinebeschichteten Glaspetrischalen kultiviert. 24 Stunden nach der Aussaat erfolgte in der Hälfte der Schalen der Austausch gegen eine Lösung von 3 ml 20 LM Pyren (Stammlösung 40 LM in DMSO), in der anderen Hälfte der Schalen gegen 3 ml einer Lösung von 20 LM Pyren-1-Hydroxid ( Stammlösung 40 LM in DMSO). Die Abnahme der Medien erfolgte nach 24 Stunden.

3.2.2.2. Versuche zum Transport

3.2.2.2.1. Transport von Pyrenmetaboliten durch Caco-2-Zellen und Induktion des Pyrenmetabolismus durch ß-Naphtoflavon

Ein möglicher gerichteter Transport von Pyren und/oder seiner Metaboliten durch Caco-2-Zellen und ein möglicher Effekt des CYP-450-1A1-Induktors ß-Naphtoflavon wurden durch einen Versuch mit in Transwell^®-Gefäßen kultivierten Zellen (p43) untersucht. Dabei wurde das Kulturmedium am 21. Tag nach Aussaat in der Hälfte

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der Wells beiderseits der Membran durch eine Lösung von 50 LM ß-Naphtoflavon (Stammlösung 50 mM in DMSO) in Medium, in den anderen Wells durch Medium mit einem Anteil von 1% DMSO (v/v) ersetzt.

Nach 24-stündiger Inkubation erfolgte in allen Wells der Austausch gegen eine Lösung von Pyren (10 LM, Stammlösung 10 mM in DMSO) im Medium. Die Medien wurden nach 4, 8, 12 und 24 Stunden abgenommen.

3.2.2.2.2. Transport von Pyrenmetaboliten durch Caco-2-Zellen und Induktion des Pyrenmetabolismus durch verschiedene Substanzen

Eine mögliche Induktion des Pyrenmetabolismus durch verschiedene weitere CYP1A1-Induktoren wurde untersucht, indem Caco-2-Zellen (p50) auf acht Transwells^® kultiviert und vom 21. bis zum 22. Tag nach Aussaat in jeweils zwei Transwells^® mit verschiedenen Induktoren der Cytochrom-P450-Enzyme inkubiert wurden.

Dabei handelte es sich um folgende Substanzen und Konzentrationen:

1.) 10 LM 3-Methylcholanthren (Stammlösung 10mM in DMSO), einen PAK und potenten Induktor des CYP1A1, nicht jedoch des CYP3A4 (ROSENBERG und LEFF, 1993; KOCAREK et al., 1995)

2.) 100 LM Indol-3-Carbinol (Stammlösung 50 mM in DMSO), eine in Cruciferen, z.B. Rosen- und Blumenkohl, enthaltene Verbindung. Eine Induktion der Cytochrome CYP1A1, CYP1A2 sowie in geringerem Maße auch CYP2B1 und/oder CYP2B2 nach Indol-3-Carbinol-Applikation wurde an Rattenlebern in vivo durch JELLINCK et al. (1993) gezeigt. Sein Reaktionsprodukt Indolo[3,2- b]carbazol stellt einen potenten Ah-Rezeptoragonisten dar (GILLNER et al., 1985; BJELDANES et al., 1991).

3.) 80 LM Oltipraz (Stammlösung 50 mM in DMSO), ein synthetisches Derivat des natürlich vorkommenden 1,2-Dithiol-3-thions. Es wird als Chemoprotektivum und CYP1A1-Induktor über den Ah-/XRE-Induktionsweg (LE FERREC et al., 2002) eingesetzt, hemmt hingegen CYP1A2 und CYP3A4 (LANGOUËT et al., 1995). KENSLER et al. (1985) zeigten ferner an Rattenlebern in vivo eine Erhöhung der spezifischen Aktivitäten der

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Epoxidhydrolase sowie der UDP-Glucuronosyl- und Glutathion-S- Transferasen nach Oltipraz-Applikation.

Die Zellen der anderen zwei Transwell^®-Platten dienten als unbehandelte Kontrolle.

In allen Wells wurden die Medien nach Ende der Vorinkubation durch Lösungen von 20 LM Pyren in Medium (Stammlösung 40 mM in DMSO) ersetzt, eine Abnahme erfolgte nach 4, 8 und 12 Stunden.

3.2.2.2.3. Transport von Pyrenmetaboliten durch Caco-2-Zellen unter chemischer Hemmung des Pyrenmetabolismus

Um die Beteiligung von CYP1-Enzymen am Metabolismus von Pyren zu prüfen, erfolgte eine Inkubation von Caco-2-Zellen (p50) auf Transwell^®-Platten mit dem CYP1A1-, CYP1A2- und CYP1B1-Inhibitor M-Naphtoflavon (GUENGERICH, 1992;

GUENGERICH et al., 2003; CHANG et al., 1994). Hierzu wurde das Medium in allen Wells auf beiden Seiten der Membran am 21. Tag der Kultivierung gegen Medium mit einem Gehalt von 50 LM ß-Naphtoflavon (Stammlösung 50 mM in DMSO) ausgetauscht.

Nach 24h Inkubation wurde dieses Inkubationsmedium in der Hälfte der Wells für eine Stunde durch ein Medium ersetzt, welches M-Naphtoflavon in einer Konzentration von 200 LM (Stammlösung 100 mM in DMSO) enthielt, danach erfolgte der Austausch gegen ein Medium mit gleicher M-Naphtoflavonkonzentration und einer Pyrenkonzentration von 10 LM (Stammlösung 10 mM in Aceton).

In die andere Hälfte der Wells wurde für eine Stunde unverändertes Kulturmedium gefüllt, dann erhielten diese Zellen Medium mit einer Pyrenkonzentration von 10 LM ohne weitere Zusätze. Die Abnahme der Medien erfolgte nach 8 , 12, und 24 Stunden.

In einer anderen Versuchsanordnung wurden Caco-2-Zellen (p43) vom 27. Tag der Inkubation an zunächst für 24 Stunden mit 50 LM ß-Naphtoflavon (Stammlösung 50 mM in DMSO) inkubiert, dann erfolgte in der Hälfte der Wells für eine Stunde eine Inkubation mit 200 LM M-Naphtoflavon (Stammlösung 100 mM in DMSO), die andere Hälfte der Wells erhielt als Kontrolle Medium mit der gleichen DMSO-Konzentration, aber ohne chemischen Hemmer.

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Nach dieser einstündigen Inkubation erhielten alle Wells eine Lösung von 10 LM Pyren (Stammlösung 10 mM in Aceton). Die Medien wurden nach 2, 4, 8, 12 und 24 Stunden abgenommen.

3.2.2.2.4. Untersuchung auf Transport durch cMOAT/MRP2 in MDCK II-Zellen

Um das Multiresistenzprotein 2 (cMOAT/MRP2) auf eine mögliche Beteiligung am Transport von Pyrenmetaboliten zu untersuchen, wurden mit dem Gen für dieses Protein stabil transfizierte MDCK II-Zellen für 7 Tage auf Transwells^®kultiviert. Am 7.

Tag wurde das Kulturmedium in beiden Kammern der Wells gegen ein Medium ausgetauscht, welches Pyren in einer Konzentration von 10 LM (Stammlösung 10 mM in Aceton) enthielt. Dieses Medium wurde nach 4, 8, 12 und 24 Stunden abgenommen.

3.2.2.2.5. Untersuchung auf Transport durch BCRP in Caco-2-Zellen

Die mögliche Bedeutung des Breast Cancer Resistance Proteins (BCRP) am Transport von Pyrenmetaboliten wurde geprüft, indem Caco-2-Zellen (p58) 19 Tage nach der Aussaat in Transwell^®-Kammern für 48 Stunden mit 10 LM des CYP1A1- und CYP1A2-Induktors (LIU et al., 2001) Benzo[k]fluoranthen (Stammlösung 10 mM in DMSO) vorinkubiert und nach Abnahme dieses Mediums mit 5 LM Ko 143 (Stammlösung 10 mM in DMSO), einem Derivat des Fumitremorgin C und potenten BCRP-Inhibitor (DOYLE und ROSS, 2003), inkubiert wurden. Dabei betrug das Mediumvolumen in der oberen und unteren Kammer der Wells jeweils nur 1,5 ml.

Nach Ablauf einer Stunde wurden in die obere und untere Kammer jedes Wells jeweils 0,5 ml Medium gegeben, welches 40 LM Pyren-1-Hydroxid (Stammlösung 20 mM in DMSO) enthielt, wodurch sich im Gemisch Konzentrationen von 3,75 LM Ko 143 und 10 LM Pyren-1-Hydroxid ergaben. Die Abnahme der Medien erfolgte nach 3, 6 und 9 Stunden.

3.2.3. HPLC-Analytik von Pyren und Pyrenmetaboliten

Die zur chromatographischen Bestimmung von Pyren und seiner Metaboliten angewandten Methoden umfassen die Aufarbeitung von aus den Versuchen

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erhaltenen Mediumproben, deren Chromatographie sowie die statistische Auswertung der Ergebnisse.

3.2.3.1. Probenaufarbeitung 3.2.3.1.1. Festphasenextraktion

Die Festphasenextraktion erfolgte in den Kartuschen von 10 ml-Glasspritzen, in welche zuvor mit dem Stempel zwei PTFE-Fritten sowie, zwischen diesen, 0,5 g ODS-Pulver (C18-Pulver) gepreßt worden waren.

Zur Aktivierung des Adsorbens wurden zunächst 10 ml Extraktionsmethanol (Methanol mit 0,05% (v/v) Triethylamin ) mit dem Stempel durch die Kartuschen gedrückt. Dieser Vorgang wurde zur Konditionierung des Materials an das wäßrige Zellkulturmedium unverzüglich mit 10 ml eines Gemisches (v/v) aus 80% Milli-Qplus

PF-Wasser und 20% reinem Methanol wiederholt.

Die Pyren und Pyrenmetabolite enthaltenden, unterdessen aufgetauten Mediumproben wurden daraufhin in die Kartuschen gefüllt und sickerten durch das Säulenmaterial.

Danach wurden in zwei Portionen weitere 10 ml des Wasser-Methanolgemisches, mit deren erster Portion zuvor verbliebene Mediumreste aus den Aufbewahrungsgefäßen gespült worden waren, auf die Säulen gegeben, um alle wasserlöslichen Bestandteile aus dem Säulenmaterial zu entfernen.

Die Extraktion der Pyrenverbindungen geschah anschließend durch Aufbringen von 30 ml Extraktionsmethanol. Dieses Extraktionsmittel wurde unterhalb der Säulen in 100 ml-Spitzkolben aufgefangen, nach dem Austropfen verbleibende Reste mit dem Stempel herausgepreßt.

Daraufhin wurden in jeden der Spitzkolben 0,6 Lg Indeno-(1,2,3-cd)-Fluoranthen (gelöst in 100 Ll Toluol) als interner Standard gegeben.

3.2.3.1.2. Lösungsmittelreduzierung

Das Volumen der Metabolitenlösungen wurde reduziert, indem die 100 ml- Spitzkolben an eine Rotationsverdampfungsapparatur (bestehend aus Membran-