3.1. Material
3.1.1. Chemikalien
Pyren- sowie Pyren-1-Hydroxid-Stammlösungen wurden in Konzentrationen von 10, 20 und 40 mM in Aceton oder Dimethylsulfoxid (DMSO) angesetzt und bei –20°C aufbewahrt.
Pyren, seine Metaboliten, Benzo[a]pyren, Chrysen und Benzo[k]fluoranthen wurden vom Biochemischen Institut für Umweltcarcinogene, Prof. Dr. Gernot Grimmer- Stiftung, Großhansdorf, dankenswerterweise zur Verfügung gestellt, ebenso Indeno-(1,2,3-cd)-Fluoranthen als interner Standard für die Chromatographie.
Ko 143 war ein Geschenk von A. H. Schinkel, Krebsforschungsinstitut der Niederlande, Amsterdam.
3.1.2. Weitere Reagenzien, Bezugsnachweis
Aceton Aldrich, Steinheim
Chloroform Merck, Darmstadt
DMSO Fluka, Buchs, CH
Diethylpyrocarbonat (DEPC) Roth, Karlsruhe
Ethanol Merck, Darmstadt
Ethidiumbromid Merck, Darmstadt
Formaldehyd AppliChem, Darmstadt
Gelatine, Typ A Sigma, Deisenhofen Guanidinthiocyanat (GTC) Roth, Karlsruhe Indol-3-Carbinol Sigma, Deisenhofen
Isopropanol Fluka, Buchs, CH
2-Mercaptoethanol Sigma, Deisenhofen
Methanol Malinckrodt Baker, Deventer, NL 3-Methylcholanthren Sigma, Deisenhofen
M-Naphtoflavon (7,8-Benzoflavon) Sigma, Deisenhofen
_________________________________________________________________
ß-Naphtoflavon (5,6-Benzoflavon) Sigma, Deisenhofen tri-Natriumcitrat-2-hydrat Merck, Darmstadt Natrium-Laurylsarcosin Sigma, Deisenhofen Oltipraz (5-[2-pyrazinyl]- McKesson BioServices, 4-methyl-1,2-Dithiol-3-Thion) San Francisco, CA, USA Penicillin-Streptomycin
(10000U bzw. 10000 Lg/ml) Gibco BRL, Eggenstein
Rifampicin Sigma, Deisenhofen
Toluol Aldrich, Steinheim
Triethylamin Fluka, Buchs, CH
Trypsin-EDTA Solution (10 x) Gibco BRL, Eggenstein
Alle Lösungsmittel und Substanzen hatten die Qualität „HPLC gradient grade“,“reinst“
oder „p. a.“.
Hochreines Wasser wurde aus einem Milli-Qplus-Wasserreinigungssystem (Millipore, Eschborn) bezogen. Für RNS-Analytik benutztes Wasser wurde gemäß den Herstellerangaben zusätzlich zur Inaktivierung von Ribonukleasen mit DEPC behandelt.
3.1.3. Zellkulturmedium und Zusätze, Bezugsnachweis
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium (DMEM) Gibco BRL, Eggenstein Fötales Rinderserum Cytogen, Lohmar MEM (100*) Nichtessentielle Aminosäuren Gibco BRL, Eggenstein HEPES-Pufferlösung (1 M) Gibco BRL, Eggenstein 3.1.4. Verwendete Puffer
PBS-Puffer
Stoff Menge (g/l)
CaCl2 0,100
KCl 0,200
KH2PO4 0,200
MgCl2*6 H2O 0,100
Material und Methoden 31 _________________________________________________________________
Na2HPO4* 2H2O 1,150
NaCl 8,000
Die Chemikalien wurden nach dem Abwiegen mit Milli-Qplus PF-Wasser auf 1l aufgefüllt und autoklaviert.
3.1.5. Verwendete Zellinien, Bezugsnachweis
Caco-2 (Parentale Zellinie und Klon TC7) wurden von der „European Collection of Cell Culture” (EACC) käuflich erworben.
V79 wurde freundlicherweise von Prof. Dr. H. Glatt, Deutsches Institut für Ernährung, Potsdam, MDCK II (MRP2) von P. Borst, Krebsforschungsinstitut der Niederlande, Amsterdam, zur Verfügung gestellt.
Das zur Kultivierung dieser Zellen (mit Ausnahme von Caco-2, Klon TC7) verwendete Medium bestand aus Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium nach Zusatz von 10% (v/v) Fötalem Rinderserum (bei 56°C für 30 min inaktiviert) und Penicillin/Streptomycin (100 IU/ml bzw.100 Lg/ml).
Caco-2-Zellen des Klons TC7 wurden mit Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium kultiviert, dem 20% Fötales Rinderserum, 3% HEPES-Pufferlösung (1 M), 1% MEM (100*) Nichtessentielle Aminosäuren sowie Penicillin/Streptomycin (100 IU/ ml bzw.
100 Lg/ml) zugesetzt wurden.
3.1.6. Verbrauchsmaterialien und Laborhilfsmittel, Bezugsnachweis
Einfriercontainer Nalgene, Rochester, NY, USA Einmalkanülen NORM-JECT R (0,9*40 mm) Henke-Sass Wolf GmbH, Tuttlingen Einmalspritzen NORM-JECT R (2 ml) Henke-Sass Wolf GmbH, Tuttlingen Falconröhrchen 15 und 50 ml Greiner Cellstar, Frickenhausen
Glasflaschen 30 ml Omnilab Laborzentrum, Gehrden Glaspipetten 1, 2, 5, 10, 25 ml, geeicht Brand, Wertheim
5 und 10 ml-Glasspritzen (Fortuna®) Omnilab Laborzentrum,Gehrden
_________________________________________________________________
Glaspetrischalen, 28 cm2(Duran®) Omnilab Laborzentrum, Gehrden HPLC-Vials Agilent Technologies, Palo Alto, CA,
USA
Kryoröhrchen (2 ml) Nalgene, Rochester, NY, USA Membran-Vakuumpumpe Vakuubrand GmbH, Wertheim Mikroeinsatz für HPLC-Vials CS-Chromatographie Service,
Langerwehe
Mikroliterspritzen (25 und 250 Ll) Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz, CH ODS-Pulver (C18-Pulver) Mallinckrodt Baker, Deventer, NL Parafilm®M American National CanTM, Neehnah,
WI, USA
Pasteurpipetten Brand, Wertheim
Pipettierhilfe (Pipetus®-akku) Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt PTFE-Fritten Mallinckrodt Baker, Deventer, NL Schraubkappen für HPLC-Vials Agilent Technologies, Palo Alto, CA,
USA
Schüttelapparat Titramax 100 Heidolph, Kelheim Schüttel- und Mischgerät ReaxTop Heidolph, Kelheim
Spitzkolben, 50 und 100ml (Duran®) Omnilab Laborzentrum, Gehrden Sterilfiltereinheiten (0,2 Lm) Nalgene, Rochester, NY, USA
Transwell®, 24 mm Durchmesser, Corning Costar Co., Cambridge, MA,
0,4 Lm Porengröße USA
Ultraschallbad Sonorex Super Bandelin electronic, Berlin AK514BH
Wasserbad GFL® Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel
Wasserbad Laborota 2004® Heidolph, Kelheim Zellkulturschale Greiner Cellstar, Frickenhausen Zellkulturflaschen 25 und 75 cm2 Greiner Cellstar, Frickenhausen
Material und Methoden 33 _________________________________________________________________
3.2. Methoden
3.2.1. Zellkulturmethoden
Die Kultur aller verwendeten Zellen erfolgte in einem CO2-Brutschrank (Nuaire, Sarstedt) bei einer Temperatur von 37°C, einer relativen Luftfeuchte von 95% und einem CO2-Gehalt von 5%.
Sämtliche Arbeitsschritte, welche ein Öffnen von Medium- und/oder Zellkulturgefäßen erforderten, wurden zur Vermeidung bakterieller Kontaminationen in einer Sterilwerkbank (Heto-Holten A/S, Allerød, DK) vorgenommen.
3.2.1.1. Passagierung
Ein Wechsel des Kulturmediums wurde bei den Caco-2-Zellen der parentalen Zellinie (in den folgenden Abschnitten als Caco-2-Zellen bezeichnet) und V79-Zellen alle 3-4 Tage, bei Caco-2-Zellen des Klons TC7 und MDCK II-Zellen täglich vorgenommen.
Dies geschah entweder als bloßer Mediumaustausch oder (nach Erreichen von 80-90%iger Konfluenz der Monolayer) im Rahmen einer Passagierung der Zellen.
Die Passagierung erfolgte nach dem Absaugen des Mediums mit einer Pasteurpipette durch Auftragen von 1 ml bzw. 2 ml (bei Kulturflaschen mit 25 bzw.
75 ml Volumen) einer Trypsin-EDTA-PBS-Lösung (Endkonzentration 0,2 % Trypsin und 0,08 % EDTA) auf die Zellen. Nach einer Inkubation von etwa 5 Minuten wurden die sich makroskopisch sichtbar ablösenden Zellen in frischem, 37°C warmem Medium aufgenommen und in einem Falconröhrchen für 5 min bei 300*g zentrifugiert. Daraufhin wurden der Überstand abgesaugt und das Zellpellet in frischem Medium resuspendiert. Die Verteilung auf neue Zellkulturgefäße erfolgte im Verhältnis 1:3 bis 1:5.
_________________________________________________________________
3.2.1.2. Einfrieren von Zellen
Zum Einfrieren wurden die Zellen nach Abtrypsinierung und Zentrifugation (s.o.) in 20°C warmem Einfriermedium (80% DMEM, 20% Fötales Rinderserum, 10% DMSO) resuspendiert.
Der Zellinhalt einer 75 cm2 großen Zellkulturflasche wurde dabei in 5 ml Einfriermedium aufgenommen und auf 5 Kryoröhrchen verteilt.
Anschließend wurden die Röhrchen in die Vertiefungen eines auf 4°C vorgekühlten Einfriercontainers mit isopropanolgefüllter Kühlmittelkammer gestellt und über Nacht in einer Kühltruhe (-80°C, Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel) aufbewahrt. Am darauffolgenden Tag wurden die Röhrchen zur permanenten Lagerung in einen Flüssigstickstoffbehälter (-196°C, MVE Inc., Bloomington, MN, USA ) überführt.
3.2.1.3. Auftauen von Zellen
Zum Auftauen der Zellen aus einem Kryoröhrchen wurde dieses bis zur Verflüssigung seines Inhaltes in einem 37°C warmen Wasserbad geschwenkt. Dieser wurde daraufhin in ein Falconröhrchen überführt und nach tröpfchenweiser Zugabe von 10 ml 37°C warmem Medium bei 300*g zentrifugiert. Die Aussaat erfolgte in einer mit 20 ml Medium gefüllten, 75 cm 2 großen Zellkulturflasche.
3.2.1.4. Kultivierung von Zellen in Glaspetrischalen
Glaspetrischalen mit einer Zellkulturfläche von 28 cm2 wurden nach Autoklavierung mit 3 ml einer 37°C warmen, autoklavierten Lösung von Gelatine (10 mg/ml in Milli-Qplus PF-Wasser) befüllt, um die Anheftung der Zellen zu ermöglichen. Nach 30 min wurden diese Lösung abgesaugt und die Zellsuspension eingefüllt. Das Medium wurde anschließend alle 3-4 Tage gewechselt.
3.2.1.5. Kultivierung von Zellen im Transwell®-System
Zur Durchführung von Transportexperimenten wurden Zellen im Transwell®-System kultiviert, einem Inkubationsgefäß, dessen Besonderheit im Vorhandensein von Doppelkammern (Wells) besteht, die nur durch die Poren (Durchmesser 0,4 Lm)
Material und Methoden 35 _________________________________________________________________
einer waagerechten Polycarbonatmembran (Oberfläche 4,71 cm2) verbunden sind.
Nach vorherigem Befüllen der unteren (basolateralen) Kammern mit jeweils 2 ml Zellkulturmedium wurden die sechs oberen (apikalen) Kammern einer Transwell ®-Platte mit jeweils 2 ml Zellsuspension befüllt, wobei die präkonfluenten Zellen aus einer großen Zellkulturflasche (75 cm2) zur Aussaat auf eine Transwell® benutzt wurden, was einer Zelldichte von 1,6*106 Zellen/Well bzw 3,5*105 Zellen/cm2 Membranoberfläche entsprach.
24 Stunden nach der Aussaat wurde erstmals das Medium gewechselt, um nicht angeheftete Zellen aus der oberen Kammer zu entfernen, danach erfolgte der Mediumwechsel alle 3-4 Tage. Das in einem Well enthaltene Mediumvolumen betrug während der Kultivierung und der Versuche, sofern nicht anders angegeben, stets 4 ml, davon 2 ml in der oberen und 2 ml in der unteren Kammer.
Die Ausbildung eines geschlossenen Zellmonolayers auf der Polycarbonatmembran wurde ab dem 7. Tag nach Aussaat durch Messung des Transepithelialen Elektrischen Widerstandes (TEER) indirekt kontrolliert.
Hierfür wurde jede Transwell® -Platte für 10 min in eine mit einem Heizblock (Biometra® TB1 Thermoblock) auf 42°C erwärmte Wasserschale gestellt, um auch außerhalb des Brutschrankes innerhalb der Wells eine konstante Temperatur von 37°C zu erhalten.
Auf diese Weise wurde eine Veränderung des Widerstandes durch Temperaturschwankungen vermieden.
Die Widerstandsmessung erfolgte bei gleichzeitigem Eintauchen der beiden
Schenkel einer Chopstick-Elektrode in die apikale und die basolaterale Kammer einer jeden Well (ermöglicht durch drei Aussparungen (Ports) in den Wänden jeder Well) mit einem Widerstandsmeßgerät (Epithelial Voltohmmeter, World Precision
Instruments, Sarasota, FL, USA). Die Messung wurde in jedem Port doppelt durchgeführt.
Bei einem Widerstandsmeßwert von >300 g*cm2(bzw. 120 g*cm2bei Monolayern aus MDCK II-Zellen) wurde die Geschlossenheit des Zellteppichs angenommen (BÜSEN et al., 2002).
_________________________________________________________________
3.2.2. Versuchsdurchführung
Die Versuche wurden unabhängig von der Art des Kulturgefäßes nach Ausdifferenzierung der Zellen am Tag 7 (MDCK II), Tag 14 (Caco-2-Zellen des Klons TC-7) oder Tag 21 (Caco-2, ausgenommen Klon TC-7) nach der Aussaat begonnen.
Während aller Inkubationen mit chemischen Induktoren, Hemmern oder PAK´s wurden die Zellkulturgefäße auf einer Schüttelapparatur sanft kreisend bewegt, um den die Aufnahme in die Zellen hemmenden Efffekt des „unstirred water layer“ zu minimieren. Mediumproben wurden nach der Entnahme unverzüglich bei –20°C eingefroren und die Zellen unter Zuhilfenahme eines Schabers von den Glasoberflächen getrennt.
3.2.2.1. Versuche zum Pyrenmetabolismus
3.2.2.1.1. Bestimmung der Kinetik der Pyrenmetabolisierung in Caco-2-Zellen
Zur Untersuchung der Frage, zu welchen Metaboliten und in welchem Umfang Caco-2-Zellen Pyren verstoffwechseln, wurden Caco-Caco-2-Zellen (Passagezahl p50) in gelatinebeschichteten Glaspetrischalen mit unterschiedlichen Pyrenkonzentrationen inkubiert. Am 21. Tag nach der Aussaat wurde das Normalmedium in den Schalen durch jeweils 5 ml Medium ersetzt, welches Pyren (Stammlösung 10 mM in Aceton) in den Konzentrationen 2 LM, 10 LM, 25 LM, 100 LM und 200 LM) enthielt. Nach 12 Stunden Inkubation wurden Medien und Zellen von den Schalen abgenommen und auf Pyren und seine Metaboliten untersucht.
3.2.2.1.2. Induktion des Pyrenmetabolismus in Caco-2-Zellen durch ß-Naphtoflavon Eine mögliche Beeinflussung des Pyrenmetabolismus durch das Flavonoid ß-Naphtoflavon, einen über den Ah-Rezeptor wirksamen CYP1A1- (ZHANG et al., 1997), CYP1A2- (SHEN et al., 1998; RUNGE et al., 2000) und CYP1B1-Induktor (KRUSEKOPF et al., 2003), wurde geprüft, indem Caco-2-Zellen (p48) in kleinen Glaspetrischalen am 21. Tag nach Aussaat in der Hälfte der Gefäße für 24 Stunden mit 50 LM ß-Naphtoflavon (Stammlösung 50 mM in DMSO) und nach
Material und Methoden 37 _________________________________________________________________
Mediumwechsel in allen Gefäßen für 2, 4, 8 und 12 Stunden mit 10 LM Pyren (Stammlösung 10 mM in Aceton) inkubiert wurden.
3.2.2.1.3. Induktion des Pyrenmetabolismus in Caco-2-Zellen (Klon TC7) durch ß-Naphtoflavon
In Glaspetrischalen kultivierte Caco-2-Zellen des Klons TC7 (p32) wurden am 14.
Tag nach Aussaat zur Hälfte mit 5 ml einer Lösung von 50 LM ß-Naphtoflavon (Stammlösung 50 mM in DMSO) inkubiert, in den übrigen Schalen erfolgte ein normaler Mediumwechsel. Nach 24 Stunden wurden diese Medien in allen Schalen durch 5 ml einer Lösung von 20 LM Pyren (Stammlösung 20 mM in DMSO) in Medium ersetzt. Die Medien wurden nach 4, 8, 12 und 24 Stunden abgenommen.
3.2.2.1.4. Bestimmung der am Pyrenmetabolismus beteiligten Sulfotransferasen Zur Beantwortung der Frage, welche der verschiedenen humanen Sulfotransferasen am Metabolismus von Pyren beteiligt sind, wurden stabil mit den Genen für 4 humane Sulfotransferasen (hSULT1A1*Arg, hSULT1A2*1, hSULT1A3 und hSULT1B1) transfizierte V79-Zellen sowie V79-Kontrollzellen (MZ) in gelatinebeschichteten Glaspetrischalen kultiviert. 24 Stunden nach der Aussaat erfolgte in der Hälfte der Schalen der Austausch gegen eine Lösung von 3 ml 20 LM Pyren (Stammlösung 40 LM in DMSO), in der anderen Hälfte der Schalen gegen 3 ml einer Lösung von 20 LM Pyren-1-Hydroxid ( Stammlösung 40 LM in DMSO). Die Abnahme der Medien erfolgte nach 24 Stunden.
3.2.2.2. Versuche zum Transport
3.2.2.2.1. Transport von Pyrenmetaboliten durch Caco-2-Zellen und Induktion des Pyrenmetabolismus durch ß-Naphtoflavon
Ein möglicher gerichteter Transport von Pyren und/oder seiner Metaboliten durch Caco-2-Zellen und ein möglicher Effekt des CYP-450-1A1-Induktors ß-Naphtoflavon wurden durch einen Versuch mit in Transwell®-Gefäßen kultivierten Zellen (p43) untersucht. Dabei wurde das Kulturmedium am 21. Tag nach Aussaat in der Hälfte
_________________________________________________________________
der Wells beiderseits der Membran durch eine Lösung von 50 LM ß-Naphtoflavon (Stammlösung 50 mM in DMSO) in Medium, in den anderen Wells durch Medium mit einem Anteil von 1% DMSO (v/v) ersetzt.
Nach 24-stündiger Inkubation erfolgte in allen Wells der Austausch gegen eine Lösung von Pyren (10 LM, Stammlösung 10 mM in DMSO) im Medium. Die Medien wurden nach 4, 8, 12 und 24 Stunden abgenommen.
3.2.2.2.2. Transport von Pyrenmetaboliten durch Caco-2-Zellen und Induktion des Pyrenmetabolismus durch verschiedene Substanzen
Eine mögliche Induktion des Pyrenmetabolismus durch verschiedene weitere CYP1A1-Induktoren wurde untersucht, indem Caco-2-Zellen (p50) auf acht Transwells® kultiviert und vom 21. bis zum 22. Tag nach Aussaat in jeweils zwei Transwells® mit verschiedenen Induktoren der Cytochrom-P450-Enzyme inkubiert wurden.
Dabei handelte es sich um folgende Substanzen und Konzentrationen:
1.) 10 LM 3-Methylcholanthren (Stammlösung 10mM in DMSO), einen PAK und potenten Induktor des CYP1A1, nicht jedoch des CYP3A4 (ROSENBERG und LEFF, 1993; KOCAREK et al., 1995)
2.) 100 LM Indol-3-Carbinol (Stammlösung 50 mM in DMSO), eine in Cruciferen, z.B. Rosen- und Blumenkohl, enthaltene Verbindung. Eine Induktion der Cytochrome CYP1A1, CYP1A2 sowie in geringerem Maße auch CYP2B1 und/oder CYP2B2 nach Indol-3-Carbinol-Applikation wurde an Rattenlebern in vivo durch JELLINCK et al. (1993) gezeigt. Sein Reaktionsprodukt Indolo[3,2-b]carbazol stellt einen potenten Ah-Rezeptoragonisten dar (GILLNER et al., 1985; BJELDANES et al., 1991).
3.) 80 LM Oltipraz (Stammlösung 50 mM in DMSO), ein synthetisches Derivat des natürlich vorkommenden 1,2-Dithiol-3-thions. Es wird als Chemoprotektivum und CYP1A1-Induktor über den Ah-/XRE-Induktionsweg (LE FERREC et al., 2002) eingesetzt, hemmt hingegen CYP1A2 und CYP3A4 (LANGOUËT et al., 1995). KENSLER et al. (1985) zeigten ferner an Rattenlebern in vivo eine Erhöhung der spezifischen Aktivitäten der
Material und Methoden 39 _________________________________________________________________
Epoxidhydrolase sowie der UDP-Glucuronosyl- und Glutathion-S-Transferasen nach Oltipraz-Applikation.
Die Zellen der anderen zwei Transwell®-Platten dienten als unbehandelte Kontrolle.
In allen Wells wurden die Medien nach Ende der Vorinkubation durch Lösungen von 20 LM Pyren in Medium (Stammlösung 40 mM in DMSO) ersetzt, eine Abnahme erfolgte nach 4, 8 und 12 Stunden.
3.2.2.2.3. Transport von Pyrenmetaboliten durch Caco-2-Zellen unter chemischer Hemmung des Pyrenmetabolismus
Um die Beteiligung von CYP1-Enzymen am Metabolismus von Pyren zu prüfen, erfolgte eine Inkubation von Caco-2-Zellen (p50) auf Transwell®-Platten mit dem CYP1A1-, CYP1A2- und CYP1B1-Inhibitor M-Naphtoflavon (GUENGERICH, 1992;
GUENGERICH et al., 2003; CHANG et al., 1994). Hierzu wurde das Medium in allen Wells auf beiden Seiten der Membran am 21. Tag der Kultivierung gegen Medium mit einem Gehalt von 50 LM ß-Naphtoflavon (Stammlösung 50 mM in DMSO) ausgetauscht.
Nach 24h Inkubation wurde dieses Inkubationsmedium in der Hälfte der Wells für eine Stunde durch ein Medium ersetzt, welches M-Naphtoflavon in einer Konzentration von 200 LM (Stammlösung 100 mM in DMSO) enthielt, danach erfolgte der Austausch gegen ein Medium mit gleicher M-Naphtoflavonkonzentration und einer Pyrenkonzentration von 10 LM (Stammlösung 10 mM in Aceton).
In die andere Hälfte der Wells wurde für eine Stunde unverändertes Kulturmedium gefüllt, dann erhielten diese Zellen Medium mit einer Pyrenkonzentration von 10 LM ohne weitere Zusätze. Die Abnahme der Medien erfolgte nach 8 , 12, und 24 Stunden.
In einer anderen Versuchsanordnung wurden Caco-2-Zellen (p43) vom 27. Tag der Inkubation an zunächst für 24 Stunden mit 50 LM ß-Naphtoflavon (Stammlösung 50 mM in DMSO) inkubiert, dann erfolgte in der Hälfte der Wells für eine Stunde eine Inkubation mit 200 LM M-Naphtoflavon (Stammlösung 100 mM in DMSO), die andere Hälfte der Wells erhielt als Kontrolle Medium mit der gleichen DMSO-Konzentration, aber ohne chemischen Hemmer.
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Nach dieser einstündigen Inkubation erhielten alle Wells eine Lösung von 10 LM Pyren (Stammlösung 10 mM in Aceton). Die Medien wurden nach 2, 4, 8, 12 und 24 Stunden abgenommen.
3.2.2.2.4. Untersuchung auf Transport durch cMOAT/MRP2 in MDCK II-Zellen
Um das Multiresistenzprotein 2 (cMOAT/MRP2) auf eine mögliche Beteiligung am Transport von Pyrenmetaboliten zu untersuchen, wurden mit dem Gen für dieses Protein stabil transfizierte MDCK II-Zellen für 7 Tage auf Transwells®kultiviert. Am 7.
Tag wurde das Kulturmedium in beiden Kammern der Wells gegen ein Medium ausgetauscht, welches Pyren in einer Konzentration von 10 LM (Stammlösung 10 mM in Aceton) enthielt. Dieses Medium wurde nach 4, 8, 12 und 24 Stunden abgenommen.
3.2.2.2.5. Untersuchung auf Transport durch BCRP in Caco-2-Zellen
Die mögliche Bedeutung des Breast Cancer Resistance Proteins (BCRP) am Transport von Pyrenmetaboliten wurde geprüft, indem Caco-2-Zellen (p58) 19 Tage nach der Aussaat in Transwell®-Kammern für 48 Stunden mit 10 LM des CYP1A1- und CYP1A2-Induktors (LIU et al., 2001) Benzo[k]fluoranthen (Stammlösung 10 mM in DMSO) vorinkubiert und nach Abnahme dieses Mediums mit 5 LM Ko 143 (Stammlösung 10 mM in DMSO), einem Derivat des Fumitremorgin C und potenten BCRP-Inhibitor (DOYLE und ROSS, 2003), inkubiert wurden. Dabei betrug das Mediumvolumen in der oberen und unteren Kammer der Wells jeweils nur 1,5 ml.
Nach Ablauf einer Stunde wurden in die obere und untere Kammer jedes Wells jeweils 0,5 ml Medium gegeben, welches 40 LM Pyren-1-Hydroxid (Stammlösung 20 mM in DMSO) enthielt, wodurch sich im Gemisch Konzentrationen von 3,75 LM Ko 143 und 10 LM Pyren-1-Hydroxid ergaben. Die Abnahme der Medien erfolgte nach 3, 6 und 9 Stunden.
3.2.3. HPLC-Analytik von Pyren und Pyrenmetaboliten
Die zur chromatographischen Bestimmung von Pyren und seiner Metaboliten angewandten Methoden umfassen die Aufarbeitung von aus den Versuchen
Material und Methoden 41 _________________________________________________________________
erhaltenen Mediumproben, deren Chromatographie sowie die statistische Auswertung der Ergebnisse.
3.2.3.1. Probenaufarbeitung 3.2.3.1.1. Festphasenextraktion
Die Festphasenextraktion erfolgte in den Kartuschen von 10 ml-Glasspritzen, in welche zuvor mit dem Stempel zwei PTFE-Fritten sowie, zwischen diesen, 0,5 g ODS-Pulver (C18-Pulver) gepreßt worden waren.
Zur Aktivierung des Adsorbens wurden zunächst 10 ml Extraktionsmethanol (Methanol mit 0,05% (v/v) Triethylamin ) mit dem Stempel durch die Kartuschen gedrückt. Dieser Vorgang wurde zur Konditionierung des Materials an das wäßrige Zellkulturmedium unverzüglich mit 10 ml eines Gemisches (v/v) aus 80% Milli-Qplus
PF-Wasser und 20% reinem Methanol wiederholt.
Die Pyren und Pyrenmetabolite enthaltenden, unterdessen aufgetauten Mediumproben wurden daraufhin in die Kartuschen gefüllt und sickerten durch das Säulenmaterial.
Danach wurden in zwei Portionen weitere 10 ml des Wasser-Methanolgemisches, mit deren erster Portion zuvor verbliebene Mediumreste aus den Aufbewahrungsgefäßen gespült worden waren, auf die Säulen gegeben, um alle wasserlöslichen Bestandteile aus dem Säulenmaterial zu entfernen.
Die Extraktion der Pyrenverbindungen geschah anschließend durch Aufbringen von 30 ml Extraktionsmethanol. Dieses Extraktionsmittel wurde unterhalb der Säulen in 100 ml-Spitzkolben aufgefangen, nach dem Austropfen verbleibende Reste mit dem Stempel herausgepreßt.
Daraufhin wurden in jeden der Spitzkolben 0,6 Lg Indeno-(1,2,3-cd)-Fluoranthen (gelöst in 100 Ll Toluol) als interner Standard gegeben.
3.2.3.1.2. Lösungsmittelreduzierung
Das Volumen der Metabolitenlösungen wurde reduziert, indem die 100 ml-Spitzkolben an eine Rotationsverdampfungsapparatur (bestehend aus
Membran-_________________________________________________________________
Vakuumpumpe und Wasserbad) angehängt und ihr Inhalt bei 40°C einem zunehmenden Unterdruck (bis 70 mbar) ausgesetzt wurden. Nach dem praktischen Verschwinden der Flüssigkeit wurden die im Spitzkolben verbliebenen, nichtflüchtigen Metabolite unter Einsatz von Ultraschall erneut in 6 ml reinem Methanol gelöst und die Rotationsverdampfung bei einem Unterdruck bis 30 mbar wiederholt. Es folgte, wiederum unter Zuhilfenahme von Ultraschall, die Aufnahme in 200 Ll reines Methanol und die Überführung in den Mikroeinsatz eines HPLC-Vials.
3.2.3.1.3. Abschließende HPLC-Vorbereitung
Die gefüllten HPLC-Vials wurden daraufhin geöffnet bei Raumtemperatur bis zur erneuten Verdunstung des Lösungsmittels unter dem Abzug gelagert.
Eine letzte Aufnahme in 60 Ll reinen Methanols, erneute Ultraschallbehandlung sowie eine 5-minütige Zentrifugation (Microfuge®R, Beckman, Palo Alto, CA, USA) bei 4°C und 5724*g (um die Sedimentation eventueller ungelöster Bestandteile herbeizuführen) gingen der HPLC-Analyse voraus.
3.2.3.2. HPLC-Analyse
Probennahme, chromatographische Trennung und photometrische Auswertung der Ergebnisse erfolgten als HPLC (High Performance Liquid Chromatography).
Verwendete Geräte Hersteller
Entgaser G1322A Hewlett-Packard, Waldbronn Binäre Pumpe G1312A Hewlett-Packard, Waldbronn Probennehmer G1313A Hewlett-Packard, Waldbronn Thermostat G1316A Hewlett-Packard, Waldbronn Säule BB PAH 16 plus (5Lm, 250 mm* Mallinckrodt Baker, Deventer, NL 3 mm i.D.)
DAD Detektor G1315A Hewlett-Packard, Waldbronn HPLC-Methode
Entnahmevolumen 30 Ll
Säulentemperatur 25°C
Material und Methoden 43 _________________________________________________________________
Fließmittel A Methanol
Fließmittel B Wasser
Flußrate 0,4 ml/min
Analysendauer 110 min
Equilibrierungsdauer 20 min
Gradient Zeit (min) %Fließmittel (v/v)
A B
0,0 20,0 80,0
1,0 20,0 20,0
10,0 40,0 60,0
40,0 60,0 40,0
70,0 100,0 0,0
100,0 100,0 0,0
110,0 20,0 80,0
130,0 20,0 80,0
Detektion Meßwellenlänge A: 275 nm,
Bandbreite 50 nm
Meßwellenlänge B: 290 nm, Bandbreite 15 nm
Referenzwellenlänge : 550 nm, Bandbreite 100 nm
Chromatogrammerstellung HPChemStation® 3.2.3.3. Auswertung
Die in den Chromatogrammen erscheinenden Peaks wurden anhand der für Pyren und seine Metabolite charakteristischen Retentionszeiten und UV-Spektren den einzelnen Verbindungen zugeordnet.
_________________________________________________________________
Die Retentionszeiten betrugen für Pyren-1-Glucuronid 11 Minuten, für Pyren-1-Sulfat 13 Minuten, für Pyren-1-Hydroxid 56 Minuten, für Pyren 64 Minuten und für den internen Standard INF (Indeno-(1,2,3-cd)-fluoranthen) 98 Minuten.
Aus der Fläche eines jeden Peaks wurde nach folgender Formel die zugehörige Substanzmenge errechnet:
Peakfläche [mAU] * substanzspez. Umrechnungsfaktor Stoffmenge [Lg] = ---
Peakfläche INF [mAU]/ Stoffmenge INF in der Probe [Lg]
Die Einführung eines substanzspezifischen Umrechnungsfaktors in die Gleichung ist erforderlich, da gleiche Stoffmengen verschiedener Metabolite aufgrund ihrer unterschiedlichen Absorptionscharakteristika unterschiedlich große Peaks erzeugen.
Die substanzspezifischen Umrechnungsfaktoren wurden durch Vergleich der durch bekannte Stoffmengen (Standards) der Metabolite erzeugten Peakflächen mit den durch INF erzeugten Peaks ermittelt.
Sie betragen für die einzelnen Substanzen:
INF 1,0
Pyren 3,44
Pyren-1- Sulfat 3,79 Pyren-1-Hydroxid 7,53 Pyren-1-Glucuronid 7,85
Die Umsetzung der Meßwerte in Grafiken sowie die Ermittlung von Mittelwerten, Standardabweichungen und statistischer Signifikanz wurden mit Hilfe der Programme Adobe Photoshop®, Microsoft Excel®und MathCad 8® vorgenommen.
Aussagen zur statistischen Signifikanz wurden unter einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p j0,05 getroffen.
Material und Methoden 45 _________________________________________________________________
3.2.4. Untersuchungen zur Genregulation 3.2.4.1. RNS-Isolierung
Um eine mögliche Induktion der Cytochrome 1A1 und 1B1, der UGT1A6, der humanen Sulfotransferasen 1A1 und 1B1 sowie der Transportproteine P-Glykoprotein und cMOAT/MRP2 durch Pyren zu untersuchen, wurden Caco-2-Zellen (p43) in Glaspetrischalen (28 cm2) kultiviert und am 21. Tag nach Aussaat für 24 und 48 Stunden mit Lösungen von jeweils 5 LM, 10 LM und 25 LM Pyren ( Stammlösung 40 mM in DMSO) inkubiert.
Als Kontrollen dienten dabei folgende Ansätze:
1. unbehandelte Zellen (24 und 48 Stunden inkubiert),
2. mit 0,25% DMSO für 24 bzw. 48 Stunden inkubierte Zellen,
3. mit 50 LM ß-Naphtoflavon (Stammlösung 50 mM in DMSO) für 24 bzw. 48 Stunden inkubierte Zellen,
3. mit 50 LM ß-Naphtoflavon (Stammlösung 50 mM in DMSO) für 24 bzw. 48 Stunden inkubierte Zellen,