Lipid Raft Assoziation von SI, DPP IV und P-gp in Caco-WT und siiPATB1 81

einen Knockdown der iPAT in ihrer Lipid Raft Assoziation beeinflusst werden, wurde folgendes Experiment durchgeführt. 8-10 d konfluente Caco-2 Zellen (Wildtyp und siiPATB1) wurden homogenisiert und mit einem Triton X-100 Lysepuffer lysiert. Die erhaltenen Lysate wurden, nach einem 15 minütigen Zentrifugationsschritt bei 16.000 g, für einen Saccharose Gradienten verwendet. Nach der Ultrazentrifugation der Gradienten wurden Fraktionen in 1 ml Schritten geerntet. Diese wurden je nach gefragtem Protein aufgeteilt und mit 96 % Ethanol über Nacht gefällt. Für SI und P-gp wurden 500 µl, für DPP IV 200 µl, für Annexin 50 µl gefällt. Am nächsten Tag wurden die Fällungen gewaschen, getrocknet und mit 30 µl Lämmli + DTT aufgenommen. Die Proben wurden dann auf eine SDS-PAGE aufgetragen und eine Western Blot Analyse angeschlossen.

Flotillin, RhoA und Annexin 2 wurden als Methodenkontrolle mitgeführt. Deren Verteilung in den Lipid Raft Fraktionen ist bekannt und sollte zudem in den Klonen unverändert sein. Flotillin ist mit Triton X-100 Rafts assoziiert und findet sich demnach in den Fraktionen geringer Dichte (floating Fraktionen). RhoA dagegen ist nicht Lipid Raft assoziiert und findet sich dementsprechend in den non-floating Fraktionen bzw. in den Fraktionen hoher Saccharosekonzentration. Die Bande von Flotillin liegt bei ~ 45-50 kDa, RhoA bei ~ 20 kDa. Für die Detektion wurden 20 µl Probe mit 20 µl 3x Lämmli + DTT gemischt und auf ein 12 % SDS Gel aufgetragen.

Ein Western Blot wurde anschließend durchgeführt und die Lumineszenz an der ChemiDoc visualisiert und das Ergebnis dokumentiert.

Abbildung 24: Western Blots B. DPP IV Gradienten, Ca C. P-gp Gradienten, Caco D. Annexin Gradienten, C E. Flotillin/RhoA Gradient

Die Kontrollproteine Flotill Kontrolle wurde für jeden Isolierung durchgeführt. In Es ist kein Unterschied in d

ots der Lipid Raft Isolierungen

er Caco-2 Zellen (Wildtyp und siiPATB1) h bei 4 °C und anschließender Zentrifugat es Lysates für die Herstellung eines Sacch rifugation bei 100.000 g für 18 h, wurden 50 esuspension in 30 µl Lämmlipuffer + DTT auf Plus Protein Marker wurde mitgeführt. Die De eszenz wurde an der Chemidoc erfasst und

g wurden jeweils die ersten drei und die letz se Gradienten, Caco-2 WT n=2 und siiPATB1 Caco-2 WT n=2 und siiPATB1 n=1

co-2 WT n=1 und siiPATB1 n=1 Caco-2 WT und siiPATB1

nten, Caco-2 WT und siiPATB1, Methodenkon

tillin und RhoA verhalten sich wie ange en durchgeführten Gradienten bzw. für

n Abbildung 24 E. ist exemplarisch eine K der Verteilung der Proteine zwischen Wil

) mit Triton X-100

und dem siiPATB1 Klone zu erkennen. Diese Ergebnisse bestätigten die technisch richtige Durchführung des Experiments.

Um eine Umverteilung in der Fraktionen beurteilen zu können wurden die Banden der ersten drei Fraktionen (1-3) und die der letzten drei Fraktionen (7-9) mit der Quantity One 4.5.2. Software quantifiziert. Die Daten wurden mit der GraphPad Prism Software analysiert.

Abbildung 25: Quantifizierung der Saccharose Gradienten

Die Dichte der detektierten Proteinbanden wurde mittels Quantity One 4.5.2. Software ermittelt und mit Hilfe der GraphPad Prism Software analysiert. Für alle drei ausgewerteten Proteine ergibt sich eine Umverteilung aus den Fraktionen geringer Dichte zu denen mit hoher Dichte.

Für die Proteine SI, DPP IV, P-gp und Annexin 2 konnten jeweils Umverteilungen aus den Fraktionen geringer Dichte zu den Fraktionen hoher Dichte gefunden werden. So beträgt für die Saccharose-Isomaltase in den siiPATB1 Zellen der

WT

WT siiPATB1

siiPATB1

WT WT

siiPATB1

siiPATB1

WT siiPATB1

siiPATB1 WT

A.

B.

C.

Rückgang in den Fraktionen 1-3 ~ 64 % bei gleichzeitiger Zunahme in den Fraktionen 7-9 auf ~ 166 % (im Vergleich zum Wildtyp 100 %; WT n=2; siiPATB1 n=1) (s. Abbildungen 24 + 25 A.).

Für DPP IV findet sich ein ähnliches Bild (s. Abbildung 24 B.). In siiPATB1 Zellen ist DPPIV in den Fraktionen 1-3 auf ~ 40 % im Vergleich zum Wildtyp vermindert. In den Fraktionen 7-9 wurde eine Zunahme von DPPIV auf ~ 196 % ermittelt (WT n=2;

siiPATB1 n=1) (s. Abbildung 25 B.).

P-gp zeigt ebenfalls eine Umverteilung im Gradienten in siiPATB1 (s. Abbildung 24 C.). In den Fraktionen 1-3 findet man nur ~ 90 % P-gp im Vergleich zum Wildtyp.

Dagegen ~ 116 % in den Fraktionen 7-9 (WT n=1; siiPATB1 n=1) (s. Abbildung 25 C.)

Für Annexin-2 konnte auch ein Shift beobachtet werden. Das Protein scheint nicht vollständig in die ersten beiden leichten Fraktionen zu flotieren, sondern in dichteren Fraktionen zu verbleiben (WT n=2, siiPATB1 n=1). Auf eine Quantifizierung wurde verzichtet, da dieses Protein nur als weitere Kontrolle für diesen Versuch verwendet werden sollte. Das Ergebnis der Western Blot Analyse ist dennoch bemerkenswert.

Obwohl die Anzahl der Experimente sicher nicht ausreicht um zweifelsfrei für jedes einzelne Protein die Richtigkeit der Ergebnisse zu verifizieren, weist die Gesamtheit der Ergebnisse dennoch eine sichere Tendenz auf, dass Proteine, die direkt oder indirekt von der Palmitoylierung abhängig sind, bei reduzierter Palmitoylierung schlechter mit Lipid Rafts assoziieren können.

5 Diskussion

Die Addition von Palmitat an Cysteinreste eines Proteins, die Palmitoylierung, ist eine der wichtigen Proteinmodifikationen in der Zelle (SMOTRYS, et al. 2004). Diese Modifikation dient Proteinen bei der Verankerung in der Zellmembran und spielt eine Rolle bei der Proteinsortierung, -zielsteuerung sowie der Proteinstabilität (ROCKS, et al. 2010). Die Palmitoylierung wird von Protein-Acyl-Transferasen (PATs) katalysiert.

Es wurde lange kontrovers diskutiert, ob es sich bei der Palmitoylierung ausschließlich um eine spontane Reaktion (Autoacylierung) handelt, oder ob tatsächlich Enzyme an dieser Reaktion beteiligt sind. In S. cerevisiae wurde schließlich der Beweis für eine enzymatische Aktivität der PATs, und somit deren Beteiligung an der Palmitoylierung geführt (BABU, et al. 2004). Das cysteinreiche DHHC Motiv, das allen PATs gemeinsam ist, bildet dabei das katalytische Zentrum (MITCHELL, et al. 2006). Zudem konnte gezeigt werden, dass PATs an der Zielsteuerung einiger Proteine zur Plasmamembran oder zu definierten Membranbereichen, wie Lipid Rafts, beteiligt sind (GREAVES, et al. 2010). Der wesentliche Unterschied zu anderen Modifikationen liegt in ihrer Reversibilität. Durch die relativ labile Thioesterbindung zwischen dem Cysteinrest und der Palmitoylgruppe ist ein dynamischer Wechsel der Proteine zwischen Palmitoylierung und Depalmitoylierung möglich. So werden Aktivität und Lokalisation der G-Protein Untereinheiten und von Ras Proteinen durch dynamische S-Acylierung reguliert (HANCOCK, et al. 1989; KLEUSS, et al. 2003). DHHC3 ist z.B. unabdingbar für den kontinuierlichen Transport der G-Protein α-Untereinheit zwischen dem Golgi Apparat und der Plasmamembran (FUKATA, et al. 2010).

Das humane ZDHHC3 Gen wird in hohem Maße in Gehirn, Lunge, Leber und Milz exprimiert (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/AceView). Eine Expression dieses Gens wurde aber auch im Auge, der Plazenta, in der Prostata und im Kolon gefunden.

Aktuelle Untersuchungen zu DHHC3 beschränken sich auf die Expression in neuronalen Zellen. So wird beschrieben, dass DHHC3 die zytoplasmatische Loop-Domäne der γ2 Untereinheit des GABA_A Rezeptors palmitoyliert (KELLER, et al.

2004; CHEN, et al. 2007; HUANG, et al. 2009). Vermutlich hat DHHC3 auch Einfluss

auf die Sortierung des GABAA Rezeptors in verschiedene Transportvesikel (KELLER, et al. 2004; CHEN, et al. 2007).

Die Relevanz der Palmitoylierung für intramolekulare Zusammenhänge konnte in neuronalen Zellen durch Knockdown Experimente eindrücklich gezeigt werden. So hat DHHC3 (DHHC2 und DHHC7 ebenfalls) eine wichtige Funktion während der Gehirnentwicklung (SHMUELI, et al. 2009). Offenbar führt die Einführung von shRNA gegen diese palmitoylierenden Proteine zu einer Hemmung der neuronalen Migration durch Fehlen der Palmitoylierung von NDEL1, einem Protein, welches in die Regulation von Dynein involviert ist.

Untersuchungen zum Einfluss der Palmitoylierung auf die Funktionalität und damit auf die Physiologie intestinaler Zellen gibt es nur ansatzweise (ROHWEDDER 2009).

Beachtenswerte Ergebnisse aus Studien an Mäusen zeigen, dass Palmitoyltransferasen im Gesamtkonzept des Organismus eine tragende Rolle einnehmen (MUKAI, et al. 2008; MILL, et al. 2009; LI, et al. 2010; SALEEM, et al.

2010). Grundlegende Forschungen zum Einfluss dieser Proteine auf das intrazelluläre Zusammenspiel aller Faktoren in der Zelle sind daher in vielerlei Hinsicht interessant.

Die Auswirkung eines Knockdowns der iPAT sollte anhand der SI als Glukosidase, DPP IV als Exopeptidase und P-gp als Transporterprotein untersucht werden. Mit den Ergebnissen aus den Experimenten sollte ein umfassenderer Eindruck zum Einfluss der DHHC3 gewonnen werden.

5.1 Die Größe und Lokalisation eines Tags sind irrelevant bei der