Molekularbiologische Methoden

Zur Isolierung von RNA aus Caco-2 Zellen, wurde das High Pure RNA Isolation Kit von Roche verwendet. Vorher wurden die Zellen in RNase freier Umgebung (und mit RNase freien Materialien) mit 1 ml 1x PBS von den Zellkulturschalen abgeschabt.

Anschließend wurden die Zellen mit Hilfe einer Spritze mit Kanüle (zuerst mit einer 21 G- und dann mit einer 26 G Kanüle) homogenisiert. Von diesem Homogenat wurden 200 µl für die Isolierung eingesetzt. Das weitere Vorgehen folgte dem Protokoll des Herstellers.

Im Anschluss wurde die erhaltene RNA mit Hilfe des Nanodrop ND 1000 auf Qualität (mögliche Degradation durch RNasen) und Menge überprüft.

600 ng RNA wurden zur anschließenden cDNA Synthese eingesetzt.

3.1.2 RT-PCR

Für die RT-PCR wurde isolierte RNA mit Hilfe der Reversen Transkriptase, einer thermolabilen RNA-abhängigen DNA-Polymerase, in einem ersten Schritt in cDNA umgeschrieben. In einem zweiten Schritt wurde die cDNA für die Polymerase-Kettenreaktion eingesetzt. Die dabei eingesetzte thermostabile DNA-Polymerase amplifizierte den gesuchten DNA-Abschnitt.

3.1.3 cDNA Synthese

Die cDNA wurde mit dem RevertAid^TM First Strand cDNA Synthesis Kit von Fermentas hergestellt. Die verwendeten Oligo-d(T)-Primer wurden in diesem Kit bereitgestellt. Die Durchführung erfolgte nach den Anweisungen des Herstellers.

3.1.4 PCR

Zur Vervielfältigung des gesuchten Genabschnittes (iPAT, Hsp, Aktin) wurde die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet. Die cDNA entstammte entweder Caco-2 Wildtyp Zellen oder siiPAT Caco-Zellen.

Ansatz

Menge Primer 1 3,0 µl Primer 2 3,0 µl Polymerase

Puffer

2,0 µl

dNTP´s 1,0 µl Template 0,5 µl Polymerase 0,3 µl A. bidest. auf 50 µl

Für Klonierungszwecke wurde eine proof reading Polymerase, die PfuUltra DNA Polymerase verwendet. Für Kontrollzwecke wurde die GoTaq® DNA Polymerase verwendet. Alle verwendeten Materialien wurden auf Eis gestellt und die Ansätze somit dort gekühlt pipettiert.

Programm

Temperatur Zeit/Dauer

preheating 95 °C 2 min

Denaturierung 95 °C 30 s

Annealing 64 °C 1 min 30 s

Elongation 72 °C 1 min

30 Zyklen

72 °C 10 min

3.1.5 Agarose-Gelelektrophorese

Mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese ist es möglich DNA-Fragmente anhand ihrer Größe aufzutrennen. Die negative geladene DNA bewegt sich dabei in einem elektrischen Feld vom negativ geladenen Pol zum positiv geladenen Pol. Generell wandern kleinere Fragmente schneller durch die Gelmatrix als große Fragmente.

Durch Variation der Gelmatrix, im prozentualen Anteil der Agarose, kann man die Auftrennung von kleinen bzw. großen Fragmenten verbessern. So wurden für kleine Fragmente Gele mit einem Agaroseanteil von 1 - 2 % verwendet. Für große Fragmente dagegen ein Agaroseanteil von 0,8 %. Für den Ansatz wurde 1x Tris-Acetat-EDTA Puffer (TAE-Puffer) verwendet. Zur Sichtbarmachung der DNA wurde Ethidiumbromid, ein Farbstoff, der sich zwischen die Basen der DNA interkaliert, dem Gel hinzugefügt. Er erhöht die Fluoreszenz der DNA unter UV-Licht. Den aufzutrennenden Proben wurde Bromphenolblau zur Sichtbarmachung der Lauffront zugegeben. Der Marker Lambda DNA/EcoRI+HindIII wurde auf jedes Gel mit aufgetragen, um die Größe der nun sichtbaren Banden zu ermitteln und gegebenenfalls auch die DNA-Menge zu bestimmen. 1x TAE-Puffer wurde in die Laufkammer gegeben und das Gel mit einer elektrischen Spannung von 120 V gestartet. Anschließend wurde das Gel an der GelDoc Station mit Hilfe des Programms Quantity One 4.5.2 ausgewertet und dokumentiert.

3.1.6 DNA-Isolierung aus Agarosegel

Interessante DNA-Banden wurden gezielt aus einem Agarosegel ausgeschnitten und die darin enthaltene DNA aus dem Gel isoliert. Dazu wurde das Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System der Firma Promega verwendet. Die Durchführung erfolgte nach dem Protokoll des Herstellers.

3.1.7 Ligation

Die Ligation ist ein Verfahren, bei dem DNA-Fragmente enzymatisch miteinander verbunden werden. Dies geschieht mit Hilfe der Ligase. Maximal 80 ng DNA sollten für einen 20 µl Ligationsansatz verwendet werden. Daher wurde das Verhältnis 20 ng Vektor/60 ng DNA-Insert gewählt. Zur Verhinderung der Selbstligation des Vektors wurde vor der Ligation eine SAP-Behandlung durchgeführt. Die SAP-Shrimp Alkaline Phosphatase entfernt die Phosphatreste am Vektor, die nach dem Restriktionsverdau übrig geblieben sind. Dazu erfolgte erst eine Hitzeinaktivierung des Verdaus bei 65 °C für 20 min. Nach kurzem Abkühlen auf Eis wurde 1 µl SAP zugegeben und der Ansatz für 30 min bei 37 °C inkubiert. Es folgte eine 30 minütige Hitzeinaktivierung bei 75 °C. Nach Abkühlen auf Eis wurde der Ansatz für die Ligation verwendet. Für den Ansatz wurden der Vektor, der vorher mit Restriktionsenzymen entsprechend verdaut wurde, und die, ebenfalls verdaute DNA zusammen in ein Eppendorfgefäß pipettiert. Nach Zugabe von A. bidest. wurde der Ansatz kurz gevortext, abzentrifugiert und für 5 min bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz für 5 min auf Eis gestellt. Danach folgte (auf Eis) die Zugabe des Ligasepuffers und der Ligase selbst. Die Inkubationszeit betrug entweder 4 h bei RT oder bei 4 °C über Nacht. Die Deaktivierung der Ligase erfolgte für 10 min bei 65 °C mit kurzem Abkühlen auf Eis. Im Anschluss erfolgte die Transformation in Escherichia coli (E. coli).

Allgemeiner Ansatz:

Vektor: 20 ng Insert: 60 ng Puffer: 2 µl T4 Ligase: 1 µl

A. bidest. : auf 20 µl Endvolumen

3.1.8 Transformation

Verwendet wurden chemisch kompetente E. coli Zellen des Stammes DHα5. Die, durch eine Calciumchlorid-Behandlung kompetenten E. coli Zellen wurden aus der Lagerung bei - 80°C entnommen und wenige Minuten auf Eis aufgetaut. 2 µl der zu transformierenden Plasmid-DNA oder 10 µl eines fertigen Ligationsansatzes wurden zugegeben und der Ansatz 30 min auf Eis inkubiert. Danach erfolgte ein Hitzeschock bei 42 °C im Heizblock. Nach kurzem Abkühlen auf Eis, wurden 900 µl 37 °C warmes LB Medium zugegeben und der Ansatz 1 h bei 37 °C schüttelnd inkubiert. Nach 1 minütigem Abzentrifugieren wurde der Überstand verworfen, dass Zellpellet in der verbliebenen Flüssigkeit resuspendiert und die Zellen auf LB-Platten mit entsprechendem Selektionsantibiotikum ausplattiert. Die Platten wurden über Nacht bei 37 °C inkubiert. Zur Anzucht wurden am nächsten Tag einzelne Kolonien mit einer sterilen Pipettenspitze gepickt und in Röhrchen mit 5 ml LB-Medium (mit entsprechendem Antibiotikum) inokuliert. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 37 °C schüttelnd bei 133 rpm.

3.1.9 Mini Präparation von Plasmid-DNA aus E. coli

Zur Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli wurde 1,5 ml einer Übernachtkultur in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß überführt und 1 min bei 16.000 g abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 100 µl Lösung 1 + RNase A (30 µl/100 ml Lösung) resuspendiert. Das in der Lösung 1 enthaltene EDTA komplexiert zweiwertige Kationen und destabilisiert damit die Zellwand der Bakterien.

Nach einer Inkubation von 5 min bei RT wurden 200 µl der Lösung 2 zugegeben.

Das darin enthaltene SDS löst die Phospholipide und die Proteine aus der Zellmembran und führt somit zu einer vollständigen Lyse der Zellen. Das NaOH wiederum denaturiert Proteine, Chromosomen und Plasmid-DNA. Danach folgte die Zugabe von 150 µl Lösung 3. In diesem Neutralisationsschritt renaturiert die Plasmid-DNA, während alle anderen Zellbestandteile zerstört bleiben. Danach wurde ein Tropfen Chloroform dem Ansatz zugegeben, dieser kurz gevortext und 2 min bei 16.000 g zentrifugiert. Die Plasmid-DNA wurde aus dem Überstand durch Zugabe

von 1 ml 96 % Ethanol gefällt. Der Ansatz wurde 2 min bei 16.000 g abzentrifugiert und das Pellet mit 500 µl 70 % Ethanol gewaschen (Zentrifugation für 2 min bei 16.000 g). Das erhaltene Plasmid-DNA Pellet wurde getrocknet und anschließend in 35 µl TE-Puffer gelöst.

3.1.10 Midi Präparation von Plasmid-DNA aus E. coli

Um eine sauberere und größere Menge an Plasmid-DNA zu erhalten wurde eine Midi-Präparation durchgeführt. Dafür wurde am Tag zuvor eine 200 ml E. coli Kultur in LB Medium angeimpft. Entsprechend des enthaltenen Plasmids wurde ein Antibiotikum (Kanamycin (10 mg/ml) 200 µl/200 ml, Ampicillin (50 mg/ml) 400 µl/200 ml) der Inokulation hinzugefügt. Die Inkubation erfolgte über Nacht im Schüttler bei 37 °C bei 133 rpm. Das Prinzip der Plasmid-Isolierung entspricht dem der Mini-Präparation. Die Zellen wurden zuerst durch 5 min Zentrifugation bei 5.500 g pelletiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 6 ml Lösung 1 (+ RNase A) resuspendiert. Nach 10 min Inkubation bei RT wurden 12 ml Lösung 2 zugegeben und nach vorsichtigem Schwenken wieder 10 min bei RT inkubiert.

Anschließend erfolgte die Zugabe von 9 ml Lösung 3. Nach 20 min Inkubation auf Eis wurde der Ansatz 30 min bei 22.000 g abzentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Gefäß filtriert und dem Filtrat 15 ml Isopropanol zugefügt. Nach erneuter Zentrifugation für 15 min bei 22.000 g, wurde der Überstand verworfen und das erhaltene Pellet mit 10 ml 70 % Ethanol gewaschen. Der Zentrifugationschritt wurde wiederholt und der Überstand komplett entfernt. Das Pellet wurde in 500 µl TE-Puffer + 50 µl RNase A resuspendiert und in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß überführt. Dieser Ansatz wurde 30 min bei 37 °C inkubiert. Um restliche Proteine aus der DNA zu entfernen wurde eine Phenol/Chlorform Extraktion durchgeführt. Dazu wurde 1:1 (V/V) Phenol-Chloroform zu der Probe gegeben, gevortext und für 5 min bei 16.000 g zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde in ein neues Eppendorfgefäß überführt und 1:1 (V/V) Chloroform zugegeben. Wieder erfolgte die Zentrifugation für 5 min bei 16.000 g. Mit dem erhaltenen Überstand wurde der Chloroformschritt wiederholt. Um die DNA zu präzipitieren wurden 30 µl 3 M Natriumacetat und 0,7 (V/V) Isopropanol

zugegeben. Nach Zentrifugation für 10 min bei 16.000 g wurde ein Waschschritt mit 500 µl 70 % Ethanol durchgeführt. Nach erneuter Zentrifugation wurde das Pellet getrocknet und in 500 µl TE-Puffer gelöst. Die DNA-Menge wurde am Photometer bei einer Wellenlänge von 260 - 280 nm bestimmt. Die Proben wurden bei 4 °C aufbewahrt

3.1.11 Restriktionsverdau

Um positive Klone einer Klonierung zu identifizieren, wurde ein Restriktionsverdau mit Hilfe von Restriktionsenzymen durchgeführt. Restriktionsenzyme, auch Restriktionsendonucleasen genannt, sind Enzyme, die doppelsträngige DNA an spezifischen Nucleotidsequenzen schneiden. Dabei entstehen spezifische DNA-Fragmente, die anschließend mittels Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und analysiert werden können. Das entstandene Bandenmuster gibt Auskunft darüber, ob ein kloniertes Fragment im isolierten Plasmid enthalten ist und ob, je nach Klonierung, das entsprechende Fragment in der richtigen Orientierung eingebaut wurde. Die Zugabe des Enzyms folgte am Ende. Ein Ansatz wurde wie folgt pipettiert.

allgemeines Ansatzschema:

Enzym: 0,5 - 1 µl (5 - 10 U)

Puffer: 2,0 µl

DNA: 1 µl (1 – 2 µg) A. bidest. : 16 - 16,5 µl Endvolumen: 20 µl

Der Ansatz wurde 2 h bei 37 °C inkubiert. Wenn (Plasmid-) DNA mit zwei verschiedenen Enzymen verdaut werden sollte, wurde das zuerst verwendete Enzym 20 min bei 75 °C hitzeinaktiviert bevor das zweite Enzym nach Abkühlen zugegeben wurde. Eine Inkubation von 2 h bei 37 °C wurde durchgeführt. Die Proben wurden im

Anschluss mit Bromphenolblau-Ladepuffer versetzt und mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese analysiert.

3.1.12 siRNA Herstellung

Die verwendete siRNA wurde mit dem GeneClip™ U1 Hairpin Cloning System der Firma Promega hergestellt. Die verwendeten Primer (s. Material) wurden eigens für die iPAT abgeleitet. Die Durchführung erfolgte laut Protokoll des Herstellers. Das damit hergestellte Fragment wurde in den pGeneClip-Vektor (Promega) per Ligation (s. Absatznummer eintragen) eingebracht. Die Selektion der Klone nach der Transformation in E. coli erfolgte auf LB-Platten (+ 30 µl Ampicillin (50 mg/ml) je Platte). Nach Anzucht der Klone in flüssigem LB-Medium (+ Ampicillin (50 mg/ml) 7 µl/5 ml) über Nacht und anschließender Mini-Präparation wurden die Klone mit Hilfe eines Restriktionsverdaus mit PstI auf ihre Richtigkeit überprüft. Die korrekten Klone wurden für die stabile Transfektion in Caco-2 verwendet.