Membranproteine

Biologische Membranen enthalten meist sowohl integrale als auch periphere Membranproteine. Diese unterscheiden sich in ihrer Art der Assoziation mit der Membran. Auf der zytosolischen Seite der Zellmembran sind integrale Membranproteine entweder kovalent über Aminosäuren mit hydrophoben Seitenketten (die mit den Kohlenwasserstoffketten der Fettsäuren in Wechselwirkung treten) in die Membran integriert. Sie durchdringen dabei die gesamte Lipid-Doppelschicht. Zum Beispiel wird das Ras Protein, ein Protein mit Signalfunktion, über eine Farnesyl- und eine Palmitoylgruppe in der Membran verankert. Oder die Integrierung erfolgt über kovalent gebundene Fettsäuren. Periphere Proteine haben dagegen keinen direkten Kontakt mit der Membran. Sie binden entweder über polare Kopfgruppen der Phospholipide an die Membran oder treten in relativ schwache Wechselwirkungen mit integralen Membranproteinen. Auf der exoplasmatischen Seite der Zelle werden verschiedene hydrolytische Enzyme mittels eines Glykosylphosphatidylinositolankers mit der Membran assoziiert.

Integrale Membranproteine lassen sich in sechs Typen und drei Klassen einteilen.

Die eine Klasse ist über ein glykosyliertes Phospholipid an die extrazelluläre Oberfläche der Membran gebunden. Zu dieser Gruppe gehören z.B. Enzyme wie die alkalische Phosphatase. Die zweite Klasse ist auf der zytoplasmatischen Seite über eine kovalent gebundene Myristinsäure fixiert (N-Myristinylierung). Diese C14:0 Fettsäure ist über eine Amidbindung an einen Glycinrest am N-Terminus der Proteine gebunden (z.B. v-Src). Die dritte Klasse sind Proteine, die über einen Farnesylrest auf der zytoplasmatischen Seite der Membran fixiert sind. Diese Fixierung erfolgt über eine Thioesterbindung im C-terminalen Bereich der Proteine (z.B. p21Ras). Die sechs Membranproteintypen sind in der folgenden Abbildung 6 gezeigt und beschrieben.

Abbildung 6: Integrale Membranproteine

Die räumliche Beziehung zwischen den Protein Domänen und der Lipiddoppelschicht kann man in sechs Kategorien einteilen. Typ I und II haben jeweils nur eine Transmembrandomäne. Typ I Proteine haben ihren Amino-Terminus extrazellulär, Typ II Proteine dagegen intrazellulär. Typ III Proteine haben mehrfache Transmembranhelices in einer Polypeptidkette. In Typ IV Proteinen bilden die Transmembrandomänen verschiedener Polypeptide zusammen einen Kanal durch die Zellmembran. Typ V Proteine werden durch kovalent gebundene Lipide an der Zellmembran fixiert. Typ VI Proteine haben sowohl eine Transmembrandomäne, als auch eine zusätzliche Fixierung in der Zellmembran über einen Lipidanker (GPI-Anker). Aus Lehninger Principles of Biochemistry S. 379 (DAVID L.

NELSON 2005)

1.6.1 Humane Saccharase-Isomaltase (hSI)

Die Saccharase-Isomaltase (SI) ist ein enzymatisch aktives, Typ II Transmembranprotein der Bürstensaummembran.

Sie besteht aus zwei homologen Untereinheiten: der Saccharase Einheit mit einem Molekulargewicht von 145 kDa und der Isomaltase Einheit mit einem Molekulargewicht von 151 kDa. Das Gesamtmolekulargewicht der komplexen humanen (h) SI Form beträgt in vivo 245 kDa.

Die SI wird zuerst als ein Vorläuferprotein (pro-hSI 210 kDa) synthetisiert und kotranslational im ER N-glykosyliert. Während des relativ langsamen Transports zur apikalen Seite der Zelle, wird das Protein in seine komplexe Form prozessiert (O-Glykosylierung).

Abbildung 7: Saccharase-Isomaltase (Schema)

Die C-terminale, extrazelluläre Domäne besteht aus der Saccharase-Untereinheit, aus der Isomaltase-Untereinheit und aus der O-glykosylierten Strangdomäne. Es folgt die Transmembrandomäne und die kurze zytoplasmatische Domäne mit dem N-Terminus (nach Hunziker 1986).

Die SI besteht aus einer kurzen Zytoplasmadomäne (aus 11 AS), einer Transmembrandomäne (20 AS) und einer großen glykosylierten extrazellulären Domäne (1795 AS) (s. Abbildung 7). Letztere enthält eine Ser/Thr-reiche, 22 AS lange Strangdomäne, die als Verbindung zwischen dem globulären Protein und der Plasmamembran dient (HUNZIKER, et al. 1986).

Die apikale Sortierung der SI ist abhängig von der Transmembrandomäne und der, der Strangdomäne anhängenden O-Glykosylierung (JACOB, et al. 2000b;

SPODSBERG, et al. 2001). Die O-Glykosylierung der SI stellt zudem auch den entscheidenden Sortiermechanismus für die Lipid Raft Assoziation dar (ALFALAH, et al. 1999; WETZEL, et al. 2009) (s. Tabelle 1). Demnach ist die O-Glykosylierung auch entscheidend für die enzymatische Aktivität der SI.

Die Saccharase spaltet die α-1,2- und α-1,4- glykosidischen Bindungen der Saccharose und Maltose. Die Isomaltase spaltet die α-1,6 glykosidischen Bindungen der Isomaltose. In vivo wird die komplexe Form der SI von Pankreas Proteasen in seine beiden Untereinheiten gespalten, die jedoch miteinander assoziiert bleiben. Die Funktion der SI besteht darin, Kohlenhydrate aus der Nahrung in Einfachzucker zu spalten und sie somit dem Körper verfügbar zu machen.

1.6.2 Humane Dipeptidyl Peptidase IV (hDPP IV)

Die Dipeptidyl Peptidase IV (DPP IV), auch bekannt als CD26, ist ein N- und O-glykosyliertes Typ II Transmembranprotein. Es besteht aus einem kurzen zytoplasmatischen Teil (N-Terminus, 6 AS), einer Transmembrandomäne (22 AS) und einer extrazellulären Domäne (C-Terminus, 738 AS).

In der Bürstensaummembran liegt es als Homodimer mit einem Molekulargewicht von 124 kDa vor (JASCUR, et al. 1991). Die Dimerizierung erfolgt nach der komplexen Glykosylierung im Golgi Kompartiment. Die N- und O-Glykosylierung ist verantwortlich für die spezifische und strenge Sortierung von DPP IV zur apikalen Membran in intestinalen Zellen (ALFALAH, et al. 2002).

In Caco-2 Zellen lokalisiert DPP IV in der apikalen Membran, in verschiedenen apikalen Vesikeln, in Mikrotubuli und in der basolateralen Membran. Es konnte gezeigt werden, dass DPP IV in Caco-2 Zellen in frühe und späte Endosomen endozytiert wird. Es wird angenommen, dass die Endozytose in späte Endosomen in das Recycling von DPP IV zur Bürstensaummembran involviert ist (KLUMPERMAN, et al. 1991).

DPP IV ist mit Triton X-100 DRMs assoziiert. Alfalah et. al. konnten zeigen, dass diese Assoziation ebenfalls stark von der Glykosylierung des Proteins abhängig ist.

TritonX-100 DRMs sind reich an Cholesterol und Sphingolipiden. Eine Verminderung von Cholesterol und eine Hemmung der N- und O-Glykosylierung führen zu einer nicht-polaren Sortierung von DPP IV (ALFALAH, et al. 2002).

DPP IV wird im Endothel von Organen (z.B. der Lunge), in der Zellmembran aktivierter T-Lymphozyten (dort CD26 genannt) exprimiert und findet sich auch frei zirkulierend im Blutplasma. Es ist ein proteolytisches Enzym aus der Gruppe der Exopeptidasen. In seiner Funktion spaltet es Dipeptide vom N-Terminus von Peptiden ab. Es spaltet bevorzugt, wenn sich an zweiter Stelle der Aminosäuresequenz ein Prolin- oder ein Alaninrest befindet. DPP IV ist beteiligt an Prozessen wie der Apoptose, der Signal Transduktion, dem Glukose Metabolismus und der Immunregulation.

1.6.3 P-Glykoprotein ABCB I (P-gp)

P-gp ist ein Transmembranprotein mit einem Molekulargewicht von 170 kDa. Es besteht aus 1280 AS und gehört zu der Gruppe der ATP abhängigen ABC-Transporter (Adenosine triphosphate-binding cassette) der MDR/TAP Unterfamilie.

Es wird auch als ATP-binding cassette subfamily B member I, MDR I und PGY I bezeichnet. Humanes P-gp ist im ABCB1 oder MDR1 (multidrug resistance 1) Gen kodiert (CHEN, et al. 1986).

Das Protein besteht aus zwei homologen Hälften. Jede Hälfte enthält sechs Transmembranhelices und eine ATP-bindenden Domäne. Beide Hälften sind flexibel verknüpft. Es gibt 3 Glykosylierungsstellen an der ersten extrazytoplasmatischen Domäne der N- terminalen Hälfte (s. Abbildung 8).

Abbildung 8: P-Glykoprotein (Schema)

Zwei homologe Hälften mit jeweils sechs TMD. Die ATP bindenden Stellen, sowie der N- und der C-Terminus befinden sich auf der zytosolischen Seite. Die drei Glykosylierungsstellen befinden sich extrazytoplasmatisch an der N-terminalen Hälfte des Proteins. (FU, et al. 2012)

P-gp wird als 150 kDa großes Vorläuferprotein im ER synthetisiert. Während der Faltung assoziiert es mit Calnexin und Hsc70 (GETHING, et al. 1992). Im Golgi wird das Protein in seine reife Form (N-) glykosyliert (MOLINARI, et al. 1994).

Wie P-gp vom ER zum Golgi gelangt ist bislang ungeklärt. Auch ist noch kein Sortiermechanismus für P-gp bekannt. Wie P-gp vom Golgi zur Zellmembran gelangt ist ebenfalls noch nicht eindeutig geklärt. Belegt ist, dass P-gp direkt oder indirekt über den endosomalen Weg zur Plasmamembran gelangt. Untersuchungen in unpolaren humanen Krebszellen Zellen konnten eine Kolokalisation von P-gp mit Rab5 positiven frühen Endosomen belegen. Scheinbar hat Rab5 eine Regulationsfunktion für das Trafficking von P-gp vom endosomalen Kompartiment zur Plasmamembran in unpolaren Zellen (FU, et al. 2007b). In polaren Zellen dagegen kolokalisiert P-gp mit Rab11a-positiven Endosomen (WAKABAYASHI, et al.

2005). Am Recycling Zyklus von P-gp zwischen dem endosomalen Pool und der Plasmamembran scheint Aktin beteiligt zu sein (FU, et al. 2007a). Obwohl die Assoziation von P-gp mit Aktin nicht direkt, sondern über Ezrin, Radixin und Moesin erfolgt (LUCIANI, et al. 2002), wurde gezeigt, dass P-gp intrazellulär akkumuliert (EEA1-positiv), wenn Aktin in der Zelle gestört ist. Die Funktion von P-gp bleibt dennoch erhalten und ist demnach unabhängig von Aktin (MESZAROS, et al. 2013).

P-gp ist mit Lipid Rafts assoziiert. Wobei P-gp hauptsächlich mit Lubrol DRM´s assoziiert und nur teilweise mit Triton X-100 Rafts (LAVIE, et al. 1998).

P-gp wird in der apikalen Membran der Mukosazellen des Intestinums (THIEBAUT, et al. 1987); in den Hepatozyten und in proximalen tubulären Zellen der Niere (SCHINKEL, et al. 1997), sowie in der Nebenniere und in den epithelialen Zellen der Kapillaren, einschließlich der Blut-Hirn Schranke und der Blut-Hoden Schranke extensiv exprimiert (SCHINKEL, et al. 1997). P-gp hat die Funktion einer Efflux Pumpe. Durch Hydrolyse von ATP wird die Energie zur Verfügung gestellt, die notwendig ist, um Substrate gegen das Konzentrationsgefälle durch die Membran zu pumpen. Transportiert wird eine ganze Reihe an Substraten. Dazu gehören Phospholipide, Sterole, Gallensäuren, Peptide, metabolische Abfallprodukte und

Medikamente. Der Efflux von Krebsmedikamenten macht P-gp zu einem Schlüsselprotein in der Behandlung von Krebs. Die Überexpression von P-gp in Krebszellen (auch in hämatopoetischen Krebsarten) gehört zum Mechanismus der sogenannten multidrug resistance (MDR).