Proteinbiochemische Methoden

Um Proteine in Zellen sichtbar zu machen, nutzt man die Methode der Immunfluoreszenzfärbung. Proteine, die mit einem Fluoreszenzprotein (YFP- oder CFP-Tag) gekoppelt wurden, brauchen nicht gefärbt zu werden. Um sie sichtbar zu machen, wurde für CFP (am Konfokalmikroskop) ein Laser mit einer Detektions-Wellenlänge von 490 nm und für YFP ein Laser mit einer Detektions- Detektions-Wellenlänge von 535 nm verwendet. Proteine mit Flag-Tag oder bekannte Strukturproteine in Zellen werden mit Antikörpern, die an Fluorochrome gebunden sind, angefärbt.

Verwendet wurden CHO und COS-1 Zellen, die transient mit den zu untersuchenden Proteinen transfiziert waren. Die Zellen wurden am Tag vor der Transfektion auf Platten mit Deckgläschen gesplittet. Die Transfektion bei einer Konfluenz von 30-40 % am nächsten Tag durchgeführt. 48 h später wurde die Immunfluoreszenzfärbung durchgeführt.

Zuerst wurden die Zellen zweimal mit kalter (2-8 °C) 1x Phosphatgepufferter Salzlösung (engl.: phosphate buffered saline) (PBS) gewaschen. Die Fixierung erfolgte mit 4 % Paraformaldehyd in 1x PBS mit 0,2 % Triton X-100 (Endkonzentration) 10 min auf Eis und dann wiederholt 30 min bei RT. Nach dreimaligem Waschen (jeweils 5 min) mit 1x PBS wurde der Quench-Puffer zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Nach 10 min Inkubation wurden die Zellen dreimal mit 1x PBS gewaschen. Danach wurden die Zellen 30 min bei RT mit Blocking-Puffer inkubiert. Der primäre Antikörper wurde in der entsprechenden Konzentration in Blocking-Puffer verdünnt, auf die Deckgläschen gegeben und 45 min bei RT inkubiert. Die Deckgläschen wurden anschließend fünfmal 3 min mit Blocking-Puffer gewaschen. Der zweite (markierte) Antikörper (Alexa 488 oder 568,

jeweils Anti-Maus; oder Alexa 633, Anti-Kaninchen) wurde ebenfalls in Blocking-Puffer angesetzt und nach dem Waschen auf die Deckgläschen gegeben. Nach erneuter Inkubation von 45 min bei RT folgte wieder fünfmaliges Waschen (jeweils 3 min) mit Blocking-Puffer. Die Deckgläschen wurden noch dreimal nur mit 1x PBS gewaschen, kurz in A. bidest. getaucht und nach kurzem Abtropfen mit Mounting-Medium auf Objektträger geklebt.

3.3.2 Immunpräzipitation

Um Proteine aus einem Zelllysat zu isolieren, nutzt man die Methode der Immunpräzipitation. Dazu wird dem Lysat der spezifische Antikörper für das gesuchte Protein zugegeben. Der entstandene Antigen-Antikörper Komplex wird anschließend mit Hilfe von Sepharose-A Beads (PAS) aus dem Lysat isoliert. Diese Beads bestehen aus Protein A, das an Sepharose Kügelchen gekoppelt ist. Protein A selbst bindet an Immunglobuline/Antikörper, während die Sepharose dem Komplex ein Gewicht verleiht, welches per Zentrifugation aus dem Lysat isoliert werden kann.

Das Zelllysat wurde analog dem Vorgehen in Punkt (Lipid Raft Isolierung) jedoch mit Standard Lysepuffer + 40 µl PI-Mix hergestellt. 1 ml Lysat wurde 30 µl 1:10 verdünntes PAS zugegeben und im sogenannten preclearing Schritt für 1 h oder über Nacht bei 4 °C rotierend inkubiert. Nach kurzem Abzentrifugieren bei 5.000 g für 1 min wurde dem Überstand der spezifische Antikörper in der dafür vorgesehenen Konzentration zugegeben. Die Inkubation erfolgte entweder für 1,5 h oder über Nacht bei 4 °C rotierend. Danach wurden 45 µl unverdünnte PAS zugegeben und wieder 1,5 h rotierend bei 4 °C inkubiert. Der Ansatz wurde dann kurz bei 5.000 g für 1 min abzentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Die Beads wurden zweimal mit Waschpuffer I und zweimal mit Waschpuffer II gewaschen, um ungebundene Proteine zu entfernen. Zum Schluss wurde den Beads 30 µl 3x Lämmli Probenpuffer + DTT zugegeben. Die Proben wurden dann für den Auftrag auf eine SDS-PAGE verwendet oder bei – 20 °C bis zur Verwendung eingefroren.

3.3.3 Lipid Raft Isolierung - Saccharose Gradient Zelllysat Herstellung:

Eine Platte konfluenter Caco-2 Zellen wurde zweimal mit kaltem (2-8 °C) 1x PBS gewaschen. Danach wurde 1 ml eines Mastermixes aus Triton X-100 Lysepuffer + 40 µl PI-Mix auf die Platte gegeben. Mit einem gereinigten Schaber wurden die Zellen von der Platte geschabt und in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß überführt. Die Zellen wurden zuerst mit einer 21 G Kanüle (20x hoch und runter), dann mit einer 26 G Kanüle (10x hoch und runter) homogenisiert. Nach einer Inkubation von 2 h, schwenkend bei 4 °C, wurde die Probe für 15 min bei 16.000 g und 4 °C abzentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues 1,5 ml Eppendorfgefäß überführt und das Pellet verworfen.

Gradienten gießen:

Die benötigten UZ- Röhrchen wurden auf Eis bereitgestellt. Auch die Saccharose Lösungen wurden bis zum Gebrauch bei 4 °C aufbewahrt. Die Probenvorbereitung, sowie das Gradienten gießen wurde auf Eis durchgeführt. 500 µl des Zelllysates wurden mit 500 µl 80 % Saccharose in einem Eppendorfgefäß gemischt.

Pipettierschema der Saccharose Lösungen, die langsam und vorsichtig in die Ultrazentrifugenröhrchen einpipettiert wurden:

Die Probenröhrchen wurden vorsichtig in die Probenbehälter gesetzt und mit der 5 % Saccharose austariert. Danach wurden die Probenbehälter verschlossen, in den Rotor SW44 eingesetzt und die Ultrazentrifuge für 18 h, bei 100.000 g bei 4 °C gestartet.

1 ml 5 % Saccharose (Abschluss oben) 7 ml 30 % Saccharose

1 ml Probe: 500 µl Lysat + 500 µl 80 % Saccharose 1 ml 80 % Saccharose (Anfang unten)

Gradienten ernten:

Die Röhrchen wurden vorsichtig aus dem Rotor genommen und sofort auf Eis gestellt. Mit einer Pumpe wurden 1 ml Fraktionen geerntet. Die Fraktionen wurden entweder direkt weiterverwendet oder mit 500 µl 96 % Ethanol über Nacht bei – 20 °C gefällt. Letztere wurden am nächsten Tag 20 min bei 16.000 g und 4 °C abzentrifugiert. Das Pellet wurde mit 500 µl 70 % Ethanol gewaschen und erneut 20 min bei 16.000 g und 4 °C zentrifugiert. Das Pellet wurde getrocknet und anschließend 30 µl zweifach Lämmli + DTT pro Pellet zugegeben. Diese Proben wurden bei – 20 °C aufbewahrt oder sofort für die Westernblotanalyse verwendet.

3.3.4 SDS-PAGE

Mittels SDS-PAGE (Sodium Dodecylsulfat - Polyacrylamid - Gelelektrophorese) können Proteine elektrophoretisch nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt werden.

Durch das anionische Tensid Natriumlaurylsulfat (SDS) werden nicht-kovalente Wechselwirkungen in nativen Proteinen aufgelöst und somit die Quartär- und Tertiär-Strukturen zerstört. Das im Laemmlipuffer enthaltene DTT führt zudem zur Reduzierung der Disulfidbrücken. Die negativ geladenen SDS-Moleküle binden an die Polypeptidketten in einem durchschnittlichen Verhältnis von zwei SDS-Anionen pro Aminosäure der Polypeptidkette, so dass die Ladung des SDS-Proteinkomplexes der Masse des Proteins proportional ist. Die Behandlung der Proteine durch Hitze, SDS und DTT bewirkt die vollständige Denaturierung des Proteins. Die SDS-Gele wurden nach der Rezepttabelle unter dieser Methodenbeschreibung hergestellt (Geldicke 1,5 mm). Nach der Auspolymerisierung wurden die Gele in die Apparatur eingespannt und in die Laufkammer überführt (Bio-Rad Laboratories GmbH, München). Die Proben wurden auf ein Endvolumen von 30 µl durch Zugabe von Lämmlipuffer (+ 1 M DTT) eingestellt und 5 min bei 95 °C im Heizblock gekocht. Nach kurzem Abkühlen auf Eis und kurzem Abzentrifugieren wurden die Gele mit den Proben beschickt. Leere Taschen wurden mit Lämmli Probenpuffer + DTT aufgefüllt.

Als Marker wurde ein Protein-Molekulargewichts-Standard (PageRuler™ Plus Prestained Protein Ladder, Fermentas GmbH, St. Leon-Rot) mit 3 µl + 27 µl Lämmli

Probenpuffer + DTT verwendet. Nach Einfüllen des SDS-Laufpuffers wurde das Gel zuerst mit 100 V Spannung gestartet. Wenn die Proben das Sammelgel passiert hatten, wurde die Spannung auf 150 V erhöht. Die Laufzeit betrug insgesamt ca.

1,5 h.

Trenngel – Menge für jeweils ein kleines Gel 6 % 7 % 10 % 12 % H₂O (ml) 4,13 3,86 3,1 2,48 Acrylamid (ml) 1,55 1,81 2,58 3,0 1,5 M Tris pH 8,8 (ml) 1,93 1,93 1,93 1,93 10 % SDS (µl) 77,5 77,5 77,5 77,5 10 % TEMED (µl) 5,75 5,75 5,75 5,75 10 % APS (µl) 77,5 77,5 77,5 77,5 Trenngel – Menge für jeweils ein großes Gel

6 % 12 % H₂O (ml) 16,5 9,9 Acrylamid (ml) 6,2 12,0 1,5 M Tris pH 8,8 (ml) 7,7 7,7 10 % SDS (µl) 310 310 10 % TEMED (µl) 23 23 10 % APS (µl) 310 310

Sammelgel – Menge für ein kleines Gel 6 %

H2O (ml) 3,9 Acrylamid (ml) 0,975 1,5 M Tris pH 8,8

(ml)

0,725 10 % SDS (µl) 58 10 % TEMED (µl) 6 10 % APS (µl) 58

Sammelgel – Menge für ein großes Gel

3.3.5 Western Blot

Das SDS-Gel wurde aus den Glasplatten gelöst, das Sammelgel entfernt und auf Whatmanpapier, das in Transferpuffer äquilibriert wurde, gelegt. Auf das Gel wurde die, in Methanol aktivierte, PVDF-Membran aufgelegt. Darauf wurde wieder äqulibriertes Whatmanpapier gelegt. Das ganz „Sandwich“ wurde anschließend in eine Blotkassette eingespannt und in eine Blotkammer verbracht. Bei diesem nassen Blotverfahren erfolgt das Blotten in einer Kammer, die mit Transferpuffer gefüllt ist.

Die Blotzeit betrug 2 h bei einer Stromstärke von 250 mA. Anschließend wurden die Membranen entweder bis zur Nutzung in Whatmanpapier getrocknet und gelagert, oder 1 h bei RT oder ü/N bei 4 °C in 5 % Magermilch (in 1x PBS) blockiert. Der erste Antikörper wurde in entsprechender Verdünnung in 2 % Magermilch mit einem Endvolumen von 5 ml pro Membran angesetzt. Die Membran wurde zusammen mit dem Antikörper 1 h in einem Falconröhrchen bei RT schwenkend inkubiert.

Anschließend wurde die Membran zweimal kurz mit Tween-PBS (T-PBS) abgespült und dreimal jeweils 10 min bei RT mit T-PBS gewaschen. Danach wurde der zweite Antikörper, der an Peroxidase gekoppelt ist, dem ersten (der verwendeten Spezies) entsprechend, zur Membran gegeben und 45 min bis 1 h inkubiert. Das Waschen erfolgte wie oben beschrieben (BURNETTE 1981). Die Detektion erfolgte dann mit 300 µl + 300 µl Pierce Reagenzien (SuperSignal^® West Femto Maximum Sensitivity H₂O (ml) 7,8

Acrylamid (ml) 1,95 1,5 M Tris pH 8,8

(ml) 1,45

10 % SDS (µl) 115 10 % TEMED (µl) 11,5 10 % APS (µl) 115

Sustrate, Thermo Scientific Inc.). Die Lumineszenz wurde am Chemidoc XRS, BioRad mit dem Programm Quantity One 4.6.5 ausgewertet und dokumentiert.

Membranen die nach dem Blotten gleich in Whatmanpapier getrocknet wurden, sind vor Gebrauch ca. 30 s in Methanol aktiviert worden. Nach mehrmaligem Waschen in VE-Wasser und 1x PBS konnte mit dem Blockieren der Membran in 5 % Magermilch das Protokoll s. oben fortgeführt werden.

3.3.6 Radioaktivlabeling

Zur Kontrolle der korrekten Faltung und Sortierung der Proteine, während ihrer Synthese (trotz künstlich angehängter Markierung durch einen Flag-Tag, YFP- oder CFP-Tag), wurde diese Methode durchgeführt. Dazu wurden transient transfizierte Zellen zunächst zweimal mit 1x PBS gewaschen und anschließend zweimal 1 h mit je 5 ml Methionin-freiem Medium (MEM) ausgehungert. Dann wurde auf jede Zellkulturplatte 3 ml MEM und 3,5 µl [³⁵S]-Invitro Cell labeling Mix zugegeben.

Entsprechend der Proteine (bzw. deren Synthesezeit) wurde die Inkubations- bzw.

Markierungszeit gewählt (30 min, 1 h und 3,5 h für Flag-iPAT5 und iPAT-Flag10, PLKC-Flag 3,5 h, YFP-iPAT und CFP-iPAT 3,5 h). Danach wurden die Zellen jeweils zweimal gründlich mit 1x PBS gewaschen. Anschließend folgte die Lyse mit Standard Lyse Puffer und die Immunpräzipitation wie vorher beschrieben. Die Platten konnten nach der Markierung mit [³⁵S]-Invitro Cell labeling Mix auch bei – 20 °C eingefroren werden. Die Auftrennung bzw. die Sichtbarmachung der Proteine erfolgte per SDS-PAGE. Die Proben wurden je nach Größe des zu detektierenden Proteins auf große 6 % bzw. 12 % SDS-Gele aufgetragen. Nach der Auftrennung wurden die Gele erst kurz in Wasser gewaschen und dann für 30 min fixiert (Fixierlösung). Dann folgte die Färbung der Proteine über Nacht in kolloidaler Coomassie Lösung.

Anschließend wurden die Gele in Wasser entfärbt. Zum Trocknen wurden die Gele auf einen Vakuumtrockner verbracht. Nach mindestens 2 h Trocknung wurde ein Phosphor Photoimaging Screen für 12 h (über Nacht) auf die Gele gelegt und dunkel

gelagert. Die Auswertung des Screens erfolgte mit Hilfe des Personal Molekular Imager FX von Bio-RAD und dem Programm Quantity-One 4.1.1..

3.3.7 Isolierung der Bürstensaummembran

Die Isolierung der Bürstensaummembran der verwendeten Caco-2 Zellen erfolgte auf Eis. Die Zellen waren 8, 9 oder 10 d konfluent. Je 2 Schalen wurden zweimal mit 4 °C kaltem PBS gewaschen. Je Schale wurde 800 µl BBM-Puffer + 40 µl PI-Mix zugegeben und die Zellen mit einem sauberen Schaber zusammengeschabt und in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß überführt. Mit einem teflonbeschichteten Homogenisator wurden die Zellen anschließend 1,5 min bei ca. 10.000 U/min zermahlen bzw.

gepottert. Anschließend wurden die Proben mit Ultraschall behandelt. 1 ml Probe wurde sechsmal 10 sec behandelt mit jeweils 20 s Pause zwischen den Sessions (um ein Überhitzen zu verhindern). Der erste Zentrifugationsschritt erfolgte bei 1.000 g für 15 min bei 4 °C. Der Überstand wurde in ein neues Eppendorfgefäß pipettiert. 200 µl der Probe wurden als Homogenat (H) in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß überführt, mit 10 µl PI-Mix versetzt und auf Eis aufbewahrt. Zur restlichen Probe wurde tröpfchenweise CaCl₂ (100mM Stammlösung) bis zu einer Endkonzentration von 10 mM hinzugegeben. Der Ansatz wurde dann 30 min auf Eis bei 4 °C auf der Wippe inkubiert. Der zweite Zentrifugationsschritt erfolgte bei 1.000 g für 20 min bei 4 °C.

Das entstandene Pellet enthielt die intrazellulären und basolateralen Membranen und wurde als P1 bezeichnet. Das Pellet (P1) wurde in 500 µl BBM-Lysispuffer + 20 µl PI-Mix resuspendiert und in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß überführt. Der Überstand aus dieser Zentrifugation (S1) wurde in ein Ultrazentrifugen-Röhrchen überführt und 30 min bei 25.000 g und 4°C in der Ultrazentrifuge zentrifugiert (dritter Zentrifugationsschritt). Der nun entstandene Überstand (S2) wurde verworfen und das Pellet (P2) in 100 µl BBM-Lysispuffer + 10 µl PI-Mix resuspendiert und in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß überführt. P2 enthielt die angereicherte Bürstensaummembran. Dem Homogenat wurden 200 µl 1 %Triton X-100/PBS zugeben und zusammen mit P1 und P2 für 1,5 h bei 4 °C schwenkend inkubiert.

Abschließend erfolgte der letzte Zentrifugationsschritt für 15 min bei 16.000 g und

4 °C. Der Überstand wurde in ein neues 1,5 ml Eppendorfgefäß überführt und die Proteinkonzentration der Proben mit Bradford Protein-Assay bestimmt. Die Proben wurden in Aliquots bei -20°C eingefroren.

3.3.8 Enzymaktivitätsbestimmung der Saccharase-Isomaltase

Für die quantitative Bestimmung der Aktivität der Saccharase-Isomaltase wurde das Lysat 1:1 mit einer Saccharoselösung bekannter Konzentration (56 mM in 1x PBS) bei 37 °C für 1 h im Wasserbad inkubiert. Als Negativkontrolle wurde eine Probe mit 1x PBS mitgeführt. Als Positivkontrolle diente ein Glukose-Standard (50 mg/100 ml).

Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde allen Proben 1 ml Glukose-Nachweisreagenz Glucoquant der Firma Roche (600 T Lösung I und 138 T Lösung II) zugegeben und für 10 min bei RT inkubiert. Die Glukose reagiert in Gegenwart von ATP und Hexokinase zu phosphat, welches mit NADP+ und der Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase zu Glukonat-6-phosphat und NADPH + H+ oxidiert. Die NADPH-Zunahme ist proportional zu der durch die SI freigesetzten Glukose und wurde photometrisch bei 339 nm gemessen.

Die Berechnung erfolgte nach folgender Formel:

EProbe – ESubstratblank

X 50 = mg Glukose/100 ml Glukoselösung EStandart - ESubstratblank

mg Glukose/100 ml Glukoselösung= mmol Glukose/l (MG Glukose = 198,2 g/mol)

3.3.9 Statistik

Alle statistischen Auswertungen wurden mit der GraphPad PRISM 6 Software durchgeführt. Die Stichprobenanzahl ist jeweils unter dem durchgeführten, ausgewerteten Experiment aufgeführt.