Cuvillier Verlag Göttingen
Internationaler wissenschaftlicher Fachverlag
Kathrin Sophia König
Ischämische und pharmakologische
Präkonditionierung mit Dexmedetomidin am equinen Dünndarm-Ischämie-Reperfusionsmodell
STIFTUNG TIERÄRZTLICHE HOCHSCHULE HANNOVER der Klinik für Pferde
Herausgegeben von
Karsten Feige, Peter Stadler,
Harald Sieme, Bernhard Ohnesorge
38
Cuvillier Verlag Göttingen
Internationaler wissenschaftlicher Fachverlag
Kathrin Sophia König
Ischämische und pharmakologische
Präkonditionierung mit Dexmedetomidin am equinen
Dünndarm-Ischämie-Reperfusionsmodell
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1. Aufl. - Göttingen : Cuvillier, 2018
Zugl.: Hannover (TiHo), Univ., Diss., 2018
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1. Auflage, 2018
Gedruckt auf umweltfreundlichem, säurefreiem Papier aus nachhaltiger Forstwirtschaft.
ISBN 978-3-7369-9805-6 eISBN 978-3-7369-8805-7
Ischämische und pharmakologische
Präkonditionierung mit Dexmedetomidin am equinen Dünndarm-Ischämie-Reperfusionsmodell
INAUGURAL – DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Kathrin Sophia König
Achern
Hannover 2018
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Sabine Kästner Klinik für Kleintiere
Tierärztliche Hochschule Hannover
Prof. Dr. Christiane Pfarrer Anatomisches Institut
Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachter: Prof. Dr. Sabine Kästner Prof. Dr. Christiane Pfarrer 2. Gutachter: Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner
Tag der mündlichen Prüfung: 10.04.2018
Teile dieser Arbeit wurden im Rahmen eines Vortrages auf dem AVA
Autumn Congress/DVG –Kongress am 10. November 2017 in Berlin,
sowie als Postervortrag auf der Jahrestagung der DVG, Fachgruppe
Innere Medizin und Klinische Labordiagnostik, am 2. Februar 2018 in
Hannover, veröffentlicht.
Meinen Eltern gewidmet
1 Einleitung ... 11
2 Literaturübersicht ... 13
2.1 Intestinale Kolik ... 13
2.1.1 Ileus ... 13
2.1.2 Ischämie-Reperfusionsschaden ... 14
2.1.2.1 Klinische und makroskopische Veränderungen ... 14
2.1.2.2 Histopathologische Veränderungen ... 16
2.1.2.2.1 Apoptose und Nekrose ... 18
2.1.2.3 Biochemische Veränderungen ... 19
2.2 Präkonditionierung ... 20
2.2.1 Allgemein ... 20
2.2.2 Möglichkeiten der Präkonditionierung ... 20
2.2.2.1 Ischämische Präkonditionierung ... 21
2.2.2.1.1 Entfernte Ischämische Präkonditionierung ... 25
2.2.2.2 Pharmakologische Präkonditionierung ... 26
2.2.2.2.1 Dexmedetomidin ... 26
2.2.2.2.1.1 Pharmakodynamik ... 27
2.2.2.2.1.2 Kardiovaskuläre und respiratorische Wirkung ... 28
2.2.2.2.1.3 Pharmakokinetik ... 29
2.2.2.2.1.4 Präkonditionierende Wirkung ... 29
2.2.2.2.1.5 Postkonditionierende Wirkung ... 31
2.2.2.3 Weitere Pharmaka mit präkonditionierender Wirkung ... 31
2.2.2.3.1 Antioxidantien... 31
2.2.2.3.2 Opioide ... 32
2.2.2.3.3 Inhalationsanästhetika ... 32
2.2.2.3.4 Adenosin ... 33
2.2.2.3.5 Stickstoffmonoxid ... 34
2.2.2.3.6 Allopurinol und Superoxiddismutase ... 34
2.3 Postkonditionierung ... 35
3 Material und Methode ... 36
3.1 Probanden ... 36
3.2 Versuchsgruppen ... 36
Inhaltsverzeichnis
3.3 Versuchsdurchführung ... 37
3.3.1 Vorbereitung ... 37
3.3.2 Prämedikation und Induktion ... 37
3.3.3 Narkoseerhaltung ... 37
3.3.4 Versuchsdurchführung ... 38
3.3.4.1 Kontrollgruppe (Gruppe C) ... 39
3.3.4.2 Ischämische Präkonditionierung (Gruppe IPC) ... 41
3.3.4.3 Dexmedetomidin Präkonditionierung (Gruppe DEX) ... 41
3.3.5 Probenentnahme ... 42
3.3.6 Probenaufarbeitung ... 42
3.4 Histologie ... 43
3.4.1 Probenverarbeitung ... 43
3.4.2 Färbeprotokolle ... 44
3.4.2.1 Hämatoxylin Eosin (HE) – Färbung ... 45
3.4.2.2 Protokolle für die immunhistochemischen Färbungen ... 46
3.4.2.2.1 Aktivierte Caspase 3 ... 46
3.4.2.2.2 TUNEL-Färbung ... 47
3.5 Lichtmikroskopische Untersuchung ... 49
3.5.1 Auswertung der histologischen Untersuchung ... 49
3.5.2 Auswertung der immunhistologischen Untersuchung ... 51
3.6 Statistik ... 52
4 Ergebnisse ... 54
4.1 Versuchsvorbereitung ... 54
4.2 Versuchsdurchführung ... 54
4.2.1 Narkoseverlauf ... 54
4.3 Makroskopische Beurteilung des Darms ... 55
4.4 Histologie ... 55
4.4.1 Beurteilung der Darmzotten ... 55
4.4.2 Neutrophile Granulozyten ... 60
4.5 Immunhistologie ... 62
4.5.1 Aktivierte Caspase-3 ... 62
4.5.2 TUNEL-Methode ... 68
5 Diskussion ... 74
5.1 Diskussion der Ergebnisse ... 74
5.1.1 Histologische Auswertung ... 74
5.1.1.1 Beurteilung der Darmzotten ... 74
5.1.1.2 Neutrophile Granulozyten ... 77
5.1.2 Immunhistologie ... 78
5.2 Diskussion der Methodik ... 79
5.2.1 Probanden ... 79
5.2.2 Versuchsdurchführung ... 80
5.2.2.1 Prämedikation ... 81
5.2.2.2 Ischämie-Reperfusionsmodell ... 82
5.2.2.3 Ischämische Präkonditionierung ... 82
5.2.2.4 Pharmakologische Präkonditionierung ... 83
5.2.3 Histologie ... 84
5.2.3.1 Auswahl des verwendeten Scores ... 84
5.2.3.2 Bestimmung der Neutrophilen Granulozyten ... 84
5.2.4 Immunhistologie ... 85
5.3 Fazit und Ausblick ... 86
6 Zusammenfassung ... 88
7 Summary ... 90
8 Literaturverzeichnis ... 92
9 Anhang ... 120
9.1 Kardiovaskuläre Parameter und Isoflurankonzentrationen ... 120
9.2 Rohdaten Histologie ... 121
9.3 Rohdaten Immunhistologie ... 123
9.3.1 Aktivierte Caspase-3 ... 123
9.3.2 TUNEL-Methode ... 126
9.4 Tierversuchsnummer ... 129
9.5 Scores ... 129
9.5.1 Score nach CHIU et al. (1970) ... 129
9.5.2 Score nach WHITE et al. (1980) ... 129
9.6 Reagenzien ... 130
9.7 Lösungen und Puffer ... 131
Abkürzungsverzeichnis
ABC Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex Aqua dest. Destilliertes Wasser
Bax Bcl-2 associated protein X Bcl-2 B-cell lymphoma 2
BSA Bovines Serumalbumin
°C Grad Celsius
cAMP Zyklisches Adenosinmonophosphat CD-44 CD-44-Oberflächenprotein
DAB 3,3’-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid DFF DNA-Fragmentierungsfaktor DNA Desoxyribonukleinsäure
DTI Dauertropfinfusion
EGFR Epidermal Growth Factor Receptor ERK 1/2 Extracellular-signal-regulated kinase 1/2 FAK Fokaler Adhäsionskomplex
G Gauge
GC Guanylatzyklase
h Stunde
HE Hämatoxylin-Eosin
HWZ Halbwertszeit
I Ischämie
ICAM Intercellular Adhesion Molecule
IL Interleukin
IPC Ischämische Präkonditionierung IR Ischämie und Reperfusion IRS Ischämie-Reperfusionsschaden Isch Ischämie
i.v. Intravenös
kDa Kilodalton
KGW Körpergewicht
LPM Lamina propria mucosae
MAPK Mitogenaktivierte Proteinkinase
MDA Malondialdehyd mm HG Millimeter Quecksilbersäule
MPO Myeloperoxidase
MZP Messzeitpunkt
NaCl Natriumchlorid
NaOH Natriumhydroxid
NO Stickstoffmonoxid
Nr Nummer
OT Objektträger
P Prä-Ischämie
PBS Phosphate buffered saline/ Phosphat gepufferte Kochsalzlösung PC Präkonditionierung
PI-3 Phosphatidylinositol-3
PKC Proteinkinase C
Rep Reperfusion
RIPC Remote Ischemic Preconditioning/
Indirekte Ischämische Präkonditionierung
ROS reaktive oxygen species/ freie Sauerstoffradikale
RT Raumtemperatur
SIRS Systemic inflammatory response syndrome/
Systemisches Entzündungsreaktionssyndrom
SOD Superoxiddismutase
Src Tyrosinkinase
SWOP Second Window of Protektion/ Späte Präkonditionierung TBS Tris buffered saline (Tris gepufferte Kochsalzlösung) TUNEL Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP-digoxigenin nick-end labeling
11
Die intestinale Kolik zählt beim Pferd zu der häufigsten Ursache für Mortalität und Morbidität (KANEENE et al. 1997; TINKER et al. 1997). Oft sind strangulierende Dünn- und Dickdarmverlegungen ursächlich für eine akute Koliksymptomatik (MAIR u. SMITH 2005). Dabei haben Pferde mit Strangulationen des Dünndarms vergleichsweise schlechtere Überlebenschancen nach einer chirurgischen Maßnahme als nach Dickdarmobstruktionen (DUCHARME et al. 1983; PHILLIPS u.
WALMSLEY 1993). Wobei die Prognose nach einer chirurgischen Maßnahme nach Dünndarmstrangulationen laut FREEMAN et al. (2000) gegenüber früheren Untersuchungen besser ist.
Der durch anhaltende Ischämien, aber auch durch Hämorrhagien, Traumata oder operative Maßnahmen hervorgerufene intestinale Ischämie-Reperfusionsschaden (IRS) ist ebenfalls mit einer hohen Mortalität und Morbidität assoziiert (MALLICK et al. 2004).
In den letzten Jahren wurden einige Untersuchungen zum Mechanismus und zur Prävention des Ischämie-Reperfusions-Schadens sowie zur Regeneration des betroffenen Gewebes durchgeführt (AKSOYEK et al. 2002; MALLICK et al. 2004).
Dabei stellte sich die ischämische Präkonditionierung (IPC) als vielversprechende Methode heraus, die die Toleranz des Darms gegenüber einer mit diesem Insult verbundenen Schädigung erhöht (MALLICK et al. 2004) und zusätzlich den intestinalen Schaden nach einer Ischämie-Reperfusion signifikant reduziert (AKSOYEK et al. 2002). Laut einigen Autoren ist der Darm, vor allem der Dünndarm, das empfindlichste innere Organ gegenüber eines IRSs (GRANGER et al. 1986;
SCHOENBERG u. BEGER 1993; YAMAMOTO et al. 2001). Neben der ischämischen Präkonditionierung wurden in den letzten Jahren zahlreiche Studien, vor allem am Ratten- und Mäusemodell, an Darm und Herz zur pharmakologischen Präkonditionierung durchgeführt (FERRER et al. 1998; FRYER et al. 2000; GAN et al. 2013; STRINGA et al. 2013). Derzeit mangelt es jedoch noch an effektiven Behandlungsmöglichkeiten und Pharmaka zum Schutz des Darms und zur Vorbeugung des intestinalen IRSs (SHEN et al. 2016). Deshalb ist vor allem beim Pferd die Untersuchung der Präkonditionierung im Hinblick auf eine mögliche
Einleitung
12
Postkonditionierung bei der Behandlung einer Darmstrangulation von großer Bedeutung.
Ziel dieser Studie war es daher zu ermitteln, ob eine Präkonditionierung und damit ein gewebeschützender Effekt des equinen Dünndarms pharmakologisch oder mechanisch-ischämisch möglich ist, um dadurch Hinweise für eine Optimierung des Narkoseregimes während einer Kolikoperation mit strangulierendem Ileus zu erlangen.
13 2.1 Intestinale Kolik
2.1.1 Ileus
Der Dünndarmileus wird unterteilt in den mechanischen und den paralytischen Ileus und unterscheidet sich vor allem in Hinblick auf die Ätiologie. Im Weiteren wird der mechanische Ileus in den Strangulations- und den Obturationsileus unterteilt (WHITE et al. 2009; BREHM et al. 2016). Als strangulierende Obstruktion wird die Unterbrechung der intestinalen Blutversorgung mit gleichzeitiger Verlegung des Darmlumens bezeichnet (STORER u. SCHWARTZ 1969). Eine Strangulation des Dünndarms entsteht meist infolge eines Volvulus, eines Lipoms oder einer Inkarzeration durch einen mesenterialen Spalt oder eine physiologische Öffnung (MAIR u. SMITH 2005). Daraus resultiert eine Ischämie des betroffenen Darmabschnittes. Diese ist als eine kritische Reduktion der Blutversorgung durch eine funktionelle Konstriktion oder eine mechanische Obstruktion der zuführenden Blutgefäße definiert, welche zur inadäquaten Gewebeperfusion und -oxygenierung führt (FANTONE 1990). Unterschieden werden die warme und die kalte Ischämie.
Der gleichzeitige vollständige Verschluss der zu- und abführenden Arterien und Venen führt zu einer kalten Ischämie. Bezeichnet wird dies auch als ischämische Strangulationsobstruktion (SULLINS et al. 1985; SNYDER 1989; BLIKSLAGER 2008). Die warme Ischämie hingegen entsteht infolge eines unvollständigen Verschlusses der Blutgefäße, wobei es zunächst zum Verschluss des venösen Gefäßsystems kommt (BLIKSLAGER 2008). Aufgrund der länger bestehenden arteriellen Blutzufuhr führt dies zur hämorrhagischen Infarzierung des Darms (SNYDER 1989; BLIKSLAGER 2008) und wird auch als hämorrhagische Strangulation bezeichnet (SULLINS et al. 1985). Experimentell wurde in den 1950er Jahren als letale Dauer einer Ischämie durch Okklusion der Mesenterialarterien eine Zeit von vier Stunden ermittelt (NELSON u. KREMEN 1950; MEDINS u. LAUFMAN 1958). Auch BUSSEMAKER u. LINDEMAN (1972) bestätigen in einer Studie an Hunden, dass die Dauer der anhaltenden Ischämie am Darm entscheidend für die Veränderungen und die Überlebensfähigkeit sowohl des Darms selbst als auch des Tieres ist. Dabei bestimmt auch der Grad der Ischämie das Ausmaß der
Literaturübersicht
14
Darmschädigung mit (GLOTZER et al. 1962). Eine etwa achtstündige vollständige Ischämie führt zur Gangränbildung mit und ohne Darmrupturen (GLOTZER et al.
1962).
2.1.2 Ischämie-Reperfusionsschaden
Der IRS am Darm geht sowohl bei chirurgischen Patienten als auch bei Traumapatienten mit hoher Mortalität und Morbidität einher (KOIKE et al. 1993).
Paradoxerweise initiiert die Wiederherstellung des Blutflusses in ischämischem Gewebe eine Kaskade, die zusätzliche Zellschäden hervorruft (MALLICK et al.
2004), den ursprünglichen ischämischen Insult übersteigt (PARKS u. GRANGER 1986; STALLION et al. 2002) und zum sogenannten IRS führt (MOORE et al. 1995).
Geht der Reperfusion eine warme (partielle) Ischämie voraus, entstehen signifikant höhere Gewebeschädigungen als nach einer kalten Ischämie (PARK et al. 1990).
Infolge erhöhter ischämie-reperfusionsbedingter intestinaler Hyperpermeabilität (AKSOYEK et al. 2002) kann es zur Translokation von Bakterien und Endotoxinen kommen (NOLAN u. ALI 1972; GANS u. MATSUMOTO 1974). Das kontinuierliche Ansteigen der LDH-Konzentration bis 30 Minuten nach Einleiten der Reperfusion spiegelt ein progressives Fortschreiten der Gewebeschädigung wider (HOTTER et al.
1996). Weiterhin begünstigt die vermehrte Produktion von Peroxiden, Superoxiden und proinflammatorischen Zytokinen, wie der Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), Interleukin-6 (IL-6) (ROCK u. YAO 2002), IL-1b und IL-18 die Entstehung einer systemischen Entzündungsreaktion (systemic inflammatory response syndrome:
SIRS) (CEPPA et al. 2003). Als weitere Folge kann der intestinale IRS zu pulmonaler Neutrophileninfiltration führen, wodurch das akute Atemnotsyndrom (acute respiratory distress syndrome: ARDS) ausgelöst wird (XIAO et al. 1997).
Letztendlich sind Sepsis, Schock oder Multiorganversagen (MOD - multiple organ dysfunction) (MALLICK et al. 2004) mögliche Folgen und eine chirurgische Resektion des betroffenen Darmabschnittes ist unausweichlich (WHITE et al. 1980).
2.1.2.1 Klinische und makroskopische Veränderungen
Mit dem Einsetzen einer Ischämie am Darm kommt es zur Blauverfärbung der Serosa und einer Pulslosigkeit der Blutgefäße am Darm. Eine zunächst verstärkte Peristaltik und ziehharmonikaähnliche Kontraktionen der Muskulatur werden beobachtet. Bei einer dauerhaften Ischämiephase wird der Darm zunehmend
15
zyanotischer und ist mit fokalen Ekchymosen gekennzeichnet (GLOTZER et al.
1962). Eine vollständige Ischämie führt letztlich zur Blaugrau-Verfärbung der Serosa (SNYDER et al. 1988) und milder Ödembildung in der Darmwand und dem Mesenterium (FREEMAN et al. 1988). Stauungen und Dickenzunahme der entsprechenden Darmsegmente werden durch den vollständigen Gefäßverschluss verhindert (SULLINS et al. 1985). Eine partielle Ischämie hingegen zeigt sich in einer Dunkelrot- bis Schwarzfärbung der Serosa mit ausgeprägter Ödembildung und einer Verdickung der Darmwand (MORTON et al. 2009) auf das Zwei- bis Dreifache (SULLINS et al. 1985). Die Ausbildung eines Ödems ist ein Indikator dafür, dass die Degeneration voranschreitet und wird als wichtiges Kriterium für die Determinierung des Überlebens des Darms gesehen (VAUGHAN 1972).
Bei der ischämischen Strangulation wird durch mechanische Stimulation eine annähernd physiologische, jedoch fast stationäre Kontraktionswelle angeregt (SULLINS et al. 1985). Ein hierbei häufig vorkommender steigender Muskeltonus, welcher durch eine Hypoxie bedingt ist (MOORE u. WHITE 1982), resultiert in einem sinkenden Durchmesser des Darmlumens (SULLINS et al. 1985). Vermutlich ist dieser hypoxische Effekt für die zunehmende muskuläre Aktivität und die ortsständigen Kontraktionsreaktionen während der Ischämie verantwortlich (SULLINS et al. 1985).
Auftretende Ödeme (WHITE et al. 1980; SULLINS et al. 1985; MESCHTER et al.
1986) entstehen bei dieser Form durch interstitielle Flüssigkeitsansammlung, resultierend aus lymphatischer Obstruktion, einem Ungleichgewicht zwischen hydrostatischem und onkotischem Gefäßdruck oder Veränderungen der Gefäßpermeabilität (GRANGER u. BARROWMAN 1983). Die mikrovaskuläre Permeabilität verdoppelt sich nach einer Stunde warmer Ischämie und verfünffacht sich nach ebenso langer Ischämiedauer mit anschließender Reperfusion (GRANGER et al. 1980). Ischämische Läsionen bleiben selten auf die strangulierten Darmsegmente beschränkt, geringgradige Veränderungen finden sich auch an benachbarten Darmabschnitten (FREEMAN et al. 1988).
Im Vergleich zur hämorrhagischen Strangulationsobstruktion erholt sich das Jejunum nach einer ischämischen Strangulationsobstruktion wesentlich schneller und gleicht nach einer etwa fünfminütigen Reperfusion makroskopisch nahezu dem ungeschädigten Darm, wobei geringgradige Hyperämie und geringgradige Ödeme
Literaturübersicht
16
bestehen bleiben (FREEMAN et al. 1988). Die Wiederherstellung der physiologischen Serosafarbe, der arteriellen Pulsation, sowie der Motilität des entsprechenden Darmabschnittes erlauben jedoch keine zuverlässige Vorhersage zur Überlebensfähigkeit des betroffenen Darmabschnitts (CAREY et al. 1970;
BUSSEMAKER u. LINDEMAN 1972; WHITE et al. 1980).
2.1.2.2 Histopathologische Veränderungen
Histologisch werden am Ischämie-geschädigten Dünndarm eine Atrophie der Zotten mit subepithelialen Flüssigkeitsansammlungen sowie Ödeme in der Tunica mucosa und Tela submucosa beobachtet. Des Weiteren kommen eine Erythrozytenextravasation, Leukozyteninfiltration, kapilläre Stauung und Verlust von Epithelzellen der Mukosa hinzu (MESCHTER et al. 1986). Mit zunehmender Dauer der Ischämie nehmen zudem die pathologischen Veränderungen zu (SULLINS et al.
1985). Nach zweitstündiger warmer Ischämie ist eine signifikante Infiltration des equinen Jejunums mit neutrophilen Granulozyten zu verzeichnen (GRISHAM et al.
1986), die während der Reperfusion nochmals weiter ansteigt (GRISHAM et al. 1986;
GROSCHE et al. 2008) und dreißig Minuten nach Beginn der Reperfusion ein Maximum in den Venolen der Tela submukosa erreicht (GROSCHE et al. 2008). Am empfindlichsten reagiert die Mukosa (SALEHI et al. 2003), insbesondere deren Enterozyten an der Zottenspitze, auf eine Ischämie (MALLICK et al. 2004). Die erhöhte Empfindlichkeit wird auf die Lokalisation der Zellen am Ende des Versorgungsgebietes der Arteriolen und somit auf eine, im Vergleich zu den Enterozyten der Krypten, geringere Sauerstoffversorgung zurückgeführt (TAKEYOSHI et al. 1996; BLENNERHASSETT et al. 1998). Eine Studie aus dem Jahr 2002 am Rattenmodell konnte zeigen, dass die Empfindlichkeit der Enterozyten abhängig vom Grad der Differenzierung der Zellen ist (HINNEBUSCH et al. 2002).
Die Degeneration und das Abheben der Enterozyten von der unterliegenden Basalmembran beginnt an der Zottenspitze (GLOTZER et al. 1962) und setzt sich Richtung Zottenbasis fort. Aufgrund der Zell-Zell-Verbindungen lösen sich die Zellen vermehrt plattenweise, seltener einzeln von der Lamina propria mucosae ab (AHO et al. 1973). Veränderungen in der Darmwand resultieren aus der Sauerstoffarmut aufgrund des ATP-Verlusts. Infolge der Sauerstoffarmut und der damit verbundenen fehlerhaften oxidativen Phosphorylierung sowie der sinkenden ATP-Produktion (MOORE et al. 1995), können energiebenötigende Strukturen der Epitheloberfläche,
17
wie zum Beispiel die Tight junctions, die Zellen nicht mehr zusammenhalten (VARGA et al. 2011). Es kommt zur Lückenbildung im Epithel, welche bis zur Basalmembran reicht, mit der Folge einer Hyperpermeabilität der intestinalen Barriere. Das Epithel löst sich, die Lamina propria mucosae der Zotten liegt frei (VARGA et al. 2011) und es kommt zu deren Degeneration (WHITE et al. 1980). Durch Kontraktion der glatten Muskulatur werden die Zotten kürzer und dicker (SULLINS et al. 1985).
Unmittelbar nach Einsetzen der Reperfusion schreiten Zellschwellung und Desquamation der Epithelzellen voran. In den Gefäßen der Tela submucosa nimmt die Endothelzellintegrität weiter ab und zudem kann eine Adhäsion aktivierter Leukozyten, vor allem der neutrophilen Granulozyten, beobachtet werden (GLOTZER et al. 1962; VATISTAS et al. 1998; CARDEN u. GRANGER 2000).
Darüber hinaus kommt es zur Aktivierung, nicht jedoch zu einem vermehrten Ansteigen von Mastzellen, Makrophagen und eosinophilen Granulozyten in der Mukosa (GROSCHE et al. 2011). Zunehmende Extravasation von Erythrozyten und fortschreitende Ödembildung in der Submukosa und der Serosa sind zu verzeichnen (SULLINS et al. 1985; VATISTAS et al. 1998). Die zentrale Lymphkapillare der Zotte füllt sich mit proteinreichem Material, die Serosa zeigt steigende zelluläre Infiltration, Hämorrhagie und vergrößerte Lymphgefäße mit erhöhtem Lymphfluss (DABAREINER et al. 1995). Sowohl die Darmzottenhöhe als auch die Kryptentiefe und infolgedessen die Mukosadicke, nehmen signifikant ab (KUBES et al. 1992;
ERLING JUNIOR et al. 2013). Demgegenüber stehend nimmt das Volumen der Submukosa und der Serosa am equinen Jejunum signifikant zu. Dies ist vermutlich aufgrund steigender mikrovaskulärer Permeabilität nach Ischämie und Reperfusion und damit verbundener intraluminaler Flüssigkeitsansammlung (DABAREINER et al.
1995). In der initialen Reperfusionsphase kommt es schnell zu endothelialen Dysfunktionen, welche jedoch ohne sichtbare morphologische Zellschäden auftreten können (CARDEN u. GRANGER 2000). Die Reepithelisierung beginnt am equinen Colon eine Stunde nach Einleiten der Reperfusion (GROSCHE et al. 2011).
FREEMAN et al. (1988) zeigten zwölf Stunden nach Ende der Ischämie in einer Studie an Ponys bei 50 Prozent der Probanden eine komplette Reepithelisierung.
Eine vollständige Regeneration des Dünndarms von Hunden nach zweistündiger Ischämie wird 24 Stunden nach Wiedereinsetzen der Durchblutung beobachtet (GLOTZER et al. 1962).
Literaturübersicht
18 2.1.2.2.1 Apoptose und Nekrose
Mit dem Einleiten der Reperfusion beginnt die Apoptose der Zellen im zuvor ischämischen Gewebe (GOTTLIEB et al. 1994). Die Reperfusion ist dabei unabdingbar, um den anaeroben Zelltod nach einer Ischämie zu verhindern (DESHMUKH et al. 1997). Beim Zelltod werden die Apoptose und die Nekrose unterschieden (MAJNO u. JORIS 1995):
Die Zellnekrose ist ein unkontrollierter, irreversibler Prozess und wird durch ATP- Abbau, Zellschwellung und Verlust der Membranintegrität charakterisiert (MAJNO u.
JORIS 1995). Die Apoptose hingegen ist ein Prozess, der es dem Organismus ermöglicht unerwünschte Zellen im Laufe der Entwicklung, während einer Krankheit oder zur Erhaltung der Homöostase zu eliminieren (THOMPSON 1995). Es handelt sich dabei um einen kontrollierten Zelltod unter Energieverbrauch (NICOTERA u.
LEIST 1997), der durch Zellschrumpfen, Chromatinkondensation, DNA- Fragmentierung und membrangebundene apoptotic bodies charakterisiert ist (KERR et al. 1972). Im Dünndarm ist die Apoptose hauptsächlich auf die Zellen der Zottenspitze lokalisiert (RAMACHANDRAN et al. 2000). Die Apoptose wird dabei in die Einleitungsphase, die Effektorphase und die Degradationsphase unterteilt (SARASTE u. PULKKI 2000) und dauert etwa eine bis drei Stunden (GAVRIELI et al.
1992). In der dritten Phase werden die Kennzeichen der Apoptose, die morphologischen Veränderungen sowie die DNA-Fragmentierung erst offensichtlich (SARASTE u. PULKKI 2000). Letzteres erfolgt spät in der Apoptosekaskade (COLLINS et al. 1997).
Für den Ablauf sind die Caspasen (cystein-aspartic acid protease) essentiell. Sie werden in Initiator- (Caspasen 2, 9, 8, 10) und Effektorcaspasen (3, 6, 7) (WANG u.
LENARDO 2000) eingeteilt und werden als enzymatisch inaktive Procaspasen im Gewebe synthetisiert (WOLF u. GREEN 1999). Die Caspase-3, eine Effektorcaspase, hat als Proenzym eine Größe von 32 kDa und im aktivierten Zustand zwei kleine (12kDa) und zwei große Untereinheiten à 17 kDa (SCHLEGEL et al. 1996). Die Procaspase-3 ist meist in den Zellen zugegen (PORTER u.
JÄNICKE 1999) und sowohl im Zytosol als auch zu einem beträchtlichen Anteil in den Mitochondrien lokalisiert (MANCINI et al. 1998; ZHIVOTOVSKY et al. 1999). Die aktivierte Form befindet sich im Zytosol, den Mitochondrien und dem Zellkern (ZHIVOTOVSKY et al. 1999). Sie stellt eine häufig aktivierte Protease während des
19
kontrollierten Zelltodes dar (POLVERINO u. PATTERSON 1997) und wird in der frühen Apoptose aktiviert (FALEIRO et al. 1997). Die Caspase-3 führt zur Abspaltung des DNA-Fragmentierungsfaktors (DFF)-45 aus einem Komplex mit dem DFF-40 (LIU et al. 1997). Das Freiwerden des DFF-40 aus diesem Komplex führt zur DNA Fragmentierung und Chromatinkondensierung (LIU et al. 1998).
2.1.2.3 Biochemische Veränderungen
Während der Ischämie wird zelluläres ATP über AMP, Adenosin und Inosin zu Hypoxanthin abgebaut (GRANGER et al. 1986). Die Hypoxie triggert die Umwandlung der Xanthindehydrogenase (XDH) zu Xanthinoxidase, welches unter Anwesenheit von Sauerstoff das Hypoxanthin umwandelt (GRANGER 1988).
Aufgrund des Sauerstoffmangels während der Ischämie kumuliert das Hypoxanthin (COLLARD u. GELMAN 2001). Mit dem Einsetzen der Reperfusion, und somit der Zufuhr von Sauerstoff, kommt es zum schnellen Abbau von Hypoxanthin durch die Xanthinoxidase. Dabei werden die reaktiven Sauerstoffmetaboliten Superoxid (O-2), Wasserstoffperoxid (H2O2) und, in Anwesenheit von Eisen, Hydroxylradikal (OH) gebildet (ARNDT et al. 1991; COLLARD u. GELMAN 2001). Außerdem kommt es zu einer erheblichen Infiltration von neutrophilen Granulozyten in das ischämische Gewebe (GRISHAM et al. 1986). Die neutrophilen Granulozyten bilden den Großteil der Radikale (NALINI et al. 1993) in der Reperfusionsphase und tragen damit, neben der Xanthinoxidase, zum IRS bei (NILSSON et al. 1994). Ein Teil der Radikalentstehung ist unbekannten Ursprungs (NILSSON et al. 1994). Unter physiologischen Bedingungen wird die Schädigung durch Superoxidanionen von der Superoxiddismutase (SOD) gemindert, welche O-2 in H2O2 umwandelt (HARRISON 2002). Im gesunden Gewebe besteht ein Gleichgewicht zwischen der Produktion der freien Radikale und dem antioxidativen Abwehrsystem. Herrscht ein Ungleichgewicht, resultiert ein oxidativer Schaden, der eine Lipidperoxidation nach sich zieht (THÉROND et al. 2000), wodurch die Membranintegrität der Zellen beeinträchtigt wird (KUYPERS 1998).
Literaturübersicht 2.2 Präkonditionierung
2.2.1 Allgemein
In der Humanmedizin sind Organtransplantationen von großer Bedeutung. Die Transplantate sind jedoch schon gegenüber kleinen pathologischen Veränderungen sehr empfindlich, was ein großes Hindernis in der Transplantationsmedizin darstellt und somit die Reduktion eines IRSs besonders wichtig ist (VARGA et al. 2011).
In der Veterinärmedizin spielt das Phänomen des IRSs vor allem bei der Kolikerkrankung des Pferdes, insbesondere bei Darmstrangulationen, eine wichtige Rolle. Denn der Ischämie-Reperfusionsschaden am Darm, dem sensitivsten der inneren Organe hinsichtlich eines IRS (GRANGER et al. 1986), ist mit einer hohen Morbidität und Mortalität des Patienten verbunden (KOIKE et al. 1993). Zusätzlich zur Steigerung des Strangulationsinsults mit dem Einsetzen der Reperfusion (STALLION et al. 2002), können benachbarte, nicht betroffene Darmanteile geschädigt werden (FREEMAN et al. 1988). Bedingt durch eine gesteigerte Darmgewebepermeabilität kann ein IRS einen septischen und hypovolämischen Schock hervorrufen (MOORE et al. 1994a; SWANK u. DEITCH 1996).
Bereits 1986 hat MURRY et al. (1986) die IPC als erfolgreiche Methode zur Abschwächung des Ischämie-Reperfusions-Schadens am Hundeherzen beschrieben. Dabei zeigten die Autoren, dass mehrere kurze aufeinanderfolgende Ischämie-Reperfusions-Perioden zu einer Reduktion der Infarktrate um 75%
gegenüber der Kontrollgruppe führen. Zehn Jahre später wurde die ischämische Präkonditionierung erstmals erfolgreich am Darm durchgeführt (HOTTER et al.
1996).
2.2.2 Möglichkeiten der Präkonditionierung
Der genaue Mechanismus der Entstehung des IRS sowie dessen Limitierung ist Gegenstand vieler Studien. Neben der ischämischen Präkonditionierung wurde auch der präkonditionierende Effekt verschiedener Pharmaka, darunter Antioxidantien, wie das Allopurinol und N-Acetylcystein (FERRER et al. 1998), Stickstoffmonoxid (NO) (Hund, Darm) (KAWATA et al. 2001), die Antikomplementtherapie (Ratten, Darm) (ARUMUGAM et al. 2002), Opioide (FRYER et al. 2000) und volatile Anästhetika (GAN et al. 2013) erfolgreich nachgewiesen.
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Eine weitere Form stellt die entfernte Präkonditionierung dar. Dabei führt eine ischämische Präkonditionierung an einem entfernt gelegenen Organ oder Gewebe zum Schutz eines anderen Organs (PRZYKLENK et al. 1993; KANORIA et al. 2006).
GOKBEL et al. (2014) konnten am Rattenmodell zeigen, dass sich auch Ausdauertraining als präkonditionierend erweist. Ein vierwöchiges Training kann die TNF-α-Konzentration im Serum senken, welches infolge eines IRS von Makrophagen ausgeschüttet wird. Der präkonditionierende Effekt des Ausdauertrainings erklärt sich vermutlich durch die dabei reduzierte Durchblutung der gastrointestinalen Organe (MUSCH et al. 2004) und infolgedessen einer erhöhten Konzentration an Antioxidantien im Gewebe (MURRY et al. 1986). Derzeit sind jedoch keine Studien zur Präkonditionierung an Pferden bekannt.
2.2.2.1 Ischämische Präkonditionierung
Die IPC wird als protektiver und adaptiver Mechanismus definiert. Dieser wird durch kurze Ischämie-Reperfusions-Perioden induziert, welche zu deutlicher, wenn auch zeitlich begrenzter, Widerstandfähigkeit gegenüber einer folgenden längeren Ischämieperiode führen (PARRATT 1994). Dieses Phänomen wurde erstmals von MURRY et al. (1986) beschrieben: Zur Präkonditionierung des Hundeherzens wurde dieses kurzen Ischämie-Reperfusionsperioden ausgesetzt. Die Infarktrate am präkonditionierten Herzen war um 75 Prozent geringer als die der Kontrollgruppe (MURRY et al. 1986). Dieser Protektionsmechanismus konnte bei verschiedenen Organen und Tierarten nachgewiesen werden (MURRY et al. 1986; GOTTLIEB et al.
1994; HOTTER et al. 1996; UM et al. 2005; VARGA et al. 2011). Es wurde gezeigt, dass eine Hypoxie den Grad des Schadens nach der Ischämie reduziert (SHIZUKUDA et al. 1992).
Unterschieden werden bei der IPC zwei Protektionsphasen: Die frühe Phase, die wenige Minuten nach der Präkonditionierung einsetzt und für etwa eine Stunde andauert (LI et al. 1992). Diese wird als „klassische Präkonditionierung“ oder „Early Preconditioning“ bezeichnet. Etwa 12-24 Stunden nach der klassischen Präkonditionierung setzt die späte Phase (Second window of Protection (SWOP), Late Preconditioning) ein, welche mehrere Stunden benötigt bis sie manifest wird und für drei bis vier Tage andauern kann (PARRATT 1994; COHEN et al. 2000; YELLON u. DANA 2000). HOTTER et al. (1996) führten erstmals erfolgreich die ischämische Präkonditionierung am Darm durch. Anschließend wurde die IPC am Darm in vielen
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Studien mit unterschiedlich langen und einer unterschiedlichen Anzahl an Ischämie- Reperfusionszyklen durchgeführt (AKSOYEK et al. 2002; UNAL et al. 2003; WU et al.
2004). Um dabei einen günstigen Effekt zu erzielen ist laut UNAL et al. (2003) mehr als ein Ischämie-Reperfusions-Zyklus nötig. Dies zeigen auch die Ergebnisse von MIURA et al. (1992) am Herzen beim Kaninchen. VARGA et al. (2011) haben in einer Studie verschiedene Präkonditionierungskonzepte verglichen, wobei hier längere Ischämie-, gefolgt von längeren Reperfusionsphasen zu besseren Erfolgen hinsichtlich des Mukosaschadens und des Becherzelluntergangs führten. Laut TSUCHIDA et al. (1993) erzielt jedoch eine einzelne fünfminütige Ischämieperiode den gleichen schützenden Effekt wie mehrere fünfminütige Ischämiezyklen. Die Ischämiezyklen zur Präkonditionierung scheinen außerdem einen Schwellenwert zwischen zwei- und fünfminütiger Dauer zu benötigen, um effektiv zu sein (VANWINKLE et al. 1991; TSUCHIDA et al. 1993), wobei es jedoch speziesabhängige Unterschiede gibt (LI et al. 1990; COHEN et al. 1994). Der protektive Effekt beruht nicht alleine auf der Dauer und Anzahl der Ischämieperioden, sondern, durch seine zeitliche Begrenzung, auch auf den Zeitraum bis zur anhaltenden Ischämie und deren Dauer (PARRATT 1994). Erfolgt die anhaltende Ischämie etwa 35 Minuten nach der Präkonditionierung, stellt sich kein signifikant protektiver Effekt mehr ein (MIURA et al. 1992).
In den letzten Jahren stellte sich die ischämische Präkonditionierung als vielversprechendste Strategie zum Schutz gegen den Reperfusionsschaden heraus, da sie scheinbar die Toleranz der Organe gegenüber dieser Schädigung erhöht (MALLICK et al. 2004), die Entzündungsparameter (ICAM, CD-44) im frühen Transplantationsstadium senkt und so auch das Abstoßungsrisiko des Gewebes (CAMPRODON et al. 2014) und im intestinalen Gewebe den Austritt von Bakterien reduziert (AKSOYEK et al. 2002). TAHIR et al. (2015) konnten zeigen, dass die IPC vor einer Ischämie und Reperfusion das Ansteigen der Lymphozytenzahl und eine signifikante Senkung der Granulozyten und Thrombozyten bedingt. Zusätzlich steigert die IPC signifikant die intestinale Stammzellaktivität in den Krypten bei Mäusen an Tag eins und zwei nach der IPC (CHEN et al. 2014). Die verbesserte Stammzellantwort sehen die Autoren als mögliche Erklärung für den positiven Effekt der IPC. Auch in der Humanmedizin weisen Studien darauf hin, dass die IPC beim
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Menschen erfolgreich ist (KLONER et al. 1995). Der genaue Wirkmechanismus am Darm ist jedoch noch unklar (TAHIR et al. 2015).
Es wird angenommen, dass die präkonditionierende Wirkung auf der Ausschüttung endogener Substanzen, darunter Adenosin (LIU et al. 1991), Prostazyklin, Stickstoffmonoxid (NO), Bradykinin (PARRATT 1994) und Opioiden, beruht (SCHULTZ et al. 1995). Adenosin, Bradykinin und Opioide scheinen parallel zu wirken, da die Inhibierung eines der Substanzen den protektiven Effekt der IPC verhindert. Durch Erhöhung Anzahl der Ischämie-Reperfusions-Zyklen ist der präkonditionierende Effekt wieder möglich (GOTO et al. 1995). Während der Ischämiezyklen in der Triggerphase (LIANG u. GROSS 1999) lösen diese Substanzen eine Signalkaskade aus, die über den epidermalen Wachstumsfaktor (EGFR), die Phosphatidyl-Inositol 3-Kinase/ Akt, Stickoxidsynthase (NOS), Guanylatzyklase (GC) und Proteinkinase G (PCG) zur Öffnung von mitochondrialen ATP-sensitiven Kaliumkanälen führt (PAIN et al. 2000). Diese sind essentiell für die IPC (TOMAI et al. 1994). Ein initialer Stickstoffmonoxidanstieg triggert die Präkonditionierung und ist essentiell für deren Ablauf (HOTTER et al. 1996). Die Mitochondrien schütten nach Aktivierung der Kaliumkanäle freie Sauerstoffradikale (ROS) aus, welche die Proteinkinase C (PKC) aktivieren (GOTO et al. 1995).
Vermehrt wird die klassische PKC-Isoform α sowie die neuen Isoformen δ und insbesondere die Isoform ɛ phosphoryliert (UM et al. 2005). Letztere ist UM et al.
(2005) zufolge die relevante PKC-Isoform für den protektiven Effekt der IPC, da die selektive Inhibierung der Isoformen α und δ den IPC-Effekt nicht aufheben. Zur Aktivierung der PKC wirken Adenosin, Bradykinin und Opioide additiv. Durch Blockieren einer der Substanzen sinkt der Stimulus auf die PKC unter einen bestimmten Schwellenwert und verhindert so die ischämische Präkonditionierung.
Ein verstärkter ischämischer Insult, eine Erhöhung von Adenosin oder einem Bradykininagonisten kann eine Rezeptorblockade überwinden (GOTO et al. 1995;
SAKAMOTO et al. 1995). PKC-Inhibitoren (z.B. Polymyxin B) während der Ischämiephase verhindern die IPC jedoch komplett (GOTO et al. 1995; SAKAMOTO et al. 1995; OKAMURA et al. 1999). Adenosin aktiviert direkt die Proteinkinase C über Adenosin-1-Rezeptoren (COHEN et al. 2001). Auch freie Sauerstoffradikale aktivieren die PKC, sowie parallel die p38 MAPK und damit eine parallel ablaufende Kaskade (LIU et al. 1994). Beide Kaskaden führen in einem unbekannten Effektor
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wieder zusammen (COHEN et al. 2001). Sowohl Bradykinin als auch Opioide und Adenosin sind Gi-Rezeptor-vermittelt, weshalb PAIN et al. (2000) annehmen, dass alle Gi-Protein-gekoppelten Substanzen präkonditionierend am Herzen sein können.
Diese wirken jedoch über unterschiedliche Kaskaden (COHEN et al. 2001).
Das Öffnen der mitochondrialen ATP-sensitiven Kalium - Kanäle (PAIN et al. 2000) und die Ausschüttung von freien Sauerstoffradikalen während der Triggerphase generiert zudem eine Erinnerungsfunktion, so dass nach dem Washout der Substanzen und dem Schließen der mitochondrialen ATP-sensitiven Kalium- Kanäle der Schutz für etwa eine Stunde besteht (YAO et al. 1997). Das Öffnen der mitochondrialen ATP-sensitiven Kalium- Kanäle muss vor der anhaltenden Ischämie erfolgen (PAIN et al. 2000). In Kombination mit Adenosin wird jedoch ein protektiver Effekt beobachtet. Adenosin und die mitochondrialen ATP-sensitiven Kalium- Kanäle scheinen synergistisch zu wirken (YAO et al. 1997). Die Hypoxie steigert zudem die Expression des hypoxie-induzierten Faktors 1α (HIF-1α) (JONES et al. 2006), welcher im Gehirn am Mäusemodell neuroprotektiv wirken soll (LUO et al. 2017). Es wird vermutet, dass HIF -1α der auslösende Faktor des endogenen Protektionsmechanismus ist und mit der PI-3K/Akt-Signalkaskade in Verbindung steht (ZHANG et al. 2016).
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Abbildung 1: Dargestellt ist der vermutete Ablauf der ischämischen Präkonditionierung vor der anhaltenden Ischämie. Die Kaskaden über die PKC und die p38 MAPK führen in einem unbekannten Effektor (Effektor X) zusammen. EGFR = Epidermal Growth Factor Receptor, PI- 3K = Phosphatidyl- Inositol 3-Kinase, Akt = Proteinkinase B Serin/Threonin-Kinase, NOS = Stickoxidsynthase,
GC = Guanylatzyklase, PKG = Proteinkinase G, ROS = reaktive oxygen species/ freie Sauerstoffradikale, PKC = Proteinkinase C, MAPK = Mitogenaktivierte Proteinkinase
Modifiziert nach DOWNEY et al. (2007)
2.2.2.1.1 Entfernte Ischämische Präkonditionierung
Bei der entfernten IPC (Remote Ischemic Preconditioning (RIPC)) werden die kurzen Ischämie-Reperfusionszyklen nicht am zu schützenden Organ oder Gewebe selbst, sondern an einem anderen Organ oder Gewebe angelegt (PRZYKLENK et al. 1993;
KANORIA et al. 2006). Zur Präkonditionierung der Leber bei Kaninchen (KANORIA et al. 2006) und Mäusen wurden Ischämien am Hinterbein mittels Blutdruckmanschette (KANORIA et al. 2006) oder per offener Technik durch Abklemmen der Vena femoralis (ABU-AMARA et al. 2011) oder der Arteria mesenterica angelegt (GHO et al. 1996). Beim Anlegen der Ischämie mit einem Stauschlauch kann es jedoch zu Lähmungen durch Quetschung der Muskulatur und Nerven kommen (ABU-AMARA et al. 2011). Auch bei der RIPC gibt es eine frühe Phase, welche nach dem Stimulus beginnt und für etwa vier Stunden andauert, sowie ein SWOP (KAGEYAMA et al. 2015), welches 12-24 Stunden nach der
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Präkonditionierung beginnt (YAMASHITA et al. 1998) und für 48-72 Stunden andauert (BAXTER et al. 1997). Die erste klinische Anwendung beim Menschen wurde 2006 präoperativ im Rahmen von Eingriffen am Herzen bei Kindern durchgeführt. Zur Präkonditionierung des Myokards wurden dabei mittels einer Blutdruckmanschette kurze Ischämien am Bein angelegt (CHEUNG et al. 2006).
Auch bei der RIPC zeigen diverse Studien unter anderem die Beteiligung von NO, speziell iNOS, Adenosin, ATP-sensitiven Kaliumkanälen und der PKC (PELL et al.
1998; KUNTSCHER et al. 2002; TOKUNO et al. 2002; WEINBRENNER et al. 2002).
2.2.2.2 Pharmakologische Präkonditionierung 2.2.2.2.1 Dexmedetomidin
Dexmedetomidin wurde in den 1980er Jahren entwickelt (KALLIO et al. 1989) und ist das aktive Enantiomer von Medetomidin. In Europa ist es für den Menschen und für Kleintiere als Sedativum zugelassen. Dexmedetomidin bindet nicht nur an Alpha-2- und Alpha-1-Adrenozeptoren, sondern zusätzlich an Imidazolinrezeptoren (HIEBLE u. RUFFOLO 1995). Im Vergleich zu Xylazin besitzt es eine einhundertfach höhere Alpha-2-/Alpha-1-Adrenozeptor-Selektivität (1620:1) (VIRTANEN et al. 1988).
Alpha-2 Agonisten sind in der Veterinärmedizin weit verbreitet (CLARKE u. HALL 1969; MAZE u. TRANQUILLI 1991). Zu den für das Pferd in Deutschland zugelassenen Alpha-2 Agonisten zählen Xylazin, Detomidin und Romifidin. Neben dem sedierenden (CLARKE u. HALL 1969; ENGLAND et al. 1992) und analgetischen Effekt bewirken diese eine Anxiolyse und Muskelrelaxation (ROHRBACH et al. 2009). Zur Sedierung von Pferden werden sie alleine oder in Kombination mit Opioiden eingesetzt (TAYLOR et al. 1988; HUBBELL et al. 2010).
Die Kombination mit Opioiden führt zur besseren Qualität der Sedation und reduziert die Antwort auf eine Stimulation (CLARKE u. PATON 1988). Weiterhin finden die Alpha-2 Agonisten sowohl zur Prämedikation vor einer Allgemeinanästhesie (BETTSCHART-WOLFENSBERGER et al. 1996) als auch währenddessen in Kombination mit einem Inhalationsanästhetikum zur balancierten Anästhesie bei Pferden Anwendung (MAZE u. TRANQUILLI 1991; AANTAA et al. 1997). Neben der hohen Einsparung an Inhalationsanästhetikum, bei Isofluran bis zu 47 % (AANTAA et al. 1997) und bei Sevofluran bis zu 53 % (GOZALO-MARCILLA et al. 2013a), zeigen Pferde nach einer Dexmedetomidin-balancierten Allgemeinanästhesie eine qualitativ
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gute bis exzellente Aufstehphase (GOZALO-MARCILLA et al. 2013b; HOPSTER et al. 2014).
2.2.2.2.1.1 Pharmakodynamik
Die Adrenorezeptoren wurden 1948 zunächst als Alpha- und Beta-Adrenozeptoren klassifiziert. Adrenalin und Noradrenalin fungieren peripher und zentral als Neurotransmitter (AHLQUIST 1948). Bis heute sind die Alpharezeptoren differenziert in Alpha-1 und Alpha-2 (BERTHELSEN u. PETTINGER 1977) und weiter in die Subtypen Alpha-2a, Alpha-2b und Alpha-2c (BYLUND et al. 1994). Es handelt sich um Transmembranrezeptoren, welche G-Protein-gekoppelt die Aktivität der Adenylatzyklase (COTECCHIA et al. 1990; WISE et al. 1997) und das Öffnen der spannungsabhängigen Calciumkanäle inhibieren, während sie Kaliumkanäle aktivieren (COTECCHIA et al. 1990). Die Alpha-2 Adrenozeptoren sind prä-, post- und extrasynaptisch in verschiedenen Geweben lokalisiert (PATON u. VIZI 1969;
WIKBERG 1979). Postsynaptische Alpha-2 Rezeptoren befinden sich in verschiedenen Geweben, darunter Leber, Pankreas, Niere, Fettgewebe, Augen und der Gefäßmuskulatur. Präsynaptische Alpha-2 Rezeptoren sind an sympathischen Nervenendigungen und noradrenergen Neuronen im zentralen Nervensystem lokalisiert und inhibieren bei Aktivierung die Freisetzung von Noradrenalin (LANGER 1974). Die sedativen und physiologischen Effekte korrelieren positiv mit der Plasmakonzentration (MAMA et al. 2009). Der sedative Effekt wird über Alpha-2a- Rezeptoren vermittelt, die vor allem im Locus coeruleus im Hirnstamm lokalisiert sind - dieser moduliert auch den Schlaf- und Wachzustand. (SCHEININ u. SCHWINN 1992). Die Sedation entsteht durch Hemmung der Noradrenalinausschüttung. Über eine Kaskade kommt es auch zu einer Senkung der Histaminausschüttung, was zur Sedation beiträgt (NELSON et al. 2001). Alpha-2-Rezeptoren werden weiterhin für Analgesie, Neuroprotektion und die Hemmung der Insulinausschüttung verantwortlich gemacht (PANZER et al. 2009). Klinisch zeigen die Pferde unter Sedation ein reduziertes Bewusstsein, eine Ptosis des Kopfes, der Unterlippe und Augen, sowie eine Ataxie (ENGLAND et al. 1992; BETTSCHART-WOLFENSBERGER et al. 1999).
Zu beachten ist, dass dabei eine weckbare Sedation vorliegt und die Pferde mit plötzlichen, koordinierten Abwehrbewegungen auf einen Stimulus reagieren können (CLARKE u. TAYLOR 1986; ENGLAND et al. 1992). Der analgetische Effekt wird
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zudem über Alpha-2a-Rezeptoren im Dorsalhorn des Rückenmarks vermittelt (YAKSH 1985).
2.2.2.2.1.2 Kardiovaskuläre und respiratorische Wirkung
Die Wirkung der Alpha-2-adrenergen Agonisten auf das zentrale Nervensystem (siehe 2.3.2) führt zur Senkung des Herzauswurfs aufgrund der Bradykardie und der negativ ionotropen Wirkung. Auf eine intravenöse Applikation von Alpha-2- adrenergen Agonisten folgt initial eine Hypertension in dosisabhängiger Wirkung und Dauer (CLARKE u. TAYLOR 1986; YAMASHITA et al. 2000) mit einer anschließenden Hypotension (BETTSCHART-WOLFENSBERGER et al. 2005). Die anfängliche Hypertension löst über die Barorezeptoren einen Anstieg des vagalen Tonus aus, zudem sinkt der Sympathikotonus, wodurch die Bradykardie und die atrioventrikulären Blöcke ersten und zweiten Grades erklärt werden (YAMASHITA et al. 2000). Der bereits beschriebene biphasische Verlauf des Blutdrucks ist bedingt durch den initialen Anstieg des Gefäßwiderstandes aufgrund der postsynaptischen Alpha-2b-Rezeptorstimulation der glatten Gefäßmuskulatur, die eine Hypertension auslöst (LINK et al. 1996). Anschließend folgt über die präsynaptischen Alpha-2a- Rezeptoren eine sinkende Noradrenalinausschüttung und abnehmende Stimulation der präsynaptischen Alpha-2c-Rezeptoren. Infolgedessen wird die Adrenalinfreisetzung aus der Nebenniere reduziert, woraus ein sinkender Gefäßwiderstand und Blutdruck resultiert (KNAUS et al. 2007). Aufgrund der schnellen Umverteilung und Elimination sind die kardiopulmonalen Auswirkungen nach einer Dexmedetomidinapplikation von kurzer Dauer (BETTSCHART- WOLFENSBERGER et al. 2005). Im Vergleich mit Medetomidin (5-7 μg/kg KGW) oder Xylazin (1 mg/kg KGW) (YAMASHITA et al. 2000), welche 60 Minuten nach Bolusapplikation wieder einen steigenden mittleren arteriellen Blutdruck verzeichnen, steigt bei Dexmedetomidin der arteriellen Blutdruck beim Pferd schon nach 45 Minuten (BETTSCHART-WOLFENSBERGER et al. 2005).
Alpha-2-Agonisten senken aufgrund der sedierenden Wirkung die Atemfrequenz und den arteriellen Sauerstoffpartialdruck (PaO2), während der Kohlenstoffdioxidpartialdruck (PaCO2) unverändert bleibt (WAGNER et al. 1991;
YAMASHITA et al. 2000). SANTOS et al. (2003) beobachten jedoch in ihrer Studie an Pferden, sowohl bei Xylazin als auch Romifidin und Detomidin, einen signifikanten
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Anstieg der Respirationsrate, bei einem sinkenden Kohlenstoffdioxidpartialdruck (PaCO2).
2.2.2.2.1.3 Pharmakokinetik
An Ponys konnte eine altersabhängige Eliminationshalbwertszeit nach Bolusapplikation von 3,5 μg/kg KGW Dexmedetomidin beobachtet wurde. Bei den 4- bis 5-jährigen Probanden betrug diese 19,8 Minuten, während bei den durchschnittlich 20-jährigen Tieren eine Eliminationshalbwertszeit von 28,9 Minuten angegeben wird (BETTSCHART-WOLFENSBERGER et al. 2005). Nach intravenöser Bolusapplikation von Dexmedetomidin (3,5 μg/kg KGW) waren nach 60- 90 Minuten keine Plasmakonzentrationen mehr messbar (BETTSCHART- WOLFENSBERGER et al. 2005). Nach einer höheren Bolusgabe (5 μg/kg KGW i.v.) ist bei Pferden hingegen die Eliminationshalbwertszeit mit 8,03 Minuten deutlich schneller und Dexmedetomidin ist nach 30-60 Minuten im Blut nicht mehr nachweisbar (REZENDE et al. 2015). In Kombination mit anderen Medikamenten, wie zusammen mit Ketamin und Midazolam im Rahmen einer totalen intravenösen Anästhesie (TIVA), ist die Eliminationshalbwertszeit von Dexmedetomidin mit 46 ± 7 Minuten deutlich verlängert (HOPSTER et al. 2014). Aufgrund seiner Pharmakokinetik ist Dexmedetomidin als Dauertropfinfusion für eine Langzeitsedation gut geeignet (BETTSCHART-WOLFENSBERGER et al. 2005). Der Sedationsgrad korreliert direkt mit der Plasmakonzentration, weshalb die Infusionsrate nach Effekt eingestellt werden kann (RANHEIM et al. 2015).
2.2.2.2.1.4 Präkonditionierende Wirkung
In den letzten Jahren konnte in Modellversuchen an Ratten und Kaninchen ein präkonditionierender Effekt für den Alpha-2-Agonisten Dexmedetomidin nachgewiesen werden (PANZER et al. 2009; SAHIN et al. 2013; GONULLU et al.
2014; JIANG et al. 2014). Die Applikation steigert am Herzen bei Ratten die Konzentration der sogenannten „Pro-Survival-Kinasen“ (phosphorylierte extrazellulär- signal-regulierte Kinase 1/2 (ERK 1/2), Proteinkinase Akt eNOS) vor Eintritt einer Ischämie, wodurch der lokale IRS gemindert wird (IBACACHE et al. 2012). Trotz der vasokonstriktiven und der nach Bolusapplikation hypotensiven und damit proischämischen Eigenschaften der Alpha-2-Agonisten stellt sich ein protektiver Effekt ein (KAMIBAYASHI u. MAZE 2000). Vermutet wird, dass die damit
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verbundene Ischämie die Präkonditionierung triggert (OKADA et al. 2007). Zudem fördert Dexmedetomidin die Expression des hypoxie-induzierenden Faktors-1α (HIF- 1α) sowohl in vitro als auch in vivo. An Modellversuchen am Gehirn bei Mäusen konnte gezeigt werden, dass die vermehrte Ausschüttung des Faktors HIF-1α die Autophagie von Neuronen am Gehirn reduziert (LUO et al. 2017). An der Lunge wirkt Dexmedetomidin protektiv über die PI-3K/Akt/HIF-1α-Signalkaskade (ZHANG et al.
2016). Dexmedetomidin hemmt außerdem die Lipidperoxidation während einer Ischämie-Reperfusion, was durch Messung der Superoxiddismutaseaktivität (SOD) und der Malondialdehydkonzentration (MDA) im Plasma nachgewiesen wurde (ARSLAN et al. 2012). Zudem führt die Applikation von Dexmedetomidin zur signifikanten Senkung von Zytokinen, darunter TNF-α (GULER et al. 2014), IL-1 und IL-6 (TASDOGAN et al. 2009), wodurch die protektive Wirkung erfolgen soll (SHEN et al. 2013). Dexmedetomidin steigert dosisabhängig die Apoptose von neutrophilen Granulozyten und verhindert dadurch deren Superoxidproduktion (KISHIKAWA et al.
2008). An der Skelettmuskulatur wird zudem eine potentere antioxidative Wirkung im Vergleich zu Vitamin E beschrieben (DONG et al. 2014). Der präkonditionierende Effekt des Dexmedetomidins soll sowohl über den Imidazolin-1- als auch den Alpha- 2-Rezeptor vermittelt werden (DAHMANI et al. 2010). Die Aktivierung des Imidazolin- 1-Rezeptors führt zur Steigerung der extrazellulär signal-regulierten Proteinkinasen 1 und 2 (ERK1/2), welche die kaliumabhängigen mitochondrialen ATP-sensitiven Kaliumkanäle aktivieren (DAHMANI et al. 2008). Des Weiteren wird durch die Stimulation des Alpha-2-Rezeptors mittels Hemmung der cAMP die Tyrosinkinase FAK aktiviert. Die Phosphorylierung der FAK führt anschließend über eine zelluläre Kaskade zur Aktivierung des Survivalproteins Akt (GIRAULT et al. 1999).
Dexmedetomidin steigert die Phosphorylierung der FAK und der ERK1/2 (DAHMANI et al. 2010). Unterstrichen wird diese Hypothese durch die Reduktion des präkonditionierenden Effekts bei der Gabe des Alpha-2-Rezeptor-Antagonisten Yohimbin, eines PI3-Kinase-Inhibitors (DAHMANI et al. 2010; IBACACHE et al. 2012) oder eines Tyrosinkinase-Inhibitors und somit der alpha-2-rezeptorbasierten Kaskade (DAHMANI et al. 2010). Yohimbin hebt den protektiven Effekt durch den Alpha-2- Rezeptoragonisten nicht auf. JIANG et al. (2014) zeigen am Rattenmodell nach der Gabe von Dexmedetomin (5 μg/kg/h i.v.) in Kombination mit Yohimbin (1.0 mg/kg i.v.) signifikant geringere histologische Organschäden als bei der nicht-
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präkonditionierten, durch Ischämie und Reperfusion geschädigten Gruppe. Efaroxan, ein Alpha-2-Rezeptor- und Imidazolin-1-Rezeptor-Antagonist, reduziert ebenfalls die schützende Wirkung (DAHMANI et al. 2010). Der protektive Effekt von Dexmedetomidin erfolgt konzentrationsabhängig (DAHMANI et al. 2010). In Modellversuchen bei Ratten konnte gezeigt werden, dass eine Bolusgabe von 10 μg/kg KGW i.v. 60 Minuten vor einer Ischämie der Niere die Serumkreatininkonzentration um 30% senkt und die Serumharnstoffkonzentration um 23% im Vergleich zu Kontrollgruppe. Die Gabe von 1 μg/kg KGW i.v. induziert keine Senkung der Werte. Beide Konzentrationen verbessern die IR-bedingte akute Tubulusnekrose (ATN). Eine DTI von 0,1 oder 0,3 μg/kg/min, beginnend 60 Minuten vor einer Ischämie und fortgesetzt bis 30 Minuten nach Einleiten der Reperfusion, hat keinen Effekt auf die Kreatinin- oder Harnstoffkonzentration bei Ratten. Die höhere Infusionsrate von 0,3 μg/kg/min senkt jedoch die ATN (LEMPIAINEN et al. 2014).
2.2.2.2.1.5 Postkonditionierende Wirkung
Dexmedetomidin induziert am Gehirn bei Mäusen auch einen postkonditionierenden Effekt, welcher vermutlich die gleichen Mechanismen verwendet (DAHMANI et al.
2010). Im Vergleich zu Isofluran, das direkt mit der Einleitung der Reperfusion effektiv wirkt (LEE et al. 2008), wird bei Dexmedetomidin 60 Minuten nach Beginn der Reperfusion der neuroprotektivste Effekt verzeichnet (DAHMANI et al. 2010). Bei einer Bolusgabe von 1 oder 10 μg/kg KGW i.v nach 40minütiger Ischämie wird an der Niere bei Ratten kein schützender Effekt beobachtet (LEMPIAINEN et al. 2014).
2.2.2.3 Weitere Pharmaka mit präkonditionierender Wirkung 2.2.2.3.1 Antioxidantien
In vielen Studien konnte gezeigt werden, dass Antioxidantien, darunter Allopurinol (FERRER et al. 1998), Captopril (BUYUKGEBIZ et al. 1994) und Ascorbinsäure (NAKAMURA et al. 1997), den durch IR verursachten Gewebeschaden reduzieren.
FERRER et al. (1998) zeigen am Rattenmodell, dass sowohl N-Acetylcystein als auch Allopurinol die intestinale Nekrose um etwa 60 Prozent senken können.
Literaturübersicht
32 2.2.2.3.2 Opioide
Opioid-Rezeptoren sind in den Schutz der Organe vor einem Ischämie- Reperfusionsschaden involviert (WANG et al. 2012; LIN et al. 2013; TIAN et al.
2013). XU et al. (2017) demonstrierten am Rattenmodell, dass Fentanyl die ischämie-reperfusionsbedingte Apoptose an Myozyten reduziert. Der dahinterstehende Mechanismus wird in der veränderten Regulierung der anti- apoptotischen B-Zell Lymphoma-2 und der pro-apoptotischen Bax-Proteine vermutet (XU et al. 2017). CHO et al. (2013) weisen bei Mäusen eine bis zu achtfach geringere Zottenschädigung im Ileum nach, sowie nach Bestimmung des Malondialdehydgehalts in diesem Darmanteil eine im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant geringere Lipidperoxidation. Im Jejunum konnte diese geringere Lipidperoxidation nicht nachvollzogen werden. Auch der Plasmagehalt des proinflammatorischen Zytokins IL-6 sinkt durch Remifentanylgabe signifikant (CHO et al. 2013). Am Rattenmodell wirkt Remifentanil dosis-unabhängig, so konnten bei Dosierungen von 0,2 μg/kg; 0,6 μg/kg oder 1 μg/kg KGW zwischen den Gruppen histologisch keine signifikanten Unterschiede am Dünndarm festgestellt werden (SHEN et al. 2016). Bei einer geringeren Dosierung bleibt dieser positive Effekt hingegen aus. Die antiapoptotische Wirkung sowohl in vivo als auch in vitro ist δ- und μ-Rezeptor vermittelt, nicht jedoch κ-Rezeptor-vermittelt und senkt so die Apoptose im Mukosaepithel (SHEN et al. 2016). Auch am Herzen bei Ratten ist die protektive Wirkung δ-Opioidrezeptor-vermittelt (FRYER et al. 2000).
2.2.2.3.3 Inhalationsanästhetika
Auch volatile Anästhetika, wie Sevofluran, wirken protektiv gegenüber eines intestinalen IRS. Der Effekt erfolgt über eine Reduktion der Neutrophileninfiltration, einer Abschwächung des IL-6-Anstiegs, der Herunterregulierung der Apoptose und der Reduzierung des oxidativen Stresses. Sevofluran hat dabei keinen Einfluss auf eine Mastzelldegranulation, welche den IRS verstärkt. Histologisch werden lediglich ein geringgradiges Ödem der Darmmukosa und die Infiltration einiger epithelialer Entzündungszellen beobachtet (GAN et al. 2013).
Das häufig in der Veterinäranästhesie verwendete volatile Anästhetikum Isofluran führt bei Mäusen nach einer Ischämie-Reperfusion an der Niere zum Ansteigen des hypoxie-induzierten Faktors 1α und damit auch zur Erhöhung von Erythropoetin.
Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Kreatinin und Harnstoff sinken. Die
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histologischen Veränderungen an den Nierentubuli sowie die Apoptoserate sind signifikant geringer, sodass die Überlebensrate steigt (ZHANG et al. 2011). LEE et al.
(2007) stellen bei Mäusen unter Isoflurananästhesie eine verbesserte Nierenfunktion, außerdem reduzierte Hämorrhagien, eine geringere Tubulusschwellung und -nekrose im Vergleich zur pentobarbitalbasierten Anästhesie fest. Weiterhin beobachten die Autoren eine reduzierte Neutrophilen- und Makrophageninfiltration wie auch eine Reduktion der Entzündungsmediatoren ICAM-1, TNF-α und IL-1β.
2.2.2.3.4 Adenosin
Adenosin wird vermehrt während der Ischämie gebildet. In einer Studie an Ratten senkt es die Neutrophileninfiltration und die Membranlipidperoxidation, stimuliert die Produktion antioxidativer Enzyme, induziert und aktiviert die Superoxiddismutase und löst außerdem die Produktion von NO zur Reduktion von oxidativem Stress aus (OZACMAK u. SAYAN 2007). Am Kaninchenmodell führt die intracoronare Injektion von Adenosin oder eines selektiven A1-Rezeptor-Agonisten (N6-1-(phenyl-2R- isopropyl) adenosin) am isolierten Herzen zu einem signifikant geringeren Infarktausmaß (LIU et al. 1991). Adenosin in Kombination mit der IPC senkt den Gewebeschaden zusätzlich (MONTERO et al. 2014). DOWNEY et al. (1994) bestätigen am Kaninchenmodell nach intravenöser Applikation von Adenosin oder einem A1-Rezeptor-Agonisten im Vorfeld einer anhaltenden Ischämie einen mit der mechanischen Form vergleichbaren Effekt, wohingegen die Gabe eines A2- Rezeptor-Agonisten diese Wirkung nicht hervorruft. LIU et al. (1991) gehen davon aus, dass durch die IPC endogenes Adenosin ausgeschüttet und durch die Bindung an die A1-Rezeptoren die Präkonditionierung induziert wird. Außerdem beobachten sie die Blockierung der ischämischen Präkonditionierung mittels Adenosinrezeptorantagonisten (LIU et al. 1991; DOWNEY et al. 1994). Am isolierten Herzen des Menschen wirkt zudem die Stimulation des A3-Adenosinrezeptors präkonditionierend (CARR et al. 1997). Es wird angenommen, dass Adenosin von ischämischen Myozyten ausgeschüttet wird und zur Verlangsamung des ischämischen Metabolismus führt (PARRATT 1994). Adenosin, welches während der ischämischen Präkonditionierung gebildet wird, soll den kardioprotektiven Effekt triggern (TSUCHIDA et al. 1993). Das in diesem Zusammenhang vermehrt gebildete Adenosin setzt den Schwellenwert für die Dauer der angelegten kurzen
Literaturübersicht
34
Ischämiezyklen am Herzen bei Kaninchen auf zwei Minuten herab (TSUCHIDA et al.
1993).
2.2.2.3.5 Stickstoffmonoxid
Stickstoffmonoxid wird von der Stickstoffmonoxid-Synthase (NOS) aus L-Arginin gebildet. Drei Formen der NOS sind bekannt: die endotheliale (eNOS), die neuronale (nNOS) und die induzierbare Synthase (iNOS) (ALBRECHT et al. 2003).
Im Intestinaltrakt wirkt NO sowohl zytotoxisch als auch zytoprotektiv, wobei die endotheliale und neuronale Synthase, welche die dominierende im gesunden Intestinaltrakt darstellt (QU et al. 2001), protektiv wirken (KUBES u. MCCAFFERTY 2000). Zudem fungiert sie im Darm unter anderem als Radikalfänger, zur Aufrechterhaltung der Gefäßpermeabilität und zur Reduktion der Leukozytenadhäsion am Endothel (WINK et al. 1993; GIDDAY et al. 1998). In der Leber scheint es durch Inhibierung der Endothelinsynthese präkonditionierend zu wirken (PERALTA et al. 1996). In einer IR-Studie an iNOS-Knockoutmäusen wurde nach der Reperfusion eine gewisse Widerstandsfähigkeit in Bezug auf eine Bakterientranslokation und Mukosaschädigung beobachtet (SUZUKI et al. 2000).
Dies bestätigen auch AKSOYEK et al. (2002) in ihrer Studie, in der die IPC am Darm ein Ansteigen der iNOS verhindert und damit der Gewebeschaden und die Bakterientranslokation sinken. Wird die NO-Synthese blockiert, ist die IPC nicht erfolgreich (VLASOV et al. 2002). Die Gabe eines exogenen NO-Donors oder eines selektiven iNOS-Inhibitors vor einer Ischämie mindert den IRS (KHANNA et al. 2003;
NAITO et al. 2004). Es wird angenommen, dass kurze Ischämieperioden ein Ansteigen der intrazellulären Kalziumkonzentration auslösen, wodurch wiederum die kalziumabhängige Stickstoffmonoxid - Synthase aktiviert wird (HOTTER et al. 1996).
2.2.2.3.6 Allopurinol und Superoxiddismutase
Die Inhibierung der Xanthinoxidase durch Allopurinol oder der Superoxide durch die Superoxiddismutase (SOD) senken signifikant die bei Ischämie-Reperfusion erhöhte gewebeassoziierte Myeloperoxidase (MPO)-Aktivität (GRISHAM et al. 1986), welche spezifisch polymorphkernige Leukozyten enzymhistochemisch nachweist (GRISHAM et al. 1990). Dies unterstützt die Annahme, dass die durch die Xanthinoxidase gebildeten Metaboliten an der Neutrophileninfiltration beteiligt sind (GRISHAM et al.
1986). Bei einer Studie am Dünndarm von Katzen führt die Gabe von Allopurinol zur
35
Verbesserung morphologischer und biochemischer Parameter (NILSSON et al.
1994).
2.3 Postkonditionierung
Die ischämische Postkonditionierung wurde 2003 von ZHAO et al. (2003) beschrieben, wobei ein oder mehrere kurze Ischämie-Reperfusionszyklen direkt nach einer längeren Ischämiephase und vor der permanenten Reperfusion erfolgen. Beim Vergleich der Ergebnisse nach histologischer Untersuchung und Beurteilung der Dünndarmmukosa von Ratten anhand des Scores nach CHIU et al. (1970) (siehe Anhang), zeigen die Darmproben nach einer Post- und Präkonditionierung mit durchschnittlichen Scorewerten von 1 und 1,2 eine vergleichbare Minderung der Gewebeschädigung bei jeweils dreimal zweiminütigen Ischämie und Reperfusionszyklen (SANTOS et al. 2008). Eine Vergleichsstudie von IPC und IPO am Rückenmark beim Kaninchen bestätigt diese Ergebnisse (HUANG et al. 2007).
LIU et al. (2007) zeigen in ihrer Studie nach IPO von Nieren bei Ratten eine vermehrte iNOS - und eNOS –expression und vermuten den positiven Effekt in der erhöhten NO-Produktion, da auch ein nichtselektiver NOS-Inhibitor den protektiven Effekt aufhebt. In einer IPO-Studie an isolierten Kaninchenherzen führt die Inhibierung der extrazellulär signalregulierenden Kinasen (ERK)1/2, nicht aber die Inhibierung der Phosphoinositid-3-Kinase, zur Aufhebung des IPO-Effekts (DARLING et al. 2005). Die Reduktion der PMN- Akkumulation ist vergleichbar zur IPC (ZHAO et al. 2003). Mit Einleiten der Reperfusion sinkt der Malondialdehydplasmawert, ein Produkt der Lipidperoxidation, signifikant gegenüber der Kontrollgruppe, gleicht sich aber gegen Ende der Reperfusion wieder an (ZHAO et al. 2003). Auch für volatile Anästhetika, wie das Isofluran, wird eine postkonditionierende Wirkung am Gehirn nach einem ischämischen Stimulus beschrieben (KIM et al. 2017).
36
3 Material und Methode
3.1 Probanden
Bei den Probanden handelte es sich um 15 klinisch darmgesunde Pferde, die sich im Besitz der Stiftung Tierärztliche Hochschule befanden. Darunter waren vier Wallache, drei Hengste und acht Stuten im Alter von 2- 14 Jahren und einem Körpergewicht von 402 bis 655 kg. Die Pferde wurden für etwa zwei Wochen in der Klinik eingestallt und ad libitum mit Heu und Wasser gefüttert. Neben der klinischen Untersuchung wurde bei allen Tieren eine Kotprobenuntersuchung mittels Flotationsverfahrens durchgeführt. Bei drei Tieren wurde ein Strongyloidenbefall festgestellt und eine Entwurmung mit einem Kombinationspräparat aus Ivermectin und Praziquantel (200 μg Ivermectin und 1,5 mg Praziquantel pro kg Körpergewicht) (Equimax®, Virbac Schweiz AG, Glattbrugg, Schweiz) durchgeführt. Nach zehn Tagen wurde zur Kontrolle eine weitere Kotprobe untersucht. Da die Pferde unsediert in Allgemeinanästhesie verbracht werden sollten, wurde ab dem Tag nach der Einstallung mit den Probanden trainiert, ruhig in der Ablegebox zu stehen.
Im Anschluss an die Versuche wurden die Pferde intraoperativ euthanasiert, bevor sie für studentische Übungen in das Anatomische Institut der Stiftung Tierärztliche Hochschule verbracht wurden. Die Durchführung der Untersuchung wurde vom Niedersächsischen Landesministerium für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit begutachtet und genehmigt (siehe 9.4).
3.2 Versuchsgruppen
Die Probanden wurden randomisiert in drei Gruppen eingeteilt. Die erste Gruppe war die Kontrollgruppe (Gruppe C). Diese Pferde wurden nicht präkonditioniert. Bei der zweiten Gruppe, der Ischämischen Präkonditionierungs-Gruppe (Gruppe IPC), wurden kurze Ischämie- und Reperfusionsperioden mit einem Scheidenband nach Bühner (WDT, Garbsen, Deutschland) angelegt. Bei der dritten Gruppe, der Dexmedetomidin-Gruppe (Gruppe DEX), erfolgte eine pharmakologische Präkonditionierung mit dem Alpha-2-Agonisten Dexmedetomidin (Dexdomitor®, 0,5 mg/ml, Orion Pharma, Finnland). Dabei wurde die Dexmedetomidininfusion nach Einleitung der Anästhesie gestartet.
37 3.3 Versuchsdurchführung
3.3.1 Vorbereitung
Um Anzeichen einer gastrointestinalen Erkrankung auszuschließen wurde am Tag vor der Versuchsdurchführung bei jedem Pferd eine klinische Allgemeinuntersuchung durchgeführt. Etwa vier Stunden vor Beginn der Narkose wurde die Futteraufnahme mittels Anlegen eines Maulkorbes unterbunden. Die Aufnahme von Wasser war weiterhin uneingeschränkt möglich.
Zwanzig Minuten vor der Anästhesie wurde jedem Pferd ein Venenverweilkatheter (Intraflon 2, 12G-80 mm, VYGON GmbH & CO.KG, Frankreich) in die Vena Jugularis dexter oder sinister gelegt. Anschließend fand in einer speziell abgepolsterten Ablegebox sowohl die Prämedikation als auch die Narkoseeinleitung statt.
3.3.2 Prämedikation und Induktion
Zur Prämedikation wurde zügig Guaifenesin (My-50 mg/ml Infusionslösung für Pferde, cp-pharma®) als Bolus (80-100 mg/kg i.v.) über etwa drei bis vier Minuten infundiert und anschließend die Narkose mit einer Kombination aus Ketamin 2,2 mg/kg KGW i.v. (Narketan®, Vétoquinol GmbH, Ravensburg, Deutschland) und Midazolam 0,05 mg/kg KGW i.v. (Midazolam®, B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland) eingeleitet. Nach Verbringen in Allgemeinanästhesie wurden die Pferde endotracheal intubiert.
3.3.3 Narkoseerhaltung
Die intubierten Pferde wurden an ein Großtiernarkosegerät (Vet.-Tec. Model JAVC 2000, J.D. Medical Distributing Company, USA), sowie zur Narkoseüberwachung an einen Narkosemonitor (Datex- Ohmeda Cardiocap/5, GE Healthcare Clinical Systems, USA) angeschlossen. Mit einem Gasgemisch aus Isofluran (Isofluran®, CP-Pharma Handelsgesellschaft GmbH, Burgdorf, Deutschland) in 100% reinem Sauerstoff wurde die Narkose aufrechterhalten. Alle Tiere wurden kontrolliert beatmet, mit einem positiven inspiratorischen Druck von 20-25 cm H2O und einem exspiratorischen Kohlenstoffdioxidgehalt von 35-45 mmHg, individuell eingestellt über die Atemfrequenz. Die endexspiratorische Kohlenstoffmonoxidkonzentration wurde mittels Sidestream-Kapnographie gemessen. Zur Aufrechterhaltung des Blutdrucks erhielten die Pferde als Dauertropfinfusion Ringer-Laktat (Ringer-Laktat®,
Material und Methode
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B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland) in einer Rate von 5 ml/kg/h und Dobutamin (Dobutamin-ratiopharm 250 mg®, Ratiopharm GmbH, Ulm, Deutschland) in einer Rate von 0,5 μg/kg/min KGW. Zur genauen Dosierung wurde das Dobutamin über eine Perfusorspritzenpumpe (Perfusor® compact, B. Braun Melsungen AB, Deutschland) verabreicht.
Während der Narkose wurden folgende Parameter mittels Narkosemonitor kontinuierlich überwacht: Herzfrequenz (HF), Atemfrequenz (AF), systolischer arterieller Blutdruck (SAP), mittlerer arterieller Blutdruck (MAP), diastolischer arterieller Blutdruck (DAP), in- und exspiratorische Sauerstoff- und Isoflurankonzentration und die exspiratorische Kohlenstoffdioxidkonzentration.
Außerdem wurden regelmäßig die arteriellen Blutgasparameter überprüft. Zur Messung des arteriellen Blutdrucks und zur arteriellen Blutgasanalyse wurde ein Katheter (Venocan™ PLUS IV Catheter 20G.33 mm, KRUUSE A/S, Dänemark) in die Arteria facialis dexter oder sinister gelegt und dieser über eine druckstabile Leitung mittels Drucknehmer (DTXPlusTM, Argon Critical CareSystems Singapore Pte Ltd., Singapore) an das Narkosemonitorgerät angeschlossen. Ein Nullabgleich des Drucknehmers gegenüber dem Umgebungsdruck erfolgte auf Höhe des Schultergelenks.
3.3.4 Versuchsdurchführung
Vom Zeitpunkt der Narkoseinduktion an erfolgte eine 90-minütige Äquilibrierungszeit.
In dieser Zeit wurden die Probanden in Rückenlage auf dem Operationstisch gelagert. Anschließend erfolgte die Vorbereitung auf die mediane Laparotomie. Das Operationsfeld wurde geschoren, mit 4%igem Chlorhexidin-Glukonat (Chlorhexidinglukonat 4 %, Regen Medical Overseas Limited, UK) gewaschen und mit einer Alkohollösung (Softasept®N, B. Braun Melsungen AG, Deutschland) desinfiziert und zusätzlich steril mit einer Folie abgedeckt. Sechzig Minuten nach der Narkoseeinleitung wurde die Bauchhöhle kranial des Nabels in der Linea alba eröffnet und das Jejunum vorgelagert. Zunächst wurde die Mitte des Jejunums aufgesucht um von diesem Abschnitt, am Ende der 90-minütigen Äquilibrierungzeit, die Prä-Ischämie-Darmprobe zu entnehmen. Die Darmproben waren etwa 20-25 Zentimeter lange Darmrohrstücke.
