Aktivierte Caspase-3 - Ischämische und pharmakologische Präkonditionierung mit Dexmedetomidin a

4.5 Immunhistologie

4.5.1 Aktivierte Caspase-3

Dargelegt wird zunächst der Vergleich der apoptose-positiven Zellen ohne Berücksichtigung morphologischer Kennzeichen. In allen Gruppen stieg die Zahl der apoptose-positiven Zellen während der Ischämie. Während der Reperfusion sank die Zellzahl pro Fläche in den Gruppen C und IPC. In Gruppe DEX stieg die Zellzahl auch während der Reperfusion. Signifikante Unterschiede innerhalb der Gruppen (Tabelle 4, Abbildung 17) waren nicht zu verzeichnen.

Der Verlauf der aktivierten Caspase-3-positiven Zellen mit morphologisch apoptotischem Zellkern über die Zeit (Abbildung 18) verhielt sich ähnlich dem Verlauf ohne Einbeziehung der morphologisch apoptotischen Kerne. Während der Ischämie stieg die Zellzahl in den drei Gruppen an, in den Gruppen C und IPC signifikant. Im Laufe der Reperfusion waren, mit Ausnahme der Gruppe C, weniger apoptose-positive Zellen zu verzeichnen. Die Zellzahlen zum Zeitpunkt der Reperfusion waren in den Gruppen C und IPC signifikant höher als zum Zeitpunkt Prä-Ischämie. In Gruppe DEX gab es keine signifikanten Unterschiede über die Zeit.

Im Vergleich zwischen den Gruppen (Tabelle 5) war zum Messzeitpunkt Ischämie in Gruppe DEX der höchste Anstieg und in Gruppe IPC der geringste Anstieg zu verzeichnen, jeweils mit und ohne Berücksichtigung der morphologisch apoptotischen Zellkerne. Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen waren nicht zu verzeichnen (Tabelle 5).

Abbildung 15: Fotomikroskopische Aufnahme der Jejunumzotten zur repräsentativen Darstellung der Apoptosedetektion zum Probenentnahmezeitpunkt der Ischämie. Im Darmlumen befindet sich Zelldetritus (Sternchen), die Lamina propria mucosae (1) der Darmzotten liegt teilweise frei (gewinkelter Pfeil). Lamina epithelialis (Pfeil); aktivierte positive Zellen (Kreis), Caspase-3-Färbung

* *

Ergebnisse

Abbildung 16 (A-C): Ausschnitte fotomikroskopischer Aufnahmen der Jejunumzotten zur repräsentativen Darstellung der apoptose-positiven Zellen zum Probenentnahmezeitpunkt der Ischämie. Lamina propria mucosae (1), Lamina epithelialis (2), Krypten (3), Caspase-3-Färbung

2 1

C 2

65 Tabelle 4: Aktivierte Caspase-3 in Zellen/mm²

Dargestellt ist die Anzahl der aktivierten Caspase-3-positiven Zellen (Casp.-3) und der mit zusätzlich morphologischen Kennzeichen der Apoptose (Kern-positiv), in den einzelnen Gruppen (Control C, Ischämische Präkonditionierung IPC, Dexmedetomidin DEX) zu den 3 Probenentnahmezeitpunkten (Prä-Ischämie, Ischämie, Reperfusion) als Median (Minimum und Maximum), sowie die p-Werte innerhalb der 3 Gruppen zwischen den 3 Probenentnahmezeitpunkten.

Zeitpunkt Gruppe C Gruppe IPC Gruppe DEX

Prä-Ischämie Casp.-3 1,68 (1,42-3,12) 3,32 (0,68-4,93) 1,85 (0,52-2,14) Kern-positiv 0,50 (0,40-1,07) 0,68 (0,16-1,13) 0,31 (0,20-1,15) Ischämie Casp.-3 6,18 (2,41-8,37) 5,56 (2,01-7,96) 3,84 (1,81-7,07) Kern-positiv 1,39 (0,82-2,70) 1,80 (0,79-2,36) 1,91 (0,72-3,16) Reperfusion Casp.-3 4,28 (2,28-7,83) 4,62 (2,94-13,53) 4,02 (0,83-10,21)

Kern-positiv 1,55 (0,46-3,57) 1,77 (0,52-7,21) 1,01 (0,31-3,98) p-Werte Casp.-3 p1 :0,117 p-Werte innerhalb der Gruppen: p1: P-Isch; p2: Isch-Rep; p3: P-Rep

Signifikante Unterschiede (p < 0,05) sind mit einem * gekennzeichnet.

Ergebnisse

66 Tabelle 5: Aktivierte Caspase-3

Dargestellt sind die aktivierten Caspase-3-positiven Zellen (Caps.-3) und diese mit zusätzlich morphologisch Kennzeichen der Apoptose (Kern-positiv), in den einzelnen Gruppen (Kontrolle C, Ischämische Präkonditionierung IPC, Dexmedetomidin DEX) zu den 3 Probenentnahmezeitpunkten als Prozentwerte ausgehend von 100% zum Entnahmezeitpunkt Prä-Ischämie sowie die p-Werte zwischen den Gruppen zu den Probenentnahmezeitpunkten.

Zeitpunkt Gruppe C Gruppe IPC Gruppe DEX p-Werte

Prä-Ischämie Casp.-3 100% 100% 100% pA: 1

pB: 1 pC: 1

Kern-positiv 100% 100% 100% p_A:1

pB: 1 pC: 1 Ischämie Casp.-3 288,2% 238,4% 321,8% pA:0,403

pB: 0,210 pC: 0,835 Kern-positiv 308,1% 276,7% 383,0% pA: 1

pB: 0,210 pC: 0,210 Reperfusion Casp.-3 230,4% 340,6% 322,2% pA:0,403 p_B: 0,835 pC: 0,531 Kern-positiv 264,7% 493,1% 415,8% pA: 0,403 pB: 0,835 pC: 0,676 p-Werte zwischen den Gruppen zu den Probenentnahmezeitpunkten:

pA: C-IPC; pB: IPC-DEX; pC: C-DEX

Abbildung 17: Quantifizierung der aktivierten Caspase-3 positiven Zellen

Dargestellt ist die Anzahl der Caspase-3-positiven Zellen innerhalb der drei Gruppen (Control C, Ischämische Präkonditionierung IPC, Dexmedetomidin DEX) zu den 3 Probenentnahmezeitpunkten (Prä-Ischämie P, Ischämie I, Reperfusion R). Signifikante Unterschiede sind nicht zu verzeichnen.

Abbildung 18: Quantifizierung der aktivierten Caspase-3 positiven Zellen, die zusätzlich morphologische Anzeichen von Apoptose zeigten.

Dargestellt sind die Ergebnisse für die 3 Gruppen (Control C, Ischämische Präkonditionierung IPC, Dexmedetomidin DEX) zu den 3 Probenentnahmezeitpunkten (Prä-Ischämie P, Ischämie I, Reperfusion R). Signifikante Unterschiede sind mit einem * gekennzeichnet.

Ergebnisse

68 4.5.2 TUNEL-Methode

Zunächst wird der Verlauf der positivgewerteten Zellen ohne Berücksichtigung morphologischer Merkmale beurteilt. Wie auch bei der Caspase-3-Färbung waren diese bereits zum Zeitpunkt Prä-Ischämie in allen Gruppen vorhanden. Der Verlauf über die Zeit stellte sich in den drei Gruppen gleich dar (Tabelle 6, Abbildung 21).

Dabei stieg die Anzahl der Zellen während der Ischämie an, in den Gruppen C und IPC signifikant. Während der Reperfusion kam es zu einem Absinken der TUNEL-positiven Zellen. Die Zellzahl während der Reperfusion entsprach in Gruppe IPC der zum Zeitpunkt Prä-Ischämie. In Gruppe DEX wurde während der Reperfusion nahezu der Ausgangswert (Prä-Ischämie) erreicht. In dieser Gruppe waren zu allen Zeitpunkten die geringsten Zellzahlen zu verzeichnen.

Der Verlauf der TUNEL-positiven Zellen mit zusätzlich morphologischen Kennzeichen der Apoptose zeigte ein signifikantes Ansteigen der Zellzahl während der Ischämie und ein signifikantes Absinken während der Reperfusion in allen Gruppen (Tabelle 6, Abbildung 22). In allen Gruppen waren die Zellzahlen zum Zeitpunkt der Reperfusion höher als zum Zeitpunkt Prä-Ischämie, in Gruppe DEX signifikant.

Im Vergleich zwischen den Gruppen zu den jeweiligen Messzeitpunkten (Tabelle 7) wurden keine signifikanten Unterschiede ermittelt. In Gruppe IPC zeigte sich während der Ischämie der geringste und in Gruppe C der stärkste Anstieg, sowohl bei den ohne als auch bei denen mit morphologischen Kennzeichen der Apoptose.

Zum Entnahmezeitpunkt Reperfusion waren in Gruppe C die Zellzahlen in Prozent 2,5 bis 3-fach höher als in Gruppe IPC.

Abbildung 19: Fotomikroskopische Aufnahme des Jejunumzotten zur repräsentativen Darstellung der Apoptosedetektion mittels TUNEL-Methode zum Probenentnahmezeitpunkt der Reperfusion. Im Darmlumen befindet sich Zelldetritus (Sternchen), die Lamina propriamucosae (1) der Darmzotten liegt teilweise frei (gewinkelter Pfeil). Lamina epithelialis (Pfeil); Tunica muscularis mucosae (2) Kreis: TUNEL-positive Zellen, TUNEL-Färbung

* *

2 1

Ergebnisse

Abbildung 20 (A-C): Ausschnitte fotomikroskopische Aufnahmen der Lamina propria mucosae (1) des equinen Jejunums zur repräsentativen Darstellung der apoptose-positiven Zellen zum Probenentnahmezeitpunkt der Ischämie. Krypten (2), TUNEL-Färbung

C B

71 Tabelle 6: TUNEL-Methode in Zellen/mm²

Dargestellt sind die TUNEL-positiven Zellen (TUNEL) und diese mit zusätzlich morphologischen Kennzeichen der Apoptose (Kern-positiv), in den einzelnen Gruppen (Control C, Ischämische Präkonditionierung IPC, Dexmedetomidin DEX) zu den 3 Probenentnahmezeitpunkten (Prä-Ischämie, Ischämie, Reperfusion) als Median (Minimum und Maximum), sowie die p-Werte innerhalb der 3 Gruppen zwischen den 3 Probenentnahmezeitpunkten.

Gruppe C Gruppe IPC Gruppe DEX Prä-Ischämie TUNEL 4,13 (2,41-5,72) 5,79 (3,39-9,04) 4,11 (1,77-6,08)

Kern-positiv 1,89 (0,86-3,15) 2,03 (1,68-4,02) 1,58 (1,08-2,73)

Ischämie TUNEL 12,76

(7,07-16,41)

9,27 (5,74-12,33) 8,97 (5,08-10,28)

Kern-positiv 7,74 (4,30-10,27) 5,09 (2,80-6,37) 6,07 (2,47-7,15) Reperfusion TUNEL 8,17 (5,18-15,21) 5,86 (3,49-8,27) 5,12 (2,93-6,08) Kern-positiv 4,77 (1,99-7,83) 2,87 (1,60-3,28) 1,90 (1,38-4,29) p-Werte TUNEL p1: 0,011*

Signifikante Unterschiede (p<0,05) sind mit einem * gekennzeichnet.

Ergebnisse

72 Tabelle 7: TUNEL-Methode

Dargestellt sind die TUNEL-positiven Zellen (TUNEL) und diese mit zusätzlich morphologischen Kennzeichen der Apoptose (Kern-positiv), in den einzelnen Gruppen (Control C, Ischämische Präkonditionierung IPC, Dexmedetomidin DEX) zu den 3 Probenentnahmezeitpunkten (Prä-Ischämie, Ischämie, Reperfusion) als Prozentwerte ausgehend von 100% zum Entnahmezeitpunkt Prä-Ischämie sowie die p-Werte zwischen den Gruppen zu den 3 Probenentnahmezeitpunkten.

Gruppe C Gruppe IPC Gruppe DEX p-Werte

Prä-Ischämie TUNEL 100% 100% 100% pA: 1

pB: 1 pC: 1

Kern-positiv 100% 100% 100% p_A:1

pB: 1 pC: 1

Ischämie TUNEL 323,9% 161,8% 238,6% pA: 0,095

pB: 0,676 pC: 0,403 Kern-positiv 455,6% 195,5% 305,8% pA: 0,144 pB: 0,210 pC: 0,531 Reperfusion TUNEL 252,8% 105,0% 145,0% pA: 0,144 p_B: 0,835 pC: 0,296 Kern-positiv 312,7% 113,1% 159,8% pA: 0,210 pB: 0,835 pC: 0,210 p-Werte zwischen den Gruppen zu einem Probenentnahmezeitpunkt:

pA: C-IPC; pB: IPC-DEX; pC: C-DEX

Abbildung 21: Quantifizierende Darstellung der TUNEL-positiven Zellen

Dargestellt sind die TUNEL-positiven Zellen innerhalb der 3 Gruppen (Control C, Ischämische Präkonditionierung IPC, Dexmedetomidin DEX) zu den 3 Probenentnahmezeitpunkten (Prä-Ischämie P, (Prä-Ischämie I, Reperfusion R). Signifikante Unterschiede sind mit einem * gekennzeichnet.

Abbildung 22: Quantifizierende Darstellung der TUNEL-positiven Zellen, die zusätzlich morphologische Anzeichen von Apoptose zeigten.

Dargestellt sind die Ergebnisse für die 3 Gruppen (Control C, Ischämische Präkonditionierung IPC, Dexmedetomidin DEX) zu den drei Probenentnahmezeitpunkten (Prä-Ischämie P, Ischämie I, Reperfusion R). Signifikante Unterschiede sind mit einem * gekennzeichnet.

5 Diskussion

5.1 Diskussion der Ergebnisse 5.1.1 Histologische Auswertung 5.1.1.1 Beurteilung der Darmzotten

In allen Gruppen kann von einem ungeschädigten Darm ausgegangen werden, da alle Proben, die vor der Ischämie entnommen wurden, mit einem Scorewert von 0 beurteilt wurden.

Bei je einem von fünf Probanden der Gruppe IPC und DEX wurde für die Darmprobe zum Zeitpunkt der Reperfusion ein Scorewert von 0 bestimmt. FREEMAN et al.

(1988) beobachten bei Ponys nach einer zweistündigen arteriovenösen Strangulationsobstruktion am Jejunum, zwölf Stunden nach Einleiten der Reperfusion, bei einem der vier Probanden eine teilweise und bei einem Pony eine vollständige Reepithelisierung der Mukosa. Bei drei von vier Tieren sehen sie nach zweistündiger venöser Strangulation, zwölf Stunden nach Einleiten der Reperfusion, eine vollständige Reepithelisierung. Die histologische Untersuchung nach 42 Tagen zeigt eine normale Länge und Struktur der Zotten (FREEMAN et al. 1988). In der vorliegenden Studie wurden jedoch nur zu den genannten Zeitpunkten Darmproben untersucht, deshalb ist daraus nicht zu sagen, nach welcher Zeitdauer eine vollständige Reepithelisierung erfolgen kann. Zudem ist es möglich, dass es Unterschiede bei der Darmreepithelisierung von Pferden zu Ponys gibt (FREEMAN et al. 1988). DABAREINER et al. (1995) sehen nach einer 60-minütigen warmen Ischämie (Blutfluss 25% des Baselinewertes) und 45 bis 60-minütigen Reperfusion am Jejunum beim Pferd lediglich eine dilatierte mit proteinreichem Material gefüllte zentrale Lymphkapillare der Zotte. Das Zottenepithel erscheint dabei intakt. In der vergleichbaren Darmprobe aus der IPC-Gruppe der vorliegenden Studie konnte dieser histologische Befund bestätigt werden (Abbildung 23). Zusätzlich zeigen sich die Darmzotten verkürzt, was jedoch auch teilweise durch den histologischen Anschnitt bedingt sein kann. Auch KILIC et al. (2012) beobachten nach Ischämie und Reperfusion, sowie der Gabe von Dexmedetomidin am Jejunum bei Ratten lediglich eine partielle Separation der Epithelzellen und ein mildes subepitheliales Ödem. In einer weiteren Studie am Rattenmodell zur IPC zeigten sich nach Ischämie und

Reperfusion ein intaktes Zottenepithel und ein ausgeprägter subepithelialer Raum (Gruenhagen Space) (AKSOYEK et al. 2002). Dem Autor ist keine vergleichbare Literatur zu Pferden bekannt. Es scheint also eine Erholung und Reepithelisierung nach Ischämie und Reperfusion möglich zu sein. Es ist dennoch nicht völlig auszuschließen, dass während der Probennahme zum Zeitpunkt der Reperfusion ein Fehler unterlaufen sein könnte, indem nicht das zuvor ischämische Darmstück, sondern ein diesem benachbarter Jejunumanteil beprobt wurde.

Diskussion

Abbildung 23 (A, B): Fotomikroskopische Aufnahmen der Jejunumzotten zum Probenentnahmezeitpunkt Reperfusion. Repräsentative Darstellung der zentralen Lymphkapillaren in den Darmzotten (Stern). Das Zottenepithel (Pfeil) ist intakt, die Zotten sind verkürzt (A). HE-Färbung

* *

*

B A

77 5.1.1.2 Neutrophile Granulozyten

Der Verlauf der Einwanderung der neutrophilen Granulozyten über die Zeit stellte sich in allen Gruppen gleich dar. Zunächst einmal zeigt sich durch den kontinuierlichen Anstieg der neutrophilen Granulozyten, dass die Versuchsdurchführung gelungen ist. Eine Infiltration der Granulozyten in die Mukosa (GRISHAM et al. 1986) und Serosa des Jejunum nach Ischämie und Reperfusion ist mehrfach beschrieben (DABAREINER et al. 2001). Es ist allerdings zu berücksichtigen, dass schon eine Laparotomie ohne Anlegen einer Ischämie ein hochsignifikantes Ansteigen der Granulozyten zur Folge haben kann (TAHIR et al.

2015). Des Weiteren würde der vergleichbare Anstieg in allen Gruppen dafür sprechen, dass die Präkonditionierung keinen Einfluss auf die Neutrophileninfiltration und deren Mechanismus hat. Die histologische Beurteilung nach dem Score-System spricht dafür, dass die Präkonditionierung am equinen Dünndarm einen protektiven Effekt ausübt. Es ist daher möglich, dass die Auswirkungen durch die Neutrophilen, welche den Großteil der Radikale (NALINI et al. 1993) in der Reperfusionsphase bilden und so zum Ischämie-Reperfusionsschaden beitragen (NILSSON et al. 1994), durch die Präkonditionierung gemildert werden, die Einwanderung der Zellen jedoch nicht beeinflusst wird. Vermehrt freie Radikale resultieren in einem oxidativen Schaden, welcher eine Lipidperoxidation nach sich zieht (THÉROND et al. 2000).

ARSLAN et al. (2012) konnten zeigen, dass Dexmedetomidin die Lipidperoxidation in der Leber senken kann und zusätzlich die Apoptose von neutrophilen Granulozyten dosisabhängig induziert und dadurch deren Superoxidproduktion verhindert (KISHIKAWA et al. 2008). TAHIR et al. (2015) beobachten am Rattenmodell allerdings nach ischämischer Präkonditionierung ein signifikant geringeres Ansteigen der neutrophilen Granulozyten als am unbehandelten Darm nach einer Ischämie und Reperfusion. Diese konträren Ergebnisse können Hinweise auf speziesabhängige Präkonditionierungskonzepte sein, welche auch schon von ILIODROMITIS et al.

(2007) vermutet wurden. So wirkt am Herzen des Hundes eine höhere Anzahl an Ischämie- und Reperfusionszyklen protektiv (LI et al. 1990), während der Schutz nach einer bestimmten Anzahl beim Kaninchen abnimmt (COHEN et al. 1994) (ILIODROMITIS et al. 2007). Es ist jedoch nicht auszuschließen, dass durch die massive Infiltration verschiedener Zellen nicht alle neutrophilen Granulozyten in der HE-Färbung korrekt identifiziert werden konnten (siehe 5.2.3.2).

Diskussion

78 5.1.2 Immunhistologie

Bei der Apoptose handelt es sich um einen kontrollierten Zelltod, der zur Aufrechterhaltung der Homöostase auch im gesunden Gewebe abläuft (2.1.2.2.1), deshalb werden in den Darmproben zum Probenentnahmezeitpunkt Prä-Ischämie auch apoptose-positive Zellen nachgewiesen.

Zu erwarten ist, dass in der Kontrollgruppe die Anzahl der apoptose-positiven Zellen sowohl während der Ischämie als auch im Laufe der Reperfusion weiter ansteigt. In der vorliegenden Studie sind in Gruppe C – mit Ausnahme der Caspase-3-Färbung unter Berücksichtigung der morphologischen Apoptosecharakteristika – während der Reperfusion weniger apoptotische Zellen zu verzeichnen im Vergleich zur Ischämiephase. Dies könnte auf einen präkonditionierenden Effekt des Isoflurans zurückzuführen sein, der in allen Gruppen gleichwertig vorhanden war (COPE et al.

1997; ZHANG et al. 2011). NODA et al. (1998) zeigen am Rattenmodell nach einstündiger Ischämie am Darm einen Peak der DNA-Fragmentierung der Mukosa eine Stunde nach Beginn der Reperfusion. Nach sechs Stunden erreicht das Ausmaß der DNA-Fragmentierung in der betreffenden Studie wieder den Anfangswert. Auch andere Autoren beschreiben das Fortschreiten der Schädigung während der Reperfusion (siehe 2.1.2). Selten wird eine primäre Nekrose nach Ischämie beobachtet, jedoch ist eine sekundäre Nekrose bei bereits apoptotischen Zellen beschrieben. Die Apoptose bleibt dennoch die wesentliche Form des Zelltodes nach einer Ischämie (SHAH et al. 1997). Eine sekundäre Nekrose und somit keine Apoptosedetektion würde die unterschiedlichen Verläufe der histologischen Untersuchung im Vergleich zur immunhistologischen Untersuchung während der Reperfusion in Gruppe C erklären. Die geschätzte Zeitdauer, in der apoptotische Zellen mit der TUNEL-Methode erfasst werden können, ist mit einer bis drei Stunden beschrieben und bezieht sich auf ungeschädigte Zellen (GAVRIELI et al. 1992). Es ist möglich, dass der Insult die Apoptose beschleunigt und diese Dauer verkürzt oder die Zellreste bereits phagozytiert werden. Daraus würde resultieren, dass zum Probenentnahmezeitpunkt am Ende der Ischämie nicht alle apoptotischen Zellen detektiert wurden.

Da die Caspase-3 die Apoptose früher im Apoptoseverlauf detektiert als die TUNEL-Färbung könnte man erwarten, dass mit der aktivierten Caspase-3-TUNEL-Färbung eine höhere Anzahl an apoptose-positiven Zellen angefärbt wird als mit der

TUNEL-79

Methode. Dies bestätigen die Ergebnisse der vorliegenden Studie jedoch nicht.

DELETTRE et al. (2006) konnten zeigen, dass es neben dem Caspase-vermittelten auch einen Caspase-unabhängigen Apoptoseweg gibt. Es ist nicht auszuschließen, dass sich ischämie- oder reperfusionsbedingt der Apoptoseweg verschiebt und dadurch nicht alle apoptose-positive Zellen erfasst werden. Aufgrund der unterschiedlichen zeitlichen Detektion der Methoden könnte angenommen werden, dass die zeitlichen Verläufe innerhalb der Gruppen zwischen den beiden Nachweismethoden nicht genau miteinander korrelieren. Da sich die zusätzliche Bestimmung der Zellen mit morphologischen Apoptosekennzeichen auf die angefärbten Zellen bezieht, sind deren zeitliche Verläufe ebenfalls nicht identisch.

XING et al. (2014) zeigen jedoch einen positiv korrelierenden Verlauf des Apoptose-Index, der mittels TUNEL - Methode und dem Chiu-Score sowie der aktivierten Caspase-3-Immunhistochemie bestimmt wurde.

In Gruppe DEX verzeichnen beide Nachweismethoden zu allen Probenentnahmezeitpunkten die geringste Anzahl an positiven Zellen. Durch den Beginn der Dexmedetomidindauertropfinfusion nach der Narkoseeinleitung hemmt der Alpha-2-Agonist möglicherweise schon die Apoptose am ungeschädigten Darm.

In einer Studie an Ratten konnte ein sinkender Apoptoseindex am Dünndarm mithilfe einer Caspase-3-Färbung nach Dexmedetomidin beobachtet werden (SUN et al.

2015). Die Mehrzahl der derzeitigen Studien werden an Labortieren durchgeführt und die Dexmedetomidin-Applikation erfolgt dabei intraperitoneal als Bolus (100 μg/kg) (ARSLAN et al. 2012; GONULLU et al. 2014). Ein direkter Vergleich der Protokolle ist daher schwierig.

5.2 Diskussion der Methodik 5.2.1 Probanden

Die Probanden wiesen mit einem Alter von 2 - 15 Jahren, und damit einer Spanne von 13 Jahren, eine große Varianz auf. Bei der Auswahl der Pferde, die für diese Untersuchung zur Verfügung standen, konnte kein Einfluss auf das Alter genommen werden. Diese Altersspanne entspricht derjenigen, die in anderen Ischämie-Reperfusions-Studien am equinen Dünn- und Dickdarm untersucht wurde (GROSCHE et al. 2008; COOK et al. 2009a; MATYJASZEK et al. 2009). Es ist jedoch bisher nicht bekannt, ob das Alter hinsichtlich der Präkonditionierung eine

Diskussion

Rolle spielt. Betreffende Studien wurden alle ohne weitere Unterteilung in verschiedene Altersgruppen an adulten Tieren durchgeführt (MURRY et al. 1986;

BONSERVIZI et al. 2014; KAGEYAMA et al. 2015). Der Autorin sind derzeit keine publizierten Studien zur Präkonditionierung im Zusammenhang mit dem Ischämie–

Reperfusionsschaden am Pferdedarm (FREEMAN et al. 1988; MOORE et al. 1995) bekannt.

Um eine direkte Vergleichbarkeit zwischen den beiden Präkonditionierungsmethoden und jeweils zu einer unbehandelten Gruppe zu erhalten, wurden die Probanden in drei gleich große Gruppen zu je fünf Tieren eingeteilt. In den meisten anderen Studiendesigns zum Reperfusionsschaden beinhalten die einzelnen Gruppen sechs (COOK et al. 2008; COOK et al. 2009b) oder sieben Pferde (MATYJASZEK et al.

2009), wobei zum Teil der Proband die eigene Kontrolle darstellt (FRANZ 2013). Laut FRANZ (2013) wird diese Vorgehensweise jedoch nicht empfohlen, denn ein Schaden bleibt nicht auf den betroffenen Darmanteil beschränkt (FREEMAN et al.

1988) und somit war es nicht möglich die Gruppe IPC gleichzeitig als Kontrollgruppe zu verwenden. Es ist möglich, dass aufgrund der geringen Gruppengröße geringgradige Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen statistisch nicht dargestellt werden konnten. Da es sich jedoch zunächst um eine Orientierungsstudie zur Überprüfung des Präkonditionierungskonzeptes am equinen Dünndarm und zudem um einen finalen Versuch handelt, wurde die Gruppengröße gering gehalten.

5.2.2 Versuchsdurchführung

Wie bereits in anderen Studien am equinen Darm beschrieben, wurde eine klinische Allgemeinuntersuchung durchgeführt, um Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes weitestgehend auszuschließen (GROSCHE et al. 2008; COOK et al. 2009a;

HOPSTERǦIVERSEN et al. 2011). Analog zu HOPSTERǦIVERSEN et al. (2011) wurde von jedem Probanden eine Kotprobe mittels Flotationsverfahren analysiert.

Während der Versuchsdurchführung konnte der Darm adspektorisch beurteilt und dabei keine makroskopischen Veränderungen festgestellt werden. Während der Probenauswertung wurden im Rahmen der histologischen Untersuchung ebenfalls keine Parasiten nachgewiesen. Als weiterer Hinweis auf einen Wurmbefall dient das Vorkommen eosinophiler Granulozyten in den Darmproben (COLLOBERT-LAUGIER et al. 2002). Eine numerische Auswertung dieser Zellen wurde jedoch nicht vorgenommen. Für Folgestudien ist im Hinblick auf ein mögliches

Entzündungsgeschehen eine Blutprobenuntersuchung zur Bestimmung der Leukozytenanzahl und des Gesamteiweißgehalt als zusätzliches Diagnostikum empfehlenswert. In der hiesigen Studie wurden alle Darmproben zum Entnahmezeitpunkt Prä-Ischämie mit einem Scorewert Grad 0 bewertet. Deshalb konnten bestehende Vorschädigungen ausgeschlossen werden.

5.2.2.1 Prämedikation

Aufgrund der Fragestellung in Bezug auf die präkonditionierende Wirkung von Dexmedetomidin und um einen Einfluss anderer Pharmaka auszuschließen, wurden die Probanden weder mit einem anderen Alpha-2-Agonisten noch mit Acepromazin sediert. Der Tranquilizer Acepromazin wirkt vasodilatativ und kann zu einer Hypotonie führen. Er verursacht zudem eine Erhöhung des peripheren Blutflusses (MARROUM et al. 1994; MARNTELL et al. 2005). Um dennoch eine vorherige Sedierung und ein ruhiges Ablegen der Pferde zu gewährleisten, wurden diese mit Guaifenesin prämediziert. Guaifenesin, das in der Anästhesie von Pferden weit verbreitet ist, ist ein zentral wirkendes Muskelrelaxans (GERTSEN u. TILLOTSON 1968), wirkt geringgradig analgetisch (WESTHUES u. FRITSCH 1961) und geringgradig sedierend (HUBBELL et al. 1980). Zum Ablegen von Pferden und Rindern ist eine Dosis von 4 bis 5 g/ 50kg KGW i.v. einer 5%-igen Guaifenesinlösung erforderlich (WESTHUES u. FRITSCH 1961). Dies entspricht der hier verwendeten Dosierung von 80-100 mg/kg KGW i.v.. HUBBELL et al. (1980) beobachten bei einer Dosierung von 134 mg/kg KGW i.v. ein Niedergehen der Pferde nach 7,8 ± 3,1 Minuten. Ponyhengste hingegen legen sich bei einer Dosierung von 108,6 mg/kg KGW i.v. bereits nach 2,8 Minuten ab, die Ponystuten bei gleicher Dosierung schon nach 2 Minuten. Auch bei der HWZ beobachten die Autoren geschlechtsspezifische Unterschiede. Bei den männlichen Tieren beträgt die HWZ 84,4 ± 7,9 Minuten und bei den Stuten 59,6 ± 4,8 Minuten (DAVIS u. WOLFF 1970). In der vorliegenden Studie konnte die moderate Sedierung und die Ataxie aufgrund der Muskelrelaxation nachvollzogen werden. Damit war ein kontrolliertes Induzieren der Allgemeinanästhesie problemlos möglich. Als Nebenwirkung ist eine moderate Hypotension beschrieben (FRITSCH 1965). Mit Nachlassen der Wirkung müsste demnach ein geringer Anstieg des Blutdrucks während des Versuchs zu beobachten sein. Dieser Anstieg konnte, unabhängig von einem Stimulus, nicht nachvollzogen werden. Ein Einfluss des Guaifenesins ist dennoch nicht vollständig auszuschließen.

Diskussion

82 5.2.2.2 Ischämie-Reperfusionsmodell

Eine kolikbedingte Strangulation des Darms verursacht meist eine warme Ischämie (MOORE et al. 1995). Dabei inkarzeriert am häufigsten der distale Anteil des Jejunums (FREEMAN u. SCHAEFFER 2005), weshalb in den meisten Studien der Ischämie-Reperfusionsschaden auch an diesem Darmabschnitt gesetzt wird (CAMPBELL u. BLIKSLAGER 2000; LITTLE et al. 2005b). Um eine möglichst kliniknahe Untersuchung durchzuführen, wurde die warme Ischämie ebenfalls am

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