TUNEL-Färbung - Protokolle für die immunhistochemischen Färbungen

3.4 Histologie

3.4.2 Färbeprotokolle

3.4.2.2 Protokolle für die immunhistochemischen Färbungen

3.4.2.2.2 TUNEL-Färbung

Für die Apoptosebestimmung mit der TUNEL-Methode wurde das ApopTag®

Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit (S7100) der Firma Merck millipore SAS, Molsheim, Frankreich verwendet. Das Färbeprotokoll wurde nach Herstellerangaben durchgeführt.

1. Entparaffinieren und Rehydrieren der Schnitte 3 x 5 min Xylol

2 x 5 min 100 %iger Alkohol 1 x 3 min 90 %iger Alkohol 1 x 3 min 70 %iger Alkohol

2. Spülen der Schnitte für 5 Minuten in PBS

3. Zur Vorbehandlung Auftragen von Proteinase K-Lösung (20μg/ml) und für 15 Minuten bei RT inkubieren

4. Zweimaliges Spülen der Schnitte für je 2 Minuten in destilliertem Wasser

Material und Methode

5. Blockierung der endogenen Peroxidase für 5 Minuten bei RT mittels 3 %igem H΍O΍ in PBS

6. Zweimaliges Spülen der Schnitte für 5 Minuten in PBS

7. Auftragen von Equilibration Buffer (im Kit enthalten) auf die Schnitte und Inkubieren für 10 Minuten bei RT

8. Inkubation mit TdT-Enzymen:

Das TdT-Enzym (im Kit enthalten) mit dem Reaction Buffer im Verhältnis 30:70 mischen und aufpipettieren. Auf die Negativkontrolle das Reaction Buffer ohne TdT-Enzyme aufpipettieren.

Die Schnitte für 1 Stunde bei 37 °C in einer Feuchtekammer inkubieren

9. Zum Stoppen der Reaktion Stop/ Wash Buffer (im Kit enthalten) mit Aqua dest. im Verhältnis 1:34 in einer Küvette ansetzen. Die Objektträger (OT) darin für 15 Sekunden schwenken und anschließend für weitere 10 Minuten bei RT inkubieren. Die Negativkontrolle in einer separaten Küvette spülen

10. Spülen der Schnitte dreimal für 1 Minute in PBS

11. Aufpipettieren von jeweils 55 μl Anti-Digoxigenin-Peroxidase (im Kit enthalten) auf jeden Schnitt.

12. Inkubation für 30 Minuten bei RT in der Feuchtekammer

13. Viermaliges Spülen und dabei Schwenken der Schnitte für je 2 Minuten in PBS

14. Auftragen von DAB und Inkubation unter Mikroskopkontrolle für etwa 20 Sekunden

15. Dreimaliges Spülen der Schnitte für je 1 Minute in Aqua dest., anschließendes Verbringen der Schnitte in Aqua dest. für 5 Minuten

16. Gegenfärbung der Schnitte in Hämalaun nach Delafield für eine Sekunde

17. Bläuen der Schnitte unter fließendem, kalten Leitungswasser für 5 Minuten 18. Dehydrieren der Schnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe für jeweils 2

Minuten in 70%igem, 80%igem, absolutem Alkohol und Isopropanol sowie zweimal für 5 Minuten in Xylol

19. Eindecken der Schnitte mit Eukitt (O. Kindler GmbH, Freiburg, Deutschland).

49 3.5 Lichtmikroskopische Untersuchung

Zunächst wurde von jedem Pferd für jeden Probenentnahmezeitpunkt (Prä-Ischämie, Ischämie, Reperfusion) jeweils ein intakter Schnitt aus dem mesenterialen und antimesenterialen Probenblöckerepertoire ausgesucht. Die für die Auswertung relevante Anzahl der Probenschnitte reduzierte sich somit auf 90 (15 Pferde x je mesenterial und antimeserterial Prä-Ischämie, Ischämie und Reperfusion).

Die lichtmikroskopische Untersuchung der Proben wurde von einem verblindeten Untersucher (KS.K.) mit Hilfe des AXIO Scope.A1 (Carl Zeiss Microscopie GmbH, Jena) und der Mikroskopkamera Axiocam 105 color inklusive Software ZEN 2.3 (Blue Edition) (Carl Zeiss Microscopie GmbH, Jena) durchgeführt.

Die Auswertung der Mukosaveränderungen an den HE-Schnitten erfolgte qualitativ unter Anwendung eines Scores (Tabelle 1) (CHIU et al. 1970; WHITE et al. 1980).

Zudem wurden die neutrophilen Granulozyten und die immunhistochemisch apoptose-positiven Zellen ausgezählt.

3.5.1 Auswertung der histologischen Untersuchung

Der Grad der Schädigung der Jejunumzotten wurde anhand eines Scores (Tabelle 1) eingeteilt. Dieser Score setzt sich aus den beiden Scores von WHITE et al. (1980) und CHIU et al. (1970) zusammen (siehe 9.5). Letztere haben die Kriterien ursprünglich zur Beurteilung der Degeneration am Darm des Hundes erstellt. WHITE et al. (1980) modifizierten diesen Score zur Anwendung beim Pferd. Anschließend fanden diese Beurteilungssysteme mehrfach, teilweise modifiziert, bei Untersuchungen an Pferden (SULLINS et al. 1985) und anderen Tierarten, Anwendung (GOMES et al. 2011; XING et al. 2014).

Zur Auswertung wurden jeweils fünf aneinander liegende, nicht überlappende Gesichtsfelder in der 50fachen Vergrößerung beurteilt. Zusätzlich wurde die Anzahl der neutrophilen Granulozyten in der Tunica mucosa ermittelt. Dazu wurden jeweils zehn ebenfalls aneinander liegende und sich nicht überlappende Reihen der Tunica mucosa meanderförmig in der 400fachen Vergrößerung mikroskopiert und die Zellzahl pro Darmschnitt bestimmt.

Material und Methode

Abbildung 6: Schemazeichnung der Jejunumwand

Zeichnung: Caren-Imme von Stemm, Anatomisches Institut, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover; aus der Dissertation von FRANZ (2013), modifiziert

Tunica mucosa

Tela submucosa

Stratum circulare

Tunica serosa Darmlumen

Lamina epithelialis

Lamina propria mucosae

Lamina muscularis mucosae

Intermuskuläre Schicht Stratum longitudinale

Tunica muscularis

Lamina propria serosae Mesothelium

Tabelle 1: Scoringsystem zur Beurteilung der Darmzotten Grade Beschreibung

0 normal

1 geringgradige Separation der Epithelzellen von der Lamina propria mucosae (LPM) an der Darmzottenspitze. Bildung des Gruenhagen space (subepithelialer Raum, ca.

zottenbreit an der Zottenspitze)

2 Ausweitung des subepithelialen Raumes mit geringgradiger Abhebung der epithelialen Schicht von der LPM mit teilweisem Verlust von Epithelzellen an der Zottenspitze und kapillärer Dilatation

3 Verbreiterung des subepithelialen Raumes mit Freilegen von 1/3 bis 1/2 der LPM, teilweise mit Vasodilatation und gestauten Gefäßen in der LPM und der Tela submucosa 4 vollständige Separation des Zottenepithels von der LPM mit deutlicher Vasodilatation, gestauten Gefäßen und Blutungen in der LPM und der Tela submucosa, sowie Ödemen 5 Verlust der Zottenstruktur, Desintegration der LPM, frühe Nekrose der Krypten

Einteilung der Mukosaschädigung des equinen Jejunums in die Grade 0-5.

Modifiziert nach WHITE et al. (1980), CHIU et al. (1970)

3.5.2 Auswertung der immunhistologischen Untersuchung

Die lichtmikroskopische Untersuchung der Proben wurde vom selben ebenfalls verblindeten Untersucher (KS.K.) mit Hilfe des AXIO Scope.A1 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena) und der Mikroskopkamera Axiocam 105 color inklusive Software ZEN 2.3 (Blue Edition) (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena) durchgeführt.

Auch die Bilder wurden mit diesem Mikroskop und der Kamera angefertigt.

Bestimmt wurden die aktivierte Caspase-3-positiven und die TUNEL-positiven Zellen innerhalb einer definierten Fläche, sowie jeweils die positiven Zellen, die sich bereits zusätzlich morphologisch apoptotisch darstellten. Die Fläche umfasste die Lamina propria mucosae und die noch an der Zotte anliegende Lamina epithelialis (Abbildung 7). Diese wurde für jedes Gesichtsfeld einzeln ausgemessen und anschließend die gemessenen Werte addiert. Die Messung der Fläche erfolgte mit der internen Software des Mikroskops.

Als aktivierte Caspase-3- bzw TUNEL-positive Zellen wurden die dunkelbraun gefärbten Zellen gewertet.

Material und Methode

Abbildung 7: Fotomikroskopische Aufnahme der Darmzotten des equinen Jejunums zur beispielhaften Darstellung der Flächenmessung der Lamina propria mucosae (1) und des noch intakten Zottenepithels (Pfeil). Innerhalb dieser Fläche wurden die immunhistologisch apoptose-positiven Zellen bestimmt.Lamina muscularis mucosae (2), TUNEL-Färbung

3.6 Statistik

Die Auswertung der erhobenen Daten erfolgte mittels des Statistikprogramms SAS 9.3 (SAS Institute Inc. Cary, USA), wobei ein Signifikanzniveau von 0,05 angenommen wurde. Die graphische Darstellung der Ergebnisse fand mit Hilfe der Software GraphPad PRISM 7.02 (GraphPad Software, Inc. USA) statt.

Die Annahme auf Normalverteilung der quantitativen Merkmale wurde mittels visueller Beurteilung der qq-plots der Modellresiduen sowie dem Kolmogorov-Smirnov-Test geprüft. In Abhängigkeit von der Verteilungsanalyse sowie der Skalierung der Daten wurden sowohl parametrische als auch nichtparametrische Verfahren benutzt. Zunächst wurde zur Prüfung auf Unterschiede für alle Parameter zwischen den mesenterialen und antimesenterialen Probenschnitte der t-Test für gepaarte Stichproben angewendet. Da für keinen der Parameter ein signifikanter Unterschied bestand, wurden die Daten aus der mesenterialen und antimesenterialen Probe gepoolt und im Weiteren damit gerechnet.

2 1

Der Vergleich unabhängiger Stichproben wurde global mit dem Kruskal-Wallis-Test sowie dem Wilcoxon-2-Sample Test für multiple paarweise Vergleiche gerechnet.

Unterschiede zwischen den Messzeitpunkten am selben Tier wurden mittels Permutationstest für wiederholte Messungen geprüft. Die Prüfung auf Zusammenhänge innerhalb einer Gruppe wurde für die neutrophilen Granulozyten ebenfalls mit dem Permutationstest durchgeführt und die p-Werte nach Sidak adjustiert.

Zum Vergleich der immunhistologischen Parameter wurde sowohl mit den gezählten Zellen als auch einem standardisierten Prozentsatz gerechnet. Dabei wurden die Zellzahlen für jeden einzelnen Wert zunächst in einen Prozentwert umgerechnet und daraus anschließend der Mittelwert gebildet. Die Zellzahl der ungeschädigten Prä-Ischämie-Darmprobe wurde als 100 % angenommen und die dazugehörigen Ischämie- und Reperfusionswerte entsprechend errechnet. Diese Prozentwerte sind somit nicht direkt mit den Zellzahlen vergleichbar und gesondert tabellarisch dargestellt.

4 Ergebnisse

4.1 Versuchsvorbereitung

Alle Pferde waren klinisch allgemeingesund und darmgesund. Drei der Probanden wiesen nach der initialen Kotprobenuntersuchung einen Wurmbefall mit kleinen Strongyloiden auf. In der Kontrolluntersuchung zehn Tage nach der Entwurmung waren auch diese Kotproben frei von Würmern und Wurmeiern. Bei allen Probanden war der Darm makroskopisch und auch mikroskopisch in Bezug auf einen Wurmbefall unauffällig.

4.2 Versuchsdurchführung

Nach Legen des Venenverweilkatheters konnten, bis auf Pferd Nr.15 aus der Gruppe DEX, alle ruhig in die Ablegebox geführt und die Narkose eingeleitet werden.

Proband Nr. 15 war geringfügig aufgeregt, ließ sich dennoch kontrolliert ablegen und zeigte sich in der Allgemeinanästhesie anhand der kardiovaskulären Parameter vergleichbar zu den anderen Probanden.

4.2.1 Narkoseverlauf

Keines der Pferde zeigte Komplikationen im Verlauf der Allgemeinanästhesie.

Der mittlere arterielle Blutdruck (MAP) befand sich bei allen Probanden kontinuierlich über 60 mmHg. Bei drei Pferden (Pferd Nr. 3, 4, 9) der Gruppe C und einem Pferd aus Gruppe DEX (Pferd Nr. 7) stieg der MAP um 15-30 mmHg nach 60 Minuten. Bei diesen Pferden wurde zu diesem Zeitpunkt die Laparotomie begonnen. Bei einem Pferd (Pferd Nr. 12) aus der Gruppe DEX stieg der MAP beim Anlegen der Ischämie von 60 mmHg auf 103 mmHg an und sank nach 30 Minuten wieder ab. Ein Pferd (Pferd Nr. 1) der Gruppe IPC fiel mit einer Steigerung des MAP um 10 mmHg nach Einleiten der Reperfusion auf. Nach 10 Minuten sank der MAP wieder auf den ursprünglichen Wert. Im Gegensatz dazu sank der MAP um 10 mmHg bei einem Probanden (Pferd Nr. 3) der Gruppe C nach Einleiten der Reperfusion. Der Proband Nr. 7 aus der Gruppe DEX fiel über die gesamte Narkosedauer mit einem pO2

zwischen 60-70 mmHg auf. Die übrigen Probanden wiesen stets einen pO2 > 100 mmHg auf.

Ein Pferd (Pferd Nr. 11) der Gruppe C zeigte während der anhaltenden Ischämie zweimal ein unzureichendes Narkosestadium, welches mit Ketamin (0,2 mg/kg i.v.) vertieft wurde.

Das Anlegen und Lösen der Ischämien verlief bei allen 15 Pferden nach dem geplanten Protokoll. Keine der angelegten Ischämien löste sich im Studienverlauf.

Auch die Darmproben wurden entsprechend des Protokolls entnommen.

4.3 Makroskopische Beurteilung des Darms

Bei Proband Nr. 2 aus der Gruppe IPC lag eine Abdominalhernie unbekannter Ursache ohne äußerlich erkennbare Narbe und einem intakten Peritoneum vor. Der Dünndarm stellte sich dabei makroskopisch unverändert dar.

Bei Proband-Nr. 15 aus der Gruppe DEX erholte sich das Jejunum im Vergleich zu den anderen Probanden nach Einleiten der Reperfusion adspektorisch sehr schnell und erschien nach wenigen Minuten nahezu unverändert.

4.4 Histologie

Zwischen den beiden Probelokalisationen mesenterial und antimesenterial konnten keine signifikanten Unterschiede im Hinblick auf das Vorkommen der neutrophilen Granulozyten (p= 0,1349) und dem Grad der Zottenschädigung (p= 0,8297) festgestellt werden.

Deshalb wurden die mesenterialen und antimesenterialen Proben im Folgenden gemittelt ausgewertet.

4.4.1 Beurteilung der Darmzotten

In allen Gruppen wurden die Darmproben zum Probenentnahmezeitpunkt Prä-Ischämie mit einem Scorewert Grad 0 (0-0) (Tabelle 2, Abbildung 11) beurteilt.

Der Scorewert der Gruppe C stieg während der Ischämie und der Reperfusion signifikant an. In den Gruppen IPC und DEX nahm der Schädigungsgrad während der Ischämie jeweils signifikant zu und wurde während der Reperfusion in beiden Gruppen gemildert, in Gruppe DEX signifikant. Der Mukosaschaden während der Reperfusion blieb dabei in allen drei Gruppen signifikant höher als zum Zeitpunkt Prä-Ischämie. Bei der Prüfung auf Zusammenhänge zwischen den Gruppen war der Scorewert der Gruppe DEX während der Ischämie signifikant höher als in Gruppe C.

Der Anstieg in der Gruppe IPC war nicht signifikant gegenüber den anderen

Ergebnisse

Gruppen. Während der Reperfusion waren keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen zu verzeichnen (Tabelle 2, Abbildung 12).

Abbildung 8: Fotomikroskopische Aufnahme der Tunica mucosa [Lamina propria mucosae jeweils in den Darmzotten (1) und zwischen den Krypten (2), Lamina muscularis mucosae (3)] und eines Anteils der Tela submucosa (4) des Jejunums zum Probenentnahmezeitpunkt Prä-Ischämie in Gruppe C mit einem Scorewert Grad 0, bewertet nach dem Score Tabelle 1.

Intakter Mikrovillisaum (Pfeil) auf der Lamina epithelialis, Krypten (Pfeilspitzen), HE-Färbung 1

2 3

Abbildung 9: Fotomikroskopische Aufnahme der Jejunumzotten zur repräsentativen Darstellung der Mukosaschädigung zum Probenentnahmezeitpunkt der Ischämie in Gruppe IPC mit einem Scorewert Grad 3 (nach Tabelle 1). Der subepitheliale Raum (Stern) ist ausgeweitet, die Lamina propria mucosae der Zotten liegt teilweise bis zur Hälfte frei. Lamina epithelialis (Pfeil), HE-Färbung

Abbildung 10: Fotomikroskopische Aufnahme der Jejunumzotten zur repräsentativen Darstellung der Mukosaschädigung zum Probenentnahmezeitpunkt der Ischämie in Gruppe IPC mit einem Scorewert Grad 3-4 nach dem Score Tabelle 1: Das Zottenepithel fehlt an großen Teilen der Zotten. Es ist nur an der Zottenbasis intakt (Pfeil) und der Lamina propria mucosae (Sterne) der Zotte anliegend. Im Darmlumen befindet sich Zelldetritus. HE-Färbung

* *

*

Ergebnisse

58 Tabelle 2: Schädigung der Darmzotten

Dargestellt sind die Scorewerte (Grad 0-5, Einteilung der Grade siehe Tabelle 1) zu den Probenentnahmezeitpunkten (Prä-Ischämie, Ischämie, Reperfusion) in den Gruppen (Control C, Ischämische Präkonditionierung IPC, Dexmedetomidin DEX) als Median (Minimum-Maximum). Sowie die p-Werte (p1, p2, p3) innerhalb der Gruppen zwischen den Probenentnahmezeitpunkten und zwischen den Gruppen (pA, pB, pC) zu den jeweiligen Entnahmezeitpunkten.

Zeitpunkt Gruppe C Gruppe IPC Gruppe DEX p-Werte

Prä-Ischämie 0 (0-0) 0 (0-0) 0 (0-0) pA: 1 pB: 1 pC: 1 Ischämie 2,78 (2,2-3,4) 3,2 (2,4-3,6) 3,35 (3-3,5) p_A:0,116

pB: 0,462 pC: 0,027*

Reperfusion 3,25 (2,4-3,7) 2,8 (0-3,2) 3,1 (0-3,3) pA: 0,094 pB: 0,207 pC: 0,139 p-Werte p1: 0,004*

p2: 0,047*

p3: 0,004*

p1: 0,007*

p2: 0,089 p3: 0,032*

p1: 0,007*

p2: 0,008*

p3: 0,040*

p-Werte innerhalb der Gruppen: p1: P-Isch; p2: Isch-Rep; p3: P-Rep.

p-Werte zwischen den Gruppen zu einem Entnahmezeitpunkt: pA: C-IPC; pB: IPC-DEX; pC: C-DEX.

Signifikante Unterschiede (p < 0,05) sind mit einem * gekennzeichnet.

Abbildung 11: Vergleich der Schädigung der Darmzotten nach Behandlungsgruppen

Dargestellt sind die Scorewerte (Grad 0-5, Einteilung der Grade siehe Tabelle 1) innerhalb der Gruppen (Control C, Ischämische Präkonditionierung IPC, Dexmedetomidin DEX) zu den Probenentnahmezeitpunkten (Prä-Ischämie P, Ischämie I, Reperfusion R).

Ausreißer sind mit einem Punkt und signifikante Unterschiede (p < 0,05) mit einem * gekennzeichnet.

Abbildung 12: Vergleich der Schädigung der Darmzotten nach Zeitpunkten

Dargestellt sind die Scorewerte der Gruppen (Control C, Ischämische Präkonditionierung IPC, Dexmedetomidin DEX) zum jeweiligen Probenentnahmezeitpunkt (Prä-Ischämie P, Ischämie I, Reperfusion R). Signifikante Unterschiede (p < 0,05) sind mit einem * gekennzeichnet.

Maximum

Median

Minimum

(Dieses Schema gilt für alle Graphen) 75 % Quartil

25 % Quartil

Ergebnisse 4.4.2 Neutrophile Granulozyten

Der Verlauf der Anzahl der neutrophilen Granulozyten in der Tunica mucosa verhielt sich in den drei Gruppen gleich (Abbildung 14). In den ungeschädigten Darmproben (Probenentnahmezeitpunkt Prä-Ischämie) waren pro Schnitt kaum Zellen enthalten (Tabelle 3). Die Zellzahl stieg während der Ischämie in allen Gruppen an. In den Gruppen C und IPC war das Ansteigen signifikant. Während der Reperfusion war nochmals ein Anstieg zu verzeichnen, jedoch ohne signifikante Unterschiede gegenüber dem Zeitpunkt Ischämie. Im Gegensatz zu den beiden anderen Gruppen, bestand in Gruppe DEX kein signifikanter Unterschied zwischen dem Zeitpunkt Prä-Ischämie und Reperfusion. Zwischen den Gruppen gab es zu keinem der drei Probenentnahmezeitpunkte signifikante Unterschiede (Prä-Ischämie: p= 0,322;

Ischämie: p= 0,925; Reperfusion: p= 0,505).

Abbildung 13: Fotomikroskopische Aufnahme der Tela submucosa des equinen Jejunums zur repräsentativen Darstellung von neutrophilen Granulozyten (Pfeil) im Lumen einer Vene; HE-Färbung

61 Tabelle 3: Neutrophile Granulozyten

Dargestellt ist die Anzahl der neutrophilen Granulozyten in den einzelnen Gruppen (Control C, Ischämische Präkonditionierung IPC, Dexmedetomidin DEX) zu den 3 Probenentnahmezeitpunkten (Prä-Ischämie, Ischämie, Reperfusion) als Median (Minimum-Maximum), sowie die p-Werte (p1,p2,p3) innerhalb der Gruppen zwischen den Probenentnahmezeitpunkten.

Zeitpunkt Gruppe C Gruppe IPC Gruppe DEX

Prä-Ischämie 0 (0-8) 1,5 (0-8) 1 (0-8)

Ischämie 7 (0-19) 7,5 (0-24) 3,5 (0-33)

Reperfusion 10 (1-119) 19,5 (4-213) 14 (0-66)

p-Werte p1: 0,019*

p2: 0,502 p3: 0,023*

p1: 0,024*

p2: 0,135 p3: 0,025*

p1: 0,092 p2: 0,418 p3: 0,066 p-Werte innerhalb der Gruppen: p1: P-Isch; p2: Isch-Rep; p3: P-Rep.

Signifikante Unterschiede (p<0,05) sind mit einem * gekennzeichnet.

Abbildung 14: Vergleich der neutrophilen Granulozyten

Verlauf der Anzahl der neutrophilen Granulozyten innerhalb der 3 Gruppen (Control C, Ischämische Präkonditionierung IPC, Dexmedetomidin DEX) zu den 3 Probenentnahmezeitpunkten (Prä-Ischämie P, (Prä-Ischämie I, Reperfusion R).

Signifikante Unterschiede (p < 0,05) sind mit einem * gekennzeichnet.

Ergebnisse

62 4.5 Immunhistologie

Sowohl bei der aktivierten Caspase-3- als auch der TUNEL-Färbung konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den mesenterialen und antimesenterialen Proben festgestellt werden. Deshalb erfolgte die Prüfung auf Zusammenhänge mit den Mittelwerten aus beiden Lokalisationen. Aufgrund der unterschiedlichen Anzahl der positiv-gewerteten Zellen zum Probenentnahmezeitpunkt Prä-Ischämie und somit unterschiedlichen Ausgangswerten, erfolgte der Vergleich der Zellzunahme während der Ischämie und Reperfusion zwischen den Gruppen in entsprechenden Prozentangaben (Tabelle 5). Die Anzahl zum Entnahmezeitpunkt Prä-Ischämie entspricht dabei in allen Gruppen 100%. Da zunächst der Prozentwert für jedes einzelne Ergebnis errechnet und anschließend daraus der Mittelwert gebildet wurde, sind diese Werte nicht direkt vergleichbar mit den Zellzahlen und gesondert tabellarisch dargestellt.

4.5.1 Aktivierte Caspase-3

Dargelegt wird zunächst der Vergleich der apoptose-positiven Zellen ohne Berücksichtigung morphologischer Kennzeichen. In allen Gruppen stieg die Zahl der apoptose-positiven Zellen während der Ischämie. Während der Reperfusion sank die Zellzahl pro Fläche in den Gruppen C und IPC. In Gruppe DEX stieg die Zellzahl auch während der Reperfusion. Signifikante Unterschiede innerhalb der Gruppen (Tabelle 4, Abbildung 17) waren nicht zu verzeichnen.

Der Verlauf der aktivierten Caspase-3-positiven Zellen mit morphologisch apoptotischem Zellkern über die Zeit (Abbildung 18) verhielt sich ähnlich dem Verlauf ohne Einbeziehung der morphologisch apoptotischen Kerne. Während der Ischämie stieg die Zellzahl in den drei Gruppen an, in den Gruppen C und IPC signifikant. Im Laufe der Reperfusion waren, mit Ausnahme der Gruppe C, weniger apoptose-positive Zellen zu verzeichnen. Die Zellzahlen zum Zeitpunkt der Reperfusion waren in den Gruppen C und IPC signifikant höher als zum Zeitpunkt Prä-Ischämie. In Gruppe DEX gab es keine signifikanten Unterschiede über die Zeit.

Im Vergleich zwischen den Gruppen (Tabelle 5) war zum Messzeitpunkt Ischämie in Gruppe DEX der höchste Anstieg und in Gruppe IPC der geringste Anstieg zu verzeichnen, jeweils mit und ohne Berücksichtigung der morphologisch apoptotischen Zellkerne. Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen waren nicht zu verzeichnen (Tabelle 5).

Abbildung 15: Fotomikroskopische Aufnahme der Jejunumzotten zur repräsentativen Darstellung der Apoptosedetektion zum Probenentnahmezeitpunkt der Ischämie. Im Darmlumen befindet sich Zelldetritus (Sternchen), die Lamina propria mucosae (1) der Darmzotten liegt teilweise frei (gewinkelter Pfeil). Lamina epithelialis (Pfeil); aktivierte positive Zellen (Kreis), Caspase-3-Färbung

* *

Ergebnisse

Abbildung 16 (A-C): Ausschnitte fotomikroskopischer Aufnahmen der Jejunumzotten zur repräsentativen Darstellung der apoptose-positiven Zellen zum Probenentnahmezeitpunkt der Ischämie. Lamina propria mucosae (1), Lamina epithelialis (2), Krypten (3), Caspase-3-Färbung

2 1

C 2

65 Tabelle 4: Aktivierte Caspase-3 in Zellen/mm²

Dargestellt ist die Anzahl der aktivierten Caspase-3-positiven Zellen (Casp.-3) und der mit zusätzlich morphologischen Kennzeichen der Apoptose (Kern-positiv), in den einzelnen Gruppen (Control C, Ischämische Präkonditionierung IPC, Dexmedetomidin DEX) zu den 3 Probenentnahmezeitpunkten (Prä-Ischämie, Ischämie, Reperfusion) als Median (Minimum und Maximum), sowie die p-Werte innerhalb der 3 Gruppen zwischen den 3 Probenentnahmezeitpunkten.

Zeitpunkt Gruppe C Gruppe IPC Gruppe DEX

Prä-Ischämie Casp.-3 1,68 (1,42-3,12) 3,32 (0,68-4,93) 1,85 (0,52-2,14) Kern-positiv 0,50 (0,40-1,07) 0,68 (0,16-1,13) 0,31 (0,20-1,15) Ischämie Casp.-3 6,18 (2,41-8,37) 5,56 (2,01-7,96) 3,84 (1,81-7,07) Kern-positiv 1,39 (0,82-2,70) 1,80 (0,79-2,36) 1,91 (0,72-3,16) Reperfusion Casp.-3 4,28 (2,28-7,83) 4,62 (2,94-13,53) 4,02 (0,83-10,21)

Kern-positiv 1,55 (0,46-3,57) 1,77 (0,52-7,21) 1,01 (0,31-3,98) p-Werte Casp.-3 p1 :0,117 p-Werte innerhalb der Gruppen: p1: P-Isch; p2: Isch-Rep; p3: P-Rep

Signifikante Unterschiede (p < 0,05) sind mit einem * gekennzeichnet.

Ergebnisse

66 Tabelle 5: Aktivierte Caspase-3

Dargestellt sind die aktivierten Caspase-3-positiven Zellen (Caps.-3) und diese mit zusätzlich morphologisch Kennzeichen der Apoptose (Kern-positiv), in den einzelnen Gruppen (Kontrolle C, Ischämische Präkonditionierung IPC, Dexmedetomidin DEX) zu den 3 Probenentnahmezeitpunkten als Prozentwerte ausgehend von 100% zum Entnahmezeitpunkt Prä-Ischämie sowie die p-Werte zwischen den Gruppen zu den Probenentnahmezeitpunkten.

Zeitpunkt Gruppe C Gruppe IPC Gruppe DEX p-Werte

Prä-Ischämie Casp.-3 100% 100% 100% pA: 1

pB: 1 pC: 1

Kern-positiv 100% 100% 100% p_A:1

pB: 1 pC: 1 Ischämie Casp.-3 288,2% 238,4% 321,8% pA:0,403

pB: 0,210 pC: 0,835 Kern-positiv 308,1% 276,7% 383,0% pA: 1

pB: 0,210 pC: 0,210 Reperfusion Casp.-3 230,4% 340,6% 322,2% pA:0,403 p_B: 0,835 pC: 0,531 Kern-positiv 264,7% 493,1% 415,8% pA: 0,403 pB: 0,835 pC: 0,676 p-Werte zwischen den Gruppen zu den Probenentnahmezeitpunkten:

pA: C-IPC; pB: IPC-DEX; pC: C-DEX

Abbildung 17: Quantifizierung der aktivierten Caspase-3 positiven Zellen

Dargestellt ist die Anzahl der Caspase-3-positiven Zellen innerhalb der drei Gruppen (Control C, Ischämische Präkonditionierung IPC, Dexmedetomidin DEX) zu den 3 Probenentnahmezeitpunkten (Prä-Ischämie P, Ischämie I, Reperfusion R). Signifikante Unterschiede sind nicht zu verzeichnen.

Abbildung 18: Quantifizierung der aktivierten Caspase-3 positiven Zellen, die zusätzlich morphologische Anzeichen von Apoptose zeigten.

Dargestellt sind die Ergebnisse für die 3 Gruppen (Control C, Ischämische Präkonditionierung IPC, Dexmedetomidin DEX) zu den 3 Probenentnahmezeitpunkten (Prä-Ischämie P, Ischämie I, Reperfusion R). Signifikante Unterschiede sind mit einem * gekennzeichnet.

Ergebnisse

68 4.5.2 TUNEL-Methode

Zunächst wird der Verlauf der positivgewerteten Zellen ohne Berücksichtigung morphologischer Merkmale beurteilt. Wie auch bei der Caspase-3-Färbung waren diese bereits zum Zeitpunkt Prä-Ischämie in allen Gruppen vorhanden. Der Verlauf über die Zeit stellte sich in den drei Gruppen gleich dar (Tabelle 6, Abbildung 21).

Dabei stieg die Anzahl der Zellen während der Ischämie an, in den Gruppen C und IPC signifikant. Während der Reperfusion kam es zu einem Absinken der TUNEL-positiven Zellen. Die Zellzahl während der Reperfusion entsprach in Gruppe IPC der zum Zeitpunkt Prä-Ischämie. In Gruppe DEX wurde während der Reperfusion nahezu der Ausgangswert (Prä-Ischämie) erreicht. In dieser Gruppe waren zu allen Zeitpunkten die geringsten Zellzahlen zu verzeichnen.

Der Verlauf der TUNEL-positiven Zellen mit zusätzlich morphologischen Kennzeichen der Apoptose zeigte ein signifikantes Ansteigen der Zellzahl während der Ischämie und ein signifikantes Absinken während der Reperfusion in allen Gruppen (Tabelle 6, Abbildung 22). In allen Gruppen waren die Zellzahlen zum Zeitpunkt der Reperfusion höher als zum Zeitpunkt Prä-Ischämie, in Gruppe DEX

Im Dokument Ischämische und pharmakologische Präkonditionierung mit Dexmedetomidin am equinen Dünndarm-Ischämie-Reperfusionsmodell (Seite 51-0)