und der
Kardiologie und Angiologie der Medizinischen Hochschule Hannover
Transkoronare Applikation von Knochenmarkzellen im murinen myokardialen Ischämie-/Reperfusionsmodell
- Durchführbarkeit, Homing und kardiale Funktionsverbesserung -
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Frederik Marquart aus Ehingen (Donau)
Hannover 2006
Univ.-Prof. Dr. H. Y. Naim, Institut für Physiologische Chemie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
und
Univ.-Prof. Dr. med. H. Drexler, Abteilung Kardiologie und Angiologie der Medizinischen Hochschule Hannover
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H. Y. Naim
2. Gutachter:Univ.-Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein
Tag der mündlichen Prüfung: 12. Mai 2006
Meinen Eltern
gewidmet
2. Literaturübersicht... 3
2.1. Was sind Stammzellen? ... 3
2.1.1. Charakterisierung von hämatopoetischen Stammzellen ... 3
2.1.2. Charakerisierung von mesenchymalen Stammzellen ... 5
2.1.3. Charakterisierung der SP-Stammzellen... 5
2.1.4. Charakterisierung von gewebeständigen Stammzellen ... 6
2.1. Stammzelltherapie kardiovaskulär ... 6
2.2.1. Klinische Studien ... 6
2.2.2. Tierexperimentelle Studien ... 10
2.2.3. Applikationswege... 13
2.2.4. Labeling bzw. Markierung der Zellen ... 16
2.2.5. Homing/Kinetik von Stammzellen ... 18
3. Fragestellung ... 24
3.1. Etablierung einer spezifischen Zelldetektionsmethode zum Nachweis... 24
applizierter KMZ... 24
3.2. Etablierung einer tierexperimentellen Applikationsmethode bei der Maus ... 24
3.3. Analyse des Homings der applizierten Zellen und Untersuchung einer möglichen Kinetik im Ziel- bzw. Abbauorgan ... 24
3.4. Analyse der kardialen Funktion nach Ischämie/Reperfusion und Knochenmarkzelltherapie ... 24
4. Material und Methoden... 25
4.1. Material ... 25
4.1.1. Geräte ... 25
4.1.2. Medikamente... 26
4.1.3. Immunfluoreszenz und Membranfarbstoffe ... 27
4.1.4. Aufreinigungskit... 27
4.1.5. Verbrauchsmaterialien... 28
4.1.6. Puffer und sonstige Lösungen ... 29
4.2. Methoden ... 31
4.2.1. Versuchstiere... 31
4.2.2 Versuchstiergruppen... 31
4.3. Versuchsprotokoll ... 32
4.3.1. Gewinnung und Behandlung der murinen Knochenmarkszellen ... 32
4.3.2. Sorten der KMZ mit autoMACS ... 33
4.3.3. Zellfärbung mit Hilfe des Membranfarbstoffes TAMRA... 33
4.3.4. Myokardiale Ischämie/Reperfusions-Operation... 33
4.3.5. Koronarostiennahe Zellapplikation ... 35
4.3.6. Durchführung der Sham-Operation... 36
4.3.7. Schwanzvenenapplikation ... 37
4.3.8. Mäuse-Echokardiographie... 38
4.3.9. Organentnahme und Anfertigen der Gewebeschnitte... 39
4.3.10. Durchführung der Zellkernfärbung DAPI ... 39
4.3.11. Überprüfung der TAMRA-Färbeeffizienz bei Knochenmarkszellen mittels FACS- ... 40
Analysen... 40
4.4. Histologische Untersuchungen... 40
4.4.1. Analyse des Zellhomings im Myokard und der Milz ... 40
4.4.2. Analyse der Kapillardichte ... 41
4.4.3. Darstellung der Arteriolen mittels α-Aktin-Färbung ... 42
4.4.4. Färben mit Hämalaun-Eosin (HE)... 42
4.4.5. Infarktgrößenbestimmung ... 43
4.5. Statistische Methoden ... 43
5. Ergebnisse... 44
5.1. Detektion von eGFP+- und TAMRA+-markierten-KMZ im Vergleich ... 44
5.2. Analyse des myokardialen Homings nach koronarostiennaher Applikation und intravenöser Applikation... 47
5.3. Kinetikanalysen des KMZ-Homings nach koronarostiennaher Applikation im Myokard ... 49
5.8. Echokardiographie ... 59
5.8.1 Fractional shortening (FS) und Ejection fraction (EF) ... 59
5.8.2. LVESD und LVEDD ... 63
5.6. Kapillarisierung... 65
6. Diskussion... 68
7. Zusammenfassung ... 75
8. Summary... 76
9. Literaturverzeichnis ... 77
10. Danksagung ... 86
Abb. Abbildung
ABC „ATP-binding Cassette“
AG Arbeitsgemeinschaft
Ak Antikörper
aq. dest deionisiertes destilliertes Wasser bFGF „basic Fibroblast Growth Factor“
BMC „Bone Marrow Cells“
BrdU Bromodeoxyuridin
bzw. beziehungsweise
ca. circa
CD „Cluster of Differentiation“
cDNA „complementary Desoxyribonucleic Acid“
cm Zentimeter
CPC „Circulating Periphere Cells“
Cu Kupfer
d Tage
d.h. das heißt
DiI 1,1‘-Dioctadecyl-1-3,3,3‘,3‘-Tetramethylindocarbocyaninperchlorat DMEM „Dulbecco’s Modified Eagles Medium“
DNA „Desoxyribonucleic Acid“
EDTA Ethylendiamintetraacetat
EF „Ejaction Fraction“
EBM-2 „Endothelial Cell Basal Medium-2“
eGFP „enhanced Green Fluorescent Protein“
ELISA „Enzyme Linked Immunoadsorption Assay“
EPC „Endothelial Progenitor Cell“
evtl. eventuell
Fa. Firma
FACS „Fluorescence-Activated Cell Sorter“
FCS „Fetal Calf Serum“
F-FDG 2-[18F]-fluoro-2-deoxy-D-Glukose
G-CSF „Granulocyte-Colony Stimulating Factor“
h Stunde
HCl Salzsäure
HE Hämalaun-Eosin
HIV „Human Immunodeficiency Virus“
HPC „Haematopoietic Progenitor Cell”
HWZ Halbwertszeit
i.a. intraarteriell
Ig Immunglobulin
IL Interleukin
i.m. intramuskulär
IMDM „Iscove`s Modifiziertes Dulbecco's Medium“
i.p. intraperitonal
I/R Ischämie/Reperfusion
In Indium
i.v. intravenös
IVC „Individually Ventilated Cages”
KDR „Kinase insert Domain Receptor“
kg Kilogramm
KG Körpergewicht
KM Knochenmark
KMZ Knochenmarkszellen
LAD „Left Anterior Descending“
lin „lineage“
LV „Left Ventricular“
LVEF „Left Ventricle Ejection Fraction“
LVESV „Left-Ventricular Endsystolic-Volume“
M. musculus
MCP-1 „Macrophage Chemoattractant Protein-1“
MHC „Major Histocompability Complex“
MHH Medizinische Hochschule Hannover
MI Myokardinfarkt
min. Minute
Mio. Millionen
mm Millimeter
mRNA „messenger-Ribonucleic Acid“
MRT Magnet-Resonanz-Tomographie
µm Mikrometer
N. nervus
ng Nanogramm
nm Nanometer
PBMC „Peripheral Blood Mononuclear Cell“
PBS „Phosphate Buffered Saline”
PCR „Polymerase Chain Reaction“
PET „Positron Emission Tomography“
PTCA „Percutaneous Transluminal Coronar Angioplasty“
RBC „red blood cell“
RNA „Ribonucleic Acid“
rpm „rotations per minute“
RT Raumtemperatur
RT-PCR „Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction”
Sca-1 „stem cell antigen-1“
SCF „Stem Cell Factor“
SDF-1 „Stromal Cell-Derived Factor-1“
sec. Sekunde
sog. sogenannt
SP „Side Population“
SPF spezifisch pathogenfrei
TAMRA 5-(und 6)-Carboxy-Tertramethylrhodamin Succinimidylester
Tc Technicum
TRIS Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
u.a. unter anderem
VE „Vascular Endothelial“
VEGF „Vascular Endothelial Growth Factor“
WGA „Wheat Germ Agglutinin”
WHO „World Health Organisation“
WMSI „Wall Motion Score Index“
WT Wildtyp
z.B. zum Beispiel
1. Einleitung
Der Myokardinfarkt (MI) stellt weltweit eine der häufigsten Todesursachen dar. 2002 nahmen herzinfarkt-bedingte Todesfälle bei den 15-59-jährigen hinter HIV/Aids (2279000 Todesfälle) mit 1332000 Todesfällen global Platz zwei ein, bei den über 60-jährigen gar mit 5825000 Platz 1 vor Schlaganfall (4689000 Todesfälle).Weltweit starben somit ca. 3,8 Mio Männer und 3,4 Mio Frauen an akutem MI (WHO, World Health Organisation). Die Ursachen liegen hier derweil weit verstreut, meist sind jedoch Rauchen, einseitige fettreiche Ernährung und wenig Bewegung an der Vorgeschichte des Patienten beteiligt. Man spricht demzufolge von einer Zivilisationskrankheit, welche vor allem in den sog. Schwellenländern oder Zweite-Welt-Ländern vorliegt, was rasante Zuwachsraten zeigen (1988-1998: Kasachstan +46%; Weißrussland +41,5%, Ukraine 43,5%;
(WHO). Auch in Deutschland nimmt der Herzinfarkt eine herausragende Stellung ein. Im Jahre 1999 erkrankten 288192 Menschen daran (156744 Männer und 92144 Frauen) wobei der Hauptanteil mit 55,3% bei den 55-74-jährigen Männern lag. Bei den Frauen lag der Spitzenwert mit 70,1% bei denjenigen, welche 75 Jahre oder älter waren. An akutem Herzinfarkt verstarben in jenem Jahr 80628 Männer und 102710 Frauen. Die stetig fortschreitende Verbesserung der ärztlichen Versorgung bundesweit konnte im Zeitraum von 1985 bis 2000 die Anzahl der Herzinfarkte und die koronarbedingte Sterblichkeit sowohl bei Männern als auch bei Frauen jeweils um ein Drittel senken.
Der Herzinfarkt ist durch eine Myokardnekrose mit Verlust an kontraktiler Substanz und einer Abnahme der Ventrikelfunktion verbunden. Die Infarktzone selber ist avital, zentral nekrotisch und vernarbt, jedoch ist häufig noch eine minimale Restperfusion erkennbar. Abhängig von der initialen Infarktgröße kommt es zum strukturellen Umbau des Ventrikels (Remodelling). Eine Hypertrophie der Kardiomyozyten am Rand des infarzierten Gewebes ist die initiale Antwort des Gewebes auf eine verminderte Herzleistung bedingt durch den hypoxisch-bedingten Verlust von Herzmuskelzellen (KELLERMAN et al. 1992; SOONPAA u. FIELD 1997). Diese Kardiomyozyten-Hypertrophie setzt eine Kaskade in Gang, welche sich in eine Myozytenapoptose fortsetzt und zu einer Expansion des infarzierten Gebietes führt. Letztendlich kommt es zum Einbau von Kollagenfasern und zur Vernarbung des abgestorbenen Bereiches (PFEFFER et al. 1991;
RAVICHANDRAN u. PUVANAKRISHNAN 1991; AGOCHA et al. 1997; COLUCCI 1997).
Somit entwickelt sich eine Ventrikeldilatation und diese führt zur weiteren Abnahme der
Ventrikelfunktion (CHRISTIAN et al. 1992; BOLOGNESE et al. 1997; KELM u. STRAUER 2001). Durch den rechtzeitigen Einsatz pharmakotherapeutischer (Thrombolyse-Therapie) und/oder mechanischer Rekanalisationsverfahren (Ballondilatation, Stentimplantation) kann die Zunahme der Infarktgröße minimiert werden, jedoch ist eine Rückbildung einer bereits vorhandenen Myokardnekrose nicht mehr möglich (STRAUER et al. 2001). Kardiomyozyten sterben schon nach kürzester Zeit ab (REIMER u. JENNINGS 1979; DUMONT et al. 2000; GIUGLIANO u.
BRAUNWALD 2003). Eine Neubildung von Kardiomyozyten im Sinne einer Myogenese, sowie eine Neubildung von Blutgefäßen, Angiogenese, könnten sowohl eine Funktionsverbesserung als auch einen Schutz vor Remodelling bewirken (KESSLER u. BYRNE 1999; KAWAMOTO et al.
2001). Erste klinische und tierexperimentelle Studien zeigten protektive und regenerative Effekte von applizierten Stammzellen oder Vorläuferzellen auf geschädigtes Myokardgewebe (ORLIC et al.
2001a; STRAUER et al. 2001; BRITTEN et al. 2003).
2. Literaturübersicht 2.1. Was sind Stammzellen?
Stammzellen sind Ursprungszellen, welche die Möglichkeit besitzen sich sowohl in eine neue Stammzelle (symmetrische Teilung oder Selbstreplikation) oder in eine Stammzelle und eine undifferenzierte Progenitorzelle (asymmetrische Teilung) zu teilen. Progenitorzellen sind bereits Linien-determinierte Vorläuferzellen, die ihre Fähigkeit zur Selbstreplikation bereits verloren haben und die Richtung in eine bestimmte Zellreihe eingeschlagen haben. Dieses Differenzierungspotential ist für die Weiterentwicklung der Zelle entscheidend, da nicht jede Stammzelle totipotent ist. Unter Totipotenz wird die Fähigkeit verstanden, alle Zell- und Organtypen bis hin zu einem eigenständigen Organismus hervorzubringen. Als ultimative totipotente Stammzelle wird die befruchtete Eizelle betrachtet. Diese Totipotenz bleibt bis zum 8- Zellstadium erhalten. Anschließend spricht man von pluripotenten embryonalen Stammzellen, da aus ihnen kein neues Individuum entstehen kann. Ebenfalls pluripotent sind die sog. Embryonalen Keim- oder Gonadenzellen. Im Verlauf der Embryogenese verlieren die Stammzellen zunehmend ihr Entwicklungspotenzial, so dass letztendlich die sog. fetalen und adulten Stammzellen entstehen.
Adulte Stammzellen konnten in bisher 20 Organen bzw. Organsystemen (u.a. Knochenmark und Blut) nachgewiesen werden. Diese verbleiben dort lebenslänglich und haben die Aufgabe unterschiedlichste organspezifische Ersatzzellen zu produzieren. Man unterscheidet bei den adulten Stammzellen hämatopoetische, mesenchymale, side-population-Zellen (SP-Zellen) und gewebeständige Stammzellen.
2.1.1. Charakterisierung von hämatopoetischen Stammzellen
Humane hämatopoetische Stamm- und Progenitorzellen exprimieren an ihrer Oberfläche das Antigen CD34. Dieser jedoch ist kein selektiver Stammzellmarker, sondern ist auch auf der Zelloberfläche von reifen Endothelzellen zu finden. Somit muss zur weiteren Charakterisierung der hämatopoetische Leukozytenmarker CD45 mit einbezogen werden. Eine große Fraktion der CD34+- Zellen besitzen ebenfalls den Marker CD38. Fehlt dieser handelt es sich bei den CD34+/CD38-- Zellen um frühe primitiven Stammzellen. Frühe primitive Stammzellen im humanen System
Abb.1 Entwicklung hämatopoetischer Progenitorzellen und deren wichtigsten Oberflächenantigenen (DIMMELER 2005)
charakterisieren sich ebenfalls durch CD133+, CD90+ sowie CD117lo. CD117lo bedeutet, dass der Stammzellfaktor Rezeptor c-kit nur schwach exprimiert wird. Hinzu kommt das Fehlen spezieller humaner Linienmarkern (lin). Unter Linienmarkern versteht man Antigene, welche für spezielle Zelllinien charakteristisch sind. So sind im humanem System die Linienmarker CD19 bei B-Zellen zu finden, CD14 bei Makrophagen, CD15 bei Granulozyten und das Glycophorin wird bei Erythrozyten exprimiert. CD3 kommt bei T-Zellen als Linienmarker sowohl im humanen als auch im murinen System vor. Ähnlich verhält es sich im murinen System. Zur Determinierung früher muriner hämatopoetischer Stammzellen werden die Rezeptoren Sca-1 und c-kit (auch als CD117 im humanen System beschrieben) herangezogen. Somit können diese als Sca-1+, c-kit+, lin- (SKL- Population) beschrieben werden. Bei der KTLS-Population werden zusätzlich Zellen einbezogen welche CD90lo bzw. Thy-1-positiv sind. Das Oberflächenmolekül Sca-1 kommt im humanen
Sca-1
c-kit (CD117)
Murine hämatopoetische Stammzellen
CD34
CD45 CD133
Humane hämatopoetische Stammzellen
Thy-1 (CD90)
Vorläufer- zellen
Reife Zellen
T-Zellen B-Zellen Makrophagen Granulozyten Erythrozyten
Murine
Linienmarker CD3 B220 Mac-1 Gr-1 Ter-119
Humane
Linienmarker CD3 CD19 CD14 CD15 Glycophorin
System nicht vor. Murine Linienmarker sind das B220 für B-Zellen, das Mac-1 für Makrophagen, Gr-1 für Granulozyten und Ter-119 bei Erythrozyten. T-Zellen exprimieren wie im humanen System auch im murinen System das Antigen CD3 (DIMMELER 2005).
Nach neuesten Erkenntnissen könnten Stammzellen der hämatopoetischen Linie sich auch in Kardiomyozyten, Endothelzellen, Muskelzellen, Hepatozyten und Neurone differenzieren, nachdem lange Zeit angenommen wurde, sie könnten sich nur in hämatopoetische Zellen differenzieren (KRAUSE et al. 2001).
2.1.2. Charakerisierung von mesenchymalen Stammzellen
Mesenchymale Stammzellen (MSCs) zeichnen sich durch ihre hohe Proliferationsfähigkeit aus und bieten dadurch die Möglichkeit einer relativ leichten Vervielfältigung. MSCs sind CD45- nicht- hämatopoetische Zellen, welche zusätzlich keine Expression des hämatopoetischen Stammzellmarkers CD34 oder des Monozytenmarkers CD14 aufweisen. Stromazellen exprimieren an ihrer Oberfläche CD73, CD105 und CD90, welches jedoch auch auf hämatopoetischen Stammzellen aufzufinden ist. CD105 wird zudem auch von Endothelzellen und Monozyten/Makrophagen exprimiert (DIMMELER 2005). Zusätzlich besitzen Endothelzellen die Linienmarker CD31, VE-Cadherin und KDR („Kinase insert Domain Receptor“) (SHINTANI et al.
2001). MSCs sind in der Lage sich zu adipogenen, chondrogenen, osteogenen Zellen sowie zu Muskelzellen differenzieren (PITTENGER et al. 1999). Zusätzlich lassen sich MSCs mit Hilfe des DNA demethylierenden Cytosin-Analogons 5-Azacytidin zu Kardiomyozyten differenzieren (MAKINO et al. 1999).
2.1.3. Charakterisierung der SP-Stammzellen
Bei dieser Untergruppe an Stammzellen handelt es sich um Zellen welche mittels eines ATP bindenden Transporters ABC („ATP-binding Cassette“) aktiv den Farbstoff Hoechst 33342 oder Rhodamin ausschleusen (GOODELL et al. 1996). Aufgrund der Tatsache, dass sie bei der Analyse mittels Durchflußzytometrie eine separate Population neben der Hauptpopulation bilden, werden sie SP-Zellen genannt. Durch Anregung mittels ultraviolettem (UV) Licht emittiert der Hoechst- Farbstoff rotes und blaues Licht, welches Hoechst Rot oder Hoechst Blau genannt wird. SP-Zellen werden neben dem Knochenmark in fast jedem Gewebe aufgefunden, so dass diskutiert wird ob SP-
Zellen mit den gewebeständigen Stammzellen identisch sind (DIMMELER 2005). In Analysen des murinen Knochenmarks zeigte sich jedoch, dass beinahe die Hälfte der SP-Zellen CD34+ waren und zusätzlich ein Drittel c-kit, Sca-1 und CD90 exprimieren, jedoch lin- sind (PEARCE et al. 2004).
SP-Stammzellen sind in der Lage sich zu Kardiomyozyten und Endothelzellen zu entwickeln (JACKSON et al. 2001).
2.1.4. Charakterisierung von gewebeständigen Stammzellen
Zu den gewebeständigen Stammzellen zählen zum Beispiel kardiale Stammzellen, welche einen lin- /c-kit+-Phänotypus besitzen (BELTRAMI et al. 2003) oder Sca-1+ sind (OH et al. 2003). Zur Fraktion der gewebeständigen Stammzellen zählen weiterhin hepatische Zellen (Ovalzellen), pankreatische Stammzellen, Skelettmuskel-Stammzellen (Satellitenzellen), Stammzellen der Haut und des intestinalen Epithels (Kryptenzellen). Diese sind nach einer Verletzung des betreffenden Gewebes die ersten, welche das zerstörte Gewebe ersetzen können. Es ist jedoch vorstellbar, dass zirkulierende Stammzellen nach Erschöpfung des Pools an gewebeständigen Stammzellen verstärkt ins nekrotische Gewebe einwandern und so am Reparaturprozeß teilnehmen (DIMMELER 2005).
2.1. Stammzelltherapie kardiovaskulär
2.2.1. Klinische Studien
Allmählich rückte die Stammzelltherapie auch in den Fokus der kardiologischen Forschung. Nach vereinzelten Tierversuchen (s. unten) gelang es als Erste Strauer et al. mononukleare Knochenmarkszellen (KMZ) erfolgreich über einen aufgeblasenen Niedrig-Druck-Ballonkatheter in das Infarktgebiet zu injizieren. Zur Stammzellgewinnung wurde dem Patienten Knochenmark punktiert, aufbereitet, kultiviert und 6 Tage nach der Infarktdiagnose injiziert. Da es sich um patienteneigene Zellen handelte konnte das Problem einer immunologischen Abstoßungsreaktion umgangen werden. 10 Wochen nach Applikation verringerte sich die Infarktgröße bei dem 46- jährigen Patienten von anfangs 24,6 % auf 15,7 %. Die Ventrikelfunktion verbesserte sich um 7%- Punkte (STRAUER et al. 2001).
Eine Studie mit Skelettmyoblasten, welche bei einem Patienten während einer Bypass-Operation durchgeführt wurde zeigte eine Verbesserung der Kontraktilität des Herzens nach 5 Monaten
(MENASCHE et al. 2001). 2001 wurde bei 5 Patienten KMZ ebenfalls während einer Bypass- Operation injiziert. Bei 3 von 5 Patienten trat nach einem Jahr eine deutliche Verbesserung der myokardialen Durchblutung im Infarktrandgebiet auf, bei 2 konnte keinerlei Verbesserung festgestellt werden (HAMANO et al. 2001).
Diese intramyokardialen Applikationsmethoden beinhalteten natürlich die bekannten Operationsrisiken und konnten bei einem Herzinfarkt aus Sicht von Kardiologen nicht durchgeführt werden, so dass die Applikation während der Ballondilatation mittels Katheterisierung in diesem Fachbereich favorisiert wurde.
2002 veröffentlichten wiederum Strauer et al. eine größer angelegte Studie mit 20 Patienten welche allesamt mittels Standardtherapie behandelt wurden (medikamentöse Standardtherapie, Reperfusion der Arterie mittels Ballondilatation, Stentimplantation). 10 Patienten erhielten zusätzlich autologe, mononukleare KMZ mittels Niedrig-Druck-Balloninfiltration. 3 Monate später konnte eine deutliche Verminderung der Infarktgröße (von 30% ± 13% auf 12%± 7%; p=0,005) und eine Zunahme der Kontraktilität (2,0 ± 1,1 zu 4,0 ± 2,6 cm/s; p=0,028) bei der KMZ-Gruppe festgestellt werden. Jedoch konnte hier keine Verbesserung der EF („Ejaction Fraction“) beobachtet werden.
Doch nun konnten aufgrund der Gruppengröße bereits statistisch belegbare Verbesserungen aufgezeigt werden (STRAUER et al. 2002).
Bei der TOPCARE-AMI-Pilotstudie wurden 31 Patienten zunächst standardmäßig behandelt.
Mittels Katheterapplikation bekamen 9 von ihnen zusätzlich autologe KMZ und 11 Patienten ebenfalls zusätzlich Progenitorzellen aus deren peripheren Blut, sogenannten CPCs („Circular Progenitor Cells“). Zwischen den Gruppen konnte kein Unterschied der Ausgangswerte ermittelt werden. 4 Monate nach Zellgabe stiegen sowohl LVEF („Left Ventricle Ejection Fraction“) (von 51,6% ± 9,6% auf 60,1% ± 8,6%; P=0,003) als auch der WMSI („Wall Motion Score Index“) im infarzierten Bereich (-1,5 ± 0,2 auf -0,5 ± 0,7 SD/chord; p<0,001) bei beiden zellbehandelten Gruppen an. Im Gegensatz dazu wurde die LVESV („Left-Ventricular Endsystolic-Volume“) (56,1
± 20 ml auf 42,2 ± 15,1 ml; p=0,01) deutlich kleiner. Es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen der BMC- („Bone Marrow Cell“) und der CPC-Gruppe festgestellt werden, wohingegen bei der nur standardbehandelten Kontrollgruppe keinerlei wesentliche Verbesserungen auftraten.
Bei dieser Studie wurde ersichtlich, dass vor allem die am Infarktgebiet angrenzenden Regionen eine Verbesserung aufzeigten (ASSMUS et al. 2002).
Mehrere Studien legten den Verdacht nahe, dass in erster Linie eine Neovaskularisierung des infarzierten Myokards für die Regeneration des Herzgewebes verantwortlich sei (TAKAHASHI et al. 1999; MUROHARA et al. 2000; KAWAMOTO et al. 2001; KOCHER et al. 2001). Diese vermehrte Durchblutung würde die Myozyten-Apoptose, Kollagenaufbau bzw. Narbenneubildung minimieren (KAWAMOTO et al. 2001; KOCHER et al. 2001).
In der BOOST-Studie aus Hannover wurden 60 Patienten 1:1 zufällig der BMC- oder der nur standardbehandelten Kontrollgruppe zugeteilt. 30 Patienten erhielten 4-5 Tage nach Standard- Infarkt-Behandlung Knochenmarksstammzellen mittels Niedrig-Druck-Balloninfiltration. 6 Monate später konnte wiederum ein signifikanter Anstieg der LVEF bei der BMC-Gruppe festgestellt werden (+ 6,7%-Punkte; Kontrollgruppe 0,7%-Punkte). Auch diese Studie ließ erkennen, dass vorangig die Randgebiete des Infarktes für die kardiale Leistungsregeneration verantwortlich waren (WOLLERT et al. 2004).
Hofmann et al. markierten 2004 unselektierte KMZ mit radioaktivem 18F-FDG (2-[18F]-fluoro-2- deoxy-D-Glukose) und injizierten diese entweder intrakoronar mittels Katheterapplikation (n=3) oder intravenös über die V. antecubitalis (n=3). Für 3 zusätzliche Patienten wurden von den 18F- FDG-markierten KMZ immunologisch CD34+-Zellen angereichert und diese intrakoronar appliziert. Die radioaktiven Zellen wiesen alle eine Markierung von 99% und eine Vitalität von 92- 96% auf. Alle Zellapplikationen fanden 5-10 Tage nach der Stentimplantation statt. Nach 50-75 min wurden die Patienten mittels 3D PET („Positron Emission Tomography“) untersucht. 1,3% - 2,6%
der markierten, unselektierten KMZ wurden im infarzierten Myokard detektiert, wobei der größte Anteil der Radioaktivität in Milz und Leber gemessen wurde. Die intravenös injizierten markierten, unselektierten Zellen konnten nicht eindeutig von der Hintergrundaktivität unterschieden werden, wohingegen 14% bis 39% der Gesamtaktivität der markierten angereicherten CD34+-Zellen, welche intrakoronar appliziert wurden, im infarzierten Myokard detektiert wurden. Unselektierte Zellen reicherten sich gleichmäßig sowohl im Infarktzentrum als auch an den Randgebieten an, wohingegen CD34+-Zellen hauptsächlich an den Randgebieten zu finden waren (HOFMANN et al.
2005).
2004 wurde die TOPCARE-AMI-Studie erweitert. 59 Patienten mit akutem MI wurden 5 Tagen nach Rekanalisation und Stentimplantation Vorläuferzellen per transkoronarer Applikation injiziert.
30 von ihnen bekamen KMZ, 29 Patienten Stammzellen aus dem peripheren Blut. Eine Angiographie nach 4 Monaten bestätigte wiederum, dass bei beiden zellbehandelten Gruppen die
LVEF signifikant angestiegen war (von 50 ± 10% auf 58 ± 10%; p<0,001) und die LVESV im Gegenzug dazu deutlich gesunken war (von 54 ± 19ml auf 44 ± 20ml; p<0,001). Ein Kontrast-MRT (Magnet-Resonanz-Tomographie) nach einem Jahr belegte zwischen dem 4. Monat und dem 12.
Monat der Studie eine signifikante Verbesserung der LVEF (9,3 ± 8,0%), eine reduzierte Infarktgröße und eine ausbleibende linksventrikuläre Hypertrophie. Dies ließ eine funktionale Regeneration des infarzierten Ventrikels vermuten (SCHACHINGER et al. 2004).
Fernandez-Aviles et al. behandelten ebenfalls in einer klinischen Studie ca. 14 Tagen nach MI und anschließender Standardbehandlung 20 Patienten (Kontrollgruppe n=13) mit KMZ. Die Knochenmarksstammzellen wurden zuvor mittels Durchflußzytometrie phänotypisiert, wobei CD34+-Zellen zu 1 ± 0,6% vorlagen (CD117+ 1,7 ± 0,9%; CD133+ 0,6 ± 0,3%). Der relativ späte Zeitpunkt der Zellapplikation, hier 14 Tagen, wurde gewählt, um eine Ausdifferenzierung der Stammzellen in inflammatorische Zellen zu vermeiden. 6 Monate später konnte im MRT nicht nur eine signifikante Verminderung der LVESV (von 81,3 ± 29,2ml auf 71,7 ± 31,8ml; p=0,007), sondern auch ein signifikanter Unterschied der infarzierten Ventrikelwanddicke zwischen beiden Gruppen nach 6 Monaten (3,2 ± 1,5mm zu 2,0 ± 1,0mm) festgestellt werden. Diese Ergebnisse zeigten somit auch eine kardiale Funktionsverbesserung nach größerer Zeitspanne zwischen MI- Behandlung und intrakoronarer Zellapplikation (FERNANDEZ-AVILES et al. 2004).
Chen et al. kultivierten die gewonnenen Knochenmarksstammzellen der Versuchspersonen über 10 Tage (auf 8-10 x 109 Zellen/ml) und applizierten diese den Patienten (n=34) 18 Tage nach MI und Standardbehandlung. Die Kontrollgruppe (n=35) bekam nach der gleichen Zeitspanne ein äquivalentes Volumen an PBS („Phosphate Buffered Saline“) injiziert, ebenfalls per Balloninfiltration. Alle 69 Patienten wurden über 6 Monate zu den gleichen Zeitpunkten untersucht (PET, Herzkatheterisierung, Echokardiographie usw). Nach 3 Monaten stieg die LVEF der zellbehandelten Gruppe signifikant an sowohl mit der base-line als auch mit der Kontrollgruppe verglichen (67 ± 11 vs. 49 ± 9% und 53 ± 8%). Jedoch wurde nach 3 weiteren Monaten keinerlei weitere Verbesserung der LVEF festgestellt. Der WMSI sank nach 3 Monaten bei der Versuchsgruppe erheblich (13 ± 5% zu 32 ± 11%), aber es wurde auch eine deutliche Verbesserung bei der Kontrollgruppe festgestellt (13,5 ± 5% zu 28 ± 10%). Auch hier konnte selbst nach 18 d eine Verbesserung der Herzleistung durch intrakoronare KMZ-Behandlung festgestellt werden (CHEN et al. 2004).
2.2.2. Tierexperimentelle Studien
Klinische Studien bergen für die Grundlagenforschung mehrere Nachteile, insbesondere was den histologischen Aspekt betrifft. So wurden im Laufe der Jahre auch verschiedene tierexperimentelle Versuchsmodelle entwickelt, um diesem Abhilfe zu schaffen. 1996 applizierten Leor et al. in chronisch infarzierten Ratten 1-2 Wochen nach Infarzierung entweder kultivierte humane fetale Kardiomyozyten oder kultivierte murine fetale Kardiomyozyten in das entstandene Narbengewebe.
Als Kontrolle diente die Injektion einer Pufferlösung. 14 bzw. 65 Tage später konnten sowohl humane als auch murine Kardiomyozyten detektiert werden, welche auch positiv auf eine α-Aktin- Färbung reagierten. Bei der Kontrollgruppe konnten weder humane noch murine α-Aktin-positive Kardiomyozyten detektiert werden. Diese Studie ließ vermuten, dass auch kultivierte Kardiomyozyten im Myokardgewebe zurückblieben (LEOR et al. 1996).
Es wurden auch Versuche mit Skelettmyoblasten nach Infarzierung mittels Cryotechnik durchgeführt. Sowohl in Ratten (MURRY et al. 1996) als auch in Kanninchen (TAYLOR et al.
1998) zeigte sich nach einigen Wochen eine kardiale Funktionsverbesserung (TAYLOR et al. 1998) sowie die immunfluoreszenzmikroskopische Expression von spezifischen skelett- und kardialen Markern im infarzierten Areal. Jedoch wiesen verschiedene Wissenschaftler auf den Umstand hin, dass Skelettmyoblasten nur 4-8% der Muskelzellen ausmachen und dieser Anteil im Laufe der Lebensjahre stetig abnehmen würde. Hinzu käme, dass Skelettmuskelzellen in-vivo keine gap- junctions ausbilden würden und sich somit nicht synchron mit den Herzmuskelzellen kontrahieren könnten (TOMITA et al. 1999).
Tomita et al. wiesen in ihrer Studie einen deutlich positiven Effekt von 5-Azacytidin auf die Kultivierung von KMZ und der anschließenden Transplantation. Zu diesem Zweck wurden KMZ 7 Tage kultiviert und am 3. Tag für 24 h 5-Azacytidin zugegeben. Diese Zellen wurden 3 Wochen nach cryoinduziertem Infarkt in die Ventrikelwand injiziert. Als Kontrolle dienten frische KMZ, über 7 Tage kultivierte KMZ und IMDM („Iscove`s Modifiziertes Dulbecco's Medium“).
Ausschließlich in 5-Azacytidin kultivierte Zellen reagierten positiv auf einen Nachweis von Troponin I und MHC („Major Histocompability Complex“). Die Kapillardichte stieg bei allen drei KMZ-Gruppen im Vergleich zur IMDM-Gruppe signifikant an (frische KMZ: 6,29 ± 0,58; KMZ:
5,93 ± 0,33; KMZ+5-Azacytidin: 5,74 ± 0,57 Kapillaren/0,2mm² vs. IMDM: 2,12 ± 0,38 Kapillaren/0,2mm²; p<0,05). Jedoch konnte bezüglich der Infarktgröße eine deutliche Verbesserung
der 5-Azacytidin-Gruppe im Vergleich zu den übrigen KMZ-Gruppen festgestellt werden (P<0,05).
Somit konnten Tomita et al. einen deutlichen positiven Effekt auf KMZ, welche zuvor mit 5- Azacytidin kultivert wurden, darlegen (TOMITA et al. 1999).
MNCs („Mononuclear Cell“) aus dem peripheren Blut gesunder Patienten wurden 2001 7 Tage in EBM-2 („Endothelial Cell Basal Medium-2“) kultiviert und 3 Stunden nach Ligatur der LAD („Left Anterior Descending“) intravenös in Ratten injiziert (n=5). Die Kontrollgruppe (n=5) erhielt ein äquivalentes Volumen an EBM-2. 28 Tage später konnte ein deutlicher Anstieg der Kapillardichte bei den EPC- („Endothelial Progenitor Cell“) Tieren im Vergleich zur Kontrollgruppe festgestellt werden (290,1 ± 21,5 vs. 191,1 ± 17,8 Kapillaren/mm²; p=0,0009). Die Ventrikelwanddicke, WMSI und das FS („Fractional Shortening“) stiegen ebenfalls signifikant an. Zusätzlich konnte mittels immunhistochemischer Analysen die Ausdifferenzierung der transplantierten Zellen in reife Endothelzellen nachgewiesen werden, jedoch wurde keine Quantifizierung derselbigen durchgeführt (KAWAMOTO et al. 2001).
In einer Pilotstudie wurden 10 SPF- (spezifisch pathogenfrei) Schweinen mittels transendokardialer Injektion, sowohl in ischämischen als auch in nicht-ischämischen Bereichen, mit „Flouresbrite YG- microspheres“ markiertes Knochenmark (KM) appliziert, nachdem mit Hilfe eines Ameroid Constrictors, eine Art Metallring, die linke A. circumflex chronisch ligiert wurde. Die Tiere wurden zu verschiedenen Zeitpunkten für weitere Untersuchungen getötet. Desweiteren wurde in einer zweiten Phase der Studie ebenfalls bei SPF-Schweinen mit Ligatur der A.circumflex frisch entnommenes KM (n=7) oder heparinisierte Pufferlösung (n=7) transendokardial injiziert. Bei 7 zusätzlichen SPF-Schweinen ohne myokardiale Ischämie wurde entweder ebenfalls frisch entnommenes KM (n=4) oder wiederum heparinisierte Pufferlösung transendokardial appliziert. In der Pilotstudie ergaben histologische Untersuchungen bei 4-6% der infiltrierten Zellen eine positive CD34-Färbung. In der zweiten Phase dieser Studie wurde 4 Wochen nach den jeweiligen Applikationen ein signifikanter Anstieg der regionalen Durchblutung des Myokards im ischämischen Bereich festgestellt (von 83 ± 12 auf 98 ± 14%; p=0,001), wobei diese Verbesserung bei den zellbehandelten, nicht-ischämischen Versuchstieren ausblieb. Ebenso konnte kein signifikanter Anstieg der Blutgefäßanzahl sowohl im ischämischen, als auch im nicht-ischämischen Bereich des Myokards festgestellt werden. Möglicherweise liegt eine Erklärung für die vorgefundene Diskrepanz zwischen erhöhter myokardialer Durchblutung und dem Fehlen eines
Anstieges der Kapillardichte oder größerer Blutgefäße in einer minimalen Vergrößerung des Gefäßdurchmessers (FUCHS et al. 2001).
Orlic et al. injizierten 3-5 h nach chronischem Infarkt durch Ligatur der LAD bei weiblichen Mäusen u.a. lin-/c-kit+-Zellen von männlichen eGFP- („enhanced Green Fluorescent Protein“) Mäusen intramyokardial in das Randgebiet des Infarktes. Bei 12 der operierten 30 Tiere konnte nach 9 Tagen eine myokardiale Regeneration festgestellt werden. 68 ± 11% des Infarktes waren mit engverbundenen Myozyten besetzt, welche sowohl Y-Chromosom-positiv als auch eGFP+ waren.
Im Gegensatz hierzu konnten neue Myozyten bei Tieren welche lin-/c-kit--eGFP-Zellen injiziert bekommen hatten nicht aufgefunden werden, wie auch bei den Sham-operierten Tieren. Außerdem wurden Y-Chromosomen und eGFP nur im ischämischen Bereich des Myokardgewebes detektiert.
Die linksventrikuläre Herzleistung verbesserte sich ebenfalls signifikant in der zellbehandelten Gruppe im Vergleich zu den anderen Versuchstiergruppen. In dieser Studie konnten also direkt Myozyten nachgewiesen werden, welche von den transplantierten männlichen lin-/c-kit+-Zellen abstammten (ORLIC et al. 2001a).
Andere Studien, wie z.B. Murry et al. (MURRY et al. 2004) konnten nach Anreicherung der KMZ und intramyokardialer Injektion keinerlei Transdifferenzierung der lin-/c-kit+-Zellen zu Herzmuskelzellen feststellen. Balsam et al. konnten ebenfalls keinerlei kardiozytenspezifische Marker detektieren, bei einem ähnlichen Versuchsaufbau wie von Orlic et al. angewandt. Es konnten nach 10 Tagen zwar vereinzelt injizierte Zellen nachgewiesen werden, jedoch 30 Tage nach erfolgter Zellapplikation konnten keinerlei markierte Zellen detektiert werden. Eine Echokardiographie ergab jedoch nach 6 Wochen eine moderate aber dennoch signifikante Verbesserung der Herzleistung (BALSAM et al. 2004).
Kultivierte humane CD34+-Zellen wurden 48 Stunden nach Ligatur der LAD intravenös in Ratten injiziert. Auch bei dieser Studie wurde ein Anstieg der Kapillardichte am Randgebiet und im infarzierten Bereich verglichen mit einer Kontrollgruppe gemessen (247 ± 12 zu 52 ± 8 im Infarktgebiet; P<0,01 und 162 ± 9 zu 51 ± 5 im Infarktrandgebiet; p<0,01), wobei Kapillaren humanen Ursprungs, welche das humane CD31 exprimierten, sich vorzugsweise im Zentrum des Infarktbereiches ansiedelten, wohingegen Kapillaren, welche das murine CD31 exprimierten, sich mehr in der Randzone ansiedelten. CD34--Zellen ließen eine ähnliche Art der Verteilung wie CD34+-Zellen erkennen, jedoch konnte hierbei keine Steigerung der Kapillaranzahl festgestellt
werden. Zusätzlich konnte eine signifikante Verbesserung der LVEF und eine Verminderung der Infarktgröße mittels Echokardiographie nachgewiesen werden (KOCHER et al. 2001).
Ciulla et al. untersuchten 2003 die Möglichkeit und Effizienz der intravenösen KMZ-Applikation, im Gegensatz zur invasiven direkten intramyokardialen Injektion. Hierfür bekamen 10 Ratten 7 Tage nach einem cryo-induziertem MI über die V. femoralis markierte KMZ injiziert. Am nächsten Tag wurden echokardiographische Untersuchungen an den Ratten durchgeführt. 7 Tage nach der Infarzierung wurden u.a. Herz und Milz entnommen und für weitere histologische Untersuchungen aufgearbeitet. Zusätzlich wurde das KM der Empfängertiere mittels Durchflußzytometrie auf die angewandte Zellfärbung hin untersucht. Die Echokardiographie wies eine deutliche Infarzierung nach, was auch später durch histologische Untersuchungen bestätigt wurde. Markierte KMZ wurden nur im infarzierten Gewebe entdeckt, im Schnitt lag deren Anzahl bei 8 Zellen pro Gewebeschnitt.
In der Milz konnten durchschnittlich 3 gefärbte Zellen detektiert werden. Im KM der Empfängertiere konnten nach der Transplantation 0,8% gefärbter Zellen nachgewiesen werden.
Jedoch wurden in anderen Zielorganen, wie Lunge, Leber, Niere und Milz, keinerlei transplantierte Zellen nachgewiesen. Um diese Daten zu erklären, stellten Ciulla et al. die Hypothese einer Cytokin-Kaskade auf, welche die injizierten Zellen zum beschädigten Gewebe führen würde (CIULLA et al. 2003).
2.2.3. Applikationswege
Die Form der Applikation verschiedener biowirksamer Stoffe oder Zellen ist für die Effektivität derselbigen zur kardiovaskulären Therapie von entscheidender Bedeutung. In klinischen Studien wurden bisher im Laufe der Zeit verschiedene Methoden angewandt. Strauer et al., welche als erste autologe Stammzellen applizierten, verwendeten hierfür die Niedrig-Druck-Balloninfiltration, was aus kardiologischer Sicht verständlich ist und Operationsrisiken vermindert (STRAUER et al.
2001). Bisher wurden bei einer Studie mit ähnlicher Fragestellung Skelettmyoblasten intramyokardial während einer Bypass-Operation injiziert (MENASCHE et al. 2001). Diese Methode der Transplantation wurde auch angewendet zur erfolgreichen Applikation von KMZ bei 3 von 5 Patienten (HAMANO et al. 2001).
Kardiologische Studien bevorzugten jedoch eine weniger invasive Form der Applikationsmethode.
Dementsprechend wurden die meisten der kardiologischen Studien mit Hilfe der intrakoronaren
Applikation nach Ballonokklusion durchgeführt (STRAUER et al. 2001; ASSMUS et al. 2002;
STRAUER et al. 2002; CHEN et al. 2004; SCHACHINGER et al. 2004; WOLLERT et al. 2004;
STRAUER et al. 2005).
Eine weitaus einfachere und sicherere Form der Injektion wäre die intravenöse Applikation, welche sowohl in klinischen als auch in tierexperimentellen Studien angewandt wurde. 2004 konnten in einer klinischen Studie von Hofman et al. mit 3 MI-Patienten nach intravenöser Applikation von radioaktiv markierten KMZ nur Hintergrundaktivität im Myokardgewebe festgestellt werden (HOFMANN et al. 2005). In ihrer tierexperimentellen Studie von 2003 detektierten Aicher et al.
24-96 h nach intravenöser Gabe 70% der applizierten radioaktiv markierten Zellen in der Milz und der Leber. Nur 1% der Radioaktivität konnte im Herzen nachgewiesen werden (AICHER et al.
2003). Ciulla et al. applizierten 15-25 x 106 markierte mononukleare KMZ über die V. femoralis. 7 Tage nach der intravenösen Zelltransplantation konnten nur noch wenige Zellen in Herz (68,75%
der Gewebeschnitte enthielten im Schnitt 8 Zellen) und in der Milz (62,5% der Gewebeschnitte enthielten im Schnitt 3 Zellen) detektiert werden (CIULLA et al. 2003).
Obig angeführte klinische Studie und die tierexperimentellen Studien legten die Diskrepanz bei intravenösen Injektionen zwischen Menge der applizierten Zellen und der Anzahl vorgefundener Zellen im Zielorgan dar. Um diesem Dilemma in Tierversuchen zu entgehen, entschieden sich viele Arbeitsgruppen für eine möglichst infarktnahe Zellapplikation. Jedoch ist bei tierexperimentellen Studien die Tierspezies für die Form der Applikation von fundamentaler Bedeutung, speziell bedingt durch die Größe und die Anatomie der verwendeten Tierart, so dass elegante und praxisnahe Applikationsmethoden wie eine intrakoronare Injektion nur bedingt bei Spezies größerer Art durchführbar sind.
Orlic et al injizierten in C57bl/6-Mäusen lin-/c-kit+-Zellen intramyokardial, rund um das infarzierte Gewebe und konnten nach 9 Tagen applizierte Zellen noch im Myokard detektieren (ORLIC et al.
2001a). Diese Art der intramyokardialen Injektion wurde bei verschiedenen Versuchen mit Mäusen oder Ratten angewandt (MANGI et al. 2003). In einer weiteren Studie wurden gefärbte Zellen 24 Stunden nach Infarzierung direkt in die linke Herzkammer von Ratten injiziert (AICHER et al.
2003; BRENNER et al. 2004).
Doch diese Wege der Zellapplikation waren wiederum mit recht invasiven Eingriffen verbunden.
Fuchs, Kornowski et al. erarbeiteten in ihrer Arbeitsgruppe die Möglichkeit einer transendokardialen Injektionsform bei Schweinen. Hierfür wurde zunächst eine 3D-Ansicht der
linken Herzkammer mittels eingeführtem Katheter angefertigt, woraufhin punktgenaue Injektionen in das Endokard möglich waren. Diese Art der Injektion verhinderte zumindest eine riskante Thorakatomie (KORNOWSKI et al. 1999; VALE et al. 1999).
Obwohl Kleinnager für größere Studien ideal sind, konnte bei der relativ geringen Größe dieser Tiere keine Form der Zellinjektion entwickelt werden, welche der klinischen Applikation in kardiologischen Studien über eine intrakoronare Katheterapplikation nahe kommt. Nur bei Tieren größerer Statur wurden unterschiedliche Ansätze einer möglichst intrakoronaren Injektion durchgeführt.
Vor allem bei Hunden und Schweinen kamen diese Versuchsansätze zum Einsatz. Nach Implantieren eines Ameroid-Constrictors und eines intrakoronaren Ballon-Occluders an der LAD wurden 47 Hunden zur täglichen bFGF- („basic Fibroblast Growth Factor“) Injektion ein transmyokardialer Katheter in den linken Vorhof positioniert. Die Enden des Katheters und des Ballon-Occluders wurden subkutan im Nacken fixiert (LAZAROUS et al. 1995). Dieser Versuchsaufbau wurde von derselben Autorengruppe für Vergleichsstudien zwischen bFGF und VEGF („Vascular Endothelial Growth Factor“) herangezogen (BANAI et al. 1994; LAZAROUS et al. 1996). Vulliet et al. berichten ebenfalls von einer intrakoronaren Katheterapplikation bei Hunden zur Injektion von 1 x 107 selektierten KMZ. 7 Tage später konnten zwar transplantierte Zellen detektiert werden, jedoch wurde auch in dieser Studie keine Quantifizierung durchgeführt (VULLIET et al. 2004).
2001 veröffentlichten Wang et al. eine Studie über eine koronare Applikation von KMZ bei Ratten.
Hierbei wurden 12 Ratten 2 Wochen nach chronischer Infarzierung durch Ligatur der LAD die aufsteigende Aorta kurzzeitig abgeklemmt und die Zellen direkt über dem linken Vorhof in die Aorta injiziert (WANG et al. 2001).
All diese bei Tieren angewandten Methoden kamen aber der klinischen Situation eines Infarktes mit anschließender Reperfusion und späterer KMZ-Applikation über einen retrograd eingeführten Katheter nicht nah genug, geschweige denn bei klassischen Versuchstieren wie Mäusen oder Ratten.
2.2.4. Labeling bzw. Markierung der Zellen
Die langzeitige Markierung der applizierten Zellen ist für weiterführende Kinetikuntersuchungen von entscheidender Bedeutung. Eine hohe Prozentzahl an markierten Zellen, eine möglichst lang anhaltende Markierung und eine weiterhin bestehende Vitalität und Funktionalität der markierten Zellen sind dabei die wichtigsten Kriterien einer erfolgreichen Methode. Hierfür wurden in vielen verschiedenen Versuchsansätzen unterschiedliche Methoden angewandt. Diese benutzten Methoden lassen sich in 3 große Gruppen einteilen: Fluoreszenzmarker, genetische Marker und radioaktive Marker
Kocher et al. benutzten 2001 für ihre Studie DiI (1,1‘-Dioctadecyl-1-3,3,3‘,3‘- Tetramethylindocarbocyaninperchlorat) zur Fluoreszenz-Markierung ihrer CD34+-Zellen. Hierfür wurden die Zellen mit 10µg/ml Lipoproteine inkubiert, welche zuvor mit DiI versetzt wurden. Die Herzen wurden nach Versuchsende per Fluoreszenzmikroskopie auf jene Zellen untersucht (KOCHER et al. 2001). Diesen Fluoreszenz-Farbstoff DiI benutzten bei ähnlichen Fragestellungen auch andere Studien (KAWAMOTO et al. 2001; VULLIET et al. 2004).
Ein anderer Fluoreszenzfarbstoff für Zellen ist das rot fluoreszierende TAMRA (5-(und 6)- Carboxy-Tertramethylrhodamin Succinimidylester). Dieser wurde bereits erfolgreich zur Färbung Dendritischer Zellen, welche aus dem KM kultiviert wurden, benutzt (OHL et al. 2004). TAMRA wies hierbei eine Anfärbung von >99% auf und die angefärbten Dendritischen- oder T-Zellen konnten auch noch nach 96 Stunden mittels Fluoreszenzmikroskopie detektiert werden (OHL et al.
2004; HARDTKE et al. 2005). Hinzu kam, dass in diesen Studien TAMRA die Funktionalität und Interaktion der angefärbten Zellen nicht zu beeinträchtigen schien.
Ciulla et al. benutzten als Fluoreszenzfarbstoff PKH26, ein rot fluoreszierender Zell-Marker. Die Färbeeffizienz lag hierbei bei 84% und auch hier schien die Vitalität der Zellen erhalten zu bleiben.
Eine Woche nach Applikation der gefärbten Zellen konnten in den angefertigten Gewebeschnitte noch rot fluoreszierende Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie entdeckt werden (CIULLA et al.
2003).
Zur Markierung entnommener KMZ verwendeten Tomita et al. BrdU (Bromodeoxyuridin), welches immunhistochemisch mit Hilfe von anti-BrdU-Antikörpern detektiert werden konnte. Die Färbeeffizienz lag bei dieser Methode ungefähr bei 75%. 5 Wochen nach Transplantation konnten noch implantierte Zellen mit dieser Methode nachgewiesen werden (TOMITA et al. 1999).
Ebenfalls häufig in Stammzellstudien wurde auch die Methode der genetischen Zellmarkierung benutzt. Das Prinzip, welches allen Ansätzen zu Grunde liegt, ist die Expression eines Proteins, welches von den Zellen der Donor-Tiere aber nicht bei den Empfängertieren exprimiert wird. Somit ist es möglich applizierte Zellen von den ubiquitär vorhandenen analogen Zellen des Empfängertieres zu unterscheiden und letztendlich zu detektieren. Hierbei wurden z.B. Zellen von Mäusen benutzt welche das eGFP exprimierten, so dass auch deren KMZ, welche nicht-eGFP- transduzierten Empfängertieren injiziert wurden, unter Fluoreszenzmikroskopie grün leuchten.
Auch viele Tage (9-14 d) nach Zellapplikation konnten noch eGFP-fluoreszierende Zellen entdeckt werden (ORLIC et al. 2001a; BALSAM et al. 2004; MURRY et al. 2004). Orlic et al. benutzten zusätzlich als Donor-Tiere männliche Tiere, so dass die weiblichen Empfänger-Tiere nach Applikation des selektierten Knochenmarks auch auf das Vorhandensein des Y-Chromosoms untersucht werden konnten (ORLIC et al. 2001a).
Ein anderer häufig benutzter genetischer Marker ist das LacZ-Protein. Für ihre Studie gewannen Jackson et al. KM von männlichen Rosa26-Ly5.2-Mäusen, welche LacZ exprimierten. Die Zellen wurden anschließend bestrahlten weiblichen Ly5.1-Tieren injiziert. In dieser Studie kamen sozusagen 3 genetische Marker zum Einsatz: LacZ, Ly5.2 und das Y-Chromosom (JACKSON et al.
2001). Viral transduziertes LacZ wurde auch bei weiteren Kleinnagern (WANG et al. 2001;
MANGI et al. 2003) und Schweinen (VALE et al. 1999) erfolgreich zur Detektion transplantierter Zellen benutzt.
Radioaktive Isotope stellen eine weitere Möglichkeit dar, Zellen zu markieren und anschließend zu detektieren. Die Arbeitsgruppe um Aicher und Brenner verwenden hierbei das 111In- (Indium) Isotop. Hierbei ergaben sich aber entscheidende Nachteile. So lag die Färbeeffizienz der CD34+- Progenitorzellen bei nur 32 ± 11%. Nach 48 h und 96 h lag die Vitalität bei 30%, und nach 7 Tagen konnten keinerlei Proliferation oder Differenzierung der Zellen ex vivo beobachtet werden. Die Halbwertszeit (HWZ) von 111In liegt bei 2,8 Tagen. Hinzu kam das technische Problem der geringen Auflösung, so dass bei der geringen Größe von Ratten (ca. 120g) nur schwer zwischen Herz, Leber und Milz unterschieden werden konnte. 111In geht zudem reversible Isotop-Zell- Bindungen ein, so dass nach 24 h 34% des Isotops nicht mehr an den Zellen gebunden war (BRENNER et al. 2004). Bei T-Lymphozyten liegt dieser Wert bei 70% (KUYAMA et al. 1997).
Bei der Markierung von EPCs lag die maximale Färbeeffizienz bei 67 ± 13%. Um die Funktionalität der gefärbten Zellen zu überprüfen wurde deren Endozytose von DiLDL untersucht.
Nach 48 h lag der Wert bei ca. 93% und nach 96 h bei 90%. Hinzu kam, dass nach 48 h 39,3% des
111In-Isotops noch inkorporiert war, und nach 96 h noch 22% in den EPC’s detektiert wurde (AICHER et al. 2003).
Weitere Isotope, die für Kinetik-Untersuchungen herangezogen werden sind 99mTc, welches eine HWZ von 6 h besitzt und das Isotop 64Cu (Kupfer) mit einer HWZ von 12,7 h (ADONAI et al.
2002). Laut Botti et al. liegt die Vitalität von T-Lymphozyten für 111In-oxin bei 90% und für 99mTc (Technicum) bei 85% (BOTTI et al. 1997). 64Cu ist jedoch nur schwer zu bekommen und daher nur wenigen Forschungseinrichtungen zugänglich (BRENNER et al. 2004). 2004 injizierten Hofmann et al. sowohl angereicherte CD34+-Zellen als auch unselektierte KMZ, welche allesamt mittels 18F- FDG markiert waren, intravenös oder intracoronar 6 Patienten. Hierbei stellte sich heraus, dass 99%
des applizierten radioaktiven Moleküls zellgebunden war. Die Vitalität der markierten Zellen lag zwischen 92% und 96% (HOFMANN et al. 2005). Brenner et al. erreichten aber im Gegensatz hierzu bei der Färbung von EPC’s und HPC’s („Haematopoietic Progenitor Cell”) nur eine Effizienz von jeweils 10% und verwiesen aufgrund der geringen HWZ von 18F-FDG (110min) und einer hohen Eliminationsrate innerhalb der ersten Stunde auf mögliche Nachteile bei Kinetikuntersuchungen hin (BRENNER et al. 2004).
2.2.5. Homing/Kinetik von Stammzellen
Nach und nach richteten die Studien ihr Augenmerk auch auf die Mechanismen zwischen den applizierten Zellen und des Myokardgewebes, welche das Homing der Stammzellen oder Vorläuferzellen beeinflussen. Laut Orlic et al. ermöglichen 2 oder mehrere Wege das Homing der Stammzellen in das verletzte Gewebe. Eine der Hypothesen besagt, dass Zellnekrosen, wie durch das Infarzieren des Myokards verursacht, Cytokine oder sonstige Botenstoffe aussenden, welche Stammzellen aus dem Knochenmarkpool mobilisieren. Zusätzlich würde das verletzte Gewebe Rezeptoren oder Liganden entwickeln, welche das Homing und die Adhäsion der Stammzellen ermöglichen bzw. vereinfachen und die Infiltration der Stammzellen würde letztendlich in eine gewebsabhängige Differenzierung enden. Eine andere Theorie besagt, dass Stammzellen fortwährend im Blut zirkulieren und nur im Moment der Gewebsverletzung aus dem Blut austreten und in das verletzte Gewebe einwandern (ORLIC et al. 2002).
Mehrere Rezeptor-Liganden-Paare rückten somit in den Fokus der kardiovaskulären Stammzellforschung. C-kit, ein Tyrosin-Kinase-Rezeptor wird durch seinen Liganden SCF („Stem Cell Factor“) reguliert. SCF mRNA („messenger-Ribonucleic Acid“) wird in adulten myokardialen Fibroblasten und Makrophagen exprimiert (FRANGOGIANNIS et al. 1998; PATELLA et al.
1998), und könnte somit theoretisch für die Migration der Stammzellen in das beschädigte Myokard eine gewisse Rolle spielen. Eine intensive inflammatorische Reaktion nach MI bedingt eine lokale Anhäufung von Mastzellen (SPERR et al. 1994; DETEN et al. 2002), welche positiv für CD117 sind, dem humanen Äquivalenten zu c-kit. Dies deutet daraufhin, dass Homing-Signale kurz nach einem myokardialem Gewebsschaden ausgesandt werden (ORLIC et al. 2002).
Ein weiteres Liganden-Rezeptor-Paar sind CXCR4 und SDF-1 („Stromal Cell-Derived Factor-1“).
Laut Orlic et al. scheint CXCR4 als Chemokin-Rezeptor zu fungieren, und dass sein Ligand SDF-1 eine wichtige Rolle bei der Gefäßneubildung (SALVUCCI et al. 2002) und Hämatopoese spielt (ZOU et al. 1998; YOUN et al. 2000; LAPIDOT 2001).
Ma et al. untersuchten den zeitlichen Verlauf der myokardialen SDF-1-Expression nach experimentellem MI bei Ratten. Mit Hilfe von RT-PCR („Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction”) und Western Blot wurde die SDF-1-Konzentration nach 1, 2, 4, 8 und 16 Tagen post operationem gemessen. Hierbei wurde ersichtlich, dass SDF-1 in den ersten 4 Tagen deutlich verstärkt exprimiert wird bei den infarzierten Tieren als in der vergleichbaren Sham-operierten Gruppe, wobei ein deutlicher Peak am 1.Tag nach MI festgestellt wurde. Ähnlich verhielt es sich mit der detektierten Anzahl intravenös transplantierter MSCs, welche zu identischen Zeitpunkten appliziert wurden. Die Herzen wurden jeweils 3 Tage nach Injektion der Zellen im Myokard quantifiziert genauso wie die Kapillardichte. Auch hier konnte jeweils ein deutlicher Peak am 1.
Tag festgestellt werden, wobei die Signifikanz im Vergleich zur Sham-Gruppe bis zum 4. Tag erhalten blieb. Die Parallelen zwischen den zeitlichen Verläufen in der SDF-1-Untersuchung und des Homings von MSCs lässt eine Schlüsselrolle von SDF-1 beim Homing applizierter Zellen vermuten (MA et al. 2005).
Manche Studien legten dar, dass SCF die Expression von CXCR4 auf humanen CD34+- Vorläuferzellen hochreguliert und so deren Antwort durch den Liganden SDF-1 verstärkt (PELED et al. 1999). Noch etwas unklar ist die Rolle von G-CSF („Granulocyte-Colony Stimulating Factor“), welches Stammzellen oder Vorläuferzellen aus dem KM mobilisiert (BODINE et al.
1994), da KMZ keinen spezifischen G-CSF-Rezeptor exprimieren (ORLIC et al. 1995). Dies deutet
auf einen indirekten Mechanismus hin, da eine positive Wirkung auf das Homing von KMZ in infarziertes Gewebe unbestritten ist.
2001 z.B. wurde von Orlic et al. bei Mäusen zunächst die Milz entfernt und 2 Wochen später täglich über 5 Tage Ratten-SCF und humanes G-CSF subkutan injiziert. Anschließend wurde die LAD ligiert und SCF und G-CSF für weitere 3 Tage verabreicht. Als Kontrollgruppen fungierten splenektomierte infarzierte Tiere und Sham-operierte Tiere, welche eine Pufferlösung injiziert bekamen. Es wurde wie auch in früheren Studien ein bis zu 250-facher Anstieg von lin-/c-kit+- Zellen im peripheren Blut festgestellt, welcher bei den Kontrollgruppen nicht beobachtet wurde.
Hinzu kam bei dieser Studie eine ausserordentliche Überlebensrate der Zytokin-behandelten Versuchsgruppe. 73% erreichten das Versuchsende am 27.Tag, wohingegen nur 17% der unbehandelten Tiere den Versuch über den kompletten Zeitraum von 27 Tagen beendeten. Es konnte auch neuformiertes Myokardgewebe bei den Zytokin-behandelten Tieren im Gegensatz zu den unbehandelten Gruppen festgestellt werden. Jenes neuformierte Myokardgewebe entsprach 76
± 11% des Infarktgebietes, wobei Myozyten ca. 61% ausmachten, neue Gefäße ca. 12% und andere Komponenten ca. 3%. Herzleistungsparameter wie z.B. LVEF verbesserten sich ebenfalls signifikant in den Zytokin-behandelten Gruppen (114% höher nach 26 Tagen gegenüber der Kontrollgruppe) (ORLIC et al. 2001b).
Asahara et al. konnten nachweisen, dass eine Gewebsischämie verursacht durch Ligatur der A.
femoralis oder LAD ebenfalls das Homing von EPCs aus dem KM ins periphere Blut und weiter in die ischämischen Gewebe mitverursacht. Hierfür wurden subletal bestrahlten Mäusen genetisch markierte KMZ appliziert, welches nach Versuchsende u.a. als neuformierte vaskuläre Endothelzellen in den betreffenden Ischämiebereichen detektiert werden konnte (ASAHARA et al.
1999). Ein ähnliches Ergebnis konnte auch in einer humanmedizinschen Studie festgestellt werden.
Täglich wurden Patienten mit akutem MI und Patienten mit atypischer Angina pectoris über mehrere Tage Blut entnommen. Bei den MI-Patienten konnte ein deutlicher Anstieg am 7. Tag post MI von CD34+-Zellen festgestellt werden. Von den untersuchten Zytokinen wies nur VEGF einen signifikanten Anstieg der MI-Patienten im Vergleich zu den Kontrollgruppen im Blutplasma auf.
Eine Korrelation zwischen der Anzahl zirkulierender CD34+-Zellen und des VEGF-Plasmawertes läßt zumindest eine Interaktion der beiden Parameter vermuten (SHINTANI et al. 2001).
Die Rolle von VEGF und dessen Tyrosin-Kinase-Rezeptor ist dagegen inzwischen gut beschrieben (RISAU u. FLAMME 1995; ORLIC et al. 2002). Kamihata et al. konnten 2001 bei Minipigs nach
intramyokardialer Injektion von mononuklearen KMZ oder einer Pufferlösung direkt nach Ligatur der LAD einen Anstieg der VEGF-mRNA nach 1 Tag feststellen, welcher jedoch nach 7 Tagen auf das Ausgangsniveau zurückfiel. 3 Tage nach der Zelltransplantation konnte ein signififkanter Anstieg von IL-1β (Interleukin-1β) festgestellt werden. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass applizierte KMZ zumindest indirekt für eine Neovaskularisierung verantwortlich sind (KAMIHATA et al. 2001), da IL-1β die Expression von VEGF und dessen Rezeptor auf koronare mikrovaskulären Endothelzellen induziert (MARUYAMA et al. 1999).
Bei in-vitro-Experimenten konnte ein Anstieg von VEGF und MCP-1 („Macrophage Chemoattractant Protein-1“) in KM-Medium festgestellt werden (FUCHS et al. 2001). MCP-1 ist ein wichtiger Mediator, welcher für die Arteriogenesis benötigt wird, ein Prozeß bei dem bestehende Blutgefäße vergrößert werden (ITO et al. 1997).
Um das Zusammenspiel zwischen VEGF und MNCs näher zu beschreiben, wurden zunächst von Hiasa et al. entweder eine Ligatur der LAD oder eine Sham-Operation bei Mäusen durchgeführt.
Direkt anschließend wurden MNCs oder MNCs + neutralisierende VEGF-Antikörper intravenös appliziert. Zusätzlich wurde einigen Tieren lösliches humanes Plasmid intramuskulär appliziert, welches für den Flt-1 VEGF-Rezeptor (s-Flt-1) kodiert. Als Kontrolle dienten intravenös appliziertes PBS oder Kontroll-IgG (Immunglobulin G) und intramuskulär appliziertes nichtkodierendes Plasmid. 2 Tage nach Versuchsbeginn wurden die Tiere getötet. Tiere, welche MNCs und VEGF-Antikörper injiziert bekommen hatten, wiesen einen größeren Infarkt auf als Tiere, welche nur MNCs appliziert bekommen hatten. IgG hingegen verursachte keinerlei Veränderungen der Infarktgrößen. Ebenso verminderte das sFlt-1-Plasmid die Infarktverbesserungen, welche bei alleiniger MNC’s-Therapie auftraten. In der VEGF-Ak- und der sFlt-1-Gruppe konnten keine Veränderungen bezüglich des gemessenen Blutdrucks oder der Kapillardichte festgestellt werden. Somit konnte die Schlußfolgerung gezogen werden, dass applizierte MNC indirekt über die Ausschüttung von VEGF eine Reduzierung der Infarktgröße bewirken könnten (HIASA et al. 2004).
Um die Verteilungsmuster verschiedener Applikationswege von mesenchymalen Stromazellen zu bewerten applizierten Gao et al. radioaktiv markierte mesenchymale Stromazellen über die V.
femoralis, A. femoralis und direkt intraperitoneal in Ratten. Mehrere Studien zeigten, dass selbst 48 h nach Injektion, sowohl i.a. als auch i.v., das Maximum der Radioaktivität in der Lunge vorzufinden war. Dies führten Gao et al. auf die Größenunterschiede der Lungengefäße (ca. 14µm)
und der Zellen (20-30µm) zurück. Daher wurde den Tieren vor den intravaskulären Injektionen der Vasodilatator Nitroprussid verabreicht. Die Mäuse wurden 15 min nach Injektion und 48 h nach Infusion gemessen. 15 min nach Transplantation konnte bei den mit Nitroprussid behandelten Tieren im Vergleich zur Kontrollgruppe eine schnellere Verteilung von der Lunge in die Leber beobachtet werden. 48 h nach Zellapplikation wurde die Radioaktivität für alle 3 Applikationswege vorrangig in der Leber gemessen, wobei bei den intravaskulären Injektionen hohe Mengen in Niere und Lunge detektiert wurden. Somit könnte evtl. auch die Verabreichung vasodilatatorischer Mittel vor intravasaler Zellapplikation das Homing der Zellen zum Myokard postitv beeinflussen, da die Form der Applikation und somit der Weg über die Blutbahn einen starken Einfluss auf das Homing und letztendlich auf die Kinetik der applizierten Zellen besitzt (GAO et al. 2001).
Einen ähnlichen Versuchsaufbau benutzten Aicher et al. Hier wurden humane EPCs aus peripherem Blut mittels 111In markiert und Ratten 24 h nach Ligatur der LAD intravenös oder intraventrikulär appliziert. Im Laufe der gesamten 96 h konnte keine signifikante Veränderung des radioaktiven Verteilungsmuster festgestellt werden, da Scanneraufnahmen sowohl direkt nach Injektion, als auch 24 h, 48 h und 96 h post applicationem jeweils 70% der Radioaktivität in Leber, Milz und Nieren offenbarten. 96 h nach intravenöser Transplantation wurde die Radioaktivität des Myokardgewebes in Verhältnis zu derjenigen der Skelettmuskeln gesetzt. Hierbei ergab sich ein Verhältnis von 1,02 ± 0,19 bei den Sham-operierten Tieren und 2,03 ± 0,37 bei den infarzierten Tieren. Bei der intraventrikulären Injektion stieg dieses Verhältnis von 2,69 ± 1,54 bei den Sham-operierten auf 4,70 ± 1,55 bei den infarzierten Tieren an. Wenn auch nur eine geringe Zahl applizierter Zellen im Myokardgewebe detektiert werden konnte, zeigte diese Studie jedoch wiederum, dass eine Gewebsläsion, wie in diesem Fall eine Infarzierung, das Homing applizierter Zellen stark beeinflußt (AICHER et al. 2003).
In dem Versuchsaufbau von Ciulla et al. konnten mittels PKH26 markierte Zellen 7 Tage nach intravenöser Gabe nur im ischämischen Myokard detektiert werden. 68,75% der untersuchten Gewebeschnitte enthielten im Schnitt 8 rot fluoreszierende Zellen, wohingegen in der Milz in 62,5% der Gewebeschnitte nur durchschnittlich 3 Zellen detektiert wurden. Ebenso konnte die Co- Lokalisierung von PKH26 und CD34+/Thy-1-Zellen das Einwandern von hämatopoetischen Vorläuferzellen ins geschädigte Herzgewebe über die periphere Blutbahn darlegen (CIULLA et al.
2003).
In einer Studie von Schuster et al. konnte der Zusammenhang zwischen der Anzahl applizierter CD34+-Zellen (mit 12% Angioblasten) und den positiven Veränderung der Herzleistung dargelegt werden. Sowohl die Kapillardichte als auch die Größe der neuformierten Kapillaren waren proportional zur Menge der intravenös applizierten Zellen. Ebenso verhielt es sich mit der Menge und der Mitoseaktivität der Kardiomyozyten am Randgebiet des vernarbten Bereiches und der sonographisch dargestellten Herzleistungsverbesserung (SCHUSTER et al. 2004).
Abb. 2 Zusammenfassung möglicher Mechanismen der Stammzelltherapie zur myokardialen Regeneration (WOLLERT u. DREXLER 2005).
Status
Risikofaktoren, Alter
Dosierung, Applikationsmethode Kombination mit Cytokinen Zellmodifikation mittels Gentransfer Anzahl und funktionale Kapazität für:
Mobilisierung aus dem KM Transplantierung
Viabilität nach Transplantation Transdifferenzierung
Ausschütten parakriner Faktoren
Stamm-/Vorläuferzellen Proliferation
Parakrine Effekte
Parakrine Effekte
“Engraftment”
Transdifferenzierung
Zellfusion
Vaskularisierung
Myokardiale Funktion ↑↑↑ ↑
(systolisch, diastolisch)
Angina ↓↓↓ ↓ Herzversagen ↓↓↓ ↓ Rekrutierung
ansässiger Stammzellen
Apoptose von Kardiomyozyten ↓↓↓↓ Rekrutierung ansässiger Stammzellen
Kardiomyozytenproliferation
Myozytenanzahl ↑↑↑ ↑ (elektromechanische Verbindung)
Matrix Granulationsgewebe
Bindegewebs- zusammensetzung
