des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf
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Präkonditionierung der Rattenleber durch Ginkgo Biloba Extrakt (Egb 761) vor warmer Ischämie und Reperfusion
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Dana Krägenau
aus Hamburg
Hannover 2005
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Gerhard Breves Prof. Dr. Xavier Rogiers
1.Gutachter: Prof. Dr. Gerhard Breves
2. Gutachter: Prof. Dr. Klaus Otto
Tag der mündlichen Prüfung: 14.11.2005
Meinen Eltern in Liebe und Dankbarkeit
1. Einleitung... 13
1.1 Allgemeine Vorbemerkung... 13
1.2 Ischämie und Reperfusion...15
1.2.1 Allgemeines... 15
1.2.2 Pathomechanismen der Ischämie und Reperfusion...15
1.3 Hitzeschockprotein-70 (HSP-70)... 20
1.3.1 Allgemeines... 20
1.3.2 Struktur und Funktion von HSP-70...21
1.4 Early Growth Response-1 (Egr-1)……… 26
1.4.1 Allgemeines... 26
1.4.2 Struktur und Funktion von Egr-1... 26
1.5 Ginkgo Biloba Extrakt 761 (Egb 761)... 28
1.6 Vorarbeiten... 31
2. Fragestellung... 32
3. Material und Methoden... 34
3.1 Tierversuchsgenehmigung... 34
3.2 Versuchstiere und Versuchstierhaltung... 34
3.3 Versuchsdurchführung... 34
3.3.1 Narkose... 34
3.3.2 Operation... 35
3.3.3 Zeitpunkt und Dosierung der Egb Gabe... 39
3.3.4 Probennahme... 39
3.4.2 Modell 2 : Intravenöse Applikation von Egb 761, 2 Stunden
vor Ischämie... 41
3.5 Messparameter... 43
3.5.1 Vitalparameter... 43
3.5.2 Reflexspektrophotometrie... 43
3.5.3 Laborchemische Analysen... 43
3.5.4 Molekularbiologische Untersuchungen zur Bestimmung der HSP-70 und Egr-1 mRNA-Expression... 44
3.5.4.1 RNA-Isolierung und RNA-Messung... 44
3.5.4.2 Northern-Blot...……….………... 45
3.5.4.3 Primer...… 49
3.5.4.4 Hybridisierungssonden... 49
3.5.4.5 Hybridisierung... 51
3.5.4.6 Nachweis der markierten RNA... 52
3.5.4.7 Auswertung des Northern-Blot... 53
3.6 Statistische Auswertung... 54
4. Ergebnisse... 55
4.1 Modell 1: Intravenöse Applikation von Egb 761, 20 Minuten vor Reperfusion... 55
4.1.1 Reflexspektrophotometrie... 55
4.1.2 Leberenzyme (AST und ALT)... 57
4.1.3 HSP-70 mRNA-Expression... 60
4.1.4 Egr-1 mRNA-Expression... 62
4.2 Modell 2: Intravenöse Applikation von Egb 761, 2 Stunden vor Ischämie... 64
4.2.1 Leberenzyme (AST und ALT)... 64
5. Diskussion... 71
6. Zusammenfassung / Summary... 80
7. Literaturverzeichnis... 84
schadens... 16
Abb. 2: Darstellung der wichtigsten Pathomechanismen des Reperfusions- schadens... 19
Abb. 3: Schematiche Darstellung der Egb 761 Herstellung... 28
Abb. 4: Strukturformel von Ginkgolid... 29
Abb. 5: Strukturformel von Bilobalid... 29
Abb. 6: Ginkgo Biloba Baum……….. 30
Abb. 7: Darstellung der zu- und abführenden Lebergefäße... 36
Abb. 8: Abgeklemmte Arterie und Vene des linken Leberlappens... 37
Abb. 9: Perfundierte und freipräparierte Leber in einer sterilen Petrischale... 38
Abb.10: Gel im Gelprinter... 47
Abb.11: Schematische Darstellung des Northern-Blot... 48
Abb.12: Filter im Gelprinter... 49
Abb.13: Reflexspektrophotometrische Messung der intrahepatischen Sauer- stoffsättigung im linken Leberlappen nach 1 Std. Ischämie und 4 Std. (A) bzw. 6 Std. (B) Reperfusion (Mittelwert; +/-Standartabweichung). V.I. – vor Ischämie, n.I. – direkt nach Ischämieinduktion, n.R.– direkt nach Reperfusion, n. 4h R. / n. 6h R. – nach 4 Std. / 6 Std. Reper- fusion... 55
Abb.14: Serum-AST nach 1 Std. warmer Ischämie und 2, 4, 6 bzw. 12 Std. Reperfusion mit (+) / ohne (-) Egb 761 entsprechend Modell 1. Darstellung der Werte als Mittelwert; +/- Standartabweichung (SD)... 58
Abb.15: Serum-ALT nach 1 Std. warmer Ischämie und 2, 4, 6 bzw. 12 Std. Reperfusion mit (+) / ohne (-) Egb 761 entsprechend Modell 1. Darstellung der Werte als Mittelwert; +/- Standartabweichung (SD)... 59
dem relativen mRNA-Anstieg gegenüber der Kontrollgruppe.
Darstellung der Werte der repräsentativen Pools... 60 Abb.17: Egr-1 mRNA-Expression im linken Leberlappen nach 1 Std. warmer
Ischämie und 2, 4, 6 bzw. 12 Std. Reperfusion mit (+) / ohne (-) Egb 761. Qualitative (A) und quantitative Analyse (B) entsprechend dem relativen mRNA-Anstieg gegenüber der Kontrollgruppe.
Darstellung der Werte der repräsentativen Pools... 62 Abb.18: Serum-AST nach Ischämie und Reperfusion. Die Egb 761- bzw.
NaCl-Applikation erfolgte 2 Std. vor Ischämie/Reperfusion.
Darstellung der Werte als Mittelwert; +/- Standartabweichung... 65 Abb.19: Serum-ALT nach Ischämie und Reperfusion. Die Egb 761- bzw.
NaCl-Applikation erfolgte 2 Std. vor Ischämie/Reperfusion.
Darstellung der Werte als Mittelwert; +/- Standartabweichung... 66 Abb.20: Qualitative Northern-Blot-Analyse der HSP-70 mRNA-Expression
2 Std. nach Egb 761- bzw. NaCl-Applikation und 2 Std. nach
Ischämie/Reperfusion... 67 Abb.21: HSP-70 mRNA-Expression nach präischämischer Egb 761- bzw.
NaCl-Gabe und Ischämie/Reperfusion. Relativer mRNA-Anstieg
gegenüber der Kontrollgruppe Egb (-) ohne Ischämie/Reperfusion... 68 Abb.22: Qualitative Northern-Blot-Analyse der Egr-1 mRNA-Expression 2 Std.
nach Egb 761- bzw. NaCl-Applikation und 2 Std. nach Ischämie/
Reperfusion... 69 Abb.23: Egr-1 mRNA-Expression nach präischämischer Egb 761- bzw.
NaCl-Gabe und Ischämie/Reperfusion. Relativer mRNA-Anstieg
gegenüber der Kontrollgruppe Egb (-) ohne Ischämie/Reperfusion... 70
Tab. 2: Gruppe B (Versuchsgruppe, mit Egb 761)... 41 Tab. 3: Gruppe C (Kontrollgruppe ohne Ischämie/Reperfusion, ohne Egb 761)... 41 Tab. 4: Gruppe D (Versuchsgruppe ohne Ischämie/Reperfusion, mit Egb 761)... 42 Tab. 5: Gruppe E (Kontrollgruppe mit Ischämie/Reperfusion, ohne Egb 761)... 42 Tab. 6: Gruppe F (Versuchsgruppe mit Ischämie/Reperfusion, mit Egb 761)... 42 Tab. 7: Serum-AST (7a) und -ALT (7b) nach 1 Std. warmer Ischämie und
2, 4, 6 bzw. 12 Std. Reperfusion mit (+) / ohne (-) Egb 761 (Mittelwert;
Standardabweichung (SD)... 57 Tab. 8: Serum-AST und -ALT vor und 2 Std. nach Egb 761 (Egb (+)- bzw.
NaCl (Egb (-)-Applikation und 2 Std. nach Ischämie und Reperfusion (Mittelwert; Standartabweichung (SD)... 64
Abb. Abbildung
ALT Alanin-Amino-Transferase AP alkalische Phosphatase AP-1 Aktivatorprotein-1
AST Aspartat-Amino-Transferase ATP Adenosin-5´-triphosphat
cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure (-acid) DIG Digoxigenin
DNA Desoxyribonukleinsäure (-acid)
EDTA Ethylen-Diamin-tetra-Essigsäure (-acid) Egb761 Ginkgo Biloba Extrakt 761
Egr Early Growth Response ET-1 Endothelin-1
GOT Glutaminsäure-Oxalessigsäure-Transaminase GPT Glutaminsäure-Pyruvat-Transaminase
h Stunde
HSE Hitzeschockelement HSF Hitzeschockfaktor HSP Hitzeschockprotein/-e IEGs Immediate early genes IL-1β Interleukin-1β
I/R Ischämie/Reperfusion K Kalium
kDa Kilodalton kg Kilogamm LB Loading Buffer LPO Lipidperoxidation
mg Milligramm
ml Milliliter
mRNA messenger Ribonukleinsäure (-acid) MW Mittelwert
n Anzahl
Na Natrium
NaCl Natriumchlorid NF-κB nukleärer Faktor- κB NO Stickstoffmonoxid
PAF Plättchen aktivierender Faktor PCR Polymerase-Kettenreaktion PDGF platelet-derived growth factor
® eingetragener Markenname RB running buffer
rd. rund
RNA Ribonukleinsäure (-acid)
SB Samplebuffer
SD Standartabweichung SDS Sodiumdodecylsulfat sog. so genannte
Std. Stunde
TNF-α Tumornekrosefaktor-α UV ultraviolett
V. Vena
XD Xanthindehydrogenase XO Xanthinoxidase
ZVK zentraler Venenkatheter
1. Einleitung
1.1 Allgemeine Vorbemerkung
Die zeitlich begrenzte Organischämie bei Lebertransplantationen oder bei komplizierten Leberresektionen, die eine passagere Unterbrechung des Blutflusses erfordern (Pringle-Manöver), triggert während der postischämischen Reperfusion organspezifische pathophysiologische Reaktionen, die wesentlich die postoperative Organfunktion beeinflussen.
Normothermische (warme) Ischämie wird von der Leber schlecht toleriert und führt relativ rasch zu einem Absterben von Hepatozyten (MCKEOWN et al. 1988;
CALDWELL-KENKEL et al. 1989). Während der sauerstoffreichen Reperfusions- phase wird die letale Zellschädigung durch Aktivierung von Kupffer-Zellen, Freisetzung reaktiver Sauerstoffradikale, lysosomaler Enzyme und verschiedener Cytokine weiter verstärkt (JAESCHKE et al. 1993; JAESCHKE 1998). Potenziert werden diese ischämie/reperfusionsbedingten Reaktionen durch Expression von Adhäsionsmolekülen und konsekutiver Adhäsion von Leukozyten und Thrombozyten (JAESCHKE 1994; LENTSCH et al. 2000).
Durch Wiedererwärmung nach kalter Ischämie (Organkonservierung) oder normothermer Ischämie hervorgerufene Zell- bzw. Organschäden sind nach wie vor von bedeutender klinischer Relevanz nach Lebertransplantationen, ausgedehnten Leberresektionen oder traumatischen Ereignissen mit hypovolämischem Schock (BILZER u. GERBES 2000). Die Folgen des Ischämie/Reperfusionsschadens reichen von lokalen Leberschäden über organische Dysfunktion bis hin zum Leberversagen (JAESCHKE 1998).
Vor diesem Hintergrund spielt das genaue Verständnis der während Ischämie/Reperfusion ablaufenden zellulären Mechanismen und die Suche nach neuen Therapieansätzen eine wichtige Rolle. Ziel dieser Ansätze ist die Begrenzung der Zellschäden und daraus folgend die Minimierung schwerer Komplikationen nach Lebertransplantationen und Leberresektionen.
Die Freisetzung reaktiver Sauerstoffradikale wird in der Pathogenese des Reper- fusionsschadens als wesentlich erachtet und durch das protektive Potenzial einiger Antioxidantien bestätigt (MARUBAYASHI et al. 1986; VONHAECKE et al. 1991;
VIVOT et al. 1993; KUSUMOTO et al. 1995; BILZER et al. 1999). Eine antioxidative Therapie steht jedoch wegen potenzieller Nebenwirkungen oder hoher Kosten in der Klinik noch nicht zur Verfügung.
Vor diesem Hintergrund soll im Rahmen dieser Arbeit die Wirkung des Antioxydans Egb 761 auf den Ischämie/Reperfusionsschaden, mit besonderer Betrachtung der HSP-70 mRNA- und Egr-1 mRNA-Expression, untersucht werden.
1. 2 Ischämie und Reperfusion
1.2.1 Allgemeines
Die Unterbrechung des Blutflusses zu einem Organ oder Gewebe (Ischämie) und die sich anschließende Wiederdurchblutung (Reperfusion) ist ein komplexer patho- physiologischer Prozess und führt zu einer akuten inflammatorischen Antwort. Diese verursacht signifikante Zellschäden und Organdysfunktionen. Insbesondere lösen freie Radikale eine komplexe Serie von biochemischen und physiologischen Ereignissen aus, die zu solchen Dysfunktionen führen können (SCHOENIGER et al.
1992; BZEIZI et al. 1997). Die Zellschäden in den verschiedenen Organen können temporär oder permanent auftreten, da die funktionellen Beeinträchtigungen reversibel sind, bis die Insulte eine bestimmte Schwelle überschritten haben (CAJONE et al. 1971; DELVA et al. 1984). Warme Ischämie der Leber spielt vor allem bei Leberresektionen, bei der die Blutzufuhr lediglich temporär unterbrochen wird, eine bedeutende Rolle. Es kommt hier vor allem zu einer Schädigung der parenchymalen Zellen (Hepatozyten) (MCKEOWN et al. 1988; CALDWELL-KENKEL et al. 1989).
1.2.2 Pathomechanismen der Ischämie und Reperfusion
Ischämie
Infolge einer Ischämie kommt es zu einer Hypoxie, die ihrerseits zu einer ver- minderten Zellatmung und in dessen Folge zu einer verminderten oxidativen Phosphorylierung und somit zu einem Mangel an Adenosintriphosphat (ATP) führt.
Durch diesen ATP-Mangel werden verschiedene Prozesse in Gang gesetzt. So werden etwa die energieabhängigen metabolischen Abläufe und Transportprozesse nachhaltig gestört und letztlich die Ionenhomöostase beeinträchtigt. Insbesondere ist die Na+/K+-ATPase betroffen die für den energieabhängigen Transport von Na+ und K+ auf ATP angewiesen ist. In der Folge wird das osmotische Gleichgewicht der Zelle
gestört, und es kommt zum Einströmen von Wasser und somit zur Zellschwellung.
Ein weiterer Vorgang ist die Entstehung einer intrazellulären Azidose, da Energie in Form von ATP nur durch anaerobe Glykolyse bereitgestellt werden kann. Letztlich führt die Degradation von ATP auch zu einer Akkumulation von Hypoxantinen, die die Umwandlung von Xanthindehydrogenase (XD) zu Xanthinoxidase (XO) begleitet.
Bei einer späteren Reperfusion, die wieder Sauerstoff zuführt, katalysiert diese Xanthinoxidase die Umwandlung der Hypoxanthine zu Xanthin und Harnsäure, wobei reaktive Sauerstoffradikale gebildet werden, die wiederum für verschiedene Zellschäden verantwortlich gemacht werden (CLAVIEN et al. 1992) (Abb.1).
O2
ATP-Verlust
Hypoxanthinakkumulation Wassereinstrom
XD → XO Störung des Na+/K+-Transports
Zellschwellung
Abb.1: Darstellung der wichtigsten Pathomechanismen des Ischämieschadens.
(Quelle: Eigene Darstellung)
Hypoxie
anaerobe Glycolyse
Azidose
Harnsäure + Xanthin
Radikale
Reperfusion
Die Reperfusion hat zwei gegensätzliche Effekte auf die Stressantwort. Zum einen werden Metaboliten für die Synthese der zytoprotektiven Stressproteine (z.B. HSP- 70, HSP-71, HSP-72, HSP-85) geliefert, zum anderen werden reaktive Oxygene (z.B. Superoxid-, Hydroxyl-, Peroxidradikale und Nitritoxide) erzeugt, die zelluläre Schäden verursachen. Solche reaktiven Oxygene, die die Hepatozyten schädigen, können von intra- und extrazellulär kommen. Intrazelluläre reaktive Oxygene werden in der Leber zum einen durch Xanthinoxidase im Zytosol und zum anderen durch das Elektronentransportsystem in den Mitochondrien bereitgestellt. Extrazelluläre Oxy- gene werden durch Neutrophile und Kupffer-Zellen (Makrophagen der Leber) erzeugt. Dabei ist darauf hinzuweisen, dass die Hepatozyten durch eine anti- oxydative Kapazität in der Lage sind, diese ungünstigen Effekte zu entschärfen (JAESCHKE et al. 1988).
Jaeschke et al. zeigten, dass die Leberschädigung durch Reperfusion in zwei Phasen eingeteilt werden kann (JAESCHKE 1991; JAESCHKE u. FARHOOD 1991;
JAESCHKE et al. 1991) (Abb.2).
In der frühen Phase sind Produkte der Komplementaktivierung an der Aktivierung von Kupffer-Zellen beteiligt (JAESCHKE et al. 1993). Diese Phase ist durch einen Kupffer-Zellen induzierten oxidativen Stress charakterisiert. Dabei führt die Kupffer- Zellenaktivierung und die Ausschüttung von reaktiven Sauerstoffradikalen (Super- oxidanionen und Hydrogenperoxide) zu einer Schädigung der Parenchymzellen (Hepatozyten). Dagegen spielt die durch die reaktiven Radikale ausgelöste Lipid- peroxidation vermutlich nur eine untergeordnete Rolle (MATHEWS et al. 1994). Die Aktivierung der Kupffer-Zellen führt zudem zur Produktion und Ausschüttung von proinflammatorischen Cytokinen, wie Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) und Interleukin- 1β (IL-1β) (WANNER et al. 1996; JAESCHKE 2000). Zudem wird der Plättchen aktivierenden Faktor (PAF) vermehrt ausgeschüttet (ZHOU et al. 1992) und die redoxsensitiven Transkriptionsfaktoren Aktivatorprotein-1 (AP-1) und nukleärer Faktor-ĸB (NF-ĸB) in Endothelzellen und Hepatozyten aktiviert (JAESCHKE 1998;
KIEMER et al. 2000). NF-ĸB ist ein Hauptregulator der Genexpression für eine große Anzahl von proinflammatorischen Cytokinen, CXC Chemokinen (d.h. IL-8 und
Homologe) und Gefäßzelladhäsionsmolekülen (LENTSCH et al. 2000). Auch wird in der frühen Phase der Reperfusion verstärkt der potente Vasokonstriktor Endothelin- 1 (ET-1) gebildet. Zum selben Zeitpunkt ist die Konzentration des vasodilatierend wirkenden Stickstoffmonoxids (NO) sehr niedrig, sodass es aufgrund des ent- standenen Ungleichgewichts zum mirovaskulären Perfusionsversagen kommen kann (JAESCHKE 1998; SERRACINO-INGLOTT et al. 2001).
In der späten Reperfusionsphase beginnt eine komplexe inflammatorische Reaktion, in deren Mittelpunkt die Aktivierung von neutrophilen Leukozyten sowie die Frei- setzung von Entzündungsmediatoren und die Bildung von reaktiven Sauerstoff- radikalen steht, deren Zusammenspiel zu einer Schädigung und einem Funktions- verlust des betroffenen Organs führt (JAESCHKE 1996). Die Freisetzung und Bildung von Entzündungsmediatoren sowie Adhäsionsmolekülen wird durch freie Radikale, deren Anzahl infolge der sauerstoffreichen Reperfusion signifikant steigt, induziert (BZEIZI et al. 1997). Diese Moleküle reagieren mit zirkulierenden Leuko- zyten und Thrombozyten, führen zu Zelladhäsion und Hyperkoagulopathie (CLAVIEN et al. 1992), und es kommt zur Freisetzung weiterer Radikale und Proteasen.
Bei dem in der späten Phase durch Neutrophile verursachten Hepatozytenschaden sind also drei Schritte zu unterscheiden. Zunächst die Aktivierung der Neutrophilen sowie deren Akkumulation in den Lebergefäßen, gefolgt von der Transmigration in das Interstitium und letztlich die Adherenz an die Parenchymzellen (JAESCHKE u.
SMITH 1997).
Die rollenden und adherenten Leukozyten in den terminalen Lebervenuolen führen zudem zu einer Erhöhung der Leberenzyme (Aspartat-Amino-Transferase (AST) und Alanin-Amino-Transferase (ALT) und zu Gewebezerstörung (SAWAYA et al.1999).
Die Zunahme der Leberenzyme im Blut nach Revaskularisation spiegelt die parenchymale Schädigung der Leber während der vorherigen Periode der Ischämie und während der frühen Phase der Reperfusion wider (SAAD et al. 1995).
Superoxidanion;
Hydrogen Peroxid
= reaktive Oxygene
Proinflammatorische Cytokine
TNF-α;IL-1β
Expression von
Adhäsionsmolekülen auf
Gefäßendothelzellen Ausschüttung von
CXC Chemokinen
↑ Adhäsionsmoleküle der Selektinfamilie;
P-Selektin
Endothelzellapoptose
Chemokinproduktion (Endothel; Parenchymzellen)
Neutrophilenaktivierung und Adhäsion;
chemotaktischer Gradient
Neutrophile:
Rollen, Stillstand, Transmigration in das Interstitium
Oxidantien und Proteasen Hepatozyten- schaden
Hepatozyten- schaden Kupffer-
Zelle
Plättchen- und Neutrophilenadhäsion
Abb.2: Darstellung der wichtigsten Pathomechanismen des Reperfusionsschadens.
(Quelle: Eigene Darstellung) f
r ü h e P h a s e
s p ä t e P h a s e
1.3 Hitzeschockprotein-70 (HSP-70)
1.3.1 Allgemeines
Bereits in den 1960er Jahren wurde die so genannte Hitzeschockantwort nachge- wiesen. So entdeckte RITOSSA bereits 1962 die so genannten "Puffs" (Aufblähun- gen), die sich nach einer Temperaturerhöhung an den Riesenchromosomen in den Speicheldrüsen von Drosophilalarven bildeten. Mit diesen Puffs wurde zum ersten Mal eine Genexpression als Antwort auf Stress nachgewiesen (RITOSSA 1962).
Dass die hitzeinduzierte Puffbildung mit einer steigenden mRNA-Synthese und einer bestimmten Gruppe von Proteinen korreliert, zeigten TISSIERE et al. 1974. Aufgrund des auslösenden Faktors (thermischer Stress) wurden letztgenannte als Hitze- schockproteine bezeichnet (CRAIG u. CROSS 1991; KREGEL u. MOSELEY 1996).
In den folgenden Jahren wurden HSP in vielen verschiedenen Organismen (Archae- und Eubakterien, niederen Pilzen, Pflanzen, Tieren und Menschen) nachgewiesen, sodass heute davon ausgegangen wird, dass sie ubiquitär vorkommen (HIGHTOWER, 1993).
Ein Temperaturanstieg induziert somit in verschiedenen Zellen unterschiedliche Proteine, die Hitzeschockproteine (HSP) genannt werden (SAAD et al. 1995). Neben Hitze sind inzwischen aber auch eine Reihe weiterer Stressfaktoren (etwa Alkohole, Schwermetalle, UV-Licht und Xenobiotika) bekannt, die ebenfalls zur HSP-Expres- sion führen (HIGHTOWER u. WHITE 1981). Ebenso werden Hitzeschockproteine durch Aminosäureanaloge, Oxidationsagentien, einige Gifte, Anoxie, Gewebe- schäden (SCHLESINGER et al. 1982; LINDQUIST 1986) und Ischämie/ Reperfusion (MARBER et al. 1995, RADFORD et al. 1996) induziert. Hitzeschockproteine sind folglich intrazelluläre Proteine, die mit einer generalisierten Antwort der Zellen auf Stress assoziiert sind (GASBARRINI et al. 1998). Insofern ist die damals gewählte Bezeichnung Hitzeschockprotein ungenügend, da sie nur einen Teilbereich der aus- lösenden Faktoren reflektiert. Heute zählt man die HSP von daher zur Gruppe der Stressproteine bzw. zur Gruppe der Chaperone (Begleitproteine), da sie auch im ungestressten Zustand wichtige Funktionen in der Zelle erfüllen (HIGHTOWER u.
WHITE 1981).
Chemisch werden die verschiedenen HSP in Abhängigkeit von ihrem Molekular- gewicht (in kDa) in vier Klassen eingeteilt (HSP-60, HSP-70, HSP-90 und "kleine"
HSP mit einem Molekulargewicht zwischen 15 und 30 kDa), wobei jede Klasse aus mehreren Isoformen besteht. Charakteristisch für die verschiedenen HSP-Klassen ist, dass sie mit 60-78% übereinstimmenden Aminosäuren innerhalb einer Klasse und mit etwa 40% zwischen den Klassen eine hohe Homologie aufweisen (LINDQUIST u. CRAIG 1988; EDWARDS et al. 1990).
Wichtig ist die Unterscheidung von konstitutiven und stressinduzierten Formen. Erst- genannte erfüllen auch im ungestressten Zustand eine Funktion in den Zellen und sind daher permanent vorhanden. Demgegenüber werden die anderen Formen nur unter Stress gebildet (BIERKENS et al. 1998).
1.3.2 Struktur und Funktion von HSP-70
Das Hitzeschockprotein mit dem Molekulargewicht 70000 wird HSP-70 genannt.
HSP-70 ist das wohl bekannteste und am besten charakterisierte Hitzeschockprotein.
Da HSP-70 für die folgende Untersuchung eine übergeordnete Rolle spielt, soll dieses Hitzeschockprotein nachfolgend näher dargestellt werden.
HSP-70 kommt in zahlreichen Zellkompartimenten (wie Mitochondrien, Cytosol und dem Endoplasmatischen Retikulum) vor (NOVER 1991). Eine erhöhte Expression wurde bisher in Endothelzellen (ZHU et al. 1994), vaskulären glatten Muskelzellen (ZHU et al. 1995) und auf der Oberfläche von zirkulierenden Leukozyten nachgewiesen (FEHRENBACH u. NIESS 1999).
Bei HSP-70 handelt es sich um Adenosintriphosphatasen, die aus einer hochkon- servierten nucleotidbindenden aminoterminalen Domäne mit hoher Affinität zu Adenosin-5´-triphosphat (ATP) und einer carboxyterminalen Domäne bestehen.
Letztere ist zu Interaktionen mit verschiedenen Proteinstrukturen befähigt. Die aminoterminale Domäne besteht aus 385 und die carboxyterminale Domäne aus 145 Aminosäuren (FLAHERTY et al. 1990; ZHU et al.1996; MUN et al. 2000).
Funktion im ungestressten Zustand
In verschiedenen Studien wurde gezeigt, dass HSP-70 an der korrekten Faltung entstehender und partiell denaturierter Proteine, am Zusammenbau oligomerer Proteinstrukturen und am Transport von Proteinen durch Membranen beteiligt sind.
Von daher zählen sie zur Gruppe der molekularen Chaperone, die, zusammen mit weiteren Chaperonen und Enzymen, Interaktionen zwischen partiell denaturierten Proteinen unterbinden, die sonst zu irreversiblen Inaktivierungen durch Aggregat- bildung führen (RUTHERFORD u. ZUKER 1994; HARTL 1996). Nach heutiger Auffassung bindet HSP-70 mit der carboxyterminalen Domäne Proteinsubstrate und ändert oder bewahrt dadurch deren Konformation oder erlaubt Interaktionen mit anderen Proteinen. Die Hydrolyse von ATP ist Vorraussetzung für die Freisetzung der gebundenen Proteinsubstrate (LANGER u. NEUPERT 1991; HARTL et al. 1992).
Regulierung der Hitzeschockantwort
Die Aktivierung der Hitzeschockgene erfolgt durch den so genannten Hitzeschock- faktor (HSF), der an einem Abschnitt der DNA stromaufwärts vom Promotor des Hitzeschockgens bindet. Diese Bindungsstelle wird als Hitzeschockelement (HSE) bezeichnet. In ungestressten Zellen liegt der HSF in einer monomeren Form, die nicht an DNA binden kann, sowohl im Cytoplasma als auch im Zellkern vor. Der HSF bildet als Antwort auf Stress aktive Trimere, die im Zellkern akkumulieren, an das HSE binden und dadurch die Transkription der Hitzeschockgene aktivieren. Beendet wird die Hitzeschockantwort durch die Umwandlung der trimeren Form des HSF in die monomere Form (MORIMOTO et al. 1992).
Die Aktivität des HSF wird durch HSP, welches in Abwesenheit von Stress bevorzugt mit HSF-Monomeren interagiert und somit die Bildung der trimeren Form verhindert, reguliert. Durch Stress steigt die Konzentration an missgefalteten und aggregierten Proteinen, welche mit dem HSF um die HSP konkurrieren. Infolgedessen steigt die Menge an freiem Aktivator, es kommt zur Trimerbildung und somit zur Transkription der Hitzeschockgene. Nach der Reparatur der missgefalteten und aggregierten Proteine können die HSP wieder mit dem HSF interagieren, und die Hitzeschock- antwort wird beendet (CRAIG u. GROSS 1991; MORIMOTO et al. 1992).
Funktion im gestressten Zustand
Durch negative chemische oder physikalische Bedingungen kommt es aufgrund der Schwächung von bipolaren Bindungen und der daraus resultierenden Exposition von hydrophoben Gruppen zur Denaturierung von Proteinen. Es entstehen missgefaltete und aggregierte Proteine (sog. "Proteotoxizität") (HIGHTOWER 1991).
Insbesondere durch potenziell schädigende Ereignisse wie Ischämie und Reperfusion wird die HSP-70 mRNA-Expression erhöht (DOI et al. 2001; SCHUTTE et al. 2001), wobei diese in der postischämischen Reperfusionsphase vor allem durch Sauerstoffradikale, z.B. Hydrogenperoxide und Superoxide (SCHIAFFONATI et al. 1994), Denaturierung von Proteinen und eine erhöhte Druckbelastung (BERNELLI-ZAZZERA et al. 1992) induziert wird. Allerdings muss für die Aktivierung der HSP-70- Gene eine bestimmte Schwelle der molekularen Schädigung erreicht werden (TACCHINI et al. 1993). Der ischämische Hepatozytennukleus behält somit die Fähigkeit, bestimmte Gene, wie z.B. HSP-70, hoch zu regulieren (BROUGHAN et al. 1996), wobei die mRNA-Synthese mit der Expression von HSP-70 korreliert (FUJIO et al. 1987).
Die Biosynthese von HSP-70 wird also in der gestressten Zelle verstärkt, um diese vor den proteotoxischen Schäden zu schützen. Dabei wandert cytoplasmatisches HSP-70 zum jeweiligen Zellkern und bindet an Pre-Ribosomen und andere Proteinkomplexe, um diese vor Denaturierung zu schützen (GETHING u.
SAMBROOK 1992). Außerdem verhindert HSP-70 die Bildung von unlöslichen Proteinaggregaten bzw. löst schon vorhandene Proteinaggregate auf. Zudem wird schon geschädigten Proteinen eine korrekte Faltung und somit die Erhaltung ihrer biologischen Aktivität ermöglicht (ELLIS 1990). Zusätzlich werden irreversibel geschädigte Proteine zum Abbau zu den Lysosomen transportiert (CHIANG et al.1989).
Die Zellen werden durch eine erhöhte HSP-70 Induktion sowohl zum Zeitpunkt der Schädigung als auch innerhalb eines bestimmten Zeitraums nach der Expression durch eine Toleranzsteigerung der Zellen gegenüber Stress geschützt. Es wurde gezeigt, dass die Produktion von HSP, ausgelöst durch eine kurze Hyperthermie,
den Organismus gegen eine zweite, sonst lethale, Hyperthermie schützen kann, was als Thermotoleranzphänomen bezeichnet wurde (LINDQUIST u. CRAIG 1988).
Spätere Studien zeigten, dass der protektive Effekt der Hitzeschockproteine nicht nur positiv in Bezug auf Thermotoleranz wirkt, sondern auch zu einer verbesserten Resistenz des Organismus gegen allgemeinen Umweltstress wie Ischämie, Hypoxie, Tumornekrosefaktor und oxidativen Stress führt. Hierbei wurde vermutet, dass HSP oxidative Schäden, die durch freie Radikale verursacht werden, während der frühen Phase der Reperfusion reduziert (BURDON et al. 1987). Zudem werden HSP-70 zytoprotektive Eigenschaften zugesprochen, da es denaturierte Proteine bindet und deren Reparatur oder Neusynthese fördert (DOI et al. 2001). Nach TOMOHIKO et al.
(1997) hat die Expression von Stressproteinen zwei wichtige Aspekte. Zum einen die zytoprotektiven Eigenschaften gegen noxische Bedingungen und zum anderen die Markereigenschaft der zellulären Schäden. Er legt nahe, dass die Akkumulation von HSP-70 mRNA die Rate der Proteinsynthese reflektieren könnte und dass die vermehrte Produktion von HSP-70 Proteinen von den gestressten Zellen zur Funktionserhaltung benötigt wird. Folglich würde der HSP-70 mRNA Level die Stärke der zellulären Schäden reflektieren.
FUJIO et al. (1987) untersuchten die Induktion von HSP in Rattenlebern, die einer Hyperthermie, einer Ischämie oder einer partiellen Hepatektomie ausgesetzt waren.
HSP-70 wurde beim Anstieg der Körpertemperatur besonders stark induziert, wobei das Maximum 2,5 Stunden nach Hyperthermie erreicht war, in ungestressten Tieren aber nicht gefunden wurde. Die Ischämie führte zu einer Induktion von HSP-70, HSP-71 und HSP-85 mRNA. HSP-70 und HSP-71 mRNA wurden 2,5 Stunden nach einer 1-stündigen Ischämie induziert und nahmen danach ab. HSP-85 wurde dagegen bis 6 Stunden nach der Ischämie induziert. Bei der Leberregeneration, 6 Stunden nach erfolgter partieller Hepatektomie, waren die mRNA für HSP-70, HSP- 71 und HSP-85 induziert und befanden sich nach 24 Stunden wieder auf dem Kontrolllevel. HSP-70, -71 und -85 wurden jedoch bei Ischämie und Regeneration der Leber in einem geringeren Umfang induziert als bei Hyperthermie.
Auch THEOCHARIS et al. (2000) stellten zum Zeitpunkt maximaler Leberschädigung eine starke Expression von Hitzeschockproteinen besonders in den Hepatozyten in der Nähe von nekrotischen Gebieten fest.
BROUGHAN et al. (1996) zeigten, dass der Level von HSP-70 mRNA während der Ischämie steigt, seinen Peak bei 5 Stunden Reperfusion erreicht und sich nach 24 Stunden Reperfusion wieder am Ausgangsniveau einpendelt.
Diese Ergebnisse legen nahe, dass Hitzeschockproteine nicht nur protektiv gegen verschiedene Arten von Stress wirken, sondern auch physiologische Funktionen bei Wachstum und Entwicklung von Tieren haben. Sie sind folglich sowohl für den Schutz gegen Gewebe- und Zellschäden als auch für Regenerationsprozesse und die Zellproliferation von Bedeutung.
DOI et al. (2001) konnten den durch partielle Hepatektomie verursachten Leber- schaden durch ischämische Präkonditionierung verringern. Hierbei scheint die durch die Ischämie verursachte Induktion von HSP-70 die Leber zu schützen. Die Induktion von HSP-70 mRNA durch hyperthermische Präkonditionierung geht mit einer verbesserten sinusoidalen Perfusionsrate und reduzierter Leukozytenadherenz nach Ischämie und Reperfusion einher (TERAJIMA et al. 2000). Auch MATSUMOTO et al.
(2001) brachten ihr durch hyperthermische Präkonditionierung verlängertes Transplantatüberleben mit der Induktion von HSP-70 in Verbindung.
1.4 Early Growth Response-1 (Egr-1)
1.4.1 Allgemeines
Early Growth Response-1 (Egr-1) wurde zuerst von Sukhatme und Kollegen identi- fiziert und als ein im Zellkern lokalisierter transkriptioneller Regulator beschrieben (SUKHATME et al 1988).
Egr-1 (auch genannt Zif268, NGFI-A, Krox24 oder TIS8) wurde aufgrund seiner Induktion innerhalb von Minuten nach einem Stimulus und seines schnellen Zerfalls oft innerhalb von Stunden als ein "immediate-early response"-Protein terminiert (YAN et al. 2000 a). Die "immediate-early"-Gene (IEGs) kodieren Proteine, die in Beziehung zu Regenerationsprozessen stehen (TSUCHIYA 1998). So zeigten PENG et al. (1999) beispielsweise, dass Egr-1-Aktivierung ein frühes Ereignis während der Leberregeneration ist und einen regulatorischen Stimulus für andere "immediate- early"-Gene liefert.
Das Egr-1-Gen ist in die Regulation von Mitose und Differenzierung involviert (SUKHATME et al. 1988). Seine physiologische Rolle manifestiert sich in der Antwort auf Umweltherausforderungen (YAN et al. 2000 a). So können eine Reihe von Stimuli, z.B. Wachstumsfaktoren oder vasokonstriktorische Peptide, die Egr-1- Expression induzieren (GASHLER u. SUKHATME 1995).
Auch beschreiben BAE et al. (1999) eine gesteigerte Expression von Egr-1, eine gesteigerte DNA-Bindungsaktivität des Egr-1-Proteins sowie einen erhöhten Level des Egr-1-Proteins bei Hypoxie.
1.4.2 Struktur und Funktion von Egr-1
Early Growth Response-1 (Egr-1) gehört zur "immediate-early"-Genfamilie. Es kodiert einen "zinc-finger" Transkriptionsfaktor, der als Antwort auf "shear"-Stress, Hypoxie oder Gefäßschäden hochreguliert wird (YAN et al. 1999; CHIU et al. 1999).
Um die Genexpression zu verändern, bindet Egr-1 mit seinen drei "zinc-fingern" an die DNA. Jede "zinc-finger" Domaine beinhaltet eine α-Helix und eine antiparallele β- Helix, die durch ein zinc-Ion und eine Reihe von hydrophoben Resten zusammen
gehalten werden (KHACHIGIAN and COLLINS 1998). Das Egr-1-Protein kann die Promotorregion anderer Gene an einer spezifischen GC-reichen Erkennungs- sequenz binden und die Transkription aktivieren oder inaktivieren (CAO et al. 1990).
Dabei erkennen die "zinc-finger" eine Sequenz, die in den Promotorregionen einer Vielzahl von Genen identifiziert wurde (SUKHATME et al. 1988). Die genaue Zielsequenz lautet GCGGGGGCG (SUKHATME 1990).
Durch schnelle Ischämie-vermittelte Aktivierung von Egr-1 werden Chemokine, Adhesionsrezeptoren, Prokoagulatoren und permeabilitätsverwandte Gene hoch- reguliert (YAN et al. 2000 b).
YAN et al. (1999) zeigten an kultivierten mononukleären Phagozyten, die einem Sauerstoffmangel ausgesetzt wurden, eine zeitabhängige Induktion von Egr-1 mRNA. Durch die Hypoxie wurde eine Kaskade induziert, die in der Aktivierung der Egr-1-Transkription, die um das 10fache zunahm, resultierte. Obwohl die Aktivierung von Egr-1 nicht spezifisch für hypoxieassoziierten Zellstress ist, könnte sie doch durch das Rekrutieren verschiedener zellulärer Effektormechanismen eine beträchtliche Wirkung auf das Ergebnis ischämischer Ereignisse haben.
KHACHIGIAN et al. (1996) konnten an endothelialen Wundrändern eine deutlich induzierte Egr-1-Expression innerhalb von 30 Minuten messen. Die dabei induzierte Egr-1 mRNA war noch nach zwei Stunden nachweisbar und nahm dann zeit- abhängig ab, was die transiente Induktion der Egr-1-Expression durch das Endothel bei Schädigung verdeutlicht. Die Egr-1-Expression ging hier einer erhöhten Expression von PDGF (platelet-derived growth factor) voran, welches in die re- generativen Ereignisse nach Gefäßschädigung verwickelt ist. Diese Ergebnisse zeigen also die Verantwortlichkeit von Egr-1, die Expression von PDGF und anderen potenten Mediatoren in mechanisch geschädigten Endothelzellen hoch zu regulieren.
Verschiedene andere Gene, dessen Produkte chemotaktische, proliferative und thrombotische Ereignisse, die mit Gefäßschäden assoziiert sind, beeinflussen, sind potenzielle Ziele von Egr-1. So werden etwa Gene für Wachstumsfaktoren, Hormone, Cytokine, Lipoproteine und Adhesionsmoleküle durch Egr-1 reguliert (KHACHIGIAN and COLLINS 1998).
Egr-1 ist somit ein bifunktionales Protein, das in der Lage ist, die transkriptionelle Aktivität von verschiedenen Zielgenen während der Kaskade der Gewebe- regeneration entweder zu aktivieren oder zu supprimieren (KHACHIGIAN u.
COLLINS 1998).
1.5 Ginkgo Biloba Extrakt 761 (Egb 761)
Ginkgo Biloba Extrakt 761 (Egb 761) ist ein pflanzliches Extrakt aus den getrockneten Blättern des Ginkgo Biloba Baumes (Abb.6); eines bis 40 Meter hoch werdenden Fächerblattbaumes (TEUSCHER 1997). Es findet in der traditionellen chinesischen Medizin schon seit Jahrhunderten therapeutische Anwendung.
Die Herstellung des Extraktes wird in der folgenden Abbildung 3 schematisch dargestellt.
Abb.3: Schematische Darstellung der Egb 761 Herstellung
(Quelle: Eigene Darstellung in Anlehnung an DE FEUDIS 1991) Wasserlösliche Komponenten
Ginkgo-biloba-Blätter
Gesamtextrakt
Aktive Komponenten/
kondensierte polyphenole Verbindungen
Egb 761
Extraktion mit Aceton/Wasser
Entfernung der stark fett- löslichen Komponenten
Anreicherung der aktiven Komponenten
Entfernung der kondensierten polyphenol Verbindungen
Bei Egb 761 handelt es sich folglich um ein mit Aceton-Wasser hergestelltes Extrakt, aus dem die lipophilen Bestandteile (Alkylphenole, Ginkgolsäure) abgetrennt werden und von dem durch mehrfache Flüssig-flüssig-Extraktion schließlich ein Produkt resultiert, das folgende wirksamkeitsbestimmende Hauptkomponenten enthält (DE FEUDIS 1991):
• 24% Flavonoide (Flavonglykoside)
• 3,1% Ginkgolide
• 2,9% Bilobalide
• 5-10% organische Säuren.
Die Pharmakokinetik wurde tierexperimentell untersucht und bei Ratten eine Resorbtionsrate von 60% festgestellt. Die akute und chronische Toxizität ist sehr gering (WICHTL 1997). Unter den vielen pharmakologischen Befunden sind die Erhöhung der Hypoxietoleranz an Maus und Ratte, die protektive Wirkung bei Ischämie an der Ratte, hier vor allem durch Ginkgolid A und B sowie Bilobalid (Abb.
4 und 5), die Radikalfängereigenschaften des Extraktes Egb 761 und die Wirkung der Ginkgolide als PAF-Antagonisten besonders hervorzuheben (WICHTL 1997).
Abb.4: Strukturformel von Ginkgolid Abb.5: Strukturformel von Bilobalid
Durch antioxidative Eigenschaften und das Entfernen freier Hydroxyl- und Peroxyl- radikale (DEFEUDIS 1991; CLOSTRE 1999; MAITRA et al. 1995; YOSHIKAWA et al. 1999; CHEN et al. 1999), Superoxid-Anionen (PINCEMAIL et al. 1989) sowie Nitridoxide (MARCOCCI et al. 1994, VARGA et al. 1999) werden Zellschäden, die durch freie Radikale hervorgerufen werden, reduziert. Auch die Lebermitochondrien werden gegen Schäden durch Anoxie/Reoxygenation geschützt (SASTRE et al.
1998; DU et al. 1999), und der oxidative Stress in Makrophagen und Endothelzellen wird verringert (RONG et al. 1996). Egb 761 antagonisiert außerdem den plättchen- aktivierenden Faktor (PAF) und verursacht eine vaskuläre Relaxation (YOSHIKAWA et al. 1999).
Egb 761 wirkt folglich sowohl protektiv bei Ischämie/Reperfusionsschäden als auch bei oxidativem Stress (DU et al. 1999). Ginkgo Biloba wurde bereits erfolgreich zur Therapie zerebraler und peripherer Durchblutungsstörungen sowie bei Netzhaut- schäden eingesetzt (CLOSTRE 1999), und es ist bekannt dafür, cardiale, zerebrale und pulmonale Schäden zu beeinflussen (DE FEUDIS 1991). Ergebnisse von HARAMAKI et al. (1994) zeigen, dass Egb 761 gegen cardiale Ischämie/Re- perfusionsschäden schützt und dass diese schützenden Effekte abhängig sind von der antioxidativen Eigenschaft. Ergebnisse bezüglich positiver Effekte zur Verminderung von Reperfusionsschäden bei der Leber liegen bereits vor (TOPP et al. 2001).
Abb.6: Ginkgo Biloba Baum
1.6 Vorarbeiten
Über die Anwendung von Egb 761 als Antioxydans bei warmer Ischämie und Reperfusion der Leber ist bislang nur wenig berichtet worden. In Studien von TOPP et al. (2001) und SCHUTTE et al. (2001) konnte gezeigt werden, dass die intravenöse Gabe von Egb 761 zu einer Verbesserung der postischämischen Mikrozirkulation und einer reduzierten Leukozytenadhärenz nach warmer Ischämie und Reperfusion der Rattenleber führt. Allerdings korrelierten diese positiven Effekte nicht mit einer Verminderung des Reperfusionsschadens, sondern nach 2 Stunden Ischämie und Reperfusion zeigten sich eher erhöhte Leberenzyme.
Des Weiteren ließ sich in diesen Studien eine gesteigerte HSP-70- und Egr-1- Expression nach Egb 761-Gabe und Ischämie/Reperfusion nachweisen (SCHUTTE et al. 2001; TOPP et al. 2001).
Bislang konnte nicht eindeutig geklärt werden, ob der Trend erhöhter Transminasen nach Egb 761-Gabe und Ischämie/Reperfusion der Leber einen passageren Effekt einer verbesserten Mikrozirkulation darstellt und die erhöhte HSP-70- und Egr-1- Expression ein Nebeneffekt von Egb 761 ist, oder ob alles zusammen Ausdruck einer gesteigerten Organschädigung ist.
2. Fragestellung
Versuchsreihe 1 (Modell 1)
Hypothese: Bei der Transaminasenerhöhung nach Ischämie/Reperfusion und Egb 761-Gabe in den Studien von TOPP et al. (2001) handelt es sich nur um eine zeitlich begrenzte Erscheinung durch eine verbesserte Mikrozirkulation.
Fragestellungen:
1. Zeigt sich nach Egb 761-Gabe im Langzeitverlauf, bis 12 Stunden nach Ischämie/Reperfusion der Leber, gegenüber der Kontrollgruppe eine Verminderung der postischämischen Transaminasen?
2. Lässt sich während der 12-stündigen Reperfusionsphase ein Unterschied in der Organoxygenierung nachweisen?
3. Welchen Verlauf nimmt die HSP-70- und Egr-1-Expression in der Leber nach 2-12 Stunden Ischämie und Reperfusion mit/ohne Egb 761-Gabe?
Versuchsreihe 2 (Modell 2)
Hypothese: Egb 761 führt per se (ohne Ischämie/Reperfusion) zu einer Erhöhung der HSP-70- und Egr-1-Expression in der Leber. Nach dem Prinzip der Präkondi- tionierung könnte durch diesen Mechanismus und die zellprotektiven Eigenschaften von HSP-70 sowie die regenerativen Eigenschaften von Egr-1 eine Verminderung des Ischämie/Reperfusionsschadens durch Egb 761 erreicht werden.
Fragestellungen:
1. Ermöglicht die intravenöse Gabe von Egb 761 ohne Ischämie und Reper- fusion eine Erhöhung der intrahepatischen HSP-70- und Egr-1-Expression?
2. Vermindert die intravenöse Applikation von Egb 761 vor warmer Ischämie und Reperfusion den postischämischen Reperfusionsschaden?
3. Material und Methoden
3.1 Tierversuchsgenehmigung
Die Versuche fanden unter Aufsicht der Versuchsleitung (Dr. Stefan Topp) am Institut für Chirurgische Forschung, Abteilung für Hepatobiliäre Chirurgie und Transplantationschirurgie des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf, gemäß des Tierschutzgesetzes in der Fassung vom 25. Mai 1998 (BGBI.I S.1106, 1818) statt.
Das Amt für Gesundheit der Freien und Hansestadt Hamburg erteilte am 26.06.2000 die Genehmigung zur Durchführung dieser Versuche (Aktenzeichen G8151/591- 00.33).
3.2 Versuchstiere und Versuchstierhaltung
Als Versuchstiere dienten männliche Lewis-Inzuchtratten aus der Zucht der Charles River Wiga GmbH (Deutschland) mit einem Körpergewicht von 200 - 330g. Die Ratten wurden in Gruppen mit bis zu 5 Tieren in Käfigen des Tierstalles der Tier- haltung des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf gehalten. Sie waren dort einem Tag-/Nachtrhythmus von 12 Stunden, einer Raumtemperatur von 20°C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60% ausgesetzt. Zur Ernährung diente das Standardtrockenfutter ssniff R/M-H, extrudiert (ssniff Spezialdiäten GmbH, D-59494 Soest) und Wasser ad libitum.
3.3 Versuchsdurchführung
3.3.1 Narkose
Zur Narkoseeinleitung erhielten die Tiere eine Inhalationsnarkose in einem durchsichtigen Glasäthertopf (Äther zur Narkose, Riedel-de Haen GmbH) unter
Erhaltung der Spontanatmung. Die Vitalfunktionen in Form von Atmung, Bewegungs- verhalten und Reflexen wurden kontinuierlich beurteilt. Im Anschluss daran wurden die Tiere im Abdominal- und Cervicalbereich rasiert und diese Bereiche sorgfältig desinfiziert (Cutasept F, Bode Chemie, Hamburg). Dann erfolgte eine intraperitoneale Applikation von 2ml Chloralhydrat 4% zur Narkoseerhaltung. Bei Bedarf wurde im Verlauf der Operation mit bis zu 2ml Chloralhydrat 4% nachdosiert.
Für die kürzeren Eingriffe -wie die medikamentöse Applikation in Modell 2, zwei Stunden vor der eigentlichen Operation und für die Hepatektomie am Ende der jeweiligen Reperfusionszeit- wurde die im Glasäthertopf eingeleitete Narkose mit Äther im halboffenen System aufrechterhalten und kein Chloralhydrat appliziert.
Hierfür wurde eine mit Äther getränkte Kompresse in ein Röhrchen verbracht, welches dem Kopf des Tieres vorgelagert wurde.
3.3.2 Operation
Für die Operation, die unter sauberen, aber nicht aseptischen Bedingungen erfolgte, wurden die Tiere rücklings auf eine mit Moltex abgedeckte Korkplatte gelagert. Die Fixierung an den vier Extremitäten erfolgte atraumatisch mit Hilfe von Gummi- bändern. Zur intravenösen Medikamentenapplikation bzw. Applikation von isotoner Natrium-Chlorid-Lösung (NaCl) wurde ein zentraler Venenkatheter (ZVK) (Venen- katheter, B. Braun Melsungen AG, 0,5 x 0,9 mm) in die rechte V. jugularis gelegt.
Hierzu wurde im Halsbereich ein ca. 1cm langer Hautschnitt rechts der Medianen gemacht, der kurz vor dem Schlüsselbein endete. Nun wurde die V. jugularis dextra stumpf freipräpariert, eine kleine Inzision mit einer Mikroschere gesetzt, der Katheter vorsichtig vorgeschoben und mit Hilfe von Nahtmaterial (Seide E, 1 metric, Resorba) fixiert.
Danach erfolgte die Eröffnung des Abdomens durch eine mediane Laparotomie von caudal des Nabels bis zum Sternum. Nach Verdrängung des Intestinums erfolgte bei allen Tieren die Darstellung der zu- und abführenden Lebergefäße (Abb.7).
Li. Leberlappen Mi. Leberlappen Arterie u. Pfortader- ast d. li. Leberl.
Re. Leberlappen Caudaler Leberl.
V.portae; A.hepatica Magen
Duodenum
Abb.7: Darstellung der zu- und abführenden Lebergefäße
Ischämie/Reperfusion
Den Versuchsgruppen entsprechend wurde im Anschluss der linke Leberlappen einer 60-minütigen Ischämie und anschließender Reperfusion ausgesetzt, indem zunächst die Arterie und der Pfortaderast des linken Leberlappens nach sorgfältigem Freipräparieren mit einer Mikroklemme abgeklemmt wurden (Abb.8).
Li. Leberlappen
Mikro-Klemme Re. Leberlappen
Darmkonvolut
Abb.8: Abgeklemmte Arterie und Vene des linken Leberlappens
Während der Ischämiezeit wurde die Leber mit NaCl befeuchtet und sorgfältig mit Kompressen abgedeckt, um einer Austrocknung vorzubeugen.
Nach 60 Minuten Ischämie wurde die Klemme wieder entfernt und das Abdomen durch eine fortlaufende Naht der Bauchwand und der Haut (PGA Resorba, 2 metric, Resorba) wieder verschlossen. Der Venenkatheter wurde gezogen, die Vene ligiert und der Hautschnitt durch zwei Einzelnähte verschlossen. Nach Verschluss der Operationswunden wurde die Narkose beendet.
Die Reperfusionszeit betrug je nach Versuchsgruppe 2-12 Stunden. Am Ende der jeweiligen Reperfusionszeit wurde das Abdomen unter einer erneuten Äthernarkose wieder eröffnet. Nach Erweiterung des abdominellen Zuganges durch einen beidseitigen Subcostalschnitt zur besseren Darstellung der Leber erfolgte die NaCl- Perfusion der Leber und die Hepatektomie.
Hepatektomie
Direkt nach der letzten Blutentnahme wurde die Pfortader aufgesucht und mit Hilfe einer gebogenen Arterienklemme fixiert ohne das Gefäß abzuklemmen. Nun wurde mit einer mikrochirurgischen Schere eine kleine Inzision gesetzt und ein Katheter (Venenverweilkanüle, Ohmeda), der über ein Verbindungsstück (Luer-Lock, Connecta plus 3, Ohmeda) und ein Infusionsbesteck mit einem Beutel isotoner Natrium-Chlorid-Lösung verbunden war, vorsichtig in die Pfortader vorgeschoben.
Das Zwerchfell und die Vena Cava wurden durchtrennt und die Leber für ca. 2 Minuten mit der isotonen Natrium-Chlorid-Lösung perfundiert.
Im Anschluss wurde die Leber nach Durchtrennen der Leberbänder und aller zu- und abführender Gefäße aseptisch freipräpariert und in eine sterile Petrischale verbracht (Abb.9). Die Tiere verstarben innerhalb der Narkose, im Rahmen der Organ- entnahme.
Mi. Leberlappen Li. Leberlappen Re. Leberlappen
Abb.9: Perfundierte und freipräparierte Leber in einer sterilen Petrischale
3.3.3 Zeitpunkt und Dosierung der Egb Gabe
Ginkgo Biloba Extrakt Egb 761 (Charge 09403, Dr. Willmar Schwabe GmbH & Co, Karlsruhe) wurde den Versuchstieren entsprechend den Versuchsgruppen entweder während der Ischämiephase vor Reperfusion oder 2 Stunden vor Ischämie des linken Leberlappens intravenös über den liegenden zentralen Venenkatheter appliziert. Die Tiere erhielten 20mg/kg Körpergewicht. Hierzu wurde das Extrakt (175mg) kurz vor der Anwendung in der beigefügten Lösung (10ml Natriummonohydrogenphosphat) gelöst und das für jedes Tier errechnete Volumen über den zentralen Venenkatheter (Venenkatheter, B. Braun Melsungen AG, 0,5x0,9mm) langsam in die rechte V.
Jugularis injiziert. Den Tieren der Kontrollgruppe wurde anstatt Egb 761 eine adäquate Menge isotoner Natrium-Chlorid-Lösung appliziert.
3.3.4 Probennahme
Für weitere molekularbiologische Untersuchungen wurden vom linken Leberlappen ca. 10 3x3mm große Gewebeproben entnommen. Diese wurden umgehend in einem Nunc-Röhrchen (Nunc Cryo Tube) mittels flüssigem Stickstoff eingefroren und bei – 80°C bis zur weiteren Verarbeitung gelagert.
3.4 Versuchsgruppen
3.4.1 Modell 1: Intravenöse Applikation von Egb 761, 20 Minuten vor Reperfusion
Bei Modell 1 erfolgte die Induktion einer 60-minütigen Ischämie des linken Leber- lappens, gefolgt von 2-12 Stunden Reperfusion (Tab. 1 und 2) vor Hepatektomie. Die intravenöse Egb 761- bzw. NaCl-Applikation erfolgte langsam während der Ischämie- phase, 20 Minuten vor Reperfusion.
Gruppe A (n=16)
Kontrollgruppe zur Beurteilung von Ischämie und Reperfusion nach intravenöser NaCl-Gabe während der Ischämiephase. Die Beurteilung erfolgte durch molekular- biologische und laborchemische Untersuchungen.
Tab.1: Gruppe A (Kontrollgruppe, ohne Egb 761)
Gruppe n 60 min Ischämie Egb 761 Leberentnahme
A1 4 (+) (-) nach 2h R
A2 4 (+) (-) nach 4h R
A3 4 (+) (-) nach 6h R
A4 4 (+) (-) nach 12h R
Gruppe B (n=16)
Versuchsgruppe zur Beurteilung von Ischämie und Reperfusion nach intravenöser Egb 761-Gabe während der Ischämiephase. Die Beurteilung erfolgte durch mole- kularbiologische und laborchemische Untersuchungen.
Tab.2: Gruppe B (Versuchsgruppe, mit Egb 761)
Gruppe n 60 min Ischämie Egb 761 Leberentnahme
B1 4 (+) (+) nach 2h R
B2 4 (+) (+) nach 4h R
B3 4 (+) (+) nach 6h R
B4 4 (+) (+) nach 12h R
3.4.2 Modell 2: Intravenöse Applikation von Egb 761, 2 Stunden vor Ischämie
Bei Modell 2 erfolgte die Induktion einer 60-minütigen Ischämie des linken Leberlappens, gefolgt von 2 Stunden Reperfusion (Tab. 5 und 6) vor Hepatektomie.
Die intravenöse Egb 761- bzw. NaCl-Applikation erfolgte langsam, 2 Stunden vor Ischämie und Reperfusion. Im Intervall zwischen Egb 761-Gabe und Induktion der linksseitigen Leberischämie wurde keine Narkose durchgeführt.
Gruppe C (n=4) und Gruppe D (n=4)
Versuchsgruppen zur Beurteilung, ob Egb 761 per se zu einer HSP-70 oder Egr-1- Induktion führt. Die Hepatektomie erfolgte 2 Stunden nach i.v.-Applikation ohne Ischämie und Reperfusion. Die Beurteilung erfolgte durch molekularbiologische und laborchemische Untersuchungen.
Tab.3: Gruppe C (Kontrollgruppe ohne Ischämie/Reperfusion, ohne Egb 761)
Gruppe n Egb 761 Ischämie/Reperfusion Leberentnahme
C 4 (-) (-) nach 2h
Tab.4: Gruppe D (Versuchsgruppe ohne Ischämie/Reperfusion, mit Egb 761)
Gruppe n Egb 761 Ischämie/Reperfusion Leberentnahme
D 4 (+) (-) nach 2h
Gruppe E (n=4) und Gruppe F (n=4)
Versuchsgruppen zur Beurteilung, ob die präischämische Gabe von Egb 761 zu einer Reduktion des hepatischen Ischämie/Reperfusionsschadens führt. Die Hepa- tektomie erfolgte nach Ischämie und 2 Stunden Reperfusion. Die Beurteilung erfolgte durch molekularbiologische und laborchemische Untersuchungen.
Tab.5: Gruppe E (Kontrollgruppe mit Ischämie/Reperfusion, ohne Egb 761)
Gruppe n Egb 761 Ischämie/Reperfusion Leberentnahme
E 4 (-) (+) nach 2h R
Tab.6: Gruppe F (Versuchsgruppe mit Ischämie/Reperfusion, mit Egb 761)
Gruppe n Egb 761 Ischämie/Reperfusion Leberentnahme
F 4 (+) (+) nach 2h R
3.5 Messparameter
3.5.1 Vitalparameter
Die Beobachtung der Spontanatmung und der Narkosetiefe in Form von Reflexen erfolgte kontinuierlich.
Die Körpertemperatur wurde kontinuierlich alle 10 Minuten rektal gemessen.
3.5.2 Reflexspektrophotometrie
Die Reflexspektrophotometrie wurde zur Beurteilung der postischämischen Organoxygenierung und zur Verifizierung der Ischämiephase angewendet. Hierzu wurde die Sonde eines von Knoefel et al. modifizierten Reflexspektrophotometers (KNOEFEL et al. 1996) direkt auf den linken Leberlappen gehalten und 3-mal die Absorbtion (zwischen 400 und 820 nm) gemessen. Die Bestimmung der Organoxygenierung erlaubt indirekt Rückschlüsse auf die Organperfusion. Die Oxygenierung des linken Leberlappens errechnete sich aus dem Mittelwert der drei erhaltenen Werte. Die 3 Messungen erfolgten jeweils kurz vor Ischämie, direkt nach Ischämiebeginn, direkt im Anschluss an die Reperfusion sowie entsprechend der Versuchsgruppen nach 2-12 Stunden Reperfusion.
3.5.3 Laborchemische Analysen
Zur Bestimmung der AST und ALT wurden bei Modell 1 vor Ischämie und am Ende der Reperfusionsphase, vor Hepatektomie nach 2, 4, 6 bzw. 12 Std. aus der V. cava Blutproben entnommen.
Bei Modell 2 erfolgte die Blutprobenentnahme über den ZVK vor Egb 761-Gabe, vor Ischämie des linken Leberlappens sowie nach 2 Stunden Reperfusion. Die Blutbestimmungen wurden im Labor der Klinischen Chemie des Universitäts- klinikums Hamburg-Eppendorf durchgeführt.
3.5.4 Molekularbiologische Untersuchungen zur Bestimmung der HSP-70 und Egr-1 mRNA-Expression
3.5.4.1 RNA-Isolierung und RNA-Messung
RNA-Isolierung
Das Prinzip der RNA-Isolierung ist die mechanische und chemische Zerstörung der Zellmembranen des Gewebes in dessen Folge die RNA freigesetzt wird. Diese wird dann reversibel an eine Membran gebunden, gewaschen und anschließend mit RNAse freiem Wasser eluiert.
Zur Isolierung der RNA wurde der Rneasy® Midi Kit (50) der Firma Quiagen (Quiagen GmbH, Hilden) sowie 40 – 250mg gefrorenes Lebergewebe verwendet.
Das Gewebe wurde bis zu diesem Zeitpunkt bei –80°C gelagert. Die Zentrifugations- schritte wurden bei Raumtemperatur und 4000 Umdrehungen pro Minute durchgeführt (Rotanta / RP Zentrifuge, Firma Hettich, Tuttlingen).
Zur RNA-Isolierung aus einer Leberprobe wurden 4ml RLT-Puffer zuzüglich 40µl β-Mercaptoethanol benötigt. Von diesem Gemisch wurden je 0,5ml mit den jeweiligen Gewebestücken homogenisiert, dann in das restliche Gemisch (3,5ml) verbracht und in einem 15ml Röhrchen (Disposable Conical Tubes, NUNC Brand Products) 10 Minuten zentrifugiert. Der sorgfältig abpipettierte Überstand wurde nun 2 Minuten mit 4ml 70%igem Ethanol in einem neuen Röhrchen mit Hilfe eines Minishakers (Minishaker, Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe) gründlich vermischt. Die Hälfte der Probe wurde nun in ein Filterröhrchen (Rneasy Midi Spin Column) pipettiert, 5 Minuten zentrifugiert und die filtrierte Flüssigkeit verworfen. Anschließend wurde dieser Vorgang mit der restlichen Probe wiederholt. Nun wurden 4ml RW1 Puffer in den Filter gegeben und 5 Minuten zentrifugiert. Wieder wurde das Filtrat verworfen, 2,5ml RPE Puffer auf den Filter gegeben und 2 Minuten zentrifugiert. Der letzte Schritt wurde wiederholt und diesmal 5 Minuten zentrifugiert. Danach wurde der Filter in ein neues Röhrchen (collection tube) verbracht und im Anschluss 200µl Rnase
freies Wasser direkt auf die Membran pipettiert. Nachdem das Röhrchen 1 Minute offen stand, wurde es für 3 Minuten zentrifugiert und der letzte Schritt wiederholt, ohne das Zentrifugat zu verwerfen. Die sich ergebenden 400µl Eluat wurden nun in, in einem Kühlelement (Eppendorf) stehende, Eppendorf-Hütchen (Safe-Lock Tubes, Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Köln) pipettiert und der RNA-Gehalt photometrisch gemessen.
Zur Herstellung der Pools wurde von den jeweils 4 Tieren einer Gruppe je 50µg RNA zusammen pipettiert und der RNA Gehalt noch einmal gemessen.
RNA-Messung
Um den RNA-Gehalt photometrisch zu bestimmen (UV-Visible Recording Spectro- photometer, UV-160A, SHIMADZU), wurde zuerst der 0-Wert mit sterilem Aqua ad injectabila (Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim) eingestellt und anschließend die Extinktion der Probe in 60facher Verdünnung gemessen. Aus den Extinktionswerten ließ sich dann die RNA-Konzentration der jeweiligen Probe berechnen.
3.5.4.2 Northern-Blot
Gelelektrophorese
Das Prinzip der Gelelektrophorese besteht darin, die RNA im Agarosegel durch Anlegen eines elektrischen Feldes nach der Größe zu trennen und anschließend mit Ethidiumbromid anzufärben.
Für die Gelelektrophorese wurden im Vorfeld 4 Puffer angesetzt.
Zur Herstellung des 10fach konzentrierten Elektrophoresepuffers (running buffer = RB) wurden 40g MOPS (SIGMA-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen), 4,05g Sodium Acetat (SIGMA-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) und 20ml 0,5 m EDTA (SIGMA- Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) in 1 Liter RNAse freiem Wasser gelöst und mit
2 m NAOH (Merck Eurolab GmbH, Hamburg) auf pH 7,0 eingestellt. Die Flasche wurde lichtgeschützt bei +4°C gelagert.
Für den 1fach konzentrierten RB wurden 100ml 10fach RB mit 900ml RNAse freiem Wasser verdünnt.
Der Probenpuffer (Samplebuffer = SB) wurde wie folgt angesetzt: 500µl deionisiertes Formamid (SIGMA-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen), 169µl Formaldehyd (SIGMA-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) und 100µl 10fach RB wurden zusammenpipettiert und bei –20°C lichtgeschützt aufbewahrt.
Für den Ladepuffer (Loading Buffer = LB) wurden 5ml 10fach RB, 3ml RNAse freies Wasser, 1,5g Ficoll 400 (SIGMA-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) und 10mg Bromphenolblau (SIGMA-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) 1 Stunde zusammen bei 37°C gelöst und anschließend im Dunkeln bei –20°C gelagert.
Die Gelelektrophoresekammer, das Tray und die Kämme (Sub-Cell GT, BIO RAD Laboratories GmbH, München) wurden zur RNAsen-Inaktivierung für 20 Minuten mit 0,1%igem DEPC (amersham pharmacia, Freiburg) behandelt.
Die Herstellung eines 1%igen Agarose-Gels fand folgendermaßen statt: 2g Agarose (NuSieve 3:1 Agarose, Biozym Diagnostik GmbH, Hess.Oldendorf) wurden in einem sterilen 500ml Erlenmeyerkolben abgewogen und 176ml RNAse freies Wasser zugegeben. Nun wurde die Flüssigkeit mehrmals in der Mikrowelle aufgekocht, bis sich alles gut gelöst hatte. Während die Flüssigkeit auf ca. 70°C abkühlte, wurden 20ml Formaldehyd, 24ml 10fach RB und 5µl 1%iges Ethidiumbromid (Merck, Eurolab GmbH, Hamburg) unter dem Abzug zusammen pipettiert und zu der abgekühlten Flüssigkeit gegeben. Die gesamte Flüssigkeit wurde durch mehrmaliges Schwenken durchmischt und luftblasenfrei in das Tray gegossen, um dann unter dem Abzug für
½ bis 1 Stunde zu polymerisieren.
Pro Probe bzw. pro Pool wurde 10µg RNA zusammen mit 7,5µl SB in ein Reaktionsgefäß pipettiert, durchmischt und für 10 Minuten bei 65°C im Thermoblock (Eppendorf Thermomixer comfort, Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Köln) erhitzt.
Anschließend wurden die Proben für 2-3 Minuten auf Eis gekühlt und dann bei 10000 Umdrehungen pro Minute und +4°C zentrifugiert (Eppendorf Centrifuge 5417R,
Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Köln). Jede Probe wurde mit 3µl LB gemischt, bei gleichen Einstellungen kurz anzentrifugiert und auf Eis gelagert.
Das erkaltete Gel wurde in der mit 1fach RB gefüllten Gelkammer platziert, und die Proben wurden in die Geltaschen pipettiert. Hierbei wurde auf jedes Gel die Probe eines Tieres aus jeder Gruppe bzw. der Pool jeder Gruppe zuzüglich einer Kontrolle aufgetragen. Daraufhin wurde die Kammer an das Power Pack P25 (Biometra, biometrische Analytik GmbH, Göttingen) angeschlossen und eine Spannung von 80 V für 1 ½ -1 ¾ Stunden angelegt.
Im Anschluss daran wurde das Gel unter UV-Licht im Gelprinter (MWG-Biotech GmbH, Ebersberg) betrachtet und zur Dokumentation fotografiert (Abb.10).
Danach wurde das Gel für den folgenden Northern-Blot auf die entsprechende Größe zurechtgeschnitten, für 10 Minuten in Aqua ad injectabilia und zweimal für 10 Minuten in 20 x SSC-Puffer (GIBCO BRL, Eggenstein) gewaschen.
Abb.10: Gel im Gelprinter
Northern-Blot
Das Prinzip des Northern-Blot beruht darauf, die im Agarosegel befindliche aufgetrennte RNA durch Kapillarkräfte aus dem Gel auf einen Filter zu transferieren.
Für den Northern-Blot (Abb.11) wurde eine Glasplatte quer über eine flache Plastikwanne gelegt, 2 Streifen Whatmanpapier (Whatman Chromatography Paper, Merck Eurolab GmbH, Hamburg) zurechtgeschnitten und so auf der Glasplatte
Gel Taschen
28S Untereinheiten der RNA 18S Untereinheiten der RNA Loading Buffer
platziert, dass sie eine doppelte Papierbrücke über der Glasplatte bildeten und an beiden Enden den Wannenboden berührten. Danach wurde die Plastikwanne mit 20fach SSC Puffer aufgefüllt und sichergestellt, dass das Whatmanpapier an beiden Seiten in den Puffer eintauchte. Luftblasen wurden beseitigt. Das Gel wurde mit den Taschenöffnungen nach unten mittig auf das auf der Glasplatte befindliche Whatmanpapier gelegt und mit Parafilm (American National Can TM, Chicago) an allen vier Seiten abgeklebt. Filterpapier (Filter Hybond-N+, amersham pharmacia, Freiburg) (Nitrocellulosemembran) wurde auf die Größe des Gels zurechtgeschnitten und Luftblasenfrei auf dem Gel platziert.
Anschließend wurden 2 Whatmanpapiere derselben Größe in 2fach SSC Puffer getränkt, auf den Filter gelegt und mit einem Stapel Zellstoff und einer weiteren Glasplatte bedeckt. Nun wurde ein 750g schweres Gewicht auf die obere Glasplatte gestellt und 24 Stunden abgewartet.
Abb.11: Schematische Darstellung des Northern-Blot (Quelle: Eigene Darstellung)
Gel
Gewicht 750g
2 Schichten Whatmanpapier, Glasplatte
Schale mit SSC-Puffer Zellstoffstapel
Filterpapier
2 Schichten Whatmanpapier, Glasplatte
Parafilm
Nach 24 Stunden wurde der Filter entnommen und die RNA im UV-Crosslinker (UVC 500, Hoefer) fixiert. Im Anschluss wurden die 18S und 28S Untereinheiten der RNA unter UV-Licht im Gelprinter auf dem Filter markiert und fotografiert (Abb.12). Bis zum weiteren Gebrauch wurde der Filter in 20fach SSC Puffer getränkt in Saranfolie (Dow) eingewickelt und im Kühlschrank aufbewahrt.
Abb.12: Filter im Gelprinter
3.5.4.3 Primer
Die Sequenz der Primer (MWG-Biotech AG, Ebersberg) für Early Growth Response Gene-1 (Egr-1) lautete 5`-AAC ACT TTG TGG CCT GAA CC- 3` für den Vorwärts- Primer und 5`-AGG TCT CCC TGT TGT TGT GG- 3` für den Rückwärts-Primer. Für Hitzeschockprotein-70 (HSP-70) wurde ein Primer (MWG-Biotech AG, Ebersberg) mit der Sequenz 5`-CAC AAG AAG GAC ATC AGC CA- 3` (Vorwärts) und ein Rück- wärts-Primer mit der Sequenz 5`-TGA TGC TCT TGT TCA GGT CG- 3` verwendet.
3.5.4.4 Hybridisierungssonden
Die Herstellung der Hybridisierungssonden erfolgte in 4 Schritten.
Zur Synthese von cDNA wurde zunächst eine RT-PCR zur Synthese von cDNA unter Verwendung des 1st Strang cDNA Synthesis Kit for RT-PCR (AMV, Roche
Filter
28S Untereinheiten der RNA 18S Untereinheiten der RNA
Loading Buffer
Diagnostics GmbH, Mannheim) durchgeführt. Hierbei vermittelt das Enzym Reverse Transkriptase die Umwandlung einer RNA-Sequenz in eine cDNA. Es wurden folgende Komponenten in einem sterilem 0,5ml Safe-Lock Reaktionsgefäß (Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Köln) gemischt: 2,0µl 10 x Reaction Buffer, 4,0µl 25 mM MgCl2 , 2,0µl Deoxynucleotide Mix, 2,0µl Oligo-p(dT)15Primer, 1,0µl RNase Inhibitor, 0,8µl AMV Reverse Transkriptase und 8,2µl RNA. Nach kurzem Ver- mischen mithilfe eines Minishakers wurde das Reaktionsgefäß in einen T3 Thermo- cycler (Biometra, biomedizinische Analytik GmbH, Göttingen) verbracht. Das PCR- Programm lief nach folgendem Muster: 10 Minuten bei 25°C, 1 Stunde bei 42 °C und 5 Minuten bei 9°C.
Als zweiter Schritt folgte eine PCR mit dem entsprechenden Primer (s.o.) zur Herstellung einer Hybridisierungssonde. Hierbei bildet die Polymerase mithilfe spezifischer Primer Kopien von DNA-Einzelsträngen. Hierzu wurde 40,75µl Aqua dest., 5µl 10fach Puffer, 1µl NTP (PCR Nucleotide Mix, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim), 1µl cDNA, 1µl Rückwärts-Primer, 1µl Vorwärts-Primer und 0,25µl Taq DNA Polymerase zusammen in ein steriles 0,5ml Reaktionsgefäß pipettiert und kurz durchmischt. Anschließend erfolgte im Thermocycler ein initialer Schritt von 3 Minuten bei 95°C, dann vierzig Zyklen bestehend aus jeweils 1 Minute bei 95°C, 1 Minute und 20 Sekunden bei 60°C und 2 Minuten bei 72°C und abschließend 10 Minuten bei 72°C.
Zur Kontrolle wurde ein DNA-Gel nach folgendem Muster hergestellt: 2,97g Agarose (NuSieve 3:1 Agarose, Biozym Diagnostik GmbH, Hess. Oldendorf) und 150ml TBE- Puffer wurden zusammen erhitzt. Nach dem Zusatz von 8µl Ethidiumbromid (zur Sichtbarmachung der DNA im UV-Licht) ließ man die Flüssigkeit auf 50-60°C abkühlen, um dann das Gel zu gießen. Zur Kontrolle wurden 10µl des PCR-Produkts, 10µl der Kontrolle und 3µl DNA Marker (DNA Molecular Weight Marker VIII, 19-1114 bp, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) in die Geltaschen pipettiert und für 30 Minuten 200 V Spannung angelegt.
In einer dritten PCR wurde die Sonde mit Digoxigenin markiert, wobei der PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) Verwendung fand. Dafür wurden 32,25µl Aqua dest., 5µl PCR Puffer mit MgCl2 10 x konzentriert, 5µl PCR DIG Probe Synthesis Mix 10fach konzentriert, 2µl Primer antisense, 5µl spez. cDNA (Sonde) und 0,75µl Enzym-Mix, Expand High Fidelity zusammenpipettiert und kurz durchmischt, um danach folgendes PCR-Programm zu durchlaufen: 3 Minuten bei 95°C, 40 Zyklen mit je 1 Minute bei 95°C, 1 Minute und 20 Sekunden bei 59°C und 2 Minuten bei 72°C und schließlich 10 Minuten bei 72°C. Zur Kontrolle wurde ein Gel mit 5µl des DIG-PCR-Produkts, 5µl der Kontrolle und 2µl des DNA-Markers hergestellt.
Als vierter und letzter Schritt erfolgte die Aufreinigung des DIG-PCR-Produkts unter Anwendung des QIAquick PCR Purification Kits (Qiagen GmbH, Hilden). Dazu wurden 45µl des DIG-PCR-Produkts in eine Safe-Lock Tube 1,5ml mit 225µl Puffer PB vermischt. Ein spin column wurde in einem 2ml collection tube platziert und die Probe hinzugegeben. Anschließend wurde 30-60 Sekunden bei 8000 rpm zentrifugiert. Das Filtrat wurde verworfen und 0,75ml Puffer PE in das spin column pipettiert. Nach erneuter Zentrifugation unter gleichen Bedingungen wurde das Filtrat entsorgt und 1 Minute bei 14000 rpm zentrifugiert. Dann wurde das spin column in eine neue 1,5ml microfuge tube platziert, 50µl Wasser hinzugegeben und 1 Minute bei 14000 r/m zentrifugiert. Das Eluat enthielt nun die aufgereinigte DNA.
In einem Kontrollgel wurde aufgereinigte und nicht aufgereinigte DNA miteinander verglichen.
Die aufgereinigte DIG-markierte Sonde wurde schließlich in 10ml DIG Easy Hyb verdünnt und bei –20°C eingefroren.
3.5.4.5 Hybridisierung
Das Prinzip der Hybridisierung besteht darin, die spezifische RNA auf dem Filter (Nitrocellulosemembran) mithilfe einer DIG-markierten DNA-Sonde, die aus einer komplementären Basensequenz zur gewünschten RNA besteht, zu markieren und sichtbar zu machen.
Der Filter wurde mit der RNA-Seite zum Lumen in einem Hybridisierungsröhrchen mit 10ml Hybridisierungspuffer (DIG Easy Hyb, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) für 1 Stunde bei 50°C unter ständigem Drehen im Hybridisierungsofen (Hybridization Ofen/Shaker, amersham pharmacia, Freiburg) prähybridisiert, um alle unspezifischen Bindungsstellen zu besetzen.
Nach Ablauf von 50 Minuten wurde die bei –20°C gelagerte Hybridisierungssonde für 10 Minuten in einem Wasserbad bei 68°C erwärmt. Anschließend wurde der Prähybridisierungspuffer verworfen und die aufgetaute Sonde zu dem Filter gegeben.
Nun wurde bei 50°C und unter ständigem Drehen im Hybridisierungsofen über Nacht hybridisiert.
Die Hybridisierungssonde wurde im Anschluss nicht verworfen, sondern für den erneuten Gebrauch wieder bei –20°C eingefroren.
3.5.4.6 Nachweis der markierten RNA
Für die Posthybridisierung wurde das DIG Wash and Block Buffer Set (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) verwendet. Die benötigten Lösungen wurden zuvor folgendermaßen angesetzt:
Wash Solution 2fach konzentriert: 0,25g SDS (Lauryl Sulfate, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) und 25ml 20fach SSC Puffer mit Wasser auf 250ml aufgefüllt;
Wash Solution 0,5fach konzentriert: 0,25g SDS und 6,25ml 20fach SSC Puffer mit Wasser auf 400ml aufgefüllt;
