3. Material und Methoden
4.2 Modell 2: Intravenöse Applikation von Egb 761, 2 Stunden
Bei Modell 2 erfolgte die Induktion einer 60-minütigen Ischämie des linken Leberlappens, gefolgt von 2 Stunden Reperfusion (Tab. 5 und 6) vor Hepatektomie.
Die intravenöse Egb 761- bzw. NaCl-Applikation erfolgte langsam, 2 Stunden vor Ischämie und Reperfusion. Im Intervall zwischen Egb 761-Gabe und Induktion der linksseitigen Leberischämie wurde keine Narkose durchgeführt.
Gruppe C (n=4) und Gruppe D (n=4)
Versuchsgruppen zur Beurteilung, ob Egb 761 per se zu einer HSP-70 oder Egr-1-Induktion führt. Die Hepatektomie erfolgte 2 Stunden nach i.v.-Applikation ohne Ischämie und Reperfusion. Die Beurteilung erfolgte durch molekularbiologische und laborchemische Untersuchungen.
Tab.3: Gruppe C (Kontrollgruppe ohne Ischämie/Reperfusion, ohne Egb 761)
Gruppe n Egb 761 Ischämie/Reperfusion Leberentnahme
C 4 (-) (-) nach 2h
Tab.4: Gruppe D (Versuchsgruppe ohne Ischämie/Reperfusion, mit Egb 761)
Gruppe n Egb 761 Ischämie/Reperfusion Leberentnahme
D 4 (+) (-) nach 2h
Gruppe E (n=4) und Gruppe F (n=4)
Versuchsgruppen zur Beurteilung, ob die präischämische Gabe von Egb 761 zu einer Reduktion des hepatischen Ischämie/Reperfusionsschadens führt. Die Hepa-tektomie erfolgte nach Ischämie und 2 Stunden Reperfusion. Die Beurteilung erfolgte durch molekularbiologische und laborchemische Untersuchungen.
Tab.5: Gruppe E (Kontrollgruppe mit Ischämie/Reperfusion, ohne Egb 761)
Gruppe n Egb 761 Ischämie/Reperfusion Leberentnahme
E 4 (-) (+) nach 2h R
Tab.6: Gruppe F (Versuchsgruppe mit Ischämie/Reperfusion, mit Egb 761)
Gruppe n Egb 761 Ischämie/Reperfusion Leberentnahme
F 4 (+) (+) nach 2h R
3.5 Messparameter
3.5.1 Vitalparameter
Die Beobachtung der Spontanatmung und der Narkosetiefe in Form von Reflexen erfolgte kontinuierlich.
Die Körpertemperatur wurde kontinuierlich alle 10 Minuten rektal gemessen.
3.5.2 Reflexspektrophotometrie
Die Reflexspektrophotometrie wurde zur Beurteilung der postischämischen Organoxygenierung und zur Verifizierung der Ischämiephase angewendet. Hierzu wurde die Sonde eines von Knoefel et al. modifizierten Reflexspektrophotometers (KNOEFEL et al. 1996) direkt auf den linken Leberlappen gehalten und 3-mal die Absorbtion (zwischen 400 und 820 nm) gemessen. Die Bestimmung der Organoxygenierung erlaubt indirekt Rückschlüsse auf die Organperfusion. Die Oxygenierung des linken Leberlappens errechnete sich aus dem Mittelwert der drei erhaltenen Werte. Die 3 Messungen erfolgten jeweils kurz vor Ischämie, direkt nach Ischämiebeginn, direkt im Anschluss an die Reperfusion sowie entsprechend der Versuchsgruppen nach 2-12 Stunden Reperfusion.
3.5.3 Laborchemische Analysen
Zur Bestimmung der AST und ALT wurden bei Modell 1 vor Ischämie und am Ende der Reperfusionsphase, vor Hepatektomie nach 2, 4, 6 bzw. 12 Std. aus der V. cava Blutproben entnommen.
Bei Modell 2 erfolgte die Blutprobenentnahme über den ZVK vor Egb 761-Gabe, vor Ischämie des linken Leberlappens sowie nach 2 Stunden Reperfusion. Die Blutbestimmungen wurden im Labor der Klinischen Chemie des Universitäts-klinikums Hamburg-Eppendorf durchgeführt.
3.5.4 Molekularbiologische Untersuchungen zur Bestimmung der HSP-70 und Egr-1 mRNA-Expression
3.5.4.1 RNA-Isolierung und RNA-Messung
RNA-Isolierung
Das Prinzip der RNA-Isolierung ist die mechanische und chemische Zerstörung der Zellmembranen des Gewebes in dessen Folge die RNA freigesetzt wird. Diese wird dann reversibel an eine Membran gebunden, gewaschen und anschließend mit RNAse freiem Wasser eluiert.
Zur Isolierung der RNA wurde der Rneasy® Midi Kit (50) der Firma Quiagen (Quiagen GmbH, Hilden) sowie 40 – 250mg gefrorenes Lebergewebe verwendet.
Das Gewebe wurde bis zu diesem Zeitpunkt bei –80°C gelagert. Die Zentrifugations-schritte wurden bei Raumtemperatur und 4000 Umdrehungen pro Minute durchgeführt (Rotanta / RP Zentrifuge, Firma Hettich, Tuttlingen).
Zur RNA-Isolierung aus einer Leberprobe wurden 4ml RLT-Puffer zuzüglich 40µl β-Mercaptoethanol benötigt. Von diesem Gemisch wurden je 0,5ml mit den jeweiligen Gewebestücken homogenisiert, dann in das restliche Gemisch (3,5ml) verbracht und in einem 15ml Röhrchen (Disposable Conical Tubes, NUNC Brand Products) 10 Minuten zentrifugiert. Der sorgfältig abpipettierte Überstand wurde nun 2 Minuten mit 4ml 70%igem Ethanol in einem neuen Röhrchen mit Hilfe eines Minishakers (Minishaker, Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe) gründlich vermischt. Die Hälfte der Probe wurde nun in ein Filterröhrchen (Rneasy Midi Spin Column) pipettiert, 5 Minuten zentrifugiert und die filtrierte Flüssigkeit verworfen. Anschließend wurde dieser Vorgang mit der restlichen Probe wiederholt. Nun wurden 4ml RW1 Puffer in den Filter gegeben und 5 Minuten zentrifugiert. Wieder wurde das Filtrat verworfen, 2,5ml RPE Puffer auf den Filter gegeben und 2 Minuten zentrifugiert. Der letzte Schritt wurde wiederholt und diesmal 5 Minuten zentrifugiert. Danach wurde der Filter in ein neues Röhrchen (collection tube) verbracht und im Anschluss 200µl Rnase
freies Wasser direkt auf die Membran pipettiert. Nachdem das Röhrchen 1 Minute offen stand, wurde es für 3 Minuten zentrifugiert und der letzte Schritt wiederholt, ohne das Zentrifugat zu verwerfen. Die sich ergebenden 400µl Eluat wurden nun in, in einem Kühlelement (Eppendorf) stehende, Eppendorf-Hütchen (Safe-Lock Tubes, Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Köln) pipettiert und der RNA-Gehalt photometrisch gemessen.
Zur Herstellung der Pools wurde von den jeweils 4 Tieren einer Gruppe je 50µg RNA zusammen pipettiert und der RNA Gehalt noch einmal gemessen.
RNA-Messung
Um den RNA-Gehalt photometrisch zu bestimmen (UV-Visible Recording Spectro-photometer, UV-160A, SHIMADZU), wurde zuerst der 0-Wert mit sterilem Aqua ad injectabila (Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim) eingestellt und anschließend die Extinktion der Probe in 60facher Verdünnung gemessen. Aus den Extinktionswerten ließ sich dann die RNA-Konzentration der jeweiligen Probe berechnen.
3.5.4.2 Northern-Blot
Gelelektrophorese
Das Prinzip der Gelelektrophorese besteht darin, die RNA im Agarosegel durch Anlegen eines elektrischen Feldes nach der Größe zu trennen und anschließend mit Ethidiumbromid anzufärben.
Für die Gelelektrophorese wurden im Vorfeld 4 Puffer angesetzt.
Zur Herstellung des 10fach konzentrierten Elektrophoresepuffers (running buffer = RB) wurden 40g MOPS (SIGMA-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen), 4,05g Sodium Acetat Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) und 20ml 0,5 m EDTA (SIGMA-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) in 1 Liter RNAse freiem Wasser gelöst und mit
2 m NAOH (Merck Eurolab GmbH, Hamburg) auf pH 7,0 eingestellt. Die Flasche wurde lichtgeschützt bei +4°C gelagert.
Für den 1fach konzentrierten RB wurden 100ml 10fach RB mit 900ml RNAse freiem Wasser verdünnt.
Der Probenpuffer (Samplebuffer = SB) wurde wie folgt angesetzt: 500µl deionisiertes Formamid (SIGMA-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen), 169µl Formaldehyd (SIGMA-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) und 100µl 10fach RB wurden zusammenpipettiert und bei –20°C lichtgeschützt aufbewahrt.
Für den Ladepuffer (Loading Buffer = LB) wurden 5ml 10fach RB, 3ml RNAse freies Wasser, 1,5g Ficoll 400 (SIGMA-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) und 10mg Bromphenolblau (SIGMA-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) 1 Stunde zusammen bei 37°C gelöst und anschließend im Dunkeln bei –20°C gelagert.
Die Gelelektrophoresekammer, das Tray und die Kämme (Sub-Cell GT, BIO RAD Laboratories GmbH, München) wurden zur RNAsen-Inaktivierung für 20 Minuten mit 0,1%igem DEPC (amersham pharmacia, Freiburg) behandelt.
Die Herstellung eines 1%igen Agarose-Gels fand folgendermaßen statt: 2g Agarose (NuSieve 3:1 Agarose, Biozym Diagnostik GmbH, Hess.Oldendorf) wurden in einem sterilen 500ml Erlenmeyerkolben abgewogen und 176ml RNAse freies Wasser zugegeben. Nun wurde die Flüssigkeit mehrmals in der Mikrowelle aufgekocht, bis sich alles gut gelöst hatte. Während die Flüssigkeit auf ca. 70°C abkühlte, wurden 20ml Formaldehyd, 24ml 10fach RB und 5µl 1%iges Ethidiumbromid (Merck, Eurolab GmbH, Hamburg) unter dem Abzug zusammen pipettiert und zu der abgekühlten Flüssigkeit gegeben. Die gesamte Flüssigkeit wurde durch mehrmaliges Schwenken durchmischt und luftblasenfrei in das Tray gegossen, um dann unter dem Abzug für
½ bis 1 Stunde zu polymerisieren.
Pro Probe bzw. pro Pool wurde 10µg RNA zusammen mit 7,5µl SB in ein Reaktionsgefäß pipettiert, durchmischt und für 10 Minuten bei 65°C im Thermoblock (Eppendorf Thermomixer comfort, Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Köln) erhitzt.
Anschließend wurden die Proben für 2-3 Minuten auf Eis gekühlt und dann bei 10000 Umdrehungen pro Minute und +4°C zentrifugiert (Eppendorf Centrifuge 5417R,
Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Köln). Jede Probe wurde mit 3µl LB gemischt, bei gleichen Einstellungen kurz anzentrifugiert und auf Eis gelagert.
Das erkaltete Gel wurde in der mit 1fach RB gefüllten Gelkammer platziert, und die Proben wurden in die Geltaschen pipettiert. Hierbei wurde auf jedes Gel die Probe eines Tieres aus jeder Gruppe bzw. der Pool jeder Gruppe zuzüglich einer Kontrolle aufgetragen. Daraufhin wurde die Kammer an das Power Pack P25 (Biometra, biometrische Analytik GmbH, Göttingen) angeschlossen und eine Spannung von 80 V für 1 ½ -1 ¾ Stunden angelegt.
Im Anschluss daran wurde das Gel unter UV-Licht im Gelprinter (MWG-Biotech GmbH, Ebersberg) betrachtet und zur Dokumentation fotografiert (Abb.10).
Danach wurde das Gel für den folgenden Northern-Blot auf die entsprechende Größe zurechtgeschnitten, für 10 Minuten in Aqua ad injectabilia und zweimal für 10 Minuten in 20 x SSC-Puffer (GIBCO BRL, Eggenstein) gewaschen.
Abb.10: Gel im Gelprinter
Northern-Blot
Das Prinzip des Northern-Blot beruht darauf, die im Agarosegel befindliche aufgetrennte RNA durch Kapillarkräfte aus dem Gel auf einen Filter zu transferieren.
Für den Northern-Blot (Abb.11) wurde eine Glasplatte quer über eine flache Plastikwanne gelegt, 2 Streifen Whatmanpapier (Whatman Chromatography Paper, Merck Eurolab GmbH, Hamburg) zurechtgeschnitten und so auf der Glasplatte
Gel Taschen
28S Untereinheiten der RNA 18S Untereinheiten der RNA Loading Buffer
platziert, dass sie eine doppelte Papierbrücke über der Glasplatte bildeten und an beiden Enden den Wannenboden berührten. Danach wurde die Plastikwanne mit 20fach SSC Puffer aufgefüllt und sichergestellt, dass das Whatmanpapier an beiden Seiten in den Puffer eintauchte. Luftblasen wurden beseitigt. Das Gel wurde mit den Taschenöffnungen nach unten mittig auf das auf der Glasplatte befindliche Whatmanpapier gelegt und mit Parafilm (American National Can TM, Chicago) an allen vier Seiten abgeklebt. Filterpapier (Filter Hybond-N+, amersham pharmacia, Freiburg) (Nitrocellulosemembran) wurde auf die Größe des Gels zurechtgeschnitten und Luftblasenfrei auf dem Gel platziert.
Anschließend wurden 2 Whatmanpapiere derselben Größe in 2fach SSC Puffer getränkt, auf den Filter gelegt und mit einem Stapel Zellstoff und einer weiteren Glasplatte bedeckt. Nun wurde ein 750g schweres Gewicht auf die obere Glasplatte gestellt und 24 Stunden abgewartet.
Abb.11: Schematische Darstellung des Northern-Blot (Quelle: Eigene Darstellung)
Gel
Gewicht 750g
2 Schichten Whatmanpapier, Glasplatte
Schale mit SSC-Puffer Zellstoffstapel
Filterpapier
2 Schichten Whatmanpapier, Glasplatte
Parafilm
Nach 24 Stunden wurde der Filter entnommen und die RNA im UV-Crosslinker (UVC 500, Hoefer) fixiert. Im Anschluss wurden die 18S und 28S Untereinheiten der RNA unter UV-Licht im Gelprinter auf dem Filter markiert und fotografiert (Abb.12). Bis zum weiteren Gebrauch wurde der Filter in 20fach SSC Puffer getränkt in Saranfolie (Dow) eingewickelt und im Kühlschrank aufbewahrt.
Abb.12: Filter im Gelprinter
3.5.4.3 Primer
Die Sequenz der Primer (MWG-Biotech AG, Ebersberg) für Early Growth Response Gene-1 (Egr-1) lautete 5`-AAC ACT TTG TGG CCT GAA CC- 3` für den Vorwärts-Primer und 5`-AGG TCT CCC TGT TGT TGT GG- 3` für den Rückwärts-Vorwärts-Primer. Für Hitzeschockprotein-70 (HSP-70) wurde ein Primer (MWG-Biotech AG, Ebersberg) mit der Sequenz 5`-CAC AAG AAG GAC ATC AGC CA- 3` (Vorwärts) und ein Rück-wärts-Primer mit der Sequenz 5`-TGA TGC TCT TGT TCA GGT CG- 3` verwendet.
3.5.4.4 Hybridisierungssonden
Die Herstellung der Hybridisierungssonden erfolgte in 4 Schritten.
Zur Synthese von cDNA wurde zunächst eine RT-PCR zur Synthese von cDNA unter Verwendung des 1st Strang cDNA Synthesis Kit for RT-PCR (AMV, Roche
Filter
28S Untereinheiten der RNA 18S Untereinheiten der RNA
Loading Buffer
Diagnostics GmbH, Mannheim) durchgeführt. Hierbei vermittelt das Enzym Reverse Transkriptase die Umwandlung einer RNA-Sequenz in eine cDNA. Es wurden folgende Komponenten in einem sterilem 0,5ml Safe-Lock Reaktionsgefäß (Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Köln) gemischt: 2,0µl 10 x Reaction Buffer, 4,0µl 25 mM MgCl2 , 2,0µl Deoxynucleotide Mix, 2,0µl Oligo-p(dT)15Primer, 1,0µl RNase Inhibitor, 0,8µl AMV Reverse Transkriptase und 8,2µl RNA. Nach kurzem Ver-mischen mithilfe eines Minishakers wurde das Reaktionsgefäß in einen T3 Thermo-cycler (Biometra, biomedizinische Analytik GmbH, Göttingen) verbracht. Das PCR-Programm lief nach folgendem Muster: 10 Minuten bei 25°C, 1 Stunde bei 42 °C und 5 Minuten bei 9°C.
Als zweiter Schritt folgte eine PCR mit dem entsprechenden Primer (s.o.) zur Herstellung einer Hybridisierungssonde. Hierbei bildet die Polymerase mithilfe spezifischer Primer Kopien von DNA-Einzelsträngen. Hierzu wurde 40,75µl Aqua dest., 5µl 10fach Puffer, 1µl NTP (PCR Nucleotide Mix, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim), 1µl cDNA, 1µl Rückwärts-Primer, 1µl Vorwärts-Primer und 0,25µl Taq DNA Polymerase zusammen in ein steriles 0,5ml Reaktionsgefäß pipettiert und kurz durchmischt. Anschließend erfolgte im Thermocycler ein initialer Schritt von 3 Minuten bei 95°C, dann vierzig Zyklen bestehend aus jeweils 1 Minute bei 95°C, 1 Minute und 20 Sekunden bei 60°C und 2 Minuten bei 72°C und abschließend 10 Minuten bei 72°C.
Zur Kontrolle wurde ein DNA-Gel nach folgendem Muster hergestellt: 2,97g Agarose (NuSieve 3:1 Agarose, Biozym Diagnostik GmbH, Hess. Oldendorf) und 150ml TBE-Puffer wurden zusammen erhitzt. Nach dem Zusatz von 8µl Ethidiumbromid (zur Sichtbarmachung der DNA im UV-Licht) ließ man die Flüssigkeit auf 50-60°C abkühlen, um dann das Gel zu gießen. Zur Kontrolle wurden 10µl des PCR-Produkts, 10µl der Kontrolle und 3µl DNA Marker (DNA Molecular Weight Marker VIII, 19-1114 bp, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) in die Geltaschen pipettiert und für 30 Minuten 200 V Spannung angelegt.
In einer dritten PCR wurde die Sonde mit Digoxigenin markiert, wobei der PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) Verwendung fand. Dafür wurden 32,25µl Aqua dest., 5µl PCR Puffer mit MgCl2 10 x konzentriert, 5µl PCR DIG Probe Synthesis Mix 10fach konzentriert, 2µl Primer antisense, 5µl spez. cDNA (Sonde) und 0,75µl Enzym-Mix, Expand High Fidelity zusammenpipettiert und kurz durchmischt, um danach folgendes PCR-Programm zu durchlaufen: 3 Minuten bei 95°C, 40 Zyklen mit je 1 Minute bei 95°C, 1 Minute und 20 Sekunden bei 59°C und 2 Minuten bei 72°C und schließlich 10 Minuten bei 72°C. Zur Kontrolle wurde ein Gel mit 5µl des DIG-PCR-Produkts, 5µl der Kontrolle und 2µl des DNA-Markers hergestellt.
Als vierter und letzter Schritt erfolgte die Aufreinigung des DIG-PCR-Produkts unter Anwendung des QIAquick PCR Purification Kits (Qiagen GmbH, Hilden). Dazu wurden 45µl des DIG-PCR-Produkts in eine Safe-Lock Tube 1,5ml mit 225µl Puffer PB vermischt. Ein spin column wurde in einem 2ml collection tube platziert und die Probe hinzugegeben. Anschließend wurde 30-60 Sekunden bei 8000 rpm zentrifugiert. Das Filtrat wurde verworfen und 0,75ml Puffer PE in das spin column pipettiert. Nach erneuter Zentrifugation unter gleichen Bedingungen wurde das Filtrat entsorgt und 1 Minute bei 14000 rpm zentrifugiert. Dann wurde das spin column in eine neue 1,5ml microfuge tube platziert, 50µl Wasser hinzugegeben und 1 Minute bei 14000 r/m zentrifugiert. Das Eluat enthielt nun die aufgereinigte DNA.
In einem Kontrollgel wurde aufgereinigte und nicht aufgereinigte DNA miteinander verglichen.
Die aufgereinigte DIG-markierte Sonde wurde schließlich in 10ml DIG Easy Hyb verdünnt und bei –20°C eingefroren.
3.5.4.5 Hybridisierung
Das Prinzip der Hybridisierung besteht darin, die spezifische RNA auf dem Filter (Nitrocellulosemembran) mithilfe einer DIG-markierten DNA-Sonde, die aus einer komplementären Basensequenz zur gewünschten RNA besteht, zu markieren und sichtbar zu machen.
Der Filter wurde mit der RNA-Seite zum Lumen in einem Hybridisierungsröhrchen mit 10ml Hybridisierungspuffer (DIG Easy Hyb, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) für 1 Stunde bei 50°C unter ständigem Drehen im Hybridisierungsofen (Hybridization Ofen/Shaker, amersham pharmacia, Freiburg) prähybridisiert, um alle unspezifischen Bindungsstellen zu besetzen.
Nach Ablauf von 50 Minuten wurde die bei –20°C gelagerte Hybridisierungssonde für 10 Minuten in einem Wasserbad bei 68°C erwärmt. Anschließend wurde der Prähybridisierungspuffer verworfen und die aufgetaute Sonde zu dem Filter gegeben.
Nun wurde bei 50°C und unter ständigem Drehen im Hybridisierungsofen über Nacht hybridisiert.
Die Hybridisierungssonde wurde im Anschluss nicht verworfen, sondern für den erneuten Gebrauch wieder bei –20°C eingefroren.
3.5.4.6 Nachweis der markierten RNA
Für die Posthybridisierung wurde das DIG Wash and Block Buffer Set (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) verwendet. Die benötigten Lösungen wurden zuvor folgendermaßen angesetzt:
Wash Solution 2fach konzentriert: 0,25g SDS (Lauryl Sulfate, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) und 25ml 20fach SSC Puffer mit Wasser auf 250ml aufgefüllt;
Wash Solution 0,5fach konzentriert: 0,25g SDS und 6,25ml 20fach SSC Puffer mit Wasser auf 400ml aufgefüllt;
Washing Buffer: 40ml Washing Buffer des DIG Wash and Block Buffer mit Wasser auf 400ml aufgefüllt;
Blocking Solution: 15ml Blocking Solution des Sets und 13,5ml Maleic Acid Buffer des Sets mit Wasser auf 150ml aufgefüllt;
Detection Buffer: 5ml Detection Buffer des Sets mit 45ml Wasser vermischt.
Zur Posthybridisierung wurde der Filter in ein kleines Plastikschälchen gelegt, das sich während des gesamten Wasch- und Detektionsvorgangs auf einem Wippschüttler (neoLab Migge Laborbedarfbetriebs GmbH) befand. Zunächst wurde der Filter 2-mal 15 Minuten in Wash Solution 2fach konzentriert und dann 2-mal 15 Minuten in der auf 68°C erwärmten Wash Solution 0,5fach konzentriert gewaschen.
Es folgte eine 1-minütige Waschung im Washing Buffer. Die Waschschritte sind erforderlich, um nicht oder unspezifisch gebundene Sondenanteile zu entfernen.
Danach wurde das Schälchen gewechselt und der Filter 90 Minuten in 100ml der Blocking Solution gebadet, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren.
Zwischenzeitlich wurden den restlichen 50ml Blocking Solution 2,5µl des Antikörpers (Anti-Digoxigenin-AP Fab Fragments, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) untergemischt. Dieser bindet an die DIG-markierte Probe.
Der Filter wurde nun 30 Minuten in der mit dem Antikörper versetzten Blocking Solution gebadet und anschließend 2-mal 15 Minuten im Washing Buffer gewaschen.
Es folgte eine 2-minütige Behandlung mit Detection Buffer, um den optimalen pH-Wert für die Substratreaktion einzustellen.
Daraufhin wurde der Filter auf eine Glasplatte gelegt, mit CDP-Star (CDP-Star, ready-to-use, Roche), einem Chemilumineszenz-Substrat für die alkalische Phosphatase (AP), beträufelt und nach 5 Minuten mit Saranfolie abgedeckt und in den Imager (Fluor-S TM Multimager, BIO-RAD) verbracht. Die enzymatische Dephos-phorylierung von CDP-Star durch die AP führt zur Bildung eines metastabilen Anions, welches zerfällt und Licht emittiert. Dieses Licht wird vom Imager detektiert.
Am Ende der Messung wurde der Filter entweder in 20fach SSC getränkt und in Folie im Kühlschrank aufbewahrt oder 2-mal 15 Minuten mit TE-Puffer 1fach konzentriert (10 ml Tris-EDTA-Puffer,Sigma + 990 ml Wasser) ausgekocht und für eine neue Hybridisierung verwendet.
3.5.4.7 Auswertung des Northern-Blot
Die mithilfe des Imagers (Fluor-S TM Multimager, BIO-RAD) erhaltenen Daten wurden mit der Quantifizierungssoftware "Quantity One" für Windows (Bio-Rad-Laboratories GmbH, D-80939 München) ausgewertet. Die Software stellt die Energie (Lumineszez) in Form von Banden graphisch dar, und die Intensität (Pixeldichte) der einzelnen Banden wird gemessen.
3.6. Statistische Auswertung
Die Darstellung der erhobenen Werte erfolgte, wenn möglich, als Mittelwert (+/- Standardabweichung (SD).
Die statistische Analyse erfolgte mithilfe des Student’s t-Test für unabhängige Stichproben. Bei p<0,05 wurden die Unterschiede als statistisch signifikant erachtet.
Die graphische Darstellung der quantitativen Northern-Blot Analyse für HSP-70 und Egr-1 erfolgte als relativer Anstieg (fold increase) gegenüber der Kontrollgruppe, die als 1 definiert wurde.
4. Ergebnisse
4.1 Modell 1: Intravenöse Applikation von Egb 761, 20 Minuten vor Reperfusion
4.1.1 Reflexspektrophotometrie
Die Beurteilung der intrahepatischen Sauerstoffsättigung des linken Leberlappens vor und nach Ischämie und Reperfusion erfolgte durch die Reflexspektrophotometrie.
Verglichen wurde dabei die Sauerstoffsättigung im linken Leberlappen vor und nach 1 Std. Ischämie und nach 4 Std. bzw. 6 Std. Reperfusion mit/ohne Egb 761-Applikation (Abb. 13). Für 12 Std. Reperfusion mit/ohne Egb 761-761-Applikation liegen keine Werte vor, da die reflexspektrophotometrische Untersuchung aufgrund einer irreparablen Sonde nicht komplementiert werden konnte.
Abb.13: Reflexspektrophotometrische Messung der intrahepatischen Sauerstoff-sättigung im linken Leberlappen nach 1Std. Ischämie und 4 Std. (A) bzw. 6 Std. (B) Reperfusion (Mittelwert; +/- Standardabweichung). V.I. – vor Ischämie, n.I. – direkt nach Ischämieinduktion, n.R. – direkt nach Reperfusion, n. 4h R. / n. 6h R. – nach 4 Std. / 6 Std. Reperfusion.
0
Nach suffizienter Abklemmung der zu- und abführenden Gefäße des linken Leberlappens zeigt sich zunächst bei allen Tieren der zu erwartende O2 -Sättigungsabfall auf etwa 10% (+/-3%). Mit Beginn der Reperfusionsphase erreicht die Sauerstoffsättigung zügig wieder die präischämischen Ausgangswerte von etwa 36% (+/-8,6%). Im weiteren Verlauf der Reperfusion zeigt sich jedoch ein O2 -Sättigungsabfall im linken Leberlappen, der bei den Versuchstieren nach Egb 761-Applikation während der Ischämiephase gegenüber der Kontrollgruppe ausgeprägter zu sein scheint. Der statistische Vergleich beider Versuchsgruppen nach 4 bzw. 6 Std. Reperfusion ergab jedoch keinen statistisch signifikanten Unterschied.
4.1.2 Leberenzyme (AST und ALT)
Zur Beurteilung des postischämischen Reperfusionsschadens mit/ohne Egb 761 wurden nach 2, 4, 6 und 12 Stunden die Leberenzyme AST und ALT bestimmt.
Tab. 7: Serum-AST (7a) und -ALT (7b) nach 1 Std. warmer Ischämie und 2, 4, 6 bzw.
12 Std. Reperfusion mit (+) / ohne (-) Egb 761 (Mittelwerte; Standardabweichung (SD).
Tab. 7a:
Tab. 7b:
AST [U/L] Reperfusionszeit [Std.]
vor Ischämie 2 4 6 12
Egb (-) 32,75 300,50 354,25 607,00 513,00
SD 2,50 148,97 238,41 105,79 164,77
Egb (+) 30,50 341,75 469,00 648,25 691,50
SD 1,73 56,92 90,03 263,04 265,12
ALT [U/L] Reperfusionszeit [Std.]
vor Ischämie 2 4 6 12
Egb (-) 29,00 303,25 360,50 648,50 527,75
SD 2,83 183,69 252,27 125,59 269,39
Egb (+) 29,75 401,50 692,75 853,00 796,50
SD 2,87 69,99 75,28 390,34 384,39
Die graphische Darstellung der oben genannten Werte in Abb. 14 und 15 zeigt einen kontinuierlichen Anstieg der Transaminasen AST und ALT bis 6 Stunden nach Reperfusion. Maximalwerte wurden in der Regel innerhalb 12 Stunden (6 bzw. 12 Std.) nach Reperfusion erreicht. Der Vergleich beider Versuchsgruppen zeigt regelmäßig höhere Werte nach Applikation von Egb 761 als nach NaCl-Gabe (Kontrollgruppe), jedoch ohne statistische Signifikanz bei Betrachtung der AST-Werte (Abb. 14).
Abb. 14: Serum-AST nach 1 Std. warmer Ischämie und 2, 4, 6 bzw. 12 Std.
Reperfusion mit (+) / ohne (-) Egb 761 entsprechend Modell 1.
Darstellung der Werte als Mittelwert; +/- Standardabweichung (SD).
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
vor Ischämie 2 4 6 12
Reperfusionszeit [Std.]
AST [U/L]
EGB (-) EGB (+)
Der Unterschied zwischen den beiden Versuchsgruppen zeigt sich deutlicher beim Vergleich der postischämischen ALT-Werte. Hier finden sich gegenüber der Kontrollgruppe zu allen Zeitpunkten deutlich höhere Werte nach Egb 761-Applikation, mit signifikantem Unterschied (p=0,045) nach 4 Stunden Reperfusion (Abb. 15).
Abb.15: Serum-ALT nach 1 Std. warmer Ischämie und 2, 4, 6 bzw. 12 Std.
Reperfusion mit (+) / ohne (-) Egb 761 entsprechend Modell 1.
Darstellung der Werte als Mittelwert; +/- Standardabweichung (SD). * t-Test, p<0,05.
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
vor Ischämie 2 4 6 12
Reperfusionszeit [Std.]
ALT [U/L]
EGB (-) EGB (+)
*
4.1.3 HSP-70 mRNA-Expression
Zur Beurteilung des Einflusses von Egb 761 auf die intrahepatische HSP-70 mRNA-Expression wurden Northern-Blot-Analysen nach 2, 4, 6 und 12 Stunden Reperfusion durchgeführt.
Abb.16: HSP-70 mRNA-Expression im linken Leberlappen nach 1 Std. warmer Ischämie und 2, 4, 6 bzw. 12 Std. Reperfusion mit (+) / ohne (-) Egb 761. Qualitative
Abb.16: HSP-70 mRNA-Expression im linken Leberlappen nach 1 Std. warmer Ischämie und 2, 4, 6 bzw. 12 Std. Reperfusion mit (+) / ohne (-) Egb 761. Qualitative