Ginkgo biloba
Untersuchungen zur Bioanalytik und ZNS-Bioverfügbarkeit von Flavonoiden und zur Expression der Atmungskettenkomplexen durch EGb 761 an Ratten
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften
vorgelegt beim Fachbereich Biochemie, Chemie und Pharmazie der Johann Wolfgang Goethe-Universität
in Frankfurt am Main
von
Laura Rangel-Ordóñez
aus Apan, Hidalgo, Mexiko
Frankfurt am Main (2008) (D30)1
________________________________________________________ 1 (D30: D=Dissertation 30=Bibliothekskennzeichen)
Vom Fachbereich Biochemie, Chemie und Pharmazie
der Johann Wolfgang Goethe- Universität als Dissertation angenommen.
Dekan: Herr Prof. Dr. Harald Schwalbe
Gutachter: Herr Professor Dr. Manfred Schubert-Zsilavecz Herr Professor Dr. Theodor Dingermann
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INHALTSVERZEICHNIS
ABKÜRZUNGEN ... V ZUSAMMENFASSUNG ... VII SUMMARY ... VIII EINLEITUNG ... IX INTRODUCTION ... XI 1. ALLGEMEINER TEIL ... 1 1.1. Ginkgo biloba ... 1 1.1.1. Herkunft ... 1 1.1.2. Botanik ... 21.1.3. Droge und Inhaltsstoffe ... 5
1.1.3.1. Flavonoide ... 6 1.1.3.2. Terpenoide ... 7 1.1.3.3. Andere Inhaltsstoffe ... 8 1.2. Standardisierte Extrakte ... 8 1.3. Anwendungen ... 9 1.3.1. Historische Anwendung ... 9 1.3.2. Aktuelle Anwendung ... 10 1.4. Pharmakokinetik ... 17 1.4.1. Terpenoide ... 17 1.4.2. Flavonoide ... 19
1.5. Wirksamkeit von Ginkgo bei Hirnleistungsstörungen ... 22
1.5.1. Terpenoide ... 23
1.5.2. Flavonoide ... 27
1.5.3. Klinische Wirksamkeit ... 31
1.5.4. Nebenwirkungen und Interaktionen ... 32
2. BIOANALYTIK VON EGb 761 FLAVONOIDEN ... 35
2.1. Experimenteller Teil ... 35
2.1.1. Probenaufarbeitung ... 35
2.1.1.1. Bedingungen für die anschließende Probenaufarbeitung von Plasma und Hirn ... 39
2.1.2. HPLC-Methodenentwicklung ... 39
2.1.2.1. Detektion der Analyten ... 39
2.1.2.2. Trennung der Analyten ... 42
2.1.3. Validierung der Methode ... 45
2.1.3.1. Spezifität ... 45
2.1.3.2. Linearität ... 47
2.1.3.3. Nachweisgrenze und Bestimmungsgrenze ... 49
2.1.3.4. Bestimmungsbereich ... 50
2.1.3.5. Wiederfindung ... 51
2.1.3.7. Stabilität ... 56
3. BIOVERFÜGBARKEIT VON GINKGOFLAVONOIDEN IN RATTEN ... 57
3.1. Experimenteller Teil ... 57
3.1.1. Haltungsbedingungen der Tiere ... 57
3.1.2. Studie 1: Bioverfügbarkeit nach Einfach- und Mehrfachgabe ... 57
3.1.2.1. Einfachgabe ... 58
3.1.2.2. Mehrfachgabe ... 58
3.1.3. Probenentnahme ... 58
3.1.4. Studie 2: Dosierungseffekt und Verteilung im ZNS ... 59
3.2. Ergebnisse ... 60
3.2.1. Studie 1: Pharmakokinetik nach Einfach- und Mehrfachgabe ... 60
3.2.1.1. Einfachgabe ... 61
3.2.1.2. Mehrfachgabe ... 64
3.2.2. Studie 2: Verteilung im ZNS und Dosierungseffekt. ... 68
4. PROTEOMICSSTUDIE ... 72 4.1. Theoretische Grundlagen ... 72 4.1.1. Mitochondrienaufbau ... 72 4.1.1.1. Atmungskettenfunktion ... 75 4.1.2. Proteintrennung ... 76 4.1.2.1. Elektrophorese ... 76 4.2. Experimenteller Teil ... 83
4.2.1. Tierfütterung und Haltungsbedingungen ... 83
4.2.2. Homogenisierung und Lagerung der Proben ... 84
4.2.3. Solubilisierung der Proben ... 85
4.2.4. Durchführung der nativen Gelelektrophorese ... 86
4.2.5. SDS-PAGE... 87
4.2.5.1. Vorbereitung von SDS-Gelen ... 88
4.2.5.2. SDS-PAGE Durchführung ... 88
4.2.6. Identifizierung und Quantifizierung ... 88
4.2.6.1. Coomassie-blau-Färbung ... 88
4.2.6.2. Silberfärbung ... 89
4.2.7. Katalytische Aktivität In-Gel ... 90
4.3. Ergebnisse ... 91
4.3.1. Vorversuch ... 91
4.3.2. Ginkgoversuche ... 93
5. DISKUSSION ... 96
6. DISCUSSION ... 102
7. GERÄTE UND MATERIALIEN ... 107
7.1. Bioanalytik und Bioverfügbarkeit der Flavonoide ... 107
7.1.1. Extrakt, Referenzsubstanzen und Tiere ... 107
7.1.2. Lösungsmittel und Chemikalien ... 107
7.1.3. Geräte und Zubehör ... 108
7.2.1. Extrakt und Tiere ... 111
7.2.2. Lösungsmittel und Chemikalien ... 111
7.2.3. Gel-Vorbereitung ... 114
7.2.4. Geräte und Zubehör ... 117
8. ANHANG: ZUGELASSENE GINKGOPRÄPARATE ... 119
ABBILDUNGSVERZEICHNIS ... 120 TABELLENVERZEICHNIS ... 123 LITERATURVERZEICHNIS ... 124 LEBENSLAUF ... 136 DANKSAGUNG ... 139 ERKLÄRUNG ... 143
ABKÜRZUNGEN
Abkürzung Bedeutung AD Morbus Alzheimer (Alzheimer Disease) AMG Arzneimittelgesetz APS AmmoniumperoxodisulfatATC Anatomisch-Therapeutisch-Chemisches Klassifikationssystem ATP Adenosintriphosphat
(Adenosine triphosphate)
AUC0-72 Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve (von t=0 h bis t =72 h) AUC72h-inf Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve (von t=72 h bis unendlich) AUC0-inf Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve (von t=0 h bis unendlich)
Bb Bilobalid
BHS Blut-Hirn-Schranke
BN-PAGE Blau-Native-Polyacrylamid Gelelektrophorese (Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis) ClT Gesamtkörperclearance
Cmax Maximale Plasmakonzentration
CN-PAGE Clear-Nativ-Polyacrylamid Gelelektrophorese (Clear Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis) CTFE Chlortrifluorethylen Da Dalton DDM Dodecylmaltosid DNS Desoxyribonukleinsäure DOC Natriumdeoxycholat EDTA Ethylendiamintetracetat EGb Ginkgo biloba Extrakt
EGb 761 Ginkgo biloba Spezialextrakt EGb 761 eNOS Endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase FC Frontaler Cortex
FD Fluoreszenz-Detektion
x g Vielfaches der Erdbeschleunigung
GA Ginkgolid A GABA γ-Aminobuttersäure GB Ginkgolid B GlyR Glycin-Rezeptoren H Hippocampus HCl Salzsäure HPLC Hochleistungsflüssigkeitchromatographie (High Performance Liquid Chromatography) I.D. Innendurchmesser
I.E. Internationale Einheit
iNOS induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase
KG Körpergewicht
KH Kleinhirn
LLOQ Untere Bestimmungsgrenze LOD Nachweisgrenze
λz Eliminationskonstant
µ Nominale Konzentration M Molarkonzentration MAO Monoaminoxidase
Abkürzung Bedeutung Na2 (HPO4)3 Natriumdihydrogenphosphat Na3PO4 Trinatriumphosphat NaCl Natriumchlorid NADH Nicotinamid-Adenin-Nucleotid NaOH Natriumhydroxid
OXPHOS Oxidativen Phosphorylierung PAF Plättchenaktivierender Faktor
(platelet activating factor)
PAFR Plättchenaktivierender Faktor-Rezeptor (platelet activating factor receptor) PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(Polyacrylamide Gel Electrophoresis) PBR Periphere Benzodiazepin-Rezeptor PE Polyethylen PEG Polyethylenglykol PFTE Polytetrafluorethylen pH pH-Wert (Potential of hydrogen ) R Rest des Gehirns R2 Determinationskoeffizient ROS Reaktive Sauerstoffspezies
RP Umkehrphase
(Reversed-Phase)
R.S.D. Relative Standardabweichung
(auch Variationskoeffizient, Vk genannt)
S Striatum
SDS Natriumdodecylsulfat (Sodium Dodecyl Sulfate) S.E.M. Standardfehler des Mittelwertes
(Standard Error of the Mean)
t Zeit
t1/2 Eliminationshalbwertzeit TBHQ tert-Butylhydrochinon
(Tert-Butyl-Hydroquinone) TEMED Tetramethylethylendiamin
Tmax Zeit bis zum Erreichen der maximalen Plasma- oder Hirnkonzentration TRIS Tris (hydroxymethyl)aminomethane Puffer
U/min Umdrehungen pro Minute UV Ultraviolett
Vz Verteilungsvolumen
WHO Weltgesundheitsorganisation (World Health Organization) x Mittlere Konzentration ZNS Zentrales Nervensystem
ZUSAMMENFASSUNG
Eine große Anzahl pharmakologischer und klinischer Studien zeigt die Wirksamkeit des standardisierten Ginkgo biloba Extraktes EGb 761 bei vaskulären und kognitiven Stö-rungen, wie der Alzheimer-Krankheit, der vaskulären Demenz und der peripheren arte-riellen Verschlusskrankheit. Experimentelle Ergebnisse weisen darauf hin, dass Terpen-laktone und Flavonolglykoside für die meisten pharmakologischen Wirkungen von EGb 761 verantwortlich sind. Allerdings gibt es wenige Studien, die die orale Biover-fügbarkeit von Terpenlaktonen und besonders von Flavonolglykosiden aus Ginkgo bilo-ba im Blut oder Zentralnervensystem untersuchten. Deshalb wurde in dieser Arbeit die Fähigkeit der Flavonoidglykosiden bzw. deren Metaboliten die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden im Tierversuch an männlichen Sprague-Dawley-Ratten erforscht. Unter-sucht wurden dabei orale Einfach- und Mehrfachgaben von EGb 761 über einen Zeit-raum von 8 Tagen in den Dosierungen 100 bzw. 600 mg Extrakt pro kg Körpergewicht. Zusätzlich wurde die Verteilung der Ginkgoflavonolmetabolite in den unterschiedlichen Bereichen des Gehirns untersucht (Hippocampus, frontaler Cortex, Striatum und Klein-hirn). Zu diesem Zweck wurde eine HPLC-Fluoreszenzmethode für die Ermittlung der Plasma- und Gehirnkonzentrationen der Flavonoidmetaboliten (Derivate von Quercetin, Kämpferol und Isorhamnetin) entwickelt und validiert. In beiden Studien (Einfach- und Mehrfachgabe) wurden Flavonoidmetaboliten im Plasma und im Gehirn nachgewiesen. Dabei wurden Metaboliten in allen untersuchten Gehirnbereichen gefunden. Bei der Dosierung von 100 mg/kg war Kämpferol vorzugsweise im frontalen Cortex lokalisiert, während die anderen Flavonole in allen Regionen vergleichbare Konzentrationen auf-wiesen. Bei der höheren Dosierung von 600 mg/kg waren die Konzentrationen der Fla-vonolmetaboliten in allen Gehirnbereichen vergleichbar. Obgleich die vier untersuchten Gehirnbereiche nur 38% des gesamten Gehirns darstellten, wurden die meisten Gink-goflavonole in diesen Regionen gefunden. Im übrigen Gehirngewebe wurden nur be-grenzte Mengen von Flavonolen nachgewiesen.
Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass es erstmalig gelungen ist, im Tier-versuch die Bioverfügbarkeit einer der therapeutisch aktiven Substanzklassen von Ginkgo biloba - die Flavonoide - sowohl im Plasma als auch im ZNS nachzuweisen.
SUMMARY
A large number of pharmacological and clinical studies have shown the efficacy of the standardized quantified Ginkgo biloba extract EGb 761 in vascular and cognitive disor-ders such as Alzheimer`s disease, vascular dementia, and peripheral arterial occlusive disease. Experimental results indicate that terpene lactones and Ginkgo flavonol gly-cosides are responsible for most of the pharmacological actions of EGb 761. However, studies concerning the oral bioavailability of the terpene lactones and in particular, the Ginkgo flavonol glycosides in the blood or central nervous system, are rare. Therefore, the ability of flavonoid glycosides to cross the blood-brain barrier in male Sprague-Dawley rats after single and repeated (8 days) oral administration of 100 or 600 mg per kg EGb 761 was investigated.
In addition, the distribution of Ginkgo flavonol metabolites in the different areas of the brain (hippocampus, frontal cortex, striatum, and cerebellum) was studied. For this pur-pose, an HPLC fluorescence method for the determination of the plasma and brain tis-sue concentrations of the Ginkgo flavonoid metabolites (quercetin, kaempferol and isorhamnetin derivatives) was validated and developed. In both single and repeated dose studies, flavonoid metabolites were found in the plasma and brain. The metabolites could be detected in all of the brain areas investigated. In the low dose group (100 mg/kg), kaempferol preferably localized in the in the frontal cortex, whereas, the con-centrations of the other flavonols were comparable in all regions. At the higher dose (600 mg/kg), the concentrations of all flavonol metabolites were comparable in all brain areas. Although the four investigated brain areas represent only 38% of the whole brain, most of the Ginkgo flavonols were found in these regions. In the remaining brain only marginal amounts of flavonols were found.
In summary it can be stated that it was possible, for the first time, to demonstrate in an-imal experiments the bioavailability of one of the therapeutically active substance classes of Ginkgo biloba, the flavonoids, both in plasma and in CNS.
EINLEITUNG
Die Verwendung von Ginkgo biloba als Heilmittel geht auf das vorchristliche China zurück. Während damals eine Reihe von Erkrankungen, wie z.B. Asthma, Bronchitis, Erfrierungen, Gonorrhöe oder Hautkrankheiten mit Ginkgo biloba Samen und/oder Blättern behandelt wurden, werden in der modernen rationalen Phytotherapie standardi-sierte Trockenextrakte aus Ginkgo biloba Blättern als Antidementiva zur Behandlung von frühen Stadien der Alzheimer Demenz (AD) oder der vaskulären Demenz einge-setzt. Wegen ihrer nachgewiesenen klinischen Wirksamkeit nahm die Weltgesundheits-organisation (WHO) standardisierte Ginkgo biloba Extrakte, wie z.B. EGb 761, als An-tidementiva in das anatomisch- therapeutisch- chemischen- (ATC) - Klassifikationssys-tem auf. Diese standardisierten Extrakte zeichnen sich durch einen klar definierten Wirkstoffgehalt aus: 22-27% Ginkgoflavonoide (berechnet als Ginkgoflavonglykoside); 5-7% Terpenlaktone (welche zu 2,8-3,4% aus Ginkgoliden A, B, C und zu 2,6-3,2% aus Bilobalid bestehen); sowie weniger als 5 ppm Ginkgolsäuren.
In den meisten veröffentlichten präklinischen und klinischen Untersuchungen wurde der standardisierte Extrakt EGb 761 verwendet. In vielen Ländern werden Fertigarzneimit-tel, die auf auf EGb 761 basieren, als verschreibungspflichtige Arzneimittel vertrieben. In Europa zählen diese Präparate zu den umsatzstärksten pflanzlichen Arzneimitteln. In einer großen Anzahl von in vitro und in vivo Studien wurden einige potentielle Wirkmechanismen für EGb 761 bzw. dessen Inhaltsstoffe erforscht. Unter anderem be-sitzt der Extrakt antioxidative Eigenschaften, die der Substanzklasse der Flavonoide zugeschrieben werden und die zur Vermeidung von Apoptose beitragen. Dies ist mögli-cherweise darauf zurückzuführen, dass die Zellen vor oxydativem Stress und dessen Konsequenzen, wie z.B. der Peroxidation von Membranen, geschützt werden. Darüber hinaus wurde herausgefunden, dass EGb 761 die Expression einiger Proteine der At-mungskette beeinflusst und damit die Bereitstellung von Adenosintriphosphat (ATP) in den Mitochondrien verbessert. Außerdem konnte in zahlreichen klinischen Studien die Wirksamkeit von EGb 761 auf das Zentralnervensystem (ZNS) nachgewiesen werden (DeFeudis and Drieu, 2000; Ramassamy et al., 2007b).
Bisher liegen nur sehr begrenzte Informationen bezüglich der Bioverfügbarkeit von Fla-vonoiden und Terpenlaktonen vor. Paulke et al. (2006) gelang der Nachweis von Flavo-noidmetaboliten im Gehirn von Ratten nach der oralen Gabe von Johanniskrautextrakt oder Quercetinglykosiden. Allerdings ist wenig bekannt über die Bioverfügbarkeit der Flavonoide und der Terpenlaktone aus Ginkgo biloba bzw. deren Metaboliten, die nach der oralen Verabreichung von EGb 761 gebildet werden. Moreau et al. (1986) unter-suchten in einem Rattenexperiment die Absorption des mit 14C radioaktiv markierten Extraktes aus Ginkgoblättern und konnten sowohl im Plasma als auch in verschiedenen Geweben Radioaktivität nachweisen. Allerdings erlaubt diese relativ unspezifische Me-thode keine qualitative Aussage über die Art der Extraktbestandteile, die im Plasma und im Gewebe gefunden wurden. Ebenso kann die Quantität dieser Substanzen nicht abge-schätzt werden.
In dieser Arbeit wird die Entwicklung, Validierung und Anwendung einer analytischen Methode gezeigt, die es erstmals ermöglichte, die Flavonoide aus Ginkgo biloba bzw. deren Metaboliten mit hinreichender Empfindlichkeit im ZNS von Ratten zu bestimmen. Damit war es möglich, im Rahmen eines Tierversuches, die Flavonoide in relevanten Konzentrationen im Gehirn nachzuweisen und damit zu beweisen, dass sie in der Lage sind, die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden.
INTRODUCTION
The use of Ginkgo biloba as a remedy goes back to pre-Christian China. At that time a number of diseases, such as asthma, bronchitis, frostbite, gonorrhea or skin diseases, were treated with Ginkgo biloba seeds and/or leaves. However, in modern rational phy-totherapy standardized herbal extracts from Ginkgo biloba leaves are used as antimentive drugs for the treatment of early stages of Alzheimer's dementia or vascular de-mentia. Due to its clinical efficacy, standardized extracts, like EGb 761, were acknowl-edged by the World Health Organization as antidementive drugs and have been listed in the Anatomical Therapeutic Chemical (ATC)-Classification System. These standardized extracts are characterized by a clearly defined active agent content of: 22-27% Ginkgo flavonoids (calculated as Ginkgo flavone glycosides); 5-7% terpene lactones (consisting of 2.8-3.4% ginkgolides A, B, C and 2.6-3.2% bilobalide); and less than 5 ppm gink-golic acids.
In most of the published preclinical and clinical investigations the standardized extract of Ginkgo leaves EGb 761 was used. In many countries products containing EGb 761 are sold as a prescription drug. In Europe, these products belong to the most widely sold phytomedicines.
In a large number of in vitro and in vivo studies some potential action mechanisms for EGb 761 or its constituents were investigated. Among others, the extract possesses anti-oxidant properties, which are attributed to the flavonoid group and help to prevent apop-tosis. This happens possibly through the protection of the cells against oxidative stress and its consequences, such as membrane peroxidation. Moreover, it was discovered that EGb 761 influences the expression of some proteins of the respiratory chain and conse-quently helps to improve the respiration mechanisms and the utilization of adenosine triphosphate (ATP) in the mitochondria. Numerous clinical studies support the efficacy of EGb 761 on the central nervous system (DeFeudis and Drieu, 2000; Ramassamy et al., 2007b).
As previously mentioned, the constituents of Ginkgo extracts found to be pharmaco-logically active were the flavonol glycosides and the terpene lactones. So far, very lim-ited information about the brain bioavailability of flavonoids and terpene lactones is
after oral administration of St. John’s wort extract or quercetin glycosides. However, very little is known about the brain bioavailability of the flavonoids and the terpene lac-tones from Ginkgo biloba and about the metabolites that are formed after the oral ad-ministration of EGb 761. Moreau et al. (1986) studied the absorption of the radioactive 14C marked extract prepared from Ginkgo leaves in a rat model and observed radioactiv-ity both in plasma and several tissues. However, this relatively nonspecific method does not allow qualitative statements about the type of extract components which were found in plasma and tissues. Similarly, the quantity of these substances could not be assessed. This work describes the development, validation and application of an analytical me-thod, which makes it possible for the first time to determine the flavonoids from Ginkgo biloba and their metabolites with reasonable sensitivity in the brain of rats. Thus, it was be possible in the context of an animal experiment to detect the flavonoids in brain at relevant concentrations and show that they are able to cross the blood-brain barrier.
Ginkgo biloba
Dieses Baums Blatt, der von Osten
Meinem Garten anvertraut,
Gibt geheimen Sinn zu kosten,
Wie’s den Wissenden erbaut.
Ist es ein lebendig Wesen,
Das sich in sich selbst getrennt ?
Sind es zwei, die sich erlesen,
Dass man sie als eines kennt ?
Solche Frage zu erwidern,
Fand ich wohl den rechten Sinn;
Fühlst du nicht an meinen Liedern,
Dass ich eins und doppelt bin ?
Abbildung 2. Ginkgofossil.
Abbildung 1. Männlicher und weibli-cher Ginkgo-Trieb aus „Flora Japoni-ca“ von Siebold & Zuccarini, Leiden 1835/42.
1. ALLGEMEINER TEIL
1.1. Ginkgo biloba
1.1.1. Herkunft
Ginkgo (Ginkgo biloba) ist aus heutiger Sicht ein lebendes Fossil, dessen Ursprünge viele Millionen Jahre zurück in die Vergangenheit reichen und des-sen nähere Verwandten bereits alle ausgestorben sind. Heute ist durch zahlreiche fossile Funde be-kannt, dass Ginkgogewächse bereits in der Zeit des Unterperms (vor ca. 300 Millionen Jahren) existier-ten. Seine Blütezeit erlebte der Ginkgo von der Trias bis zur Kreide. Vor ca. 150 Millionen Jahren hat es nach heutigen Erkenntnissen noch mehrere Arten von Ginkgogewächsen gegeben. Im Laufe der Evolution zog sich der Ginkgo immer weiter nach Südostasien zurück, wo er auch Eiszeiten überlebte. Ende des 17. Jahrhunderts wurde er
durch den deutschen Arzt Engelbert Kaempfer, der in Japan unterwegs war, über Ut-recht in Holland wieder zurück nach Europa gebracht. Kämpfer beschrieb den Baum in seinem Buch „Amoenitatum Exoticarum“ im Jahre 1712. Seitdem wird der Ginkgo wieder in Europa kultiviert.
In China, Korea und Japan wird von Ginkgobäu-men mit einem Alter von mehr als 1000 Jahren, einem Stammumfang von 10-20 Metern und einer Gesamthöhe von bis zu 40-50 Metern berichtet (Schulz and Hänsel, 2004).
Seit ältester Zeit wird Ginkgo aufgrund seiner Sa-men als Tempelbaum kultiviert. Heutzutage kommt er nur noch in China wildwachsend in der Natur vor,
ist aber als Zierbaum überall in den gemäßigten Breiten zu finden und hat sich in den Städten als sehr widerstandsfähig gegen Luftverschmutzung erwiesen (Hänsel and Sti-cher, 2004), so dass er häufig in Gartenanlagen, Alleen und Parks zu finden ist.
Bei Ginkgo handelt es sich um eine der am besten untersuchten und erforschten Arznei-pflanzen der Gegenwart. Als belegte Indikationen gelten hirnorganische Leistungsstö-rungen in Form von beginnender Alzheimer-Demenz, Tinnitus und Schwindel. Darüber hinaus verbessert er die rheologischen Eigenschaften des Blutes und führt zur Hem-mung des Plättchenaktivierenden Faktors (PAF). Für die Klasse der Flavonoide wird außerdem von einer Inaktivierung toxischer Sauerstoffradikale berichtet. Aufgrund der o.g. Wirkungen ist der Umsatz mit Ginkgopräparaten und –produkten in Deutschland und Europa nicht zu unterschätzen. Dieser betrug 2006 in Europa immerhin 10,8 Milli-onen Euro (Schwabe and Pfaffrath, 2008).
Es befinden sich Arzneimittel und Nahrungsergänzungsmittel aus Ginkgo mit sehr un-terschiedlicher Zusammensetzung und rechtlicher Zulassung auf dem Markt: von Arz-neimitteln, die aufgrund klinischer Studien ihre Zulassung erhalten haben, über „traditi-onell angewendete“ Produkte, die nach §109a AMG zugelassen sind, bis hin zu Nah-rungsergänzungsmitteln, die lediglich der Nahrungsmittelverordnung unterliegen. Alle diese verschiedenen Produkte können in Apotheken, Supermärkten und im Internetver-sandhandel erworben werden.
Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind ausschließlich Arzneimittel, die aufgrund kli-nisch belegter Wirksamkeit ihre Zulassung erhalten haben.
1.1.2. Botanik
Ginkgo biloba ist der letzte lebende Vertreter der im Mesozoikum weltweit verbreiteten Klasse der Ginkgopsida (Ginkgoataer). Biloba heißt zweilappig (lat. bi = zweifach, gr. lobós = Lappen) und bezieht sich auf die Blattspreite (Genaust, 2005). Über die Rang-höhe des Taxons (Gruppe von Individuen, die gegen andere Gruppen abgegrenzt ist) gibt es, je nach morphologischen und molekularen Merkmalen, unterschiedliche Auf-fassungen (Reinhard, 2001; Sitte et al., 2002; Heß, 2005). Für ein Beispiel der vollstän-digen Klassifikation siehe Tabelle 1.
Taxonomische Kategorie Taxon
Reich/Domäne Eucarya (echten Pflanzen) Unterreich Chlorobionta (Grünpflanzen) Abteilung Spermatophyta (Samenpflanzen) Unterabteilung Gymnospermae (Nacktsamer)
Klasse Ginkgopsida
Unterklasse Ginkgoidae
Überordnung Ginkgoanae
Ordnung Ginkgoales (Ginkgoartige) Familie Ginkgoaceae (Ginkgogewächse)
Gattung Ginkgo
Art biloba
Wissenschaftlicher Name Ginkgo biloba L.
Der Ginkgobaum gehört zu der Unterabteilung der Gymnospermae (Nacktsamer), die einem paraphyletischen Taxon entsprechen, welches Pflanzen zusammenfasst, die zwar Samen hervorbringen, diese aber nicht mit einer Frucht schützend umhüllen (Heß, 2005). Die Herkunft des Wortes Ginkgo ist nicht genau bekannt. Wahrscheinlich hat es seinen Ursprung in dem Begriff, der in Japan bzw. China gebräuchlich ist: jap. ギンキ ョウ Ginkyō (heutige Schreibweise イチョウ ichō), chinesisch 銀杏, Yín Xìng „Sil-berne Aprikose“.
Ginkgo ist ein zweihäusiger (diözischer), sommergrüner Baum, d.h., es gibt weibliche und männliche Pflanzen, die im Herbst ihre Blätter abwerfen (s. Abbildungen 3Abbildung 3-A und 3-B). Junge Ginkgobäume haben eine schmale Krone, die jedoch bei älteren Exemplaren breiter wird. Die Möglichkeit, sich fortzupflanzen, erreicht der Ginkgo erst in einem Alter von 20 bis 30 Jahren (Strasburger et al., 1983). Besonders auffällig sind die im rechten Winkel von der Hauptachse abgehenden, gestauchten Kurztriebe, an denen sich Ende April bis Anfang Mai Blätter und Blüten entwickeln (s. Abbildung 3-C).
Die Blätter des Ginkgobaums weisen eine charakteristische Form auf. Sie sind lang ge-stielt, fächerförmig bis zweilappig und werden von strahlig verlaufenden, gabelig ver-zweigten Nerven (Dichotomie) durchzogen. Diese intensiv grünen, zur Zeit der Herbst-färbung leuchtend goldgelben Blätter sind kahl, schwach bewachst und unterschiedlich groß. Die Blätter können sowohl in ihrer Breite als auch Fläche variieren. Während die männlichen Blütenstände Haselnusskätzchen (s. Abbildung 4-A) ähneln, sitzen die weiblichen Blüten (s. Abbildung 4-B) terminal mit zwei Samenanlagen auf einem lan-gen Stiel. Allerdings entwickelt sich jeweils nur eine Anlage zum Samen (Juretzek and Müller, 2002).
Nach erfolgreicher Befruchtung entstehen an den weiblichen Bäumen zahlreiche, rund-liche, mirabellenähnliche gelbe Samen (s. Abbildung 5-A). Die reifen Samen beinhalten ein Embryo und ein Integument, das aus einer äußeren, dickfleischig-weichen Schicht (Sarcotesta) und einer inneren versteinerten, weißlichen, zwei- oder dreikantigen Skle-rotesta besteht. Die SkleSkle-rotesta wird wegen ihrer Analogie mit Steinfrüchten oft auch „Steinkern“ genannt (s. Abbildung 5-B). Beim Verfaulen der pflaumenartigen Früchte Abbildung 3. Gingkobaum im Sommer (A) und Winter (B); Ginkgoblatt (C)
Abbildung 4. Weibliche (A) und männliche (B) Ginkgoblüten.
,
tritt häufig ein sehr unangenehmer Geruch auf, der auf einen hohen Anteil an Butter-, Valerian- und Capronsäure zurückzuführen ist. Dies führt dazu, dass überwiegend männliche Bäume durch Stecklinge vermehrt und in den Gartenanlagen angepflanzt werden.
1.1.3. Droge und Inhaltsstoffe
Als arzneilich genutzte Droge für die Herstellung standardisierter Extrakte werden die grünen, noch nicht gelb verfärbten Blätter von Ginkgo verwendet. Der heute hohe Be-darf an der Ginkgodroge wird durch Plantagen in Frankreich und den USA gesichert. Die in Ginkgo vorkommenden sekundären Pflanzeninhaltsstoffe sind heute weitgehend bekannt. Es handelt sich um eine Vielzahl von polaren und apolaren Substanzen, die aus den Blättern von Ginkgo isoliert wurden. Hauptinhaltsstoffe der Droge Ginkgo folium sind, nach der WHO Monographie (Kommission-E, 1994):
0,5-2% Flavonoide; nach dem Europäischen Arzneibuch (EAB, 2006) mindes-tens 0,5%
0,06-0,23% Ginkgolide 0,26% Bilobalid
Weiterhin enthalten Ginkgoblätter Sesquiterpene, Steroide, Benzenoide, Karotinoide, Phenylpropanole und Kohlenhydrate. Nicht-glykosidische Biflavone, Catechin und Pro-anthocyanidine sind auch vorhanden.
Nachfolgend werden die wichtigsten pharmakologischen Inhaltsstoffe beschrieben. Abbildung 5. Ginkgofrüchte (A) und -samen (B).
1.1.3.1. Flavonoide
Flavonoide gehören zu einer Gruppe von sekundären pflanzlichen Inhaltsstoffen, die in der Natur sehr weit verbreitet sind. Die Bezeichnung Flavonoide leitet sich von dem lateinischen Wort „flavus“ (gelb) ab, welche darauf zurückzuführen ist, dass diese Sub-stanzen häufig eine gelbe Farbe besitzen.
Ginkgo verfügt über hohe Konzentrationen an Flavonoiden, darunter Flavonolglykosi-de, acylierte FlavonolglykosiFlavonolglykosi-de, BiflavonoiFlavonolglykosi-de, Flavan-3-ole bzw. Proanthocyanidine. Als Aglyka der Flavon- und Flavonolglykoside kommen in erster Linie Kämpferol, Quercetin und Isorhamnetin vor. Bis heute wurden annähernd 40 verschiedene flavo-noidartige Substanzen in Ginkgo nachgewiesen. Unter diesen identifizierten Verbin-dungen sind Mono-, Di- und Triglykoside von Flavonolen mit den Hauptvertretern Kämpferolrutinosid, Isoquercetinrutinosid und Quercetinrutinosid (Rutosid) sowie Zimtsäureester von Flavonolglykosiden mit den Hauptkomponenten 6’’’-Cumaroyl-kämpferolrutinosid und 6’’’-Cumaroylrutosid (Smith and Luo, 2004). Die Strukturen der wichtigsten Flavonoidverbindungen aus Ginkgo biloba sind in Abbildung 6 aufge-führt. OH 2 3 5 6 7 8 1' 2' 3' 4' 5' 6' 4 HO OH O O R1 OH OH HO OH O O
O-Mono-, Di-, Triglykoside R1 OH HO OH O O R1 O O HO HO HO O O OH OH HO O O OH Aglyka Flavonolglykoside Flavonolacylglykoside R1 Derivat H Kämpferol OH Quercetin OCH3 Isorhamnetin
Außerdem enthalten die Blätter Biflavone, vor allem Sciadopitysin, Ginkgetin und Iso-ginkgetin (Rimpler, 1999).
1.1.3.2. Terpenoide
Eine weitere Klasse sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe in Ginkgo stellen die Isoprene dar. Hierzu zählen Steroide und Terpene, wobei sechs verschiedene terpenoide Verbindun-gen aus Ginkgo bekannt sind: die DiterpenverbindunVerbindun-gen Ginkgolid A, B, C, J und M und das Sesquiterpen Bilobalid (s. Abbildung 7).
O O O O O H3C R2 R1 R3 O C(CH3)3 O HO 1 10 7 A B C D E F OH R1 R2 R3 Ginkgolid Bilobalid OH H H A OH OH OH B OH OH OH C OH H OH J H OH OH M O O C(CH3)3 O HO O O O
Die Ginkgolide A, B, C, J und M gehören zu einem ungewöhnlichen, auf einem Spiro-bicyclononan-Grundgerüst basierenden Typ von Diterpenen, der bisher nur in Ginkgo nachgewiesen wurde. Ginkgolid M kommt allerdings nur in der Wurzel vor (Nakanishi, 2005; Bolshakov et al., 2006). Das Molekülgerüst baut sich aus mehreren, fünfgliedri-gen Rinfünfgliedri-gen auf, die dreidimensional zu stabilen, im Fall der Ginkgolide, zu käfigartifünfgliedri-gen Strukturen kondensiert sind. Ring A und die drei sauerstoffhaltigen Ringe C, D und F umschließen einen Hohlraum, in dem Kationen oder Molekülteile geeigneter Größe eingelagert und durch multidentate Wechselwirkung mit den Sauerstoffatomen, die den Hohlraum umgeben, gebunden werden können (Hänsel and Sticher, 2004).
Ein weiteres Terpen ist das Bilobalid. Diese Verbindung zählt zu den Sesquiterpen. Ihre Struktur zeigt noch die Verwandtschaft zu den Ginkgoliden. Biogenetisch handelt es sich um ein Abbauprodukt der Ginkgolide, das wahrscheinlich durch Abspaltung von vier Kohlenstoffatomen aus den Ringen F und A sowie einem Kohlenstoffatom aus dem Abbildung 7. Terpenlaktone aus Ginkgo biloba L.
Ring E entstanden ist und daher als Pentanoditerpen einzuordnen ist (Rimpler, 1999). Es enthält ebenfalls drei Laktonringe und eine tertiäre Butylgruppe.
1.1.3.3. Andere Inhaltsstoffe
Neben den bereits genannten Hauptinhaltsstoffen kommen weitere Substanzen in Gink-goblättern vor.
Ginkgolsäuren und andere, ähnlich aufgebaute Polyketide, sind in den fleischigen äuße-ren Teilen der Samenschale (Sarcotesta) und in geringer Konzentration auch in den Blättern vorhanden; weiterhin kommen alycyclische Säuren, Cyclite, Kohlenhydrate und ihre Derivate sowie Shikimisäure, Chinasäure, Ascorbinsäure und Zuckersäure vor. Pinit, Sequoyit und Saccharose stellen genauso weitere in Ginkgo vorhandene sekundä-re Pflanzeninhaltsstoffe dar wie die langkettigen Kohlenwasserstoffe und Derivate, Al-kohole, Aldehyde (z.B. 2-Hexanal, Blattaldehyd), Ketone und Säuren. Ferner findet man u.a. Substanzen wie (Z, Z)-4,4’-(1,4-Pentadien-1,5-diyl) diphenol, 6-Hydroxy-kynurensäure, Cytokinine und ß-Lectine,
1.2. Standardisierte Extrakte
Ginkgo wird therapeutisch in Form eines Trockenextraktes eingesetzt, d.h. einer Mi-schung aus verschiedenen in Ginkgo vorkommenden sekundären Pflanzeninhaltsstof-fen. Zur Gewährleistung der Vergleichbarkeit bei klinischen Studien und der therapeuti-schen Anwendung ist eine qualitative und quantitative Standardisierung des Ginkgoex-traktes in Bezug auf bestimmte Inhaltsstoffe erforderlich.
Nach Angaben des Deutschen Arzneibuches (DAB, 2006) und des Europäischen Arz-neibuches (EAB, 2006) müssen Ginkgotrockenextrakte aus getrockneten und zerklei-nerten Ginkgoblättern unter Verwendung von Aceton 60% (m/m) und einem mehrstufi-gen Extraktionsverfahren hergestellt werden. Hierbei müssen die in der Monographie Extrakte (Extracta) für die Erstellung von Trockenextrakten beschriebenen Verfahrens-weisen eingehalten werden.
Als Arzneistoffe werden laut Monographie der Komission E (publiziert im Bundesan-zeiger Nr. 133 vom 19.07.1994) nur noch Spezialextrakte akzeptiert, die als Wirkstoff einen Trockenextrakt enthalten, der ein Droge-Extrakt-Verhältnis (DEV) von 35-67 zu
1 (Mittelwert 50:1) aufweist und durch Extraktion mit Aceton 60% und nachfolgenden Reinigungsschritten ohne Zumischung von Konzentraten oder isolierten Inhaltsstoffen hergestellt wurde. Derartige Spezialextrakte gewährleisten einen Gehalt von 22-27% Flavonoidglykoside berechnet als Flavonoidglykoside mit einer mittleren Molmasse von Mr 756,7 sowie mindestens 5 und höchstens 7 Prozent Terpenlaktone (davon 2,8 bis 3,4% als Ginkgolide A, B und C und 2,6 bis 3,2% als Bilobalid). Weitere Inhalts-stoffe der Spezialextrakte sind z.B. Hydroxykynurensäure, Shikimisäure, Protrocatechu-säure, Vanillinsäure und Parahydroxybenzoesäure.
Durch diese speziellen Herstellungsverfahren werden Stoffe in den Spezialextrakten eliminiert, welche u.a. die Stabilität beeinträchtigen oder die wegen ihrer toxischen Ei-genschaften entfernt werden sollten. Entfernt werden im wesentlichen Fette, Wachse, Tannine, Proanthocyanidine, Biflavone, Ginkgole, Ginkgolsäure, Proteine und minerali-sche Bestandteile.
Insbesondere für Ginkgolsäuren konnte gezeigt werden, dass sie ein allergenes, zytoto-xisches, mutagenes und tumorpromovierendes Potenzial aufweisen (Hausen, 1998; Sie-gers, 1999; Koch et al., 2000; Westendorf and Regan, 2000; Ahlemeyer et al., 2001; Baron-Ruppert and Luepke, 2001). Die für die Arzneimittelherstellung verwendeten Extrakte haben einen Gehalt von < 5ppm Ginkgolsäuren.
Nur die standardisierten Extrakte „EGb 761“ und „LI 1370“ erfüllen die o.g. Kriterien.
1.3. Anwendungen
1.3.1. Historische Anwendung
Der Einsatz von Ginkgopräparaten für medizinische Zwecke reicht mehr als 5.000 Jahre in die Ursprünge der traditionellen chinesischen Medizin zurück. Zunächst wurden die Früchte oder Samen („Bai-guo") des Ginkobaumes für den therapeutischen Einsatz verwendet. Dieser erste medizinische Einsatz wurde während der Yuan Dynastie (1280-1368) in Li Tung Wan’s Werk „Shi Wu Ben Cao“ (Essbare Pflanzen) und in Wu-rui’s Werk „Ri Yong Ben Cao“ (Pflanzen des täglichen Gebrauchs) schriftlich belegt (De-Feudis, 2003). Die Samen wurden zur Behandlung von Erkrankungen wie Asthma, chronischer Bronchitis, Tuberkulose und Harnfluss verwendet. Eine Einnahme der
Blät-ter zu medizinischen Zwecken wurde erstmals in einem Text von Liu Wen-Tai, „Ben Cao Pin Hue Jing Yaor“ in 1505 beschrieben (Zimmermann et al., 2002). Jedoch sind die Ginkgo biloba Blätter erst seit kurzem in den chinesischen Arzneibüchern zur Be-handlung von Herz- und Lungenerkrankungen zu finden (DeFeudis, 2003).
Für keine der zahlreichen Wirkungen und Indikationen, welche über die Jahrhunderte beschrieben wurden, gibt es klinische Belege. Deshalb sind sie nach den Regeln einer rationalen Phytotherapie nicht von wissenschaftlicher Bedeutung.
1.3.2. Aktuelle Anwendung
Ginkgo wird heutzutage nicht nur in der traditionellen Medizin, sondern auch als Arz-neipflanze in Fertigarzneimitteln der Schulmedizin, die auf pharmakologischen Unter-suchungen und klinischen Studien basieren, angewendet. Bei der therapeutischen An-wendung von Ginkgo ist es in diesem Kontext wichtig, grundsätzlich zu unterscheiden zwischen den traditionellen Therapiemethoden, die nur auf Erfahrungswissen beruhen, und der Schulmedizin, die durch wissenschaftliche Forschungen und Studien gestützt und belegt wird.
Folgende Gruppen von Ginkgopräparaten müssen aus wissenschaftlicher und rechtli-cher Sicht unterschieden werden:
Rationale Phytopharmaka (zugelassen nach Abs. 2. Und 3 des Arzneimittelge-setztes (AMG)
Traditionell angewendete Präparate (Zulassung nach §109a des AMG) Homöopathische Präparate
Nahrungsergänzungsmittel
Rationale Phytopharmaka
In Europa, besonders in Deutschland und Frankreich, existiert ein großer Markt für rati-onale Phytopharmaka, die als Wirkstoff einen Trockenextrakt aus Ginkgo besitzen. Weiterhin lässt sich die Bedeutung von Ginkgoprodukten dadurch erkennen, dass diese Arzneipflanze bzw. deren Spezialextrakt vor einigen Jahren in der von der WHO neu geschaffenen Gruppe Antidementiva des ATC-Index unter dem Code N06D gelistet wurde. Weiterhin enthält die Rote Liste 2007 in der Hauptgruppe Antidementiva
(Nootropika) 19 allopathische und apothekenpflichtige Ginkgopräparate, die in festen und flüssigen Darreichungsformen angeboten werden. Die einzigen monografiekonfor-men Ginkgopräparate, die dem aktuellen Wissensstand in Bezug auf klinische Studien entsprechen, sind als Monopräparate im Handel. Eine sinnvolle Kombination mit Ex-trakten anderer Arzneipflanzen konnte bisher nicht gezeigt werden. Wie in Abbildung 8 und dem Anhang veranschaulicht, werden diese Präparate auch in unterschiedlichen Extraktdosierungen angeboten. Hinsichtlich ihrer Wirkstoffspezifikation entsprechen alle Präparate den Vorgaben der Monographie der Kommission E von 1994 (BfArM, 1994).
Abbildung 8. Auswahl von verschiedenen rationalen Ginkgophytopharmaka.
Das Interesse am therapeutischen Einsatz von Ginkgo wurde ursprünglich ausgelöst durch den EGb 761 Extrakt von Dr. Willmar Schwabe Arzneimittel (Karlsruhe, Deutschland). EGb 761 wird in Europa seit Anfang der 90er Jahre unter dem Handels-namen „Tebonin“ als Phytopharmakon angeboten. Im Gegensatz dazu sind in den USA Produkte, die EGb 761 enthalten, durch die US-Zulassungsbehörde FDA nur als Nah-rungsergänzungsmittel und nicht als Arzneimittel zugelassen. Die französische Firma Beafour-Ipsen und ihre deutsche Tochtergesellschaft Ipsen Pharma produzierten EGb
761 und vermarkten es als Tanakanund Rökan. Inzwischen gibt es mit LI 1370 einen weiteren Spezialextrakt, der unter dem Handelsnamen Kaveri auf dem Markt ist.
Alle diese Präparate enthalten als Wirkstoff den in Abschnitt 1.2 beschrieben Spezial-trockenextrakt mit einem Droge-Extrakt-Verhältnis von 35-67:1.
Die Monographie der Kommission E (1994) erkennt für die definierten Spezialextrakte (EGb 761 und LI 1370) folgende Anwendungsgebiete an :
Zur symptomatischen Behandlung von hirnorganisch bedingten Leistungsstö-rungen im Rahmen eines therapeutischen Gesamtkonzeptes bei demenziellen Syndromen mit Leitsymptomatik, d.h. Gedächtnisstörungen, Konzentrationsstö-rungen, depressive Verstimmung, Schwindel, Ohrensausen oder Kopfschmer-zen. Zur primären Zielgruppe gehören demenzielle Syndrome bei primär dege-nerativer Demenz, vaskulärer Demenz und Mischformen aus beiden.
Zur Verbesserung der schmerzfreien Gehstrecke bei peripherer arterieller Ver-schlusskrankheit der Stadien IIa bis IIb nach Fontaine (Claudicatio intermittens) im Rahmen von physikalisch-therapeutischer Maßnahmen, insbesondere Geh-training.
Schwindel und Tinnitus begründet auf vaskulärer und involutiver Genese.
Traditionell angewendete Präparate
Es gibt auf dem Markt einige traditionell angewendete Ginkgopräparate, deren Indikati-on und Wirksamkeit auf jahrelanger Beobachtung beruhen. Zu diesen Präparaten liegen keine Studiendaten vor und somit ist nach den Regeln der Evidence-based-Medicine keine Wirksamkeit zu erwarten. Eine Vergleichbarkeit mit den Phytopharmaka, die auf-grund von positiven Studienergebnissen zugelassen sind, ist daher keinesfalls möglich. Schon allein aufgrund der unterschiedlichen Zusammensetzung und Dosierung der Ex-trakte.
Traditionell angewendete Präparate müssen lediglich bestimmte Qualitätskriterien erfül-len und nach AMG §109a entsprechend gekennzeichnet sein. Die Richtlinie 2004/24/EG der Kommission E (2004) bezeichnet diese Produkte ebenfalls als traditio-nelle pflanzliche Arzneimittel.
Laut § 109a Abs. 3 des AMG muss auf der Verpackung traditionell angewandter Arz-neimittel, eine oder mehrere der folgenden Deklarationen angegeben sein:
Abbildung 9. Traditionell angewen-detes Ginkgopräparat.
Abbildung 10. Homöopatisches Ginkgopräparat.
„Traditionell angewendet
…als mild wirkendes Arzneimittel....“ …zur Stärkung oder Kräftigung…“ …zur Besserung des Befindens…“
…zur Unterstützung der Organfunktion…“ …zur Vorbeugung…, usw.“
Ein Beispiel für solche Ginkgopräparate ist Ginkgo 405 Duopharm (s. Abbildung 9). Dieses Präparat in Drageeform wird laut
Verpa-ckung „zur Förderung der Durchblutung und Kräf-tigung des Adernsystems“ eingesetzt. Weiterhin enthält es einen Extrakt, welcher nicht die Anforde-rungen der Kommission E erfüllt. Der Extrakt wird mit 30% bzw. 96% Ethanol (V/V) als Auszugsmit-tel hergesAuszugsmit-tellt und enthält 10% Flavonoidglykoside; das Droge-Extrakt-Verhältnis entspricht 9-11:1.
Homöopathische Präparate
Nach dem AMG ist ein homöopathisches Arzneimit-tel ein ArzneimitArzneimit-tel, das nach einem homöopathi-schen Zubereitungsverfahren hergestellt wurde, wel-ches im Europäischen Arzneibuch oder - falls dort nicht vorhanden - in den offiziell gebräuchlichen Pharmakopöen der Mitgliedstaaten der EU verzeich-net ist. Ein homöopathisches Arzneimittel kann auch mehrere Wirkstoffe enthalten. Zwar sind einige
Prä-parate aus Ginkgo als homöopathische Arzneimittel registriert, wie z.B. Ginkgo biloba Hevert (s. Abbildung 10), aber es wird - wie auch bei anderen Homöopathika und Dro-gen - keine Angabe über eine therapeutischen Indikation gemacht. Allerdings sind diese Präparate mit den o.g. pflanzlichen Arzneimitteln nicht vergleichbar und vereinbar und werden deshalb nicht weiter betrachtet.
Nahrungsergänzungsmittel
Weltweit sind zahlreiche Nahrungsergänzungsmittel mit Ginkgo als vermeintlich wirk-samen Bestandteil auf dem Markt, die jedoch häufig nur eine mangelhafte Qualität auf-weisen. Im Besonderen ist dies in den USA zu sehen, wo Ginkgoprodukte nicht als Arzneimittel zugelassen sind, sondern nur als Nahrungsergänzungsmittel akzeptiert werden. Hieraus resultieren andere Regularien für die Überwachung dieser Produkte. Auch in Deutschland werden Ginkgoprodukte, wie z.B. die in Abbildung 11 dargestell-ten, als Nahrungsergänzungsmittel angebodargestell-ten, bei denen eine physiologische Wirkung nicht vollständig ausgeschlossen werden kann. Deshalb ist bei vielen dieser Produkte unklar, wie hoch das potentielle Gesundheitsrisiko ist.
In der EU werden Ginkgoprodukte rechtlich durch die Richtlinie 2002/46/EG reguliert. Gemäß der geltenden Nahrungsergänzungsmittel-Verordnung ist ein Nahrungsergän-zungsmittel „ein Lebensmittel, welches
dazu bestimmt ist, die allgemeine Ernährung zu ergänzen,
ein Konzentrat von Nährstoffen oder sonstigen Stoffen mit ernährungsspezifi-scher oder physiologiernährungsspezifi-scher Wirkung allein oder in Zusammensetzung darstellt und
in dosierter Form, insbesondere in Form von Kapseln, Pastillen, Tabletten, Pil-len, Brausetabletten und anderen ähnlichen Darreichungsformen, Pulverbeutel, Flüssigampullen, Flaschen mit Tropfeinsätzen und ähnlichen Darreichungsfor-men von Flüssigkeiten und Pulvern zur Aufnahme in abgemessenen kleinen Mengen in den Verkehr gebracht wird.“
In Deutschland werden Ginkgoprodukte zusätzlich zum Arzneimittelbereich auch als Nahrungsergänzungsmittel angeboten. Obwohl solche Mittel physiologische Wirkungen Abbildung 11. Beispiele für Ginkgo-Nahrungsergänzungsmittel.
verursachen können, ist ihr Verkauf auch ohne umfassende Erforschung ihrer Wirksam-keit oder UnbedenklichWirksam-keit möglich. Deshalb ist für viele von diesen Produkten sowohl die Qualität als auch die Unbedenklichkeit unklar und nicht gewährleistet.
Die mangelhafte Qualität dieser Ginkgoprodukte wurde unter anderem auch in einer Untersuchung des Zentrallaboratoriums Deutscher Apotheker aufgezeigt, in der nach-gewiesen wurde, dass einige der untersuchten Präparate nicht die Kriterien der Kom-mission E erfüllten und aus diesem Grund nicht als Fertigarzneimittel betrachtet werden sollen.
Zwar enthalten diese Nahrungsergänzungsmittel Ginkgoblätter oder Ginkgoextrakte (EGb), unterscheiden sich aber bezüglich des „Wirkstoffes“ (=Extrakt, der hierbei den Wirkstoff darstellt), gravierend von Ginkgopräparaten, die als Arzneimittel zugelassen sind (Meins et al., 2005). Es wurde gezeigt, dass diese Produkte unzulässig hohe Men-gen an Ginkgolsäure beinhalten, was für die Patienten ein Gesundheitsrisiko mit sich bringt. Laut der E-Monographie der Kommission, sollte der zulässige Höchstwert von 5 ppm nicht überschritten werden. Da bei einigen dieser Produkte zwar in der Werbung, nicht jedoch auf der Packung, auf die zugelassene Indikation von Fertigarzneimittel aus Ginkgo hingewiesen wird, könnten Patienten irrtümlich annehmen, dass die Wirkung von entsprechenden Nahrungsergänzungsmitteln den Fertigarzneimitteln vergleichbar wäre.
Aussagen in der Produktwerbung von Nahrungsergänzungsmitteln werden seit dem 1. Juli 2007 durch die neue Gesundheitsverordnung 1924/2006 (Europäische-Union, 2007) geregelt. Krankheitsbezogene Aussagen und Indikationen sind, wie für andere Lebens-mittel auch, nicht zulässig.
1.4. Pharmakokinetik
Die Pharmakokinetik der Ginkgo-Inhaltstoffe wurde sowohl in Tier- als auch in Hu-manstudien untersucht.
Moreau et al. (1986) verabreichten bei der Durchführung ihrer Tierstudie einen radioak-tiv markierten, standardisierten Extrakt EGb 761 p.o. an Ratten, wobei eine Absorpti-onsrate von 60% bestimmt wurde. Da schon nach 1,5 Stunden spezifische Radioaktivi-tät im Blut festgestellt wurde, wurde davon ausgegangen, dass die Resorption im oberen Magen-Darm-Trakt stattfindet. Die glandulären und neuronalen Gewebe bzw. die Au-gen zeigten eine hohe Affinität zu den markierten Inhaltsstoffen des verabreichten Ex-traktes. Die Eliminationshalbwertszeit des markierten Extraktes betrug etwa 4,5 Stun-den. Nach 72 Stunden waren 22% der Radioaktivität im Urin und 29% in den Fäzes. Nachfolgend wird auf weitere Untersuchungen eingegangen, bei denen bestimmte Fla-vonoide oder Terpenoide verabreicht wurden.
1.4.1. Terpenoide
Zur Untersuchung der Bioverfügbarkeit der Terpene aus Ginkgo (Ginkgolide und Bilo-balid) wurde eine Humanstudie mit 12 Probanden durchgeführt (KG = 59 ± 9 kg). Die Auswertung der Plasmaproben wurde mittels einer GC/MS-Analytikmethode ermittelt (Fourtillan et al., 1995). Nach der oralen und intravenösen Verabreichung von EGb 761 stellten Fourtillan et al. die absolute Bioverfügbarkeit von 80%, 88% und 79% für Ginkgolid A (GA), Ginkgolid B (GB) und Bilobalid (Bb) fest. Daher kann davon aus-gegangen werden, dass diese drei Terpenlaktonen, die nicht metabolisiert werden, fast vollständig absorbiert werden (Fourtillan et al., 1995).
Darüber hinaus wurde auch die Pharmakokinetik untersucht. Die maximalen Plasma-konzentrationen wurden innerhalb von 1 bis 2 Stunden erreicht und betrugen 33,3, 16,5 und 18,81 ng/mL für GA, GB und Bb (s. Abbildung 12). Die entsprechenden Eliminati-onshalbwertszeiten betrugen 4,5, 10,5 und 3,2 Stunden und die Urinausscheidungen beliefen sich auf 72,3%, 41,4% und 31,2% der oralen verabreichten Dosis. Die Zugabe
Es wurde beobachtet, dass Bb in biologischen Proben (Plasma, Urin, Fäzes) instabil war, da in neutralen oder alkalischen Medien die laktonische Gruppe durch eine irreversible Hydrolyse gespalten wird. Im Gegensatz dazu werden GA und GB durch eine Säuerung des Milieus laktonisiert (Fourtillan et al., 1995).
In einer weiteren Studie wurde die Bioverfügbarkeit der Terpenoide aus EGb 761 an Ratten untersucht. Die Auswertung erfolgte ebenfalls mittels einer GC/MS-Analytik in Anlehnung an die Methode von Fourtillan (Biber and Koch, 1999). In diesem Fall wur-den wur-den Tieren auch verschiewur-dene Dosierungen von EGb 761 (30, 55 und 100 mg/kg KG) p.o. verabreicht. Die Pharmakokinetik war für alle drei Terpenlaktone (GA, GB und Bb) linear. Die maximalen Plasmakonzentrationen wurden für die drei untersuchten Substanzen innerhalb von einer Stunde erreicht und die Halbwertzeiten (t1/2) betrugen zwischen 1,7 und 3 Stunden.
Bei der Untersuchung der Pharmakokinetik bei älteren Menschen (67-89 Jahre, n=12) nach einfacher und mehrfacher Gabe von EGb 761 (Biber, 2003) wurden bis auf die Clearance keine Unterschiede festgestellt. Im Vergleich zu jungen und gesunden Pro-Abbildung 12. Konzentrations-Zeit-Verlauf im Plasma von Terpenoiden nach einmaliger Gabe von 1,44, 1,03 und 3,36 mg von Ginkgolid A, Ginkgolid B und Bilobalid an Menschen (Fourtil-lan et al., 1995).
banden, waren die Clearance-Werte etwas niedriger. Dies war aber zu erwarten, da die Clearance im Laufe des Lebens in der Regel abnimmt.
Weitere Untersuchungen haben die Bioverfügbarkeit von GA, GB und Bb durch HPLC/APCI bestätigt (Mauri et al., 2001). Wie auch schon in den oben aufgeführten Studien zu beobachten war, konnte auch kein Ginkgolid C nachgewiesen werden. In einer neuen Studie haben Mauri et al. (2006) die Bioverfügbarkeit von GA, GB und Bb durch HPLC/APCI bestätigt und festgestellt, dass die Abwesenheit von Ginkgolid C in Plasmaproben tierischer und menschlicher Herkunft auf seine schnelle Methylierung zurückzuführen ist.
Die Bioverfügbarkeit von Ginkgolid C ist bis jetzt nicht ausführlich untersucht. In den oben aufgeführten Studien, die bis 2006 durchgeführt wurden, konnte kein Ginkgolid C in Plasmaproben nachgewiesen werden. Mauri et al. (2006) vermuten, dass die Abwe-senheit von Ginkgolid C in Plasmaproben tierischer und menschlicher Herkunft auf eine schnelle Methylierung zurückzuführen ist. In einer neuen Studie wurde jedoch die Bio-verfügbarkeit vom Ginkgolid C nach intravenöser Gabe an Ratten festgestellt (Xie et al., 2008). Die orale Bioverfügbarkeit und damit die pharmakologische Relevanz von Gink-golid C bleiben trotzdem offen.
1.4.2. Flavonoide
Fast alle Flavonoide, die in EGb 761 enthalten sind, kommen in Form von Flavonol- und Acylglykosiden vor und haben eine oder mehrere Zuckerreste (Hasler et al., 1992; Tang et al., 2001). Die zugehörigen Aglyka sind Quercetin, Kämpferol oder Isorhamne-tin (s. Abschnitt 1.1.3.1 Flavonoide). Die glykosidischen Reste befinden sich in den Positionen 3‘ und 4‘. Bei den Kohlenhydratmolekülen handelt es sich in der Regel um Einheiten von L-Rhamnose, D-Glucose oder Glukorhamnose.
In einer Rattenstudie konnten nach der Verabreichung von 300 mg/kg EGb 761 die Aglyka Quercetin, Kämpferol und Isorhamnetin im Plasma nachgewiesen (Watanabe et al., 2001) und somit die Bioverfügbarkeit von den Flavonolglykosiden belegt werden. Ferner wurde eine humane Studie durchgeführt, bei der die drei o.g. Aglyka im Urin an drei Probanden bestimmt wurden (Drieu, 1986). Weiterhin wurden die pharmakokineti-schen Parameter der Aglyka in zwei Pilotstudien untersucht: eine vorläufige Studie mit
zwei gesunden Freiwilligen und eine Bioäquivalenzstudie mit 18 gesunden Probanden (Nieder, 1991; Wojcicki et al., 1995).
Da es sich bei Quercetin um den häufigsten Vertreter der Flavonoide handelt, wurden seine Pharmakokinetik und Bioverfügbarkeit sowie sein Metabolismus vielfach unter-sucht. U.a. wurde Quercetin in verschiedenen Studien als reine Substanz oder aus ver-schiedenen pflanzlichen Quellen, u.a. aus Zwiebeln, Äpfeln und EGb 761, verabreicht. Dazu zählen Rattenstudien (Pietta et al., 1995; Manach et al., 1996; Abrahamse et al., 2005), Schweinestudien (Cermak et al., 2003) und Humanstudien (Hollman and Katan, 1997; Pietta et al., 1997; Erlund et al., 2000; Graefe et al., 2001; Williamson and Ma-nach, 2005).
Die Mechanismen, die für die Absorption und den Metabolismus von Flavonoidglyko-siden verantwortlich sind (s. Abbildung 13), wurden zwar in Ratten und Menschen un-tersucht, sind aber noch nicht vollständig aufgeklärt und werden immer noch wissen-schaftlich diskutiert.
Vor der Resorption werden die Flavonolglykoside durch Hydrolyse im Dünndarm deglykosidiert (Crespy et al., 1999; Wolffram et al., 2002; Spencer et al., 2003). Danach Abbildung 13. Möglicher Metabolismus von Flavonoiden.
können verschiedene Konjugationsschritte durch Enzyme stattfinden (Phase II-Reaktionen), so dass glucuronidierte, sulfatierte und methylierte Derivate aus Quercetin, Kämpferol und Isorhamnetin entstehen. Ein besonderer Nachweis liegt über den aus-führlichen Metabolismus der Phase-I-Deglykosilierung und Phase-II vor, der durch UDP-glucuronosyltransferasen, Sulphotransferasen und Catechol-O-Methyltransferasen erfolgte (Shali et al., 1991; Spencer et al., 1999; O'Leary et al., 2003). Als nächster Schritt werden die erzeugten Metaboliten resorbiert. Dies kann mittels passiver Diffusi-on durch die Enterozytenmembran oder durch Aufnahme über einen aktiven Transporter geschehen (Ader et al., 2000; Cermak et al., 2003). Als Folge dieses Metabolismus be-finden sich im Blut keine der im Extrakt enthaltenen Flavonolglykosiden, sondern ein Gemisch von glukuronidierten, sulfatierten und methylierten Derivaten aus Quercetin, Kämpferol und Isorhamnetin. Anschließend können weitere Metabolismusschritte in der Leber erfolgen (Hollman and Katan, 1997; Oliveira et al., 2002). Flavonoide, die im Dünndarm nicht resorbiert werden, und jene, die von der Galle abgegeben werden, wer-den im Dickdarm durch Mikroorganismen zu verschiewer-denen Benzo- oder Phenolsäuren umgewandelt. Diese werden anschließend weiter absorbiert oder mit dem Urin elimi-niert (Pietta et al., 1997).
Fast alle Flavonoide, die im Plasma und Urin vorkommen, liegen glucuronidiert, sulfa-tiert oder als Methylderivate vor (Watson and Oliveira, 1999; Day et al., 2001). Als Er-gebnis des Stoffwechsels sind keine von den ursprünglichen Flavonoylglykosiden und kein oder nur ganz wenig Quercetin in vivo zu finden (Ader et al., 2000; Erlund et al., 2000; Graefe et al., 2001; Cermak et al., 2003). Die durch die verschiedenen Stoffwech-selwege entstehenden Metaboliten erreichen anschließend die verschiedenen Gewebe bzw. Zellen und sind dort für die zelluläre Wirkung verantwortlich.
1.5. Wirksamkeit von Ginkgo bei Hirnleistungsstörungen
Es gibt eine Reihe von Studien über die Wirksamkeit von EGb 761 bei Hirnleistungs-störungen wie der Alzheimer Demenz, die in verschiedenen Publikationen zusammen-gefasst sind (Ahlemeyer and Krieglstein, 2003b; Smith and Luo, 2004; Ramassamy et al., 2007a). Einige davon belegen die klinische Wirksamkeit von EGb 761, während andere die dazu gehörigen möglichen Mechanismen pharmakologisch in vitro und in vivo erklären. Diese Studien wurden zum überwiegenden Teil mit dem Ginkgoextrakt EGb 761 durchgeführt. Ebenfalls gut dokumentiert sind Untersuchungen mit dem Ex-trakt LI 1370.
Die durch standardisierte Spezialextrakte nachgewiesenen Wirkungen, umfassen neu-roprotektive und durchblutungsfördernde Effekte, die Steigerung der Gedächtnisleis-tungen und des Lernvermögens sowie eine bessere Kompensation von Gleichgewichts-störungen. Allerdings sind die molekularen Mechanismen, die für diese Wirkungen ver-antwortlich sind, noch nicht vollständig geklärt.
Zu den pharmakologischen Wirkungen von Ginkgoextrakten liegen über 300 Original-publikationen vor. Tierexperimentell wurden bei Ginkgoextrakten bisher folgende Wir-kungen nachgewiesen: PAF-Antagonismus, Beeinflussung des zentralen cholinergen Systems, Verringerung altersbedingter Defizite der Neurotransmission, Verbesserung von Gedächtnisleistung und Lernvermögen, Neuroprotektion durch Membranprotekti-on, Steigerung der Hypoxietoleranz, antiischämische Eigenschaften, Hemmung des Hirnödems, Schutz vor Läsion zerebraler Strukturen und Hemmung von Apoptose. Zu-sätzlich gibt es auch Belege für Radikalfängereigenschaften sowie hämodynamische, vaskuläre und hämorheologische Eigenschaften.
Die Frage, welche Inhaltsstoffe oder Inhaltsstoffklassen an der neuroprotektiven Wir-kung von EGb 761 beteiligt sind, ist noch nicht abschließend geklärt. Wie bei anderen Phytopharmaka ist auch bei Ginkgoextrakten davon auszugehen, dass die Gesamtwir-kung des Extraktes aus einem synergistischen Zusammenwirken verschiedener Inhalts-stoffe resultiert. Einzelnen Inhaltsstoffgruppen aus dem Ginkgoextrakt lassen sich aller-dings bestimmte pharmakologische Wirkungen zuordnen. Nach heutigem Kenntnis-stand sind es vor allem die Terpenlaktone (Ginkgolide und Bilobalid) und die Flavonoi-de (Quercetin-, Kämpferol- und Isorhamnetin-Derivate) mit ihren konkreten
Eigen-schaften, die für die polyvalente Wirkung von Ginkgo verantwortlich sind. Nachfolgend wird auf die verschiedenen Eigenschaften im Einzelnen eingegangen.
1.5.1. Terpenoide
Die Terpenoide hemmen verschiedenen Enzyme, was den Anstieg von Botenstoffen bewirkt. Es kommt demnach zu Wirkungen, die als Membran- und Gewebsprotektion sowie als Vasoregulation beschrieben werden können.
Plättchenaktivierender Faktor
Der Plättchenaktivierende Faktor-Rezeptor (PAFR) ist Mitglied der G-Protein-gekoppelten-Rezeptor-Familie. Diese Rezeptoren wurden in einer Reihe von Zellen und Geweben nachgewiesen (Doly et al., 1987), u.a. im ZNS. Einige Studien (Maclennan et al., 1996; Smith et al., 1996; Bazan et al., 2002) deuten darauf hin, dass der PAFR ein Target für die Verlangsamung der Progression von neurodegenerativen Erkrankungen sein könnte, daher spielt dieser Rezeptor bei der Aufklärung der Auswirkungen der Ter-penlaktonen in der Neuromodulation eine bedeutende Rolle.
Das Bilobalid und die Ginkgolide, vor allem GB und GC, sind Antagonisten des PAFRs (Braquet, 1986). In vitro Studien belegen z.B., dass Bilobalid den stärksten Antagonis-mus am klonierten PAFR aufweist (Stromgaard et al., 2002), gefolgt von GB, das eine ca. 25-fach höhere Potenz als GC zeigt (Vogensen et al., 2003). Abbildung 14 zeigt eine Zusammenfassung der Struktur-Wirkung-Beziehung der Ginkgolide und des PAFR (Stromgaard and Nakanishi, 2004).
Der Plättchenaktivierende Faktor (PAF) ist andererseits ein nativer Phospholipid-Agonist und potenter Bioregulator, der in den Zellmembranen von Säugern als Reaktion auf verschiedenartige Reize hin biosynthetisiert wird und dadurch unterschiedliche phy-siologische und pathophyphy-siologische Reaktionen in Gang bringt. Er löst die Blutplätt-chenaggregation aus und spielt eine entscheidende Rolle als Mediator allergischer Ent-zündungen. Da die Ginkgolide die Anzahl und Aggregation der Thrombozyten reduzie-ren (Lamant et al., 1987), können sie die Blutzirkulation und damit die Gabe von Glu-kose und Sauerstoff im Gehirn nach einer Ischämie verbessern. Der PAF spielt auch eine Rolle in der Modulation verschiedener Prozesse im ZNS und peripherer Prozesse, u.a. bei der Modulation der Langzeit-Potenzierung an den Synapsen, der Erhöhung der intrazellulären Ca-Ionenkonzentration und bei der Genexpression. Die genauen Mecha-nismen, durch die der PAF im ZNS seine Wirkung vermittelt, sind weiterhin unklar.
Glycin-Rezeptor
Studien zeigen, dass die Ginkgolide, vor allem GA und GC, potente und selektive An-tagonisten der Glycin-Rezeptoren (GlyR) sind (Chatterjee et al., 2003; Kondratskaya et al., 2005). Diese Rezeptoren befinden sich hauptsächlich im Rückenmark und Hirn-stamm, aber auch in den höheren Regionen des Gehirns, wie dem Hippocampus. Zu-sammen mit den γ-Aminobuttersäure-Rezeptoren (GABA, aus Gamma-aminobutyric acid), sind sie die wichtigsten hemmenden Rezeptoren im ZNS. GlyR gehören, zusam-men mit nicotinischen Acetylcholin und Serotonin-Rezeptoren, zu einer Superfamilie von Membran-Rezeptoren, welche die schnelle Übertragung von chemischen Signalen im ZNS ermöglichen. Elektrophysiologische Untersuchungen zeigten, dass GB die GlyR sowohl im Hippocampus als auch in neokortikalen Zellen antagonisiert (Kon-dratskaya et al., 2002; Ivic et al., 2003). Ein High-Throughput-Screening-Test (Jaracz et al., 2004) zeigte, dass es sich bei Ginkgolid C um den stärksten Ligand des GlyR han-delte und dass jede Manipulation der Hydroxyl-Gruppe zu einem Verlust der Aktivität auf α1-GlyR führte.
Benzodiazepin Rezeptor
Benzodiazepin bindet nicht nur den GABA-Rezeptor im ZNS (zentraler Benzodiazepin-Rezeptor), sondern auch Rezeptoren im peripheren Gewebe und Gliazellen im Hirn. Diese Rezeptoren sind die peripheren Benzodiazepin-Rezeptoren (PBR), auch
Translo-cator Protein (TSPO) genannt. PBR ist ein Transmembranprotein der äußeren Mitochondrienmembran und spielt eine zentrale Rolle bei der Regulierung des Choles-terin-Transportes. Seine Funktion ist nicht vollständig geklärt, aber er kann bei Steroi-dogenesis, Zellproliferation sowie Stress und Apoptose eine Rolle spielen. Die Wirkung bei Apoptose stützt sich auf die Erhöhung der Anzahl von PBR in bestimmten Hirnregi-onen bei neurodegenerativen Erkrankungen und nach Hirnschädigungen (Gavish et al., 1999).
Mehrere Studien haben zusätzlich gezeigt, dass die Ginkgolide, insbesondere GA und GB, die Ligandbindung-Kapazität sowie die Protein- und mRNA-Expression der mito-chondrialen PBR im adrenalen Cortex in vivo verringern (Amri et al., 1996; Amri et al., 1997). Dies wiederum führt zu einer verminderten Corticosteron-Plasmakonzentration. Darüber hinaus deuten die o.g. Untersuchungen darauf hin, dass die neuroprotektive Wirkung von GA und GB durch ihre Auswirkung auf die Glukokortikoid-Biosynthese erklärt werden könnte (Stromgaard and Nakanishi, 2004).
Neuere Studien zeigten, dass GB hauptsächlich die Expression der PBR hemmt, welche durch die Bindung an einen Transkriptions-Faktor vermittelt wird. Deshalb wird vermu-tet, dass GB die überschüssige Gluocorticoid-Bildung durch PBR-kontrollierte Steroi-dogenesis reguliert (Amri et al., 2002; Amri et al., 2003).
Die oben dargestellten Wechselwirkungen von Ginkgoliden mit PAFR, GlyR und PBRs sind die am besten beschriebenen Interaktionen von Ginkgoliden mit Targets im ZNS. Mehrere Studien haben zusätzlich gezeigt, dass die Ginkgolide gegen verschiedene ZNS-Schäden, wie Ischämie sowie zerebrovaskuläres und Schädel-Hirn-Trauma, aber auch vor Entzündungen schützen (Maclennan et al., 2002). Es ist anzunehmen, dass GB die post-ischemische Produktion von freien Sauerstoff-Radikalen vermindert (Pietri et al., 1997). Außerdem hat sich gezeigt, dass GA und GB Glutamat-induzierte Schäden von Hippocampuszellen verringert (Prehn and Krieglstein, 1993).
Einer weiteren Untersuchung zufolge schützt GB vor dem Rückgang der CaMKII-Aktivität (Ca2+/Calmodulin-abhängige Protein-Kinase-II) nach zerebraler Ischämie (Za-lewska et al., 1996). Da man davon ausgeht, dass sich CaMKII an der Langzeit-Potenzierung beteiligt, könnte dies eine Erklärung für die Wirkung der Ginkgolide in
der Neuromodulation sein. Weiterhin wurde gezeigt, dass GA und GB die Menge von potenziellen zytotoxischen Stickstoffmonoxiden verringern, die von der induzierbaren Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS) produziert werden. Diese Eigenschaft wurde auch bei Bilobalid nachgewiesen (Cheung et al., 1999; Sharma et al., 2000; Cheung et al., 2001).
Die Rolle des Bilobalids
In Bezug auf Bilobalid zeigen verschiedene Studien, dass sich das Sesquiterpentrilakton an der neuroprotektiven Wirkung von EGb 761 durch verschiedene Mechanismen betei-ligt. U.a. kann Bilobalid die mitochondriale Adenosintriphosphat (ATP)-Synthese be-einflussen, Apoptose hemmen, gegen Membranschädigung schützen und die Ge-nexpression in den Mitochondrien beeinflussen (Bruno et al., 1993; DeFeudis and Drieu, 2000; Defeudis, 2002; Chandrasekaran et al., 2003; Klein et al., 2003).
Außerdem konnte beobachtet werden, dass die Effekte des Bilobalids, die der Ödembil-dung und der Ischämie entgegenwirken, auf den Schutz vor Hypoxie-Schäden in Zell-membranen zurück zu führen sind. Es ist bekannt, dass hypoxische Gewebe über die aktive Rolle des Endothels entzündliche Reaktionen verursachen können, die zu Gewe-beschädigungen führen. Eine Studie zeigte z.B., dass unter induziertem Hypoxia das ATP-Niveau von humanen Endothelzellen (HUVEC - human umbilical vein endothelial cells) abnimmt (Janssens et al., 1995). Diese ATP-Abnahme wurde durch EGb 761 und besonders durch Bilobalid vermindert.
Unter hypoxischen/hypoglykämischen Bedingungen konnte die Freisetzung von Gluta-mat in kortikalen Hirnschnitten von Ratten durch Bilobalide deutlich reduziert werden. Dies deutet darauf hin, dass die neuroprotektive Wirkung von Bilobalid durch den ver-minderten Efflux von Glutamat und damit die Exitotoxizität verursacht werden könnte (Johns et al., 2002). Darüber hinaus wurde auch der durch Glutamat-induzierte Zelltod von Rattenneuronenkulturen gezeigt (Chandrasekaran et al., 2002).
Eine weitere Studie zeigte, dass die mitochondriale Atmungskettenaktivität durch Bilo-balid geschützt wird (Janssens et al., 1999). Die dazu gehörenden molekularen Mecha-nismen sind bis dato nicht bekannt, aber sie könnten in der Beeinflussung der oxidati-ven Phosphorylierung (OXPHOS) in der Atmungskette von Mitochondrien auf Ebene der NADH-Dehydrogenase (Komplex I) und der Cytochrome c Oxidase (Komplex III)
liegen (Janssens et al., 2000; Tendi et al., 2002). Dies liegt daran, dass sich unter Ischä-mie die Aktivität dieser zwei Enzymkomplexe verringert.
1.5.2. Flavonoide
Wie bei den Terpenlaktonen, wurden auch die pharmakologischen Mechanismen der Flavonoide von EGb 761 in mehreren Studien untersucht.
Der Körper produziert während des normalen Stoffwechselprozesses und bei externen Schäden freie Radikale und reaktive Sauerstoffspezies. Diese Moleküle verursachen verschiedene Prozesse, wie die Lipidperoxidation und Schäden in Membranen und Ge-weben, und führen letztendlich zum Zelltod. Unter normalen Bedingungen ist der Kör-per in der Lage, diesen schädlichen Mechanismen entgegenzuwirken. Sie umfassen En-zyme wie Superoxid-Dismutase (SOD), Katalase (CAT), Glutathion Peroxidase (GPx) und Glutathion Reductase (GR), aber auch nicht-enzymatische Moleküle wie Glutathio-ne, Ascorbinsäure und α-Tocopherol. Die erhöhte Produktion von reaktiven Sauerstoff-spezies kann jedoch zu einer Überforderung der körpereigenen Entgiftungssysteme füh-ren. Im Tiermodell konnte eine Unterstützung der Entgiftungssysteme durch Flavonoide nachgewiesen werden, d.h., es konnte gezeigt werden, dass EGb-Phytosomen die Akti-vität von SOD im Cortex, Kleinhirn und Striatum sowie CAT und GB im Cortex und Hippocampus steigern und zudem die GPx-Aktivität im Striatum erhöhen (Naik et al., 2006; Ramassamy et al., 2007b).
In einer Reihe von Studien wird die Rolle der Flavonoide bei der Neuroprotektion dar-gelegt (Dajas et al., 2003; Ramassamy, 2006; Vafeiadou et al., 2007). Demnach ist die am besten beschriebene Wirkung der Flavonoide die Fähigkeit, direkt als Akzeptoren von freien Radikalen zu agieren. So werden die toxischen Sauerstoffradikale in erster Linie durch die in EGb 761 enthaltenen Ginkgoflavonoide inaktiviert (Joyeux et al., 1995).
Einer Untersuchung zufolge wird die synaptosomale Wiederaufnahme von Dopamin im Striatum und die von Serotonin im Cortex durch Flavonoide aus EGb 761 verringert, wenn ein peroxidatives Milieu vorliegt (Ramassamy et al., 1992).
