Entwicklung von Methoden zur
Empfindlichkeitstestung von Bordetella bronchiseptica und Haemophilus parasuis im Bouillon-Mikrodilutionsverfahren
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Sandra Prüller
Hannover
Hannover 2016
1. Gutachterin: Prof. Dr. C. Kehrenberg, PhD
2. Gutachter: Prof. Dr. P. Valentin-Weigand
Tag der mündlichen Prüfung: 19.05.2016
Diese Arbeit wurde durch Mittel des Bundesministeriums für Ernährung und Landwirtschaft (BMEL) vertreten durch die Bundesanstalt für Landwirtschaft und Ernährung (BLE) gefördert.
Meiner lieben Mutter gewidmet
"One sometimes finds what one is not looking for"
(Sir Alexander Fleming)
Publikations- und Manuskriptverzeichnis
Die vorliegende Dissertation basiert in überwiegenden Teilen auf den folgenden Publikationen und einem Manuskript:
Publikation 1:
PRÜLLER, S., FRÖMKE, C., KASPAR, H., KLEIN, G., KREIENBROCK, L.
and KEHRENBERG, C. (2015):
Recommendation for a Standardised Method of Broth Microdilution Susceptibility Testing for Porcine Bordetella bronchiseptica. PLoS One. DOI:
10.1371/journal.pone.0123883 Publikation 2:
PRÜLLER, S., RENSCH, U., MEEMKEN, D., KASPAR, H., KOPP, P. A.
KLEIN, G. and KEHRENBERG, C. (2015):
Broth Microdilution Susceptibility Testing and Identification of Antibiotic Resistance Genes of Bordetella bronchiseptica Isolates from Pigs and Companion Animals. PLoS One. DOI: 10.1371/journal.pone.0135703.
Manuskript 1 (zur Publikation eingereicht):
PRÜLLER, S., TURNI, C., BLACKALL, P. J., STRUTZBERG-MINDER, K., KASPAR, H., MEEMKEN, D., KLEIN, G. and KEHRENBERG, C. (2015):
Towards a Standardized Method for Broth Microdilution Susceptibility Testing of Haemophilus parasuis.
Weitere Aspekte der Dissertation wurden in Form von Vorträgen oder Postern präsentiert:
Vorträge:
1. PRÜLLER, S., KLEIN, G., KEHRENBERG, C. (2012) Erarbeitung einer Testmethode für Bordetella bronchiseptica. Vortrag im Rahmen der Sitzung des DVG-Arbeitskreises Antibiotikaresistenz am 05.11.2012
2. PRÜLLER, S., KLEIN, G., KEHRENBERG, C. (2013) Empfehlung einer Testmethode für die standardisierte Empfindlichkeitstestung von Bordetella bronchiseptica. Vortrag im Rahmen der Sitzung des DVG-Arbeitskreises Antibiotikaresistenz am 25.03.2013
3. PRÜLLER, S., KLEIN, G., KEHRENBERG, C. (2013) Standardisierung der Empfindlichkeitstestung von Haemophilus parasuis. Vortrag im Rahmen der Sitzung des DVG-Arbeitskreises Antibiotikaresistenz am 14.10.2013
4. PRÜLLER, S., KLEIN, G., KEHRENBERG, C. (2013) Standardisierung der Empfindlichkeitstestung von Bordetella bronchiseptica.
Wahlpflichtveranstaltung im Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover am 27.11.2013
5. PRÜLLER, S., KLEIN, G., KEHRENBERG, C. (2014) Erarbeitung einer Testmethode für Haemophilus parasuis. Vortrag im Rahmen der Sitzung des DVG-Arbeitskreises Antibiotikaresistenz am 10.03.2014
6. PRÜLLER, S., KLEIN, G., KEHRENBERG, C. (2014) Ringversuch Bordetella bronchiseptica und Empfindlichkeitstestung im Agardilutionsverfahren von Haemophilus parasuis. Vortrag im Rahmen der Sitzung des DVG- Arbeitskreises Antibiotikaresistenz am 17.11.2014
7. PRÜLLER, S., KLEIN, G., KEHRENBERG, C. (2015) Entwicklung eines neuen Mediums für die Empfindlichkeitstestung im Bouillon-Mikrodilutionsverfahren von Haemophilus parasuis. Vortrag im Rahmen der Sitzung des DVG- Arbeitskreises Antibiotikaresistenz am 16.03.2015
8. PRÜLLER, S., TURNI, C., BLACKALL, P. J., STRUTZBERG-MINDER, K., KASPAR, H., MEEMKEN, D., KLEIN, G. und KEHRENBERG, C. (2015) Standardisierung der Antimikrobiellen Empfindlichkeitstestung von Haemophilus parasuis. 34. Jahrestagung der DVG-Fachgruppe „AVID“, Bad Staffelstein, Kloster Banz, 09.-11.09.2015
Poster:
1. PRÜLLER, S., KLEIN, G., KRISCHEK, C., MEEMKEN, D., BLAHA, T., KOPP, P. A., KASPAR, H., KEHRENBERG, C. (2013). Standardisierung der Empfindlichkeitstestung von Bordetella bronchiseptica. 54. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft (DVG), Garmisch-Partenkirchen, 24.-27.09.2013
2. PRÜLLER, S., FRÖMKE, C., KLEIN, G., KREIENBROCK, L., MEEMKEN, D., BLAHA, T., KOPP, P. A., KASPAR, H., KEHRENBERG, C. (2013).
Standardisierung der Empfindlichkeitstestung von Bordetella bronchiseptica, einem bedeutenden Erreger in der Schweine-Primärproduktion. Symposium
“Antibiotika Resistenzen in der Lebensmittelkette” des Bundesinstituts für Risikobewertung (BfR), Berlin, 11.-12.11.2013
3. PRÜLLER, S., KLEIN, G., MEEMKEN, D., BLAHA, T., KOPP, P. A., KASPAR, H., KEHRENBERG, C. (2014). Antimikrobielle Empfindlichkeitstestung von Bordetella bronchiseptica-Isolaten von Schweinen und Liebhabertieren aus den Jahren 2010 – 2012 sowie Identifizierung von Resistenzgenen. 55.
Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft (DVG), Garmisch-Partenkirchen, 23.- 26.09.2014
4. PRÜLLER, S., FRÖMKE, C., KLEIN, G., KREIENBROCK, L., KEHRENBERG, C. (2014). Recommendation for a Standardised Method of Broth Microdilution Susceptibility Testing for porcine Bordetella bronchiseptica. 3rd European Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians (EAVLD) Congress, Pisa, Italy, 12.-15.10.2014
5. PRÜLLER, S., Frömke, C., Kaspar, H., KLEIN, G., KREIENBROCK, L., KEHRENBERG, C. (2015). Bordetella bronchiseptica: Proposal for a Modifikation of the Broth Microdilution Susceptibility Testing Method. „One Health – New Challenges“, First International Symposium on Veterinary Medicine (ISVM 2015), Novi Sad, Serbia. Book of Abstracta, ISBN 978-86- 82871-37-8, 21.-23.05.2015
6. PRÜLLER, S., TURNI, C., BLACKALL, P. J., STRUTZBERG-MINDER, K., KASPAR, H., MEEMKEN, D., KLEIN, G., KEHRENBERG, C. (2015).
Comparison of Agardilution and Broth Microdilution Susceptibility Testing of 48 Haemophilus parasuis Isolates from Germany. „One Health – New Challenges“, First International Symposium on Veterinary Medicine (ISVM 2015); Novi Sad, Serbia. Book of Abstracts, ISBN 978-86-82871-37-8, 21.- 23.05.2015
7. PRÜLLER, S., FRÖMKE, C., KASPAR, H., KLEIN, G., KREIENBROCK, L.
und KEHRENBERG, C. (2015): Bordetella bronchiseptica: Vorschlag für eine Modifikation der Empfindlichkeitstestung im Bouillon-Mikrodilutionsverfahren.
34. Jahrestagung der DVG-Fachgruppe „AVID“, Kloster Banz, Bad Staffelstein, 09.- 11.09.2015
8. PRÜLLER, S., TURNI, C., BLACKALL, P. J., STRUTZBERG-MINDER, K., KASPAR, H., MEEMKEN, D., KLEIN, G., KEHRENBERG, C. (2015).
Vergleich der Agardilution und Bouillon Mikrodilution Empfindlichkeitstestung von 48 Haemophilus parasuis Isolaten aus Deutschland. 56. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft (DVG), Garmisch-Partenkirchen, 29.09.- 02.10.2015
Inhaltsverzeichnis
Publikations- und Manuskriptverzeichnis ... I Inhaltsverzeichnis ... V Abkürzungsverzeichnis ... VIII Tabellenverzeichnis ... X Abbildungsverzeichnis ... XI
1 Einleitung ... 1
2 Literaturübersicht ... 3
2.1 Empfindlichkeitstestung ... 3
2.1.1 Historie der Antibiotika und Entstehung der Empfindlichkeitstestung ... 3
2.1.2 Methoden zur Empfindlichkeitstestung von Bakterien ... 6
2.1.3 Relevanz einer Standardisierung der Empfindlichkeitstestung ...13
2.2 Vorschriften zur Durchführung von Empfindlichkeitstestungen ...14
2.2.1 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) ...14
2.2.2 EUCAST/VetCAST ...15
2.2.3 Nationale Standards ...16
2.3 Klinische Grenzwerte (Breakpoints) und Epidemiologische Grenzwerte (ECOFFs) 17 2.4 Bordetella bronchiseptica ...19
2.4.1 Taxonomie, Morphologie und Merkmale der Gattung ...19
2.4.2 Epidemiologie und Bedeutung von B. bronchiseptica ...20
2.4.3 Infektionen mit B. bronchiseptica ...21
2.4.4 Kultivierung, Wachstum, Erregernachweis und Typisierung von B. bronchiseptica ...23
2.5 Haemophilus parasuis ...23
2.5.1 Taxonomie, Morphologie und Merkmale der Gattung ...23
2.5.2 Epidemiologie und Bedeutung von H. parasuis ...24
2.5.3 Infektionen mit H. parasuis ...25
2.5.4 Kultivierung, Wachstum, Erregernachweis und Typisierung von H. parasuis ...26
2.6 Antimikrobielle Resistenz ...27
2.6.1 Intrinsische Resistenz ...27
2.6.2 Extrinsische (erworbene) Resistenz und Transfermechanismen ...28
2.6.3 Resistenzmechanismen ...30
2.6.4 Relevanz und Kontrolle der Antibiotikaresistenz ...30
2.7 Ziel der Studie ...31
3 Publikationen und Manuskripte ...33
3.1 Publikation 1...33
3.2 Publikation 2...36
3.3 Manuskript 1...39
4 Diskussion ...71
4.1 Prinzip der Methodenentwicklung für B. bronchiseptica ...71
4.1.1 Wachstumsversuche mit B. bronchiseptica-Isolaten ...72
4.1.2 Auswahl von Isolaten für die Entwicklung einer Bouillon-Mikrodilutionsmethode für B. bronchiseptica ...76
4.1.3 Veränderungen der Inkubationszeit und Auswirkung auf die Testinterpretation mittels bestehender Grenzwerte ...77
4.1.4 Laborvergleichsuntersuchung der modifizierten Empfindlichkeitstestung von B. bronchiseptica ...79
4.1.5 Empfindlichkeitstestung der B. bronchiseptica-Feldisolate und Beurteilung anhand klinischer Grenzwerte ...81
4.1.6 Vergleich der MHK-Werte nach 20 und 24 Stunden Inkubation ...86
4.1.7 Bestimmung von Resistenzgenen und Lokalisation auf Plasmiden ...86
4.2 Prinzip der Methodenentwicklung für die Empfindlichkeitstestung von H. parasuis 89 4.2.1 Auswahl eines geeigneten Mediums für H. parasuis ...90
4.2.2 Eignung der Medien zur Empfindlichkeitstestung von H. parasuis ...94
4.2.3 Entwicklung eines neuen Mediums für die Empfindlichkeitstestung von H. parasuis...96
4.2.4 Überprüfung der Medien mit Referenzstämmen zur Qualitätskontrolle ...97
4.2.5 Laborvergleichsuntersuchung H. parasuis ...98
4.2.6 Empfindlichkeitstestungen der H. parasuis-Feldisolate ...99
4.2.7 Resultate der Empfindlichkeitstestungen von H. parasuis ... 101
4.2.8 Vergleich der MHK50 und MHK90-Werte aus den Empfindlichkeitsstudien der H. parasuis-Isolate mit supplementierter CAMHB und TMB Medium ... 101
4.2.9 Verteilung der MHK-Werte in dem im Rahmen der Studie entwickelten Medium supplementierte CAMHB ... 102
4.2.10 Statistische Auswertung der Empfindlichkeitstestung von H. parasuis ... 106
4.3 Schlussfolgerung ... 107
5 Zusammenfassung ... 109
6 Summary ... 112
7 Literaturverzeichnis ... 115 Danksagung ... 138
Abkürzungsverzeichnis
AST antimikrobielle Empfindlichkeitstestung (engl.: antimicrobial susceptibility testing)
ATCC American Type Culture Collection
BHI Hirn-Herz-Glucose Bouillon (engl.: brain-heart-infusion) BTK Bundestierärztekammer
bzw. beziehungsweise
CAMHB Kationen-supplementierte Mueller-Hinton Bouillon CAMHB+ CAMHB supplementiert mit Hühnerserum und NADH CLSI engl.: Clinical and Laboratory Standards Institute DHFR Dihydrofolsäure-Reduktase
DHFS Dihydrofolsäure-Synthetase
ECDC Europäisches Zentrum für die Prävention und die Kontrolle von Krankheiten (engl.: European Center for Disease Prevention and Control)
ECOFF Epidemiologischer Grenzwert (engl.: epidemiological cut-off value) EMA Europäische Arzneimittel Agentur (engl.: European Medicine Agency) EFSA Europäische Behörde für Lebensmittelsicherheit (European Food
Safety Authority) EU Europäische Union
EUCAST engl.: European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing ggf. gegebenenfalls
HfR Stamm Bakterienstamm, der sich durch hohe Rekombinationsrate auszeichnet (engl.: high frequency of recombination)
HTM Haemophilus Test Medium k.A. keine Angabe
KbE koloniebildende Einheiten
LHB lysiertes Pferdeblut (lysed horse blood)
MHBS Mueller-Hinton Bouillon mit Hämatin, NAD und Hefeextrakt MHK minimale Hemmstoffkonzentration
mg/l Milligramm pro Liter
MLST Multi Locus Sequenz Typisierung (engl.: multilocus sequence typing) NaCl Natriumchlorid
NADH Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (reduzierte Form) PCR Polymerasekettenreaktion
PFGE Pulsfeld-Gelelektrophorese SPF spezifiziert pathogenfrei TMB Test Medium Bouillon
TSB Tryptose Soja Bouillon (tryptic soy broth) VFM engl.: Veterinary Fastidious Medium
WHO Weltgesundheitsorganisation (engl.: World Health Organization)
µm Mikrometer
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Vergleich verschiedener Studien porciner B. bronchiseptica-Isolate, MHK-Werte im Bouillon-Mikrodilutionsverfahren erhoben ... 85 Tabelle 2: Abweichung der MHK-Werte zwischen supplementierter CAMHB und
TMB Medium ... 100 Tabelle 3: MHK50 und MHK90-Werte von 47 H. parasuis-Isolaten vergleichend
getestet mit den Medien TMB und CAMHB+ ... 102 Tabelle 4: Vergleich verschiedener Studien zur Empfindlichkeitstestung von H.
parasuis-Isolaten unter Berücksichtigung verwendeter Methoden und Medien ... 105
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Agardiffusionstest mit den zu testenden Wirkstoffen Cefpodoxim und Ceftriaxon mit dem Erreger E. coli auf Kationen-supplementiertem Mueller-Hinton Agar ... 7 Abbildung 2: E-Test mit der zu testenden Wirkstoffkombination
Trimethoprim/Sulfamethoxazol und dem Erreger H. parasuis auf Kochblutagar ... 8 Abbildung 3: Agardilution mit dem zu testenden Wirkstoff Tetrazyklin, dem Erreger
H. parasuis und E. coli (ATCC 25922) als Qualitätskontrollstamm auf Kochblutagar ... 10 Abbildung 4: Makrodilution des Erregers B. bronchiseptica in Kationen-
supplementierter Mueller-Hinton Bouillon. Der Pfeil weist auf die Konzentrationsstufe hin, die als MHK-Wert ermittelt wurde. ... 11 Abbildung 5: Bouillon-Mikrodilutionstestung des Erregers H. parasuis gegenüber
acht Wirkstoffen in Test Medium Bouillon. Der Pfeil zeigt beispielhaft die erste Verdünnungsstufe an, in der kein sichtbares Wachstum mehr erkennbar ist (MHK-Wert). ... 13 Abbildung 6: Schematische Darstellung der peritrichen Begeißelungsform bei
B. bronchiseptica ... 20 Abbildung 7: Typische Wachstumskurve von Bakterien ... 73 Abbildung 8: Wachstumskurven dreier Salmonella enterica-Isolate unterschiedlicher
Serovare, Abbildung modifiziert nach RENSCH et al. 2013 ... 75 Abbildung 9: Wachstumskurven des B. bronchiseptica-Feldisolates Bb5/12... 75 Abbildung 10: Wachstum des H. parasuis-Typstammes DSM 21448T in drei
Anzuchtmedien ... 91 Abbildung 11: Wachstum des H. parasuis-Feldisolates 8 in drei Anzuchtmedien, ST5 steht für Serotyp 5 ... 92 Abbildung 12: Wachstum des H. parasuis-Feldisolates 24 in drei Anzuchtmedien,
ST14 steht für Serotyp14 ... 92 Abbildung 13: Wachstum des H. parasuis-Feldisolates 52 in drei Anzuchtmedien,
ST5 steht für Serotyp 5 ... 93
Abbildung 14: Wachstum von H. parasuis-Typstamm DSM21448T und drei
H. parasuis-Feldisolaten in TMB Medium ... 94
1 Einleitung
Die Behandlung mit antimikrobiellen Wirkstoffen stellt sowohl beim Menschen als auch beim Tier ein wichtiges Instrument zur Bekämpfung von bakteriellen Infektionskrankheiten dar, auf deren Einsatz aufgrund fehlender Alternativen derzeit nicht verzichtet werden kann (AARESTRUP 2005; BUNDESTIERÄRZTEKAMMER 2015). Seit Beginn der Verwendung dieser Wirkstoffe zur Behandlung bakterieller Infektionen wurde auch die Gefahr der zunehmenden Resistenzentwicklung deutlich (LEVY 1982; SCHWARZ u. KEHRENBERG 2006). Das Auftreten von multiresistenten Erregern erlangte in den letzten Jahren eine immer größere Bedeutung in der Human- und Veterinärmedizin und der bedachte Umgang mit antimikrobiellen Wirkstoffen wurde immer wichtiger (UNGEMACH et al. 2006; ACAR u. MOULIN 2012; SOOTHILL et al. 2013). Gemäß den Antibiotika-Leitlinien, die von der Bundestierärztekammer herausgegeben werden, soll ein antimikrobieller Wirkstoff nur nach Bestimmung des am Krankheitsgeschehen ursächlich beteiligten Erregers und anschließender Empfindlichkeitstestung zur Bestimmung der In-vitro- Wirksamkeit dieses Wirkstoffes eingesetzt werden (UNGEMACH et al. 2006;
BUNDESTIERÄRZTEKAMMER 2015). Da nicht zu erwarten ist, dass in der nächsten Zeit neue Klassen antimikrobieller Wirkstoffe auf dem Markt verfügbar werden, ist es von besonderer Bedeutung, bereits vorhandene Wirkstoffe umsichtiger einzusetzen und damit eine Therapiemöglichkeit von bakteriellen Infektionskrankheiten für Mensch und Tier aufrecht zu erhalten (SCHWARZ u. KEHRENBERG 2006; CARON u. MOUSA 2010).
Zur Durchführung der Empfindlichkeitstestung von Bakterien können verschiedene Methoden eingesetzt werden. Um möglichst valide und reproduzierbare Empfindlichkeitsdaten erheben zu können, die zu einer Empfehlung für den behandelnden Tierarzt führen, ist eine Standardisierung der Empfindlichkeitstestung notwendig (SILLEY 2012; CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE 2013a). In den meisten Ländern Europas ist die Verwendung eines bestimmten Standards für die Empfindlichkeitstestung nicht gesetzlich verpflichtend und es werden unterschiedliche Durchführungsvorschriften verwendet (BAQUERO 1990;
SCHWARZ et al. 2003). Um eine zunehmende Entwicklung von Resistenzen rechtzeitig zu erkennen oder eine Therapie von Infektionskrankheiten mit einem geeigneten antimikrobiellen Wirkstoff einzuleiten, sind valide MHK-Daten aber essentiell (WALLMANN et al. 2006). Dabei stellen anspruchsvolle Erreger, die nicht nach den bisher standardisierten Bedingungen für schnellwachsende Erreger getestet werden können, da sie in den empfohlenen Medien ein schwaches oder kein Wachstum zeigen und besondere Ansprüche an Testmedium und/oder Testbedingungen stellen, eine besondere Herausforderung dar. Eine Standardisierung der Empfindlichkeitstestung für diese besonders anspruchsvollen Bakterien ist aus diesem Grunde anzustreben (KING 2001). Für viele veterinärmedizinisch bedeutsame Erreger liegen derzeit aber keine anerkannten Methoden zur Empfindlichkeitstestung vor (SCHWARZ et al. 2010).
Ziel dieser Arbeit war es daher, eine geeignete Methode zur quantitativen Empfindlichkeitstestung für die Erreger Bordetella (B.) bronchiseptica und Haemophilus (H.) parasuis zu entwickeln. Derzeit sind in Dokumenten des Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) einige Standards zur quantitativen Empfindlichkeitstestung von Bakterien tierischen Ursprungs enthalten, so z.B. eine Bouillon-Mikrodilutionsmethode für schnellwachsende Bakterien in dem CLSI- Dokument VET01-A4 (CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE 2013a). Da es sich bei B. bronchiseptica um relativ langsam wachsende Erreger handelt und H. parasuis zu den anspruchsvollen Erregern zählt, sollte im Rahmen der Arbeit überprüft werden, ob die vorliegenden Methoden auch auf die untersuchten Erreger angewendet werden können. Mit der Entwicklung einer standardisierten Methode zur Empfindlichkeitstestung von Bakterien können zuverlässige MHK-Daten erhoben und somit bessere Empfehlungen zum Empfindlichkeitsstatus eines Erregers gegeben werden. Dies trägt zu einem gezielteren Einsatz von Wirkstoffen bei und soll eine Selektion resistenter Bakterien verhindern.
2 Literaturübersicht
2.1 Empfindlichkeitstestung
2.1.1 Historie der Antibiotika und Entstehung der Empfindlichkeitstestung Bereits die Wissenschaftler Louis Pasteur (*1822-†1895), Robert Koch (*1843-
†1910) und Paul Ehrlich (*1854-†1915) verwiesen in ihren Arbeiten auf die Antibiose.
Paul Ehrlich forschte als erster Bakteriologe an chemischen Substanzen zum Einsatz gegen Infektionskrankheiten in vivo (POUPARD et al. 1994). Der Physiker William Roberts fand 1874 heraus, dass ein mit Penicilium glaucum kontaminiertes Flüssigmedium nicht durch Bakterien besiedelt werden konnte. Im Jahr 1876 entdeckte John Tyndall, dass bei Verwendung einer Nährbouillon entweder das Wachstum von Bakterien oder Schimmelpilzen unterstützt werden konnte, aber nicht beide zeitgleich in der Nährbouillon kultivierbar waren (LECHEVALIER u.
SOLOTOROVSKY 1965). Den Beginn der Empfindlichkeitstestung prägte Alexander Fleming 1920 durch die Entdeckung der Wachstumshemmung von Staphylokokken auf einem mit Penicilium kontaminierten Nährboden. Im Jahr 1924 testete Fleming die Reaktion von Bakterien auf eine antiseptische Lösung mittels der „ditch plate“
Technik, bei der eine antiseptische Lösung in eine Furche im Nährboden gegeben wurde und die Bakterien in der Nähe der Furche aufgetragen wurden (FLEMING 1924). George Reddish testete ein ähnliches Prinzip mit einer antiseptischen Lösung, die in Vertiefungen im Nährboden aufgebracht wurde (REDDISH 1929). Im selben Jahr veröffentlichte Fleming die Nutzung der Bouillon-Dilutionsmethode. Die Trübung der Bakteriensuspension nach Inkubation wurde zur Bestimmung des Ergebnisses verwendet (FLEMING 1929). Norman Heatley nutzte 1944 saugfähiges Papier, das einen antimikrobiellen Wirkstoff enthielt und auf den Nährboden aufgelegt wurde, um die Empfindlichkeit von Bakterien zu bestimmen.
Bereits Ende der 50er Jahre des 19. Jahrhunderts stellten Wissenschaftler fest, dass Ergebnisse der Empfindlichkeitstestung durch verschiedene Parameter beeinflusst werden und daher eine Standardisierung der Methoden notwendig ist (WHEAT 2001). Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) veröffentlichte erstmalig 1961 ein Dokument zur Empfindlichkeitsprüfung von Bakterien (WORLD HEALTH
ORGANIZATION 1961). Im Jahr 1971 unterstützte die WHO finanziell eine Studie der ICS (International Collaborative Study), um eine standardisierte Methode zur antimikrobiellen Empfindlichkeitstestung (AST) von Bakterien für Laboratorien einzuführen. Bei dieser Methode handelte es sich um eine Bouillon- Makrodilutionsmethode (ERICSSON u. SHERRIS 1971). Eine 1966 von Bauer et al.
publizierte Agardiffusionsmethode wurde zur Verwendung für Diagnostiklabore eingeführt und 1975 zur Grundlage für die von dem CLSI empfohlenen Methode der Agardiffusion eingesetzt (WHEAT 2001). Mikrotiterplatten, die den antimikrobiellen Wirkstoff in den Vertiefungen enthielten, wurden zum ersten Mal 1977 verwendet (POUPARD et al. 1994). Bis zum Jahre 1990 wurden in Europa allerdings bis zu sechs verschiedene Standards zur antimikrobiellen Empfindlichkeitstestung genutzt (BAQUERO 1990).
Die In-vitro-Empfindlichkeitstestung stellt ein wichtiges Instrument zur Überprüfung der Sensitivität eines Erregers gegenüber einem antimikrobiellen Wirkstoff dar. Sie kann somit den praktischen Tierarzt bei der Auswahl eines geeigneten Antibiotikums unterstützen. Des Weiteren können resistente bakterielle Isolate ermittelt werden und durch eine kontinuierliche Erfassung der Empfindlichkeitsdaten ein Anstieg von Resistenzen zeitnah erkannt werden (RELLER et al. 2009; BVL 2014). Dies ist notwendig, da Resistenzen gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen eine immer größere Bedeutung in der Human- und Veterinärmedizin einnehmen (LUHOFER 2004). Das Auftreten von Infektionen mit resistenten Erregern, für die kein wirksamer antimikrobieller Wirkstoff zur Verfügung steht, kann für einen Patienten lebensgefährliche Auswirkungen zur Folge haben (VILLANUEVA 2012). Die Leitlinien der Bundestierärztekammer (BTK) besagen, dass vor Behandlung mit einem antimikrobiellen Wirkstoff eine Empfindlichkeitstestung durchgeführt werden sollte, sofern dies, dem Einzelfall entsprechend, angemessen ist. Bei lebensbedrohlichen Infektionen kann es sinnvoll sein, einen antimikrobiellen Wirkstoff ohne vorherige Empfindlichkeitstestung einzusetzen und gegebenenfalls nach Erstellung eines Antibiogramms auf einen für den Erreger wirksamen Wirkstoff zu ändern (BUNDESTIERÄRZTEKAMMER 2015). Vor der Behandlung mit einem
antimikrobiellen Wirkstoff sollten demnach diagnostische Untersuchungen wie die Bestimmung des ursächlichen Erregers und eine antimikrobielle Empfindlichkeitstestung durchgeführt werden. Dadurch soll die Möglichkeit eines Therapieversagens aufgrund der Auswahl von Wirkstoffen, gegenüber denen bakterielle Resistenzen vorliegen, minimiert werden. Der Behandlungserfolg in-vivo ist zudem von weiteren Faktoren abhängig, wie z.B. der Pharmakodynamik, der Pharmakokinetik, der Wirkstoffkonzentration im Zielgewebe und dem Immunstatus des Patienten (RICHTER et al. 2006).
Zur Durchführung der antimikrobiellen Empfindlichkeitstestung können verschiedenen Methoden angewendet werden. Einige Methoden liefern qualitative Ergebnisse, wie bei der Agardiffusionsmethode, wobei andere Methoden quantitative Ergebnisse in Form von Minimalen Hemmkonzentrationswerten (MHK-Werten) liefern (SCHWARZ et al. 2003). Die Auswertung der Ergebnisse, unabhängig davon, ob qualitative oder quantitative Ergebnisse erzielt wurden, muss anhand einer darauf abgestimmten Bewertungstabelle erfolgen (JORGENSEN u. FERRARO 2009). Das CLSI mit Sitz in den USA veröffentlicht entsprechende Standards, in denen Vorschriften zur Durchführung der Testungen sowie Interpretationskriterien für die Ergebnisse der quantitativen und qualitativen Empfindlichkeitstestungen angegeben werden. Unter anderem gibt es von der CLSI publizierte Standards für bakterielle Erreger, welche von Tieren isoliert wurden (CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE 2013a). Zur Auswertung der Empfindlichkeitstestung werden abhängig von der Methode unterschiedliche Parameter zu der Bewertung der bakteriellen Empfindlichkeit herangezogen. Für die Agardiffusionsmethode wird der Hemmhofdurchmesser genutzt, mit dem eine qualitative Aussage über die Empfindlichkeit des getesteten Erregers gemacht werden kann. Bei den verschiedenen Reihenverdünnungstests kann über die Angabe von MHK-Werten ein quantitatives Ergebnis erzielt werden. Anschließend lässt sich eine Einteilung der getesteten Isolate in „sensibel“, „intermediär“ und „resistent“ vornehmen, sofern entsprechende klinische Grenzwerte für die jeweilige Erreger-Wirkstoff-Kombination verfügbar sind (RELLER et al. 2009). Wird der Erreger für einen bestimmten Wirkstoff als „sensibel“ eingestuft, ist anzunehmen, dass eine Therapie mit diesem
Wirkstoff erfolgreich sein wird. Bei der Aussage „intermediär“ ist der Erfolg der Therapie unsicher und es sollte – falls verfügbar – ein anderer geeigneter Wirkstoff eingesetzt werden. Die Aussage „resistent“ bedeutet, dass eine Therapie des Patienten, der mit diesem Erreger infiziert ist, vermutlich nicht erfolgreich sein wird (SILLEY 2012).
2.1.2 Methoden zur Empfindlichkeitstestung von Bakterien
In Abhängigkeit vom Diagnostiklabor, dem Erreger und dem Spektrum der zu testenden Wirkstoffe kann es variieren, welche Methode für die Empfindlichkeitstestung geeignet ist. Für einige anspruchsvolle Erreger, die spezielle Anforderungen an das Nährmedium stellen oder besondere Testkonditionen erfordern, ist die Methode der Empfindlichkeitstestung ausschlaggebend für das Ergebnis. Abweichungen können zu unterschiedlichen Werten in der MHK-Testung führen (KING 2001).
2.1.2.1 Agardiffusionstest
Die Agardiffusionsmethode stellt eine Methode dar, welche in den Standards der CLSI als Methode zur Empfindlichkeitstestung enthalten ist. Bei der Durchführung des Tests wird ein fester Nährboden mit einem Inokulum von etwa 1-2 x 108 koloniebildenden Einheiten (KbE) beimpft, indem die Bakteriensuspension homogen auf der Agarplatte verteilt wird. Für nicht anspruchsvolle Bakterien wird in den CLSI- Richtlinien Mueller-Hinton Agar empfohlen, da der Agar eine gute Reproduzierbarkeit antimikrobieller Empfindlichkeitstestungen zeigt und nur eine geringe Hemmung der antimikrobiellen Wirkstoffe Tetrazyklin, Trimethoprim von Sulfonamiden bewirkt. Für anspruchsvolle Erreger, wie zum Beispiel Actinobacillus (A.) pleuropneumoniae und Histophilus (H.) somni, wird Mueller-Hinton Agar mit Kochblut verwendet (CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE 2013a). Anschließend werden Testplättchen, welche den antimikrobiellen Wirkstoff mit jeweils einer bestimmten Wirkstoffmenge enthalten, auf den Nährboden gelegt. Dabei können auf einer
Agarplatte gleichzeitig mehrere Wirkstoffe getestet werden (Abb. 1). Nach einer Inkubationszeit von 16-18 Stunden (für einige Erreger existieren abweichende Inkubationszeiten) wird der Durchmesser des Hemmhofes um das Plättchen durch Abmessen oder anhand einer dafür vorgesehenen Schablone bestimmt (JORGENSEN u. FERRARO 2009; CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE 2013a). Werte für eine Beurteilung des Hemmhofdurchmessers werden in den jeweiligen Durchführungsvorschriften z.B. des CLSI veröffentlicht. Anhand derer können die Ergebnisse der Testung in eine Kategorisierung des Erregers als
„sensibel“, „intermediär“ oder „resistent“ gegenüber dem Wirkstoff vorgenommen werden (CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE 2013a). Bei diesem Empfindlichkeitstest handelt es sich um eine einfach durchzuführende und zeitsparende Methode, bei der allerdings keine MHK-Werte erhoben werden können (SCHWARZ et al. 2003). Bei einem Vergleich des Agardiffusiontests mit dem Bouillon-Mikrodilutionstest stellte sich der Agardiffusionstest als weniger verlässlich dar. Daraus erfolgte die Empfehlung des DVG-Arbeitskreises „Antibiotikaresistenz“, den Bouillon-Mikrodilutionstests dem Agardiffusionstest vorzuziehen (LUHOFER 2004).
Abb. 1:
Abbildung 1: Agardiffusionstest mit den zu testenden Wirkstoffen Cefpodoxim und Ceftriaxon mit dem Erreger E. coli auf Kationen-supplementiertem Mueller-Hinton Agar
2.1.2.2 Epsilontest (E-Test)
Der E-Test stellt eine Kombination aus einem Reihenverdünnungstest und dem Agardiffusionstest dar (BOLMSTRÖM et al. 1988; BROWN u. BROWN 1991). Bei der Durchführung dieses Tests wird ebenfalls ein fester Nährboden mit einem Inokulum von ca. 1-2 x 108 Keimen (entspricht in etwa 0.5 McFarland) beimpft und ein kommerziell erhältlicher E-Test Streifen mit einem Konzentrationsgradienten des antimikrobiellen Wirkstoffes aufgelegt. Nach einer Inkubationszeit von etwa 18-24 Stunden wird ein ellipsoider Hemmhof sichtbar (Abb. 2). Das Ergebnis kann am unteren Schnittpunkt des Hemmhofes mit dem Teststreifen in Form des MHK-Wertes abgelesen werden, da auf der Oberfläche des Teststreifens eine Skala aufgetragen ist (JORGENSEN u. FERRARO 2009). Diese Methode ist ebenfalls leicht anwendbar, jedoch kosten- und zeitintensiver als der Agardiffusionstest. Der Vorteil ist darin zu sehen, dass Ergebnisse in Form von MHK-Werten erhoben werden und auch Erreger getestet werden können, die in Flüssigmedium nur schwaches oder kein Wachstum zeigen (SELBITZ 2011). Des Weiteren kann die Auswahl der antimikrobiellen Wirkstoffe variabel zusammengestellt werden. Nicht alle Wirkstoffe, die veterinärmedizinisch relevant sind, sind auch als Teststreifen erhältlich. Zudem liegen keine standardisierten Durchführungsvorschriften für diesen Test vor.
Abb.2:
Abbildung 2: E-Test mit der zu testenden Wirkstoffkombination Trimethoprim/Sulfamethoxazol und dem Erreger H. parasuis auf Kochblutagar
2.1.2.3 Reihenverdünnungstests
Bei dem Reihenverdünnungstest wird eine zweifache Verdünnungsreihe des antimikrobiellen Wirkstoffes in einem festen oder flüssigen Nährmedium erstellt und mit einem spezifischen Inokulum der Bakteriensuspension beimpft. Die Inkubation erfolgt nach den Bedingungen, die für den jeweiligen Erreger angegeben werden.
Nach erfolgter Inkubation wird die Auswertung visuell vorgenommen, wobei auf das Vorliegen von bakteriellem Wachstum überprüft wird. Die erste Verdünnungsstufe, bei der kein sichtbares Wachstum mehr vorhanden ist, zeigt den MHK-Wert an (SCHWARZ et al. 2003; RICHTER et al. 2006). Der Vorteil dieser Methode ist die Ermittlung von quantitativen Ergebnissen in Form von MHK-Werten (JORGENSEN u.
FERRARO 2009). Eine Einteilung in “sensibel“, „intermediär“ und „resistent“ kann (wie bei den anderen Testverfahren auch) allerdings nur erfolgen, wenn für die getestete Erreger-Wirkstoff-Kombination Grenzwerte vorliegen (BYWATER et al.
2006). Zu den Reihenverdünnungstests werden die Agardilution, die Bouillon- Makrodilution und die Bouillon-Mikrodilution gezählt.
Agardilution
Dieser Reihenverdünnungstest auf einem festen Nährboden stellt eine verhältnismäßig aufwändige Methode der Empfindlichkeitstestung dar. Sie eignet sich aber besonders für anspruchsvolle Bakterien, die in einem Flüssigmedium nur schwaches Wachstum zeigen (WHITE et al. 2001; LUBER et al. 2003; VARELA et al.
2008). Für die Agardilution wird in den CLSI-Standards für nicht anspruchsvolle Erreger tierischen Ursprungs Mueller-Hinton Agar empfohlen, der mit 5 % defibriniertem Blut von Schaf, Kaninchen, Rind oder Pferd supplementiert werden kann. Bei der Herstellung von Agarplatten mit einem antimikrobiellen Wirkstoff muss zudem auf eine gleichmäßige Verteilung des Wirkstoffes im Agar geachtet werden.
Weiterhin ist die Einhaltung der Temperatur bei der Herstellung des Agars bedeutend, damit kein Konzentrationsverlust des Wirkstoffes eintritt (CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE 2013a).
Bei der Agardilution enthält jede Agarplatte eine spezifische Konzentration des Wirkstoffes, welche anschließend mit mehreren Bakterienisolaten beimpft werden
kann. Es ist möglich dafür einen speziellen Replikator zu verwenden, mit dem die Bakteriensuspension mehrerer Isolate zeitgleich aufgetragen wird. Die Herstellung des Inokulums richtet sich nach dem zu testenden Erreger (WIEGAND et al. 2008a).
Bei der Herstellung des Inokulums von schnellwachsenden aeroben Erregern wird wie folgt verfahren: Ein geeignetes Medium wird mit 4-5 Kolonien des Erregers beimpft und bei 35°C inkubiert, bis zum Erreichen oder Überschreiten einer optischen Dichte von OD 0,08 bis 0,13 bei einer Wellenlänge von 625 nm im Photometer (entspricht 0,5 McFarland). Anschließend wird die Bakteriensuspension auf exakt 0,5 McFarland Standard eingestellt (ca. 1-2 x 108 KbE). Bei anspruchsvollen Erregern, wie z.B. A. pleuropneumoniae und H. somni, werden 4-5 Kolonien direkt in eine 0,9 % NaCl-Lösung gegeben und auf 0,5 McFarland Standard eingestellt. Die Auswertung der beimpften Agarplatte erfolgt visuell, für die meisten Erreger nach etwa 16-20 Stunden Inkubation. Die Platte mit der ersten Konzentration des Wirkstoffes, auf der kein Wachstum mehr sichtbar ist, definiert den MHK-Wert.
Eine einzelne Kolonie, die durch das Inokulum verursacht wurde oder ein sehr schwacher Schleier, welcher auf den Platten sichtbar ist, werden nicht in die Auswertung der Agardilution einbezogen (CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE 2013a). In Abbildung 3 ist ein Beispiel einer Agarplatte dargestellt, die für die Agardilution von H. parasuis verwendet wurde.
Abb. 3:
Abbildung 3: Agardilution mit dem zu testenden Wirkstoff Tetrazyklin, dem Erreger H. parasuis und E. coli (ATCC 25922) als Qualitätskontrollstamm auf Kochblutagar
Bouillon Makrodilution
Bei der Bouillon-Makrodilution handelt es sich um einen Reihenverdünnungstest, bei dem eine zweifache Verdünnungsreihe des zu testenden antimikrobiellen Wirkstoffes in einem Reagenzröhrchen mit Flüssigmedium erstellt wird. Dabei wird jedes Reagenzröhrchen mit einem Inokulum beimpft, so dass anschließend ca. 5 x 105 KbE/ml in der Bakteriensuspension enthalten sind. Nach der Inkubation wird die Auswertung anhand des visuell zu ermittelnden Wachstums der Bakterien im Reagenzröhrchen vorgenommen. Die erste Konzentrationsstufe, in der kein Wachstum mehr sichtbar ist, bestimmt den MHK-Wert (CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE 2013a). Nachteile dieser Methode sind das arbeits- bzw. zeitintensive Herstellen der Verdünnungsreihen im Reagenzröhrchen und der Verbrauch von relativ großen Mengen an Medium und Wirkstoff. Vorteil dieser Methode ist die Erhebung quantitativer Ergebnisse in Form von MHK-Werten und die Möglichkeit einer individuellen Auswahl der Wirkstoffe und Konzentrationsstufen (SCHWALBE et al. 2007; JORGENSEN u. FERRARO 2009).
Beispielhaft wurde in Abbildung 4 eine Makrodilution des Erregers B. bronchiseptica dargestellt.
Abb. 4:
Abbildung 4: Makrodilution des Erregers B. bronchiseptica in Kationen-supplementierter Mueller-Hinton Bouillon. Der Pfeil weist auf die Konzentrationsstufe hin, die als MHK-Wert ermittelt wurde.
Bouillon-Mikrodilution
Bei der Bouillon-Mikrodilutionsmethode handelt es sich ebenfalls um einen Reihenverdünnungstest, welcher der Makrodilution zwar ähnlich ist, bei dem jedoch
MHK-Wert
viel kleinere Volumina an Nährsuspension verwendet werden. Die Testung erfolgt in den meisten Fällen in Mikrotiterplatten, die kommerziell erworben werden und deren Vertiefungen bereits mit den antimikrobiellen Wirkstoffen in 2-fachen Verdünnungsreihen beschichtet sind. Bei dieser Methode ist die Testung mehrerer Wirkstoffe oder Wirkstoffkombinationen gleichzeitig möglich und es handelt sich durch die Verwendung vorbelegter Mikrotiterplatten um eine zeitsparende Methode.
Der Verwendung entsprechend können spezielle Layouts, wie z.B. angepasste Layouts für grampositive oder gramnegative Erreger, benutzt werden. Pro Mikrotiterplatte können eine Vielzahl von Wirkstoffen oder Konzentrationsstufen getestet werden. Dabei sollten mindestens zwei Vertiefungen der Platte für eine Wachstumskontrolle vorgesehen sein. Für die Mikrodilution können vorbelegte, bei den Herstellern vorrätig gehaltene Layouts der Mikrotiterplatten verwendet oder individuell erstellte Layouts bestellt werden (JORGENSEN u. FERRARO 2009). Für eine Durchführung der Bouillon-Mikrodilution wird eine Bakteriensuspension des zu testenden Erregers hergestellt und z.B. mit einer Mehrkanalpipette auf die einzelnen Vertiefungen der Mikrotiterplatte aufgetragen. Diese Vertiefungen können je nach verwendeter Platte ein Volumen von 50-100 µl aufnehmen. Die Einstellung des Inokulums erfolgt nach einer festen Methodenvorschrift, wobei die zu erzielende Konzentration ca. 5 x 105 KbE/ml beträgt. Die Auswertung kann visuell oder automatisiert erfolgen (CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE 2013a). Bewertet wird vorhandenes Bakterienwachstum, welches sich in Form von kleinen Knöpfen auf dem Boden der Vertiefungen der Mikrotiterplatten darstellt. Der MHK-Wert entspricht der ersten Konzentrationsstufe des getesteten Wirkstoffes, bei der kein Wachstum des Erregers mehr sichtbar ist (WIEGAND et al. 2008a).
Ringversuche haben eine gute Eignung der Methode gezeigt. Sie zeichnet sich dabei durch eine hohe Reproduzierbarkeit aus und ist für Routinelabors durch die Möglichkeit des kommerziellen Bezugs von mit antimikrobiellen Wirkstoffen beschichteten Mikrotiterplatten und dadurch geringeren Zeitaufwand ebenfalls geeignet. Von dem DVG-Arbeitskreis Antibiotikaresistenz wird die Methode derzeit als Methode der Wahl empfohlen (WALLMANN et al. 2005). Abbildung 5 zeigt
beispielhaft einen Bouillon-Mikrodilutionstest eines H. parasuis–Isolates in Test Medium Bouillon (TMB) für acht verschiedene antimikrobielle Wirkstoffe.
Abb. 5:
Abbildung 5: Bouillon-Mikrodilutionstestung des Erregers H. parasuis gegenüber acht Wirkstoffen in Test Medium Bouillon. Der Pfeil zeigt beispielhaft die erste Verdünnungsstufe an, in der kein sichtbares Wachstum
mehr erkennbar ist (MHK-Wert).
2.1.3 Relevanz einer Standardisierung der Empfindlichkeitstestung
In den verschiedenen nationalen und internationalen Standards zur Empfindlichkeitstestung von Bakterien finden sich Unterschiede in der empfohlenen Durchführung, welche die Verwendung von Nährmedien, den Einsatz von Supplementen, die Inkubationsbedingungen und die Konzentration des Inokulums betreffen (SCHWARZ et al. 2010a). Des Weiteren werden abweichende Grenzwerte zur Beurteilung der Ergebnisse in den unterschiedlichen Standards angegeben (SILLEY 2012). Beim Einsatz abweichender Methoden und Grenzwerte in den verschiedenen Laboratorien bzw. Ländern ist ein Vergleich der dabei erzielten Testergebnisse schwierig. Zudem kann es in besonderen Fällen zu einer unterschiedlichen Einstufung eines Erregers in “sensibel“, „intermediär“ und
MHK-Wert
Positivkontrollen
„resistent“ und damit zu abweichenden Empfehlungen für den Einsatz des getesteten Wirkstoffes führen (KAHLMETER et al. 2003).
2.2 Vorschriften zur Durchführung von Empfindlichkeitstestungen 2.2.1 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
Das CLSI ist eine gemeinnützige Organisation, die aus Mitgliedern der Industrie, staatlichen Stellen und Fachpersonal des Gesundheitswesens besteht. Ihr Anliegen ist das Entwickeln von Standards für Untersuchungen in der Labordiagnostik, um Laboratorien ein Werkzeug zur Erzeugung gleichbleibender Qualität von Laborergebnissen und reproduzierbaren Daten an die Hand zu geben. Die Entwicklung der CLSI-Standards ist ein dynamischer Prozess, welcher durch die Mitwirkung von Vertretern aus der Regierung, mikrobiologischer Laboratorien, Ausbildungsstätten, Universitäten sowie der pharmazeutischen und diagnostischen mikrobiologischen Industrie gestaltet wird (BANCROFT u. GAMBLE 2008; MCCALL u. TANKERSLEY 2008).
Unterschieden wird zwischen Standards und Richtlinien, wobei in den Dokumenten der Standards klar definierte Anforderungen an Material, Methoden und Vorgehensweisen festgelegt sind, während in den Richtlinien generelle Vorgehensweisen beschrieben werden, die optional genutzt werden können. Bei den Standards darf keine abweichende Vorgehensweise eingesetzt werden, so müssen beispielsweise spezielle, nicht austauschbare Nährmedien für die Empfindlichkeitstestung verwendet werden. Das CLSI gibt, unter anderem, internationale Standards für die antimikrobielle Empfindlichkeitstestung für Erreger, welche von Menschen und Tieren isoliert wurden, heraus. Die Standards zur Empfindlichkeitstestung, die Qualitätskontrollparameter und die Interpretationskriterien für die Ergebnisse stellen wichtige Informationen für eine reproduzierbare Durchführung von Empfindlichkeitstests dar (CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE 2013a).
Für die Veterinärmedizin liegen zur Zeit fünf Dokumente vor, in denen Durchführungsvorschriften oder Methoden für die Empfindlichkeitstestung von
Bakterien, isoliert von Tieren oder aquatischen Tieren, enthalten sind (CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE 2006, 2013a; CLSI 2014a;
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE 2014b, 2015). Zudem liegt ein Dokument zur Entwicklung von In-vitro Empfindlichkeitstests, Kriterien und Qualitätskontrollparametern für veterinärmedizinisch relevante antimikrobielle Wirkstoffe vor (Development of In Vitro Susceptibility Testing Criteria and Quality Control Parameters for Veterinary Antimicrobial Agents; Approved Guideline—Third Edition), sowie ein Dokument zur Generierung, Präsentation und Anwendung von Daten der antimikrobiellen Empfindlichkeitstestung für Bakterien tierischer Herkunft (Generation, Presentation, and Application of Antimicrobial Susceptibility Test Data for Bacteria of Animal Origin; A Report) (CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE 2008, 2011).
In den Dokumenten werden zudem Grenzwerte für bestimmte Erreger- Wirkstoffkombinationen angegeben, wobei nur eingeschränkt Daten für veterinärmedizinisch relevante Erreger vorhanden sind. Es werden Grenzwerte für Actinobacillus spp., Aeromonas salmonicida, B. bronchiseptica, Enterobactericeae, Escherichia (E.) coli, H. somni, Mannheimia haemolytica, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeroginosa, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Cholerasuis, Staphylococcus spp. und Streptococcus spp. angegeben, teilweise für eine bestimmte Tierart, ein bestimmtes Organsystem und/oder auch nur für ausgewählte antimikrobielle Wirkstoffe (CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE 2013a, 2015).
2.2.2 EUCAST/VetCAST
EUCAST (European Commitee on Antimicrobial Susceptibility Testing) ist ein europäisches Gremium, dessen Hauptaufgabe darin besteht, in Europa MHK- Grenzwerte für die antimikrobielle Empfindlichkeitstestung humanmedizinischer Erreger zu vereinheitlichen und in Zusammenarbeit mit der Europäischen Arzneimittel-Agentur „European Medicine Agency“ (EMA) klinische Grenzwerte für neue Wirkstoffe zu erarbeiten (BROWN et al. 2015). Gegründet wurde EUCAST
1997 durch die ESCMID (European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases), von der dieses Gremium, neben der Europäischen Union (EU), ECDC („European Center for Disease Prevention and Control“) und verschiedenen europäischen Gremien für Grenzwerte, auch finanziell gefördert wird (KAHLMETER et al. 2003; BROWN et al. 2015). Von EUCAST werden allerdings keine MHK- Grenzwerte für Erreger aus der Veterinärmedizin festgelegt (SILLEY 2012).
Richtlinien und Grenzwerte zur Beurteilung der Testungen werden von EUCAST kostenfrei im Internet zur Verfügbarkeit gestellt (BROWN et al. 2015).
Das veterinärmedizinische Gremium für antimikrobielle Empfindlichkeitstestung (VetCAST) wurde am 07.11.2014 als Subkomitee von EUCAST durch die Studiengruppe ESCMID für Veterinärmedizinische Mikrobiologie (European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases) gegründet. Ziel dieses Komitees ist die Festlegung von Grenzwerten für Krankheitserreger, welche von Tieren isoliert wurden oder die zoonotisches Potential besitzen. Damit soll eine Vereinheitlichung der antimikrobiellen Empfindlichkeitstestung in der EU angestrebt werden. Geplant ist, dass die Richtlinien für die antimikrobielle Empfindlichkeitstestung von Bakterienisolaten tierischen Ursprungs ebenfalls kostenfrei im Internet verfügbar sein sollen. In dieser Kommission wird eine Zusammenarbeit mit Behörden der EU, wie z.B. der EMA, der Europäischen Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA - European Food Safety Authority), dem ECDC und der Generaldirektion Gesundheit und Lebensmittelsicherheit/Generaldirektion der Europäischen Kommission (DG SANCO - The European Commission's Directorate General for Health and Consumer Protection) angestrebt (EUCAST 2015).
2.2.3 Nationale Standards
Auf nationaler Ebene geben diverse Organisationen ebenfalls Richtlinien oder Standards zur Empfindlichkeitstestung von Bakterien humanen Ursprungs heraus oder definieren spezifische MHK-Grenzwerte zur Einteilung der Erreger in „sensibel“,
„intermediär“ und „resistent“. Dieses sind beispielsweise die BSAC in Großbritannien (British Society for Antimicrobial Chemotherapy), das DIN (Deutsches Institut für
Normung), die CA-SMF - Richtlinien in Frankreich (Committé Antibiogramme - Société Française de Microbiologie), das CRG - Richtlinien der Niederlande, die NWGA - Norwegische Arbeitsgruppe (Norwegian Working Group on Antibiotics) oder die SRGA - Schweden Standards (Swedish Reference Group for Antibiotics). Die Methoden zeigen zwar einige Gemeinsamkeiten, es sind aber auch Abweichungen ersichtlich, wie z.B. Unterschiede in der Verwendung von Medien, der eingesetzten Inokulumkonzentrationen oder der Inkubationsbedingungen (KAHLMETER et al.
2003; SILLEY 2012). Auch die Grenzwerte zur Beurteilung der Empfindlichkeitstests weichen voneinander ab und sind auf die jeweilige Methodik abgestimmt. In einigen Fällen ist es möglich, dass die unter Verwendung der unterschiedlichen Standards erstellten Ergebnisse zu einer unterschiedlichen Einstufung (sensibel, intermediär und resistent) der Erreger-Wirkstoff-Kombination führen können (KAHLMETER et al.
2003). Ein Großteil der Diagnostiklabore in den europäischen Ländern nutzt mittlerweile EUCAST Grenzwerte zur Beurteilung der Empfindlichkeitstests für Erreger humanen Ursprungs, wobei bisher nicht für alle Methoden Richtlinien zur Durchführung der Empfindlichkeitstestung vorliegen (BROWN et al. 2015).
2.3 Klinische Grenzwerte (Breakpoints) und Epidemiologische Grenzwerte (ECOFFs)
Der Erfolg einer antimikrobiellen Therapie bakterieller Infektionen ist abhängig vom Einsatz eines geeigneten Wirkstoffs. Daher sollte der ursächliche Erreger isoliert und ein Empfindlichkeitstest durchgeführt werden. So kann ein geeigneter Wirkstoff ermittelt werden, gegen den keine phänotypische Resistenz des Erregers in-vitro vorliegt. Für eine Einstufung eines Erregers in die Kategorie „sensibel“, „intermediär“
oder „resistent“ ist das Vorliegen von (klinischen) Grenzwerten notwendig (KAHLMETER et al. 2003). Dabei gibt die Einstufung des Erregers als „sensibel“ an, dass eine Therapie höchstwahrscheinlich erfolgreich sein wird, wenn dieser Wirkstoff eingesetzt wird. Bei der Einstufung eines Wirkstoffes in „intermediär“ ist der therapeutische Erfolg unsicher und bei der Einstufung des Erregers als „resistent“
besteht eine höhere Wahrscheinlichkeit, dass sich kein therapeutischer Erfolg bei Einsatz dieses Wirkstoffes einstellt.
In den verschiedenen Richtlinien oder Standards werden Grenzwerte für die Beurteilung von Reihenverdünnungstests angegeben und zur Beurteilung von Ergebnissen der Agardiffusion werden Hemmhofdurchmesser als Kriterien bereitgestellt.
Eine Beurteilung der Ergebnisse von Empfindlichkeitstestungen kann prinzipiell nach klinischen Grenzwerten oder epidemiologischen Grenzwerten (sogenannten ECOFFs – epidemiological cut-off values) vorgenommen werden. In die klinischen Grenzwerte fließen Ergebnisse aus klinischen Studien, der Pharmakodynamik und Pharmakokinetik eines Wirkstoffes sowie die Wirkstoffverteilung im betreffenden Organsystem und die Dosierung des Wirkstoffes ein. Die Beurteilung des MHK- Wertes bezieht sich somit auf die vermutliche Wirksamkeit eines antimikrobiellen Wirkstoffes in-vivo, so dass der behandelnde Tierarzt die oben genannten Informationen (z.B. Tierart, Dosierung, betroffenes Organsystem) vor der Behandlung eines Patienten berücksichtigen muss und diese in die Auswertung einfließen (BYWATER et al. 2006). Der ECOFF ist dagegen der MHK-Wert eines antimikrobiellen Wirkstoffes, welcher die Wildtyp-Population der Bakterienspezies (MHK-Werte unterhalb des ECOFFs) von der Nicht-Wildtyp-Population (MHK-Werte gleich oder oberhalb des ECOFF-Wertes) abgrenzen soll. Hierbei wird angenommen, dass bei bi- bzw. multimodalen Verteilungen von MHK-Werten bei der Wildtyp- Population vermutlich keine Resistenzmechanismen vorhanden sind, während bei der Nicht-Wildtyp-Population Resistenzmechanismen vermutlich vorhanden sind.
Berücksichtigt für die Bestimmung eines ECOFFs werden dabei Bakterienisolate, die aus verschiedenen Quellen, Zeitintervallen und geographischen Regionen stammen.
Es handelt sich somit um einen Wert, der aufgrund der Verteilung von MHK-Werten in einer Bakterienpopulation ermittelt wurde und welcher z.B. für die Auswertung epidemiologischer Studien geeignet erscheint. Der ECOFF sollte aber nicht genutzt werden, um eine Beurteilung von MHK-Werten für die vermutliche Wirksamkeit eines antimikrobiellen Wirkstoffes beim therapeutischen Einsatz am Patienten in-vivo vorzunehmen, da viele Parameter bei der Ermittlung des ECOFFs nicht
berücksichtigt werden, welche aber für eine Abschätzung des Erfolges einer Therapie mit dem Wirkstoff von Bedeutung sind.
Das CLSI stellt für die Beurteilung der Empfindlichkeit eines Erregers und somit auch für die Zuordnung zu den Kategorien „sensibel“, „intermediär“ und „resistent“
klinische Grenzwerte zur Verfügung (SILLEY 2012). Die ECOFFs sind vor allem relevant, um feststellen zu können, ob eine bakterielle Subpopulation mit verminderter Empfindlichkeit gegenüber einem Wirkstoff vorliegt, sie sind hingegen nicht sinnvoll um den Anteil klinisch resistenter Bakterienisolate darzustellen (SILLEY et al. 2011).
Für viele veterinärmedizinisch wichtige Erreger liegen zurzeit keine klinischen Grenzwerte vor. Dadurch ist eine Einteilung der Erreger aufgrund der ermittelten MHK-Werte in die Kategorien „sensibel“, „intermediär“ und „resistent“ für diese Erreger-Wirkstoff-Kombinationen nicht möglich (KIETZMANN 2004).
2.4 Bordetella bronchiseptica
2.4.1 Taxonomie, Morphologie und Merkmale der Gattung
Erstmals wurde der Erreger 1910 bei einem Hund mit Atemwegserkrankung entdeckt und wenig später das Vorkommen bei anderen Säugetieren beschrieben (FERRY 1910, 1912a, b). Der Erreger wurde erst 1940 mit Atemwegserkrankungen beim Schwein in Zusammenhang gebracht und später als Mitverursacher der Erkrankung Rhinitis athrophicans entdeckt (PHILLIPS 1943; SWITZER 1956).
Bei Bordetella bronchiseptica handelt es sich um aerobe gramnegative Stäbchen der Gattung Bordetella aus der Ordnung/Familie Alcaligenaceae. Sie sind nicht sporenbildend, durch die Ausbildung einer peritrich angeordneten Begeißelung beweglich (Abbildung 6) und weisen eine Größe von etwa 0,5-0,5 x 0,2-2,0 µm auf.
Abb. 6:
Abbildung 6: Schematische Darstellung der peritrichen Begeißelungsform bei B. bronchiseptica
2.4.2 Epidemiologie und Bedeutung von B. bronchiseptica
Der Erreger B. bronchiseptica besiedelt die Schleimhaut des oberen Respirationstraktes und weist ein breites Wirtsspektrum auf. Dies kann zu Infektionen bei verschiedenen Säugetieren und Vögeln führen und auch bei immunsupprimierten Menschen kann der Erreger eine Infektion auslösen (GOODNOW 1980). Der Erreger wird häufig von Schweinen mit Atemwegserkrankungen oder Rhinitis athrophicans isoliert, gleichwohl auch nicht offensichtlich erkrankte Tiere den Erreger tragen können (BACKSTROM et al. 1988; PALZER et al. 2008; ZHAO et al. 2011;
HORIGUCHI 2012). Eine Infektion mit B. bronchiseptica prädisponiert Schweine für Infektionen mit weiteren Erregern wie z.B. Pasteurella (P.) multocida, H. parasuis, Streptococcus suis und verschiedene virale Erreger (z.B. PRRSV) (HARRIS u.
SWITZER 1968; GILES et al. 1980; DUGAL et al. 1992; BROCKMEIER et al. 2001;
BROCKMEIER 2004). Beim Hund ist B. bronchiseptica an der multifaktoriellen Atemwegserkrankung des Zwingerhustenkomplexes beteiligt (MCCANDLISH et al.
1976; MCCANDLISH et al. 1978; CHALKER et al. 2003; SCHULZ et al. 2014). Bei der Katze ist B. bronchiseptica sekundär am Katzenschnupfenkomplex beteiligt, kann aber auch als Primärerreger auftreten (GASKELL u. GASKELL 1997; BINNS et al.
1999; FOLEY et al. 2002). Des Weiteren wurden Infektionen des Atemtraktes bei Kaninchen und Pferden beschrieben (DEEB et al. 1990; GARCIA-CANTU et al.
2000). B. bronchiseptica-Infektionen des Menschen wurden bisher hauptsächlich bei immungeschwächten Patienten beschrieben (WOOLFREY 1991; VIEJO et al. 2002;
BOSE et al. 2008; GARCÍA-DE-LA-FUENTE et al. 2015).
Eine Übertragung des Erregers erfolgt hauptsächlich durch Tröpfcheninfektion zwischen Tieren einer Art, wobei auch eine Übertragung zwischen verschiedenen Tierarten oder vom Tier auf den Menschen möglich ist. Die Übertragung aus der Umwelt oder durch stark kontaminierte Gegenstände wird ebenfalls diskutiert, da der Erreger relativ lange außerhalb des Wirtes überleben kann (SPEAKMAN et al. 1999).
2.4.3 Infektionen mit B. bronchiseptica
Eine B. bronchiseptica-Infektion beim Schwein kann bei Tieren jeden Alters auftreten, meist infizieren sich aber schon Saugferkel beim Muttertier. Da der Erreger für einige Monate im Tier persistiert, stellen diese Tiere eine Quelle für Neuinfektionen anderer Tiere dar. Eine erworbene Immunität durch Antikörper aus dem Kolostrum kann die Ferkel vor Pneumonien oder schweren Läsionen schützen, dennoch kann die Infektion nicht verhindert werden. Die Infektion ist selbstlimitierend und transient, wenn keine anderen Erreger beteiligt sind (FENWICK 2013).
Die Inkubationszeit beträgt etwa 2-3 Tage und die klinischen Symptome reichen von einer leichten Rhinitis über Husten bis hin zu schweren Bronchopneumonien. Die Schwere der Symptome ist abhängig vom Alter des Tieres, dem Immunstatus und möglichen Infektionen mit anderen Erregern. Bei einer Co-Infektion mit toxinproduzierenden P. multocida-Stämmen kann das Krankheitsbild der progressiven Rhinitis atrophicans auftreten, welche auch als „Schnüffelkrankheit“
bezeichnet wird. Diese Erkrankung führt zu schweren Atemwegsinfektionen und ruft eine Deformation und Atrophie der Nasenmuscheln hervor (DE JONG u. NIELSEN 1990). Zur Prophylaxe gibt es einen inaktivierten Kombinationsimpfstoff, der B.bronchiseptica und P. multocida umfasst und einen Immunschutz für etwa sechs Monate bietet.
Auch Hunde jeden Alters sind für eine B. bronchiseptica-Infektion empfänglich und sie wird besonders dort beobachtet, wo viele Hunde auf engem Raum zusammen gehalten werden. Charakteristischerweise fallen die Tiere durch einen trockenen bellenden Husten auf, in schweren Fällen kann aber auch eine Pneumonie oder der Tod des Tieres beobachtet werden. Die Erkrankung, welche auch als Zwingerhusten
oder canine infektiöse Tracheobronchitis bezeichnet wird, wird meist durch eine Virusinfektion ausgelöst und kann anschließend zu einer mehrere Monate persistierenden Besiedlung mit B. bronchiseptica führen, welche im Normalfall selbstlimitierend ist (MCCANDLISH et al. 1976; MCCANDLISH et al. 1978;
SPEAKMAN et al. 2000; CHALKER et al. 2003; STEINFELD et al. 2012; FENWICK 2013).
B. bronchiseptica ist zudem am „Katzenschnupfenkomplex“ beteiligt, bei dem es sich um einen Krankheitskomplex der oberen Atemwege handelt (SPEAKMAN et al.
1997; FOLEY et al. 2002; EGBERINK et al. 2009). Der Erreger kann bei der Katze auch primär zu Infektionen des oberen Respirationstraktes führen. Es werden milde Symptome einer Atemwegserkrankung, wie Niesen oder Nasenausfluss bis hin zu schweren Fällen von Bronchopneumonien beschrieben. Besonders bei Katzenwelpen kann der Erreger zu schwerwiegenden Symptomen führen. In Haushalten mit mehreren Katzen oder in Tierheimen wird eine höhere Seroprävalenz des Erregers beschrieben. Nach Abklingen der Infektion kann der Erreger noch einige Wochen ausgeschieden werden. Es besteht die Möglichkeit, dass die Ausscheidung mit Faktoren wie Stress verbunden ist und der Erreger nicht in jeder Phase nachgewiesen werden kann (HELPS et al. 2005).
Ferner werden auch durch B. bronchiseptica verursachte Atemwegserkrankungen beim Pferd sowie bei Kaninchen und Nagetieren beschrieben (DEEB et al. 1990;
SPEAKMAN et al. 1997).
Durch das Auftreten von immer mehr Fällen beim Menschen wird dem Erreger inzwischen eine höhere Bedeutung zugeschrieben. Nicht in allen Fällen kann ein direkter Kontakt zu Haustieren nachgewiesen werden und es wurden zudem auch nosokomiale Übertragungen beschrieben (HUEBNER et al. 2006; BOSE et al. 2008;
GARCÍA-DE-LA-FUENTE et al. 2015).
B. bronchiseptica kann beim Menschen zu Atemwegsinfektionen führen und auch eine systemische Infektion ist möglich (WOOLFREY 1991; VIEJO et al. 2002; BOSE et al. 2008; GARCÍA-DE-LA-FUENTE et al. 2015).
2.4.4 Kultivierung, Wachstum, Erregernachweis und Typisierung von B. bronchiseptica
Bei B. bronchiseptica handelt es sich um strikt aerobe Bakterien, die auf Blutagar bei 35 - 37 °C innerhalb von 1 - 3 Tagen grau-weiße Kolonien bilden und durch eine nicht konsistente Hämolyse gekennzeichnet sind. Sie beziehen ihre Energie aus der Oxidation von Aminosäuren und können keine Kohlenhydrate als Energiequelle nutzen. Die Bakterien sind Oxidase und Katalase positiv, produzieren Urease und reduzieren Nitrat. Citrat wird als Kohlenstoffquelle verwendet (PICKETT u.
GREENWOOD 1986; WOOLFREY 1991).
Um die Verwandtschaft verschiedener Isolate zu untersuchen, werden molekularbiologische Methoden wie die Makrorestriktionsanalyse oder MLST- (Multilocus sequence typing) Verfahren zur Typisierung genutzt (SHIN et al. 2007).
Da keine Methode zur Serotypisierung von B. bronchiseptica-Isolaten verfügbar und die Kultivierung des Erregers wenig sensitiv ist, wurde zum Nachweis von B. bronchiseptica eine speziesspezifische PCR entwickelt, die das strukturelle Flagellin Gen (flaA) detektiert. Dieses Gen kann zur Differenzierung der Art genutzt werden, da in der Gattung Bordetella nur B. bronchiseptica Flagellen oder Geißeln besitzt (HOZBOR et al. 1999).
2.5 Haemophilus parasuis
2.5.1 Taxonomie, Morphologie und Merkmale der Gattung
Den Erreger der Glässerschen Krankheit, heute als Haemophilus (H.) parasuis bekannt, entdeckte Karl Glässer bereits 1910 und beschrieb ihn als gramnegatives Stäbchen (GLÄSSER 1910). Im Jahr 1931 wurde von Lewis und Shope ein Erreger als „Haemophilus influenzae suis“ identifiziert, welcher Ähnlichkeit mit dem humanen Erreger Haemophilus (H.) influenzae aufwies, aber vom Schwein isoliert wurde (LEWIS u. SHOPE 1931). Im Jahr 1969 machten Biberstein und White den Vorschlag, den Erreger in Haemophilus parasuis umzubenennen und nach genaueren taxonomischen Studien durch Kilian wurde der Erreger im Jahr 1976 in Haemophilus parasuis umbenannt (BIBERSTEIN u. WHITE 1969; KILIAN 1976).
Bei H. parasuis handelt sich um gramnegative Bakterien aus der Ordnung Pasteurellaceae und der Gattung Haemophilus. Der Erreger ist relativ klein (˂1 µm Breite und 1-3 µm Länge), nicht beweglich und pleomorph (einzelne Kokken bis filamentöse Ketten). Für sein Wachstum benötigt der Erreger den Wachstumsfaktor V (Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid – NADH), aber nicht den Wachstumsfaktor X (Hämin) (BIBERSTEIN u. WHITE 1969).
2.5.2 Epidemiologie und Bedeutung von H. parasuis
H. parasuis ist ein Teil der normalen Bakterienflora des oberen Respirationstraktes beim Schwein und führt häufig bei Saug- und Absatzferkeln zu Infektionen (HOLTKAMP 2007). Der Erreger kommt weltweit und mit einer steigenden Prävalenz in Schweinebeständen vor. Infektionen mit diesem Erreger sind unter den Bezeichnungen Glässersche Krankheit oder „Transportkrankheit“ bekannt (SELBITZ 2011; ARAGON 2012). Die Krankheit tritt häufig nach dem Transport auf und wird daher mit Stress auslösenden Noxen in Verbindung gebracht (RITZMANN u.
HEINRITZI 2005).
Eine Übertragung kann durch andere Tiere oder Vektoren erfolgen, wobei der Erreger in der Umwelt nicht sehr stabil ist (RODRIGUEZ FERRI et al. 2010). In Wildschweinen ist die Glässersche Krankheit bisher nicht aufgetreten, dennoch konnte H. parasuis von Wildschweinen isoliert werden (OLVERA et al. 2007).
Innerhalb der Spezies H. parasuis wurden bisher 15 verschiedene Serovare und mehrere Serovare, die nicht typisierbar sind, beschrieben. Aus klinischem Untersuchungsmaterial wird in Australien, Europa und Nordamerika am häufigsten der Serotyp 5 isoliert, dem an zweiter Stelle der Häufigkeit der Serotyp 4 folgt. In einer Studie mit SPF-Schweinen wurden die Serovare 1, 5, 10, 12, 13 und 14 als besonders virulent beschrieben und führten bei infizierten Tieren zu einer hohen Sterblichkeit. Die Serovare 2, 4 und 15 führten zu Polyserositis und Serovar 8 rief milde Symptome hervor. Die anderen Serovare von H. parasuis führten nicht zu klinischen Symptomen (KIELSTEIN 1992; RAPP-GABRIELSON u. GABRIELSON 1992; BLACKALL et al. 1996; RUBIES et al. 1999; OLIVEIRA 2003; TURNI u.
