Methoden zur Empfindlichkeitstestung von Bakterien

In Abhängigkeit vom Diagnostiklabor, dem Erreger und dem Spektrum der zu testenden Wirkstoffe kann es variieren, welche Methode für die Empfindlichkeitstestung geeignet ist. Für einige anspruchsvolle Erreger, die spezielle Anforderungen an das Nährmedium stellen oder besondere Testkonditionen erfordern, ist die Methode der Empfindlichkeitstestung ausschlaggebend für das Ergebnis. Abweichungen können zu unterschiedlichen Werten in der MHK-Testung führen (KING 2001).

2.1.2.1 Agardiffusionstest

Die Agardiffusionsmethode stellt eine Methode dar, welche in den Standards der CLSI als Methode zur Empfindlichkeitstestung enthalten ist. Bei der Durchführung des Tests wird ein fester Nährboden mit einem Inokulum von etwa 1-2 x 10⁸ koloniebildenden Einheiten (KbE) beimpft, indem die Bakteriensuspension homogen auf der Agarplatte verteilt wird. Für nicht anspruchsvolle Bakterien wird in den CLSI-Richtlinien Mueller-Hinton Agar empfohlen, da der Agar eine gute Reproduzierbarkeit antimikrobieller Empfindlichkeitstestungen zeigt und nur eine geringe Hemmung der antimikrobiellen Wirkstoffe Tetrazyklin, Trimethoprim von Sulfonamiden bewirkt. Für anspruchsvolle Erreger, wie zum Beispiel Actinobacillus (A.) pleuropneumoniae und Histophilus (H.) somni, wird Mueller-Hinton Agar mit Kochblut verwendet (CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE 2013a). Anschließend werden Testplättchen, welche den antimikrobiellen Wirkstoff mit jeweils einer bestimmten Wirkstoffmenge enthalten, auf den Nährboden gelegt. Dabei können auf einer

Agarplatte gleichzeitig mehrere Wirkstoffe getestet werden (Abb. 1). Nach einer Inkubationszeit von 16-18 Stunden (für einige Erreger existieren abweichende Inkubationszeiten) wird der Durchmesser des Hemmhofes um das Plättchen durch Abmessen oder anhand einer dafür vorgesehenen Schablone bestimmt (JORGENSEN u. FERRARO 2009; CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE 2013a). Werte für eine Beurteilung des Hemmhofdurchmessers werden in den jeweiligen Durchführungsvorschriften z.B. des CLSI veröffentlicht. Anhand derer können die Ergebnisse der Testung in eine Kategorisierung des Erregers als

„sensibel“, „intermediär“ oder „resistent“ gegenüber dem Wirkstoff vorgenommen werden (CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE 2013a). Bei diesem Empfindlichkeitstest handelt es sich um eine einfach durchzuführende und zeitsparende Methode, bei der allerdings keine MHK-Werte erhoben werden können (SCHWARZ et al. 2003). Bei einem Vergleich des Agardiffusiontests mit dem Bouillon-Mikrodilutionstest stellte sich der Agardiffusionstest als weniger verlässlich dar. Daraus erfolgte die Empfehlung des DVG-Arbeitskreises „Antibiotikaresistenz“, den Bouillon-Mikrodilutionstests dem Agardiffusionstest vorzuziehen (LUHOFER 2004).

Abb. 1:

Abbildung 1: Agardiffusionstest mit den zu testenden Wirkstoffen Cefpodoxim und Ceftriaxon mit dem Erreger E. coli auf Kationen-supplementiertem Mueller-Hinton Agar

2.1.2.2 Epsilontest (E-Test)

Der E-Test stellt eine Kombination aus einem Reihenverdünnungstest und dem Agardiffusionstest dar (BOLMSTRÖM et al. 1988; BROWN u. BROWN 1991). Bei der Durchführung dieses Tests wird ebenfalls ein fester Nährboden mit einem Inokulum von ca. 1-2 x 10⁸ Keimen (entspricht in etwa 0.5 McFarland) beimpft und ein kommerziell erhältlicher E-Test Streifen mit einem Konzentrationsgradienten des antimikrobiellen Wirkstoffes aufgelegt. Nach einer Inkubationszeit von etwa 18-24 Stunden wird ein ellipsoider Hemmhof sichtbar (Abb. 2). Das Ergebnis kann am unteren Schnittpunkt des Hemmhofes mit dem Teststreifen in Form des MHK-Wertes abgelesen werden, da auf der Oberfläche des Teststreifens eine Skala aufgetragen ist (JORGENSEN u. FERRARO 2009). Diese Methode ist ebenfalls leicht anwendbar, jedoch kosten- und zeitintensiver als der Agardiffusionstest. Der Vorteil ist darin zu sehen, dass Ergebnisse in Form von MHK-Werten erhoben werden und auch Erreger getestet werden können, die in Flüssigmedium nur schwaches oder kein Wachstum zeigen (SELBITZ 2011). Des Weiteren kann die Auswahl der antimikrobiellen Wirkstoffe variabel zusammengestellt werden. Nicht alle Wirkstoffe, die veterinärmedizinisch relevant sind, sind auch als Teststreifen erhältlich. Zudem liegen keine standardisierten Durchführungsvorschriften für diesen Test vor.

Abb.2:

Abbildung 2: E-Test mit der zu testenden Wirkstoffkombination Trimethoprim/Sulfamethoxazol und dem Erreger H. parasuis auf Kochblutagar

2.1.2.3 Reihenverdünnungstests

Bei dem Reihenverdünnungstest wird eine zweifache Verdünnungsreihe des antimikrobiellen Wirkstoffes in einem festen oder flüssigen Nährmedium erstellt und mit einem spezifischen Inokulum der Bakteriensuspension beimpft. Die Inkubation erfolgt nach den Bedingungen, die für den jeweiligen Erreger angegeben werden.

Nach erfolgter Inkubation wird die Auswertung visuell vorgenommen, wobei auf das Vorliegen von bakteriellem Wachstum überprüft wird. Die erste Verdünnungsstufe, bei der kein sichtbares Wachstum mehr vorhanden ist, zeigt den MHK-Wert an (SCHWARZ et al. 2003; RICHTER et al. 2006). Der Vorteil dieser Methode ist die Ermittlung von quantitativen Ergebnissen in Form von MHK-Werten (JORGENSEN u.

FERRARO 2009). Eine Einteilung in “sensibel“, „intermediär“ und „resistent“ kann (wie bei den anderen Testverfahren auch) allerdings nur erfolgen, wenn für die getestete Erreger-Wirkstoff-Kombination Grenzwerte vorliegen (BYWATER et al.

2006). Zu den Reihenverdünnungstests werden die Agardilution, die Bouillon-Makrodilution und die Bouillon-Mikrodilution gezählt.

Agardilution

Dieser Reihenverdünnungstest auf einem festen Nährboden stellt eine verhältnismäßig aufwändige Methode der Empfindlichkeitstestung dar. Sie eignet sich aber besonders für anspruchsvolle Bakterien, die in einem Flüssigmedium nur schwaches Wachstum zeigen (WHITE et al. 2001; LUBER et al. 2003; VARELA et al.

2008). Für die Agardilution wird in den CLSI-Standards für nicht anspruchsvolle Erreger tierischen Ursprungs Mueller-Hinton Agar empfohlen, der mit 5 % defibriniertem Blut von Schaf, Kaninchen, Rind oder Pferd supplementiert werden kann. Bei der Herstellung von Agarplatten mit einem antimikrobiellen Wirkstoff muss zudem auf eine gleichmäßige Verteilung des Wirkstoffes im Agar geachtet werden.

Weiterhin ist die Einhaltung der Temperatur bei der Herstellung des Agars bedeutend, damit kein Konzentrationsverlust des Wirkstoffes eintritt (CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE 2013a).

Bei der Agardilution enthält jede Agarplatte eine spezifische Konzentration des Wirkstoffes, welche anschließend mit mehreren Bakterienisolaten beimpft werden

kann. Es ist möglich dafür einen speziellen Replikator zu verwenden, mit dem die Bakteriensuspension mehrerer Isolate zeitgleich aufgetragen wird. Die Herstellung des Inokulums richtet sich nach dem zu testenden Erreger (WIEGAND et al. 2008a).

Bei der Herstellung des Inokulums von schnellwachsenden aeroben Erregern wird wie folgt verfahren: Ein geeignetes Medium wird mit 4-5 Kolonien des Erregers beimpft und bei 35°C inkubiert, bis zum Erreichen oder Überschreiten einer optischen Dichte von OD 0,08 bis 0,13 bei einer Wellenlänge von 625 nm im Photometer (entspricht 0,5 McFarland). Anschließend wird die Bakteriensuspension auf exakt 0,5 McFarland Standard eingestellt (ca. 1-2 x 10⁸ KbE). Bei anspruchsvollen Erregern, wie z.B. A. pleuropneumoniae und H. somni, werden 4-5 Kolonien direkt in eine 0,9 % NaCl-Lösung gegeben und auf 0,5 McFarland Standard eingestellt. Die Auswertung der beimpften Agarplatte erfolgt visuell, für die meisten Erreger nach etwa 16-20 Stunden Inkubation. Die Platte mit der ersten Konzentration des Wirkstoffes, auf der kein Wachstum mehr sichtbar ist, definiert den MHK-Wert.

Eine einzelne Kolonie, die durch das Inokulum verursacht wurde oder ein sehr schwacher Schleier, welcher auf den Platten sichtbar ist, werden nicht in die Auswertung der Agardilution einbezogen (CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE 2013a). In Abbildung 3 ist ein Beispiel einer Agarplatte dargestellt, die für die Agardilution von H. parasuis verwendet wurde.

Abb. 3:

Abbildung 3: Agardilution mit dem zu testenden Wirkstoff Tetrazyklin, dem Erreger H. parasuis und E. coli (ATCC 25922) als Qualitätskontrollstamm auf Kochblutagar

Bouillon Makrodilution

Bei der Bouillon-Makrodilution handelt es sich um einen Reihenverdünnungstest, bei dem eine zweifache Verdünnungsreihe des zu testenden antimikrobiellen Wirkstoffes in einem Reagenzröhrchen mit Flüssigmedium erstellt wird. Dabei wird jedes Reagenzröhrchen mit einem Inokulum beimpft, so dass anschließend ca. 5 x 10⁵ KbE/ml in der Bakteriensuspension enthalten sind. Nach der Inkubation wird die Auswertung anhand des visuell zu ermittelnden Wachstums der Bakterien im Reagenzröhrchen vorgenommen. Die erste Konzentrationsstufe, in der kein Wachstum mehr sichtbar ist, bestimmt den MHK-Wert (CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE 2013a). Nachteile dieser Methode sind das arbeits- bzw. zeitintensive Herstellen der Verdünnungsreihen im Reagenzröhrchen und der Verbrauch von relativ großen Mengen an Medium und Wirkstoff. Vorteil dieser Methode ist die Erhebung quantitativer Ergebnisse in Form von MHK-Werten und die Möglichkeit einer individuellen Auswahl der Wirkstoffe und Konzentrationsstufen (SCHWALBE et al. 2007; JORGENSEN u. FERRARO 2009).

Beispielhaft wurde in Abbildung 4 eine Makrodilution des Erregers B. bronchiseptica dargestellt.

Abb. 4:

Abbildung 4: Makrodilution des Erregers B. bronchiseptica in Kationen-supplementierter Mueller-Hinton Bouillon. Der Pfeil weist auf die Konzentrationsstufe hin, die als MHK-Wert ermittelt wurde.

Bouillon-Mikrodilution

Bei der Bouillon-Mikrodilutionsmethode handelt es sich ebenfalls um einen Reihenverdünnungstest, welcher der Makrodilution zwar ähnlich ist, bei dem jedoch

MHK-Wert

viel kleinere Volumina an Nährsuspension verwendet werden. Die Testung erfolgt in den meisten Fällen in Mikrotiterplatten, die kommerziell erworben werden und deren Vertiefungen bereits mit den antimikrobiellen Wirkstoffen in 2-fachen Verdünnungsreihen beschichtet sind. Bei dieser Methode ist die Testung mehrerer Wirkstoffe oder Wirkstoffkombinationen gleichzeitig möglich und es handelt sich durch die Verwendung vorbelegter Mikrotiterplatten um eine zeitsparende Methode.

Der Verwendung entsprechend können spezielle Layouts, wie z.B. angepasste Layouts für grampositive oder gramnegative Erreger, benutzt werden. Pro Mikrotiterplatte können eine Vielzahl von Wirkstoffen oder Konzentrationsstufen getestet werden. Dabei sollten mindestens zwei Vertiefungen der Platte für eine Wachstumskontrolle vorgesehen sein. Für die Mikrodilution können vorbelegte, bei den Herstellern vorrätig gehaltene Layouts der Mikrotiterplatten verwendet oder individuell erstellte Layouts bestellt werden (JORGENSEN u. FERRARO 2009). Für eine Durchführung der Bouillon-Mikrodilution wird eine Bakteriensuspension des zu testenden Erregers hergestellt und z.B. mit einer Mehrkanalpipette auf die einzelnen Vertiefungen der Mikrotiterplatte aufgetragen. Diese Vertiefungen können je nach verwendeter Platte ein Volumen von 50-100 µl aufnehmen. Die Einstellung des Inokulums erfolgt nach einer festen Methodenvorschrift, wobei die zu erzielende Konzentration ca. 5 x 10⁵ KbE/ml beträgt. Die Auswertung kann visuell oder automatisiert erfolgen (CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE 2013a). Bewertet wird vorhandenes Bakterienwachstum, welches sich in Form von kleinen Knöpfen auf dem Boden der Vertiefungen der Mikrotiterplatten darstellt. Der MHK-Wert entspricht der ersten Konzentrationsstufe des getesteten Wirkstoffes, bei der kein Wachstum des Erregers mehr sichtbar ist (WIEGAND et al. 2008a).

Ringversuche haben eine gute Eignung der Methode gezeigt. Sie zeichnet sich dabei durch eine hohe Reproduzierbarkeit aus und ist für Routinelabors durch die Möglichkeit des kommerziellen Bezugs von mit antimikrobiellen Wirkstoffen beschichteten Mikrotiterplatten und dadurch geringeren Zeitaufwand ebenfalls geeignet. Von dem DVG-Arbeitskreis Antibiotikaresistenz wird die Methode derzeit als Methode der Wahl empfohlen (WALLMANN et al. 2005). Abbildung 5 zeigt

beispielhaft einen Bouillon-Mikrodilutionstest eines H. parasuis–Isolates in Test Medium Bouillon (TMB) für acht verschiedene antimikrobielle Wirkstoffe.

Abb. 5:

Abbildung 5: Bouillon-Mikrodilutionstestung des Erregers H. parasuis gegenüber acht Wirkstoffen in Test Medium Bouillon. Der Pfeil zeigt beispielhaft die erste Verdünnungsstufe an, in der kein sichtbares Wachstum

mehr erkennbar ist (MHK-Wert).