Sandra Prüller
Entwicklung von Methoden zur Empfindlichkeitstestung von Bordetella bronchiseptica und Haemophilus parasuis im Bouillon-Mikrodilutionsverfahren
Bei B. bronchiseptica und H. parasuis handelt es sich um bedeutende Erreger in der Schweine-Primärproduktion. B. bronchiseptica Infektionen können auch artübergreifend auftreten und Infektionen des Menschen kommen ebenfalls, hauptsächlich bei immunsupprimierten Menschen, vor. Der Erreger H. parasuis hingegen ist wirtsspezifisch und verursacht in Schweinebetrieben hohe ökonomische Verluste. Da für diese beiden Erreger zu Beginn der Arbeit noch kein standardisiertes Verfahren für die Empfindlichkeitstestung vorlag, sollte im Rahmen dieser Arbeit überprüft werden, ob bereits vorliegende Methoden zur Empfindlichkeitstestung Anwendung für diese langsamer wachsenden bzw. schwieriger zu kultivierenden Erreger finden können. Sollte dies nicht der Fall sein, war es Ziel dieser Studie, eine neue Methode zur Empfindlichkeitstestung für B. bronchiseptica und H. parasuis zu entwickeln.
Um die Eignung verschiedener Nährmedien zu untersuchen, wurden als erstes Wachstumskurven in verschiedenen Flüssigmedien erstellt. Ein B. bronchiseptica-Referenzstamm, ein B. bronchiseptica-Typstamm sowie zwei Feldisolate zeigten in vier getesteten Medien ein ausreichendes Wachstum und erreichten die stationäre Phase nach 22 bis 24 Stunden Inkubationsdauer. Da es sich bei CAMHB um ein für Empfindlichkeitstestungen validiertes Medium handelt, wurde dieses Medium für die weitere Methodenentwicklung verwendet. Dazu wurden mit zehn Isolaten in fünf Wiederholungen Empfindlichkeitstestungen durchgeführt. Die Durchführung der Testungen bezüglich der verwendeten Inokulumdichte, Inkubationstemperatur und -atmosphäre erfolgte nach dem CLSI-Standard VET01-A4. Die Ergebnisse wurden anschließend statistisch ausgewertet. Die Auswertung zeigte, dass die Methode aus dem CLSI Standard prinzipiell für B. bronchiseptica gut geeignet ist,
allerdings wurden nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden deutlich homogenere MHK-Werte erzielt als nach 20 Stunden. Daher wurde vorgeschlagen, eine Modifikation der Methode für diesen Erreger vorzunehmen und die Inkubationszeit auf 24 Stunden zu erhöhen. Eine Laborvergleichsuntersuchung mit zehn teilnehmenden Laboren bestätigte die gute Eignung der modifizierten Methode.
Die Methode wurde an 107 aktuellen B. bronchiseptica-Isolaten von Schweinen und 43 Isolaten von Liebhabertieren vergleichend getestet und die Auswirkung der verlängerten Inkubationszeit auf den MHK50- und MHK90-Wert untersucht. Die Einteilung der Isolate in „sensibel“, „intermediär“ und „resistent“ konnte aufgrund fehlender weiterer Grenzwerte nur für porcine Isolate und die Wirkstoffe Ampicillin und Florfenicol vorgenommen werden. Es stellte sich heraus, dass alle 107 Isolate gegen Ampicillin resistent waren. Ein Isolat konnte als „resistent“ und ein weiteres Isolat als „intermediär“ für Florfenicol eingestuft werden. Die 43 Isolate von Liebhabertieren lagen für Ampicillin vermutlich ebenfalls im resistenten Bereich, für Florfenicol lagen nur drei Isolate im vermutlich resistenten Bereich. Bei den Isolaten vom Schwein führte die verlängerte Inkubationszeit auf 24 Stunden bei sieben von 24 Wirkstoffen zu leicht erhöhten MHK50-Werten und bei sechs Wirkstoffen zu erhöhten MHK90-Werten, wobei die Isolate vom Begleittier nur bei zwei Wirkstoffen erhöhte MHK50- und MHK90-Werten aufwiesen. Eine veränderte Einstufung von
„sensibel“ in „intermediär“ der 107 Isolate vom Schwein durch die verlängerte Inkubationszeit wurde nur für zehn Isolate und den Wirkstoff Florfenicol festgestellt.
Resistente Isolate und Isolate mit höheren MHK-Werten wurden zusätzlich auf das Vorliegen antimikrobieller Resistenzgene untersucht. Es wurden die β-Laktamase-Resistenzgene blaBOR-1 bei 146 Isolaten und zusätzlich das Gen blaOXA bei drei Isolaten mit MHK-Werten von ≥128 µg/ml Ampicillin nachgewiesen. Die Streptomycin-Resistenzgene strA und strB wurden bei 17 Isolaten und das Tetrazyklin-Resistenzgen tet(A) bei acht Isolaten mittels PCR detektiert. Insgesamt zehn Isolate trugen das Sulfonamid-Resistenzgen sul1, wovon drei Isolate mit MHK-Werten von 16/304 – 32/608 µg/ml für die Kombination Trimethoprim/Sulfamethoxazol zusätzlich das Trimethoprim-Resistenzgen dfrA7
trugen. Das Resistenzgen sul2 wurde bei 73 Isolaten nachgewiesen. Die Resistenzgene waren zum Teil auf Plasmiden lokalisiert.
Auch für den Erreger H. parasuis wurden im Rahmen der Methodenentwicklung Wachstumskurven in vier verschiedenen Medien erstellt. Da dieser Erreger besondere Ansprüche an das Nährmedium stellt, konnte für den H. parasuis-Typstamm und drei Feldisolate nur in den Medien VFM und TMB ein Wachstum in der Flüssigkultur beobachtet werden. Ein sichtbares Wachstum in den Vertiefungen von Mikrotiterplatten konnte allerdings nur in TMB Medium für alle Feldisolate erzielt werden. Um ein für die Routinediagnostik geeignetes Medium zu finden, das sich in der Herstellung und Anwendung als weniger aufwändig im Gegensatz zu TMB darstellt, wurde ein neues Medium entwickelt. Dazu wurde untersucht, welches der vier Supplemente des TMB Mediums essentiell für das Wachstum von H. parasuis ist und diese dem Medium CAMHB zugefügt. Es stellte sich heraus, dass NADH in Verbindung mit inaktiviertem Hühnerserum geeignet war, um das Wachstum von H.
parasuis in CAMHB zu unterstützen. Die statistische Auswertung der Methodenentwicklung von drei H. parasuis-Isolaten in CAMHB und TMB Medium zeigte, dass die Inkubationszeit keinen signifikanten Einfluss auf die Homogenität der MHK-Werte hatte und somit die Auswertung der Mikrotiterplatten nach 20 oder 24 Stunden Inkubationszeit vorgenommen werden kann. Die MHK-Werte in TMB Medium zeigte sich in der statistischen Auswertung zwar etwas homogener, der Unterschied war aber nicht signifikant. Der Vergleich der MHK-Werte von 47 H. parasuis-Isolaten und 21 Wirkstoffen ergab ebenfalls keinen signifikanten Unterschied zwischen den MHK-Werten die mit beiden Medien vergleichend erstellt wurden. Eine Einteilung der Isolate in die Kategorien sensibel oder resistent konnte aufgrund fehlender spezifischer Grenzwerte für H. parasuis nicht vorgenommen werden. Die Inkubationsbedingungen und Inokulumkonzentration konnte gemäß CLSI-Standard angewendet werden. Die Inokulumkonzentration sollte für H. parasuis-Isolate, die ein sehr schwaches Wachstum zeigen überprüft werden.
Unter Verwendung des neu entwickelten Mediums (supplementierte CAMHB) stellte sich diese Methode zur Empfindlichkeitstestung im Bouillon-Mikrodilutionsverfahren von H. parasuis als sehr vielversprechend dar.
6 Summary
Sandra Prüller
Development of a broth microdilution susceptibility testing method for Bordetella bronchiseptica und Haemophilus parasuis
B. bronchiseptica and H. parasuis are important pathogens in swine production.
Infections with B. bronchiseptica have also been shown to be zoonotic, with infections in primarily immune suppressed individuals occurring. On the other hand H. parasuis is host specific and causes high losses on pig farms. As there was no standardised method of antimicrobial susceptibility testing for both bacteria species at the beginning of the study, the initial aim was thus to verify if the existing susceptibility methods could also apply for these slow growing or fastidious bacteria.
If this is not the case, the aim of the study was to develop an antimicrobial susceptibility method for B. bronchiseptica and H. parasuis.
To examine the suitability of various culture media, growth curves were first established. B. bronchiseptica reference strain, B. bronchiseptica type strain and two field isolates in four culture media showed a sufficient growth and all isolates reached the stationary phase after 22 to 24 hours incubation time. Since CAMHB medium is a validated medium for broth microdilution susceptibility testing, this medium was used for further method development. For this purpose susceptibility testing was performed with ten B. bronchiseptica isolates in five replications. Inoculum density, incubation temperature and incubation atmosphere followed CLSI document VET01-A4.
Statistical analysis of the results was determined afterwards. The evaluation showed that the recommended CLSI method is suitable for B. bronchiseptica in principle.
However, the incubation time of 24 hours achieved more homogenous MIC values in comparison to 20 hours. Therefore the modification of increasing the incubation time to 24 hours was recommended for B. bronchiseptica. A laboratory comparison trial with ten laboratories confirmed the suitability of the modified method.
The method was tested against a panel of 107 current isolates from swine and 43 isolates from companion animals and the effect of the increased incubation time on the MIC50- and MIC90-values were examined. A classification of the isolates in susceptible, intermediate susceptible and resistant was only possible for porcine isolates and the antimicrobial agents ampicillin and florfenicol due to the lack of specific breakpoints for this pathogen. It has been proven that all 107 porcine isolates were resistant against ampicillin. One isolate could be classified as resistant and another one as intermediate susceptible for florfenicol. 43 isolates from companion animals were probably in the range of resistance for ampicilllin, for florfenicol only three isolates were probably located in the range of resistance. For the porcine isolates, an increased incubation time of 24 hours lead to slightly elevated MIC50 -values of seven from 24 antimicrobials agents and for six antimicrobial agents to elevated MIC90-values, whereas isolates from companion animals exhibited elevated MIC50- and MIC90-values only for two of the tested antimicrobials agents. A modified classification from susceptible to intermediate susceptible of the 107 porcine isolates due to the increased incubation time was determined for only 10 isolates and the antimicrobial agent florfenicol. Additionally, resistant isolates and isolates with elevated MIC values were examined for antimicrobial resistance genes. For 146 isolates, the β-Lactamase resistance genes blaBOR-1 and additionallyblaOXA for three isolates with an MIC of ≥128 µg/ml were detected. Streptomycin resistance genes strA and strB were located in 17 isolates and tetracycline resistance gene tet(A) were found in eight isolates. Ten isolates carried the resistance gene sul1, thereof three isolates with an MIC of 16/304 – 32/608 µg/ml carried the trimethoprim resistance gene dfrA7 in addition. Resistance gene sul2 were detected in 73 isolates. Some of the resistance genes were located on plasmids.
Subsequently for the pathogen H. parasuis, growth curves were performed in four different media to examine the suitability. Due to the special medium requirements, growth could only be detected in VFM and TMB medium for the H. parasuis type strain and three field isolates. However, visible growth in microtiter plates could be achieved for all four isolates only in TMB medium. To find a suitable medium for routine diagnostics, which is simple to assemble and the application is less complex
compared to TMB medium, a new medium was developed. Therefore CAMHB was used as a basis medium and four supplements were evaluated to determine which are essential to support the growth of H. parasuis isolates. It was seen that the supplements NADH and inactivated chicken serum were required to promote growth.
Statistical analysis of the method development of two H. parasuis isolates in supplemented CAMHB and TMB showed that incubation time had no significant influence on homogeneity of MIC values. Therefore reading of MIC values can be performed after 20 or 24 hours incubation time. By comparing the media, it was seen that the MIC values in TMB medium were more homogenous, but the difference was not statistically significant. A comparison of MIC values from 47 H. parasuis isolates and 21 antimicrobial agents showed no significant difference between MIC values obtained with both media. Classification of the isolates into the categories susceptible or resistant could not be obtained due to the absence of specific H. parasuis breakpoints. Incubation conditions and inoculum size can be adopted from the CLSI document VET01-A4. The inoculum size should be verified for those H. parasuis isolates which are showing weak growth. Broth microdilution susceptibility testing with the new developed medium (supplemented CAMHB) appeared to be a promising method for testing H. parasuis isolates.
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