Tierärztliche Hochschule Hannover Zentrum für Infektionsmedizin
Institut für Mikrobiologie
Identifizierung neuer virulenzassoziierter Faktoren von Haemophilus parasuis und
Entwicklung einer Multiplex-PCR
INAUGURAL - DISSERTATION Zur Erlangung des Grades Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
- Dr. med. vet. -
vorgelegt von Meike Sack aus Wilhelmshaven
Hannover 2008
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. N. Baltes
1. Gutachten: Prof. Dr. N. Baltes 2. Gutachten: PD Dr. I. Hennig-Pauka
Tag der mündlichen Prüfung: 4. November 2008
Diese Arbeit wurde gefördert durch die Akademie für Tiergesundheit (AfT).
"Gehör ich doch zu den Narren, die nach inwendig gucken, wo bekanntermaßen nur spärlich beleuchtet wird."
Wilhelm Busch
Folgende Teile der vorliegenden These wurden bereits publiziert:
Sack, M. und Baltes, N. (2008)
Identification and Characterization of New Virulence Associated Factors of Haemophilus parasuis
Jahrestagung der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft Fachgruppe
„Bakteriologie und Mykologie“
25.-27. Juni 2008, Braunschweig, Deutschland Sack, M. und Baltes, N. (2008)
Identification and Characterization of New Virulence Associated Factors of Haemophilus parasuis,
108th General Meeting of the American Society for Microbiology 01.-05. Juni 2008, Boston, USA
Inhalt
A Einleitung ...13
B Schrifttum ...14
1 Haemophilus parasuis ...14
1.1 Allgemeine Eigenschaften ... 14
1.2 Charakterisierung des Erregers ... 15
1.2.1 Nachweis des Erregers ...16
1.2.2 Virulenzfaktoren ...18
1.2.2.1 Neuraminidase ... 18
1.2.2.2 Eisenrezeptoren ... 18
1.2.2.3 Fimbrien ... 20
1.2.2.4 Kapsel ... 20
1.2.2.5 Lipopolysaccharide, Lipooligosaccharide ... 20
1.2.2.6 Toxine ... 21
1.2.2.7 Sonstige virulenzassoziierte Faktoren ... 22
1.2.2.8 Vergleichsstudien zur Identifizierung von virulenzassoziierten Faktoren ... 22
1.2.3 Typisierung von H. parasuis ...24
1.2.3.1 DNA-basierte Typisierungsmethoden ... 24
1.2.3.2 Proteinbasierte Typisierungsmethoden ... 27
1.2.3.3 Serologische Methoden ... 29
1.2.3.4 Vergleich der Typisierungsmethoden ... 30
1.2.4 Tiermodelle ...31
2 Ziel der Studie ...35
C Material und Methoden ...36
1 Material ...36
1.1 Geräte, Verbrauchsmittel und Chemikalien ... 36
1.2 Lösungen und Puffer ... 36
1.3 Bakterienstämme ... 36
Inhalt
2 Methoden ...36
2.1 Mikrobiologische Methoden ... 36
2.1.1 Kultivierung von Escherichia coli Stämmen ...36
2.1.2 Kultivierung von H. parasuis Stämmen...36
2.2 Molekularbiologische Methoden ... 37
2.2.1 Arbeiten mit DNA ...37
2.2.1.1 Präparation chromosomaler DNA ... 37
2.2.1.2 Plasmidpräparationen ... 38
2.2.1.3 Polymerase-Kettenreaktion ... 39
2.2.1.3.1 Restriction Fragment Length Polymorphism-PCR ...41
2.2.1.4 Primer ... 42
2.2.1.5 Agarosegel-Elektrophorese ... 42
2.2.1.6 Polyacrylamidgel-Elektrophorese ... 42
2.2.1.7 Koloniegel ... 43
2.2.1.8 Klonierung ... 43
2.2.1.8.1 Restriktionsenzymverdau ...43
2.2.1.8.2 Ligation ...44
2.2.1.9 Transformation ... 44
2.2.1.10 Herstellung chemokompetenter E. coli Zellen ... 45
2.2.1.11 Repräsentative Differenzanalyse ... 45
2.2.1.12 Markieren von Gensonden mit 32P-dCTP ... 48
2.2.1.13 Southern Blot ... 48
2.2.1.14 Southern Transfer ... 48
2.2.1.15 Southern Hybridisierung ... 49
2.2.1.16 DNA-Sequenzierung und Sequenzanalyse ... 50
2.2.2 Arbeiten mit RNA ...50
2.2.2.1 Präparation von RNA ... 50
Inhalt
2.2.2.2 Reverse Transkriptase-PCR ... 50
2.2.3 Arbeiten mit Proteinen ...51
2.2.3.1 Eindimensionale SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese ... 51
2.2.3.2 Ganzzelllysate ... 51
2.2.3.3 Massenspektrometrie ... 52
2.2.3.4 Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-of-Flight- Mass Spectrometry ... 53
2.2.3.5 Electro-Spray Injection Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry ... 54
2.3 Infektionsversuche an Schweinen ... 55
2.3.1.1 Zeitplan ... 55
2.3.1.2 Herkunft und Unterbringung der Schweine ... 55
2.3.1.3 Präparation der Bakterien für die Infektion ... 56
2.3.1.4 Aerosolinfektion... 56
2.3.1.5 Intratracheale Infektion ... 57
2.3.1.6 Überwachung während des Experiments ... 57
2.3.1.7 Euthanasie und Sektion ... 57
2.3.1.8 Reisolation von H. parasuis ... 58
2.3.1.9 Enzyme Linked Immunosorbent Assay ... 59
D Ergebnisse ...60
1 Isolierung H. parasuis spezifischer Fragmente mittels Repräsentativer Differenzanalyse ...60
1.1 Überprüfung der Spezifität der RDA-Fragmente ... 61
1.2 Homologiesuche und PCR ... 62
1.3 Vorkommen der H. parasuis Serotyp 5 (Stamm Nagasaki) – spezifischen Fragmente in Referenz- und Feldstämmen ... 66
2 Proteomanalysen mittels SDS-PAGE ...76
3 Proteomuntersuchungen mittels Massenspektrometrie ...78
3.1 MALDI-TOF-Analysen ... 79
Inhalt
3.2 Q-TOF-Analysen ... 82
4 Entwicklung einer Multiplex-PCR ...84
4.1 Primerkonstruktion ... 84
4.2 Überprüfung der Spezifität ... 84
4.3 Optimierung der PCR-Bedingungen ... 86
4.4 Interne Kontrolle ... 86
4.5 Überprüfung der Referenzstämme ... 87
4.6 Überprüfung der aus pneumonischen Lungen isolierten Feldstämme ... 89
1.1 Überprüfung der systemisch isolierten Feldstämme ... 90
1.1 Überprüfung der nasal isolierten Feldstämme ... 91
4.7 Überprüfung weiterer Feldstämme ... 92
5 Infektionsversuch am Schwein mit H. parasuis ...95
5.1 Infektion mit dem Referenzstamm für Serotyp 12 ... 95
5.2 Klinische Symptome in den belasteten Tieren ... 95
5.3 Pathomorphologische Veränderungen ... 96
5.4 Reisolierung von H. parasuis, Referenzstamm für Serotyp 12 ... 98
5.5 PCR-Untersuchungen der reisolierten Stämme ... 99
5.5.1 Untersuchung der reisolierten Stämme mittels Multiplex-PCR ...101
E Diskussion ...102
1 Identifizierung von virulenzassoziierten Genen ...102
2 Entwicklung einer Multiplex-PCR ...107
3 Identifizierung von Stamm spezifischen Proteinen ...111
4 Infektionsversuch ...115
F Zusammenfassung ...121
G Summary ...123
H Literaturverzeichnis ...125
I Anhang ...137
Inhalt
1 Verbrauchsmittel und Chemikalien ...137
2 Lösungen und Puffer...142
3 Eingesetzte Stämme ...147
4 Tabellarische Zusammenfassung der Ergebnisse der PCR- Untersuchungen ...149
5 Ergebnisse der massenspektrometrischen Untersuchungen ...158
6 Tabellarische Zusammenfassung der Ergebnisse des Tierversuchs ...160
7 Tabellenverzeichnis ...163
8 Abbildungsverzeichnis ...165
Abkürzungen
Abkürzungsverzeichnis
® registered trademark (eingetragenes Warenzeichen) (v/v) volume per volume (Volumen pro Volumen)
(w/v) weight per volume (Gewicht pro Volumen)
A. Actinobacillus
Abb. Abbildung
Aqua dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser)
bp Basenpaare
bzw. beziehungsweise
ca. circa
cDNA complementary DNA (komplementäre DNA)
Ci Curie
dCTP 2‘-Desoxy-Cytosin-5‘-Triphosphat
ddRT-PCR differential display reverse transcription PCR DNA deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) dNTP 2‘-Desoxy-Nucleotid-5‘-Triphosphat
dUTP 2‘-Desoxy-Uridin-5‘-Triphosphat
E. coli Escherichia coli
et al. et alii (und andere)
g Erdbeschleunigungskonstante
H. Haemophilus
HAD Haloacid Dehalogenase
k kilo
kb Kilobasenpaare (103 Basenpaare)
KBE Kolonie bildende Einheiten
kDa Kilodalton
LOS Lipooligosaccharide
LPS Lipopolysaccharide
M Molarität (mol/l)
M. Mannheimia
min. Minuten
mM millimolar (mmol/l)
NAD Nikotinamidadenindinukleotid
nm Nanometer
OD optische Dichte
P. Pasteurella
PCR Polymerase Chain Reaction (Polymerase-Kettenreaktion)
RDA Repräsentative Differenzanalyse
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus) RNA ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)
RT Raumtemperatur
RT-PCR Reverse Transkriptase-PCR
s. siehe
SDS-PAGE Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese
sek. Sekunden
Abkürzungen
SPF spezifisch pathogenfrei
ssp. subspecies (Subspezies)
Tab. Tabelle
U unit
UV Ultraviolett
V Volt
Vol. Volumen
A Einleitung 13
A Einleitung
Haemophilus (H.) parasuis ist der Erreger der Glässerschen Krankheit, einer fiebri- gen Allgemeinerkrankung von Schweinen, die im klassischen Erscheinungsbild mit einer Polyserositis, Meningitis und Arthritis einhergeht. Weitere Erscheinungsformen, z. B. Pneumonie oder perakute Septikämie, wurden beschrieben und auch symptom- lose Besiedlungen des oberen Respirationstraktes kommen vor. H. parasuis-Infek- tionen treten weltweit auf und sind verantwortlich für große wirtschaftliche Verluste, die vor allem Betriebe mit hohen Hygienestandards betreffen. Trotz einer nahezu vollständigen Durchseuchung der Herden mit H. parasuis kommt es durch Stress oder den Eintrag eines anderen Stammes zu Krankheitsausbrüchen.
H. parasuis ist ein gramnegatives, NAD abhängiges Stäbchen der Familie der Pasteurellaceae. Für die 15 beschriebenen Serotypen konnte eine Korrelation zwischen Serotyp und Virulenz bislang nicht nachgewiesen werden, und einzelne Stämme derselben Serotypen verhalten sich äußerst heterogen. Die Diagnostik wird dadurch erschwert, dass in einer Herde oder sogar von Einzeltieren oftmals die Isolation mehrerer Stämme gleichzeitig gelingt. Über die Virulenzfaktoren und Patho- genitätsmechanismen des Erregers ist bislang wenig bekannt.
Zum jetzigen Zeitpunkt ist zwar eine Speziesdiagnose möglich, nicht jedoch die Aus- sage über das Virulenzpotenzial einzelner Stämme. Daher beschäftigt sich diese Studie mit der Identifizierung möglicher neuer Virulenzfaktoren von H. parasuis, wel- che zur Entwicklung einer diagnostischen Multiplex-PCR verwendet wurden. Diese ermöglicht sowohl den Speziesnachweis als auch den Nachweis dreier virulenzasso- ziierter Gene. Zur Identifizierung geeigneter Kandidatengene wurde eine Repräsen- tative Differenzanalyse mit den Referenzstämmen der Serotypen 5 und 11 sowie ein Vergleich des Proteinexpressionsmusters verschiedener Stämme durchgeführt.
Da für eine funktionelle Charakterisierung der identifizierten Gene in vivo-Unter- suchungen notwendig sind, wurden erste Versuche zur Etablierung eines Tiermo- dells mit dem Referenzstamm von Serotyp 12 im Schwein unternommen.
B Schrifttum 14
B Schrifttum
1 Haemophilus parasuis 1.1 Allgemeine Eigenschaften
H. parasuis ist der Erreger der Glässerschen Krankheit (auch Glässer’s disease, Transportkrankheit, Glässersyndrom oder „porcine polyserositis and arthritis“), wel- che 1910 zum ersten Mal von Glässer als fibrinöse Pleuro-Perikardio-Peritonitis be- schrieben wurde (GLÄSSER 1910) und als deren Verursacher seit 1943 H. suis galt (HJÄRRE u. WRAMBY 1943). Die Beobachtung, dass nicht alle Stämme von H. suis Hämin (X-Faktor) für ihr Wachstum benötigen, führte 1963 zur Abgrenzung des Erregers Haemophilus parasuis (BIBERSTEIN et al. 1963), welcher nur NAD-abhän- gig ist (V-Faktor). Eine erste Beschreibung erfolgte 1969 durch Biberstein und White (BIBERSTEIN u. WHITE 1969).
Die Glässersche Krankheit ist weltweit verbreitet, so wurde beispielsweise über Fälle in Deutschland (KIELSTEIN u. RAPP-GABRIELSON 1992), Dänemark (ANGEN et al. 2004), Spanien (RUBIES et al. 1999), USA (OLIVEIRA u. PIJOAN 2004; RAPP- GABRIELSON u. GABRIELSON 1992), Kanada (RAPP-GABRIELSON u.
GABRIELSON 1992), Japan (MOROZUMI u. NICOLET 1986a) und Australien (BLACKALL et al. 1996) berichtet. Es handelt sich um eine infektiöse Fakto- renkrankheit, die entweder gemeinsam mit anderen Erregern von Atemwegserkran- kungen als Mischinfektion, jedoch auch als Monoinfektion auftritt (KIELSTEIN et al.
1991b). Nahezu alle Schweinebetriebe sind mit H. parasuis infiziert und im Zusam- menhang mit Stress (z.B. durch das Absetzen, Umstallen oder Transportieren) kann es zu akuten Krankheitsausbrüchen kommen, die z. T. mit hohen wirtschaftlichen Verlusten einhergehen. Zudem verursacht der Erreger in Betrieben mit einem hohen Hygienestatus zunehmend Probleme, wenn naive Tiere mit Keimträgern gemeinsam aufgestallt werden oder durch Zukauf von Tieren ein neuer Stamm eingetragen wird.
Bei dem typischen Krankheitsbild der Glässerschen Krankheit handelt es sich um eine fiebrige Allgemeinerkrankung von Schweinen, die mit serofibrinösen Entzün-
B Schrifttum 15 dungen der serösen Häute einhergeht. Häufig betroffen sind Pleura und Peritoneum, aber auch das Perikard. Weitere Erscheinungsformen sind nichteitrige Entzündungen der Meningen mit entsprechenden neurologischen Symptomen, Arthritis mit Bewe- gungsunlust und Lahmheit, Husten und Dyspnoe und in akuten Fällen auch eine Septikämie, gefolgt von plötzlichen Todesfällen (AMANO et al. 1994; RAFIEE et al.
2000; SMART et al. 1993). Vornehmlich betroffen sind Ferkel, deren Empfänglichkeit mit steigendem Alter sinkt (BAK u. RIISING 2002). Da eine klinische Erkrankung durch Stress begünstigt wird, kommt es häufig bei Absetzern zu Ausbrüchen.
H. parasuis gilt jedoch nicht als obligat pathogen, da er häufig auch bei klinisch gesunden Tieren aus den oberen Atemwegen isoliert werden kann (MOLLER u.
KILIAN 1990). Da die Pathogenitätsmechanismen des Erregers bislang weitgehend ungeklärt sind und das Virulenzpotenzial einzelner Stämme derzeit nicht definiert werden kann, ist die Rolle von H. parasuis im Zusammenwirken mit anderen fakul- tativ pathogenen Keimen bei Erkrankungen ungeklärt.
Im Falle eines Krankheitsausbruches erfolgt eine antibiotische Behandlung der Tiere zumeist mit Penicillin (MEISTERMANN 2006), zur Prophylaxe steht in Deutschland eine auf Serotyp 5 basierende Vakzine zur Verfügung (Porcilis® Glässer, Intervet).
Desweiteren werden ebenfalls bestandsspezifische Vakzine verwendet.
1.2 Charakterisierung des Erregers
H. parasuis gehört zur Familie der Pasteurellaceae. Es handelt sich um gramne- gative, kokkoide, unbewegliche Stäbchen mit gelegentlicher Fadenbildung. Bakos beschrieb eine Neigung zur Dissoziation, wobei es bei den einzelnen Formen zur Bildung einer Kapsel kommen kann, deren Nachweis z.B. durch eine Kapselfärbung erfolgt (BAKOS et al. 1952; BAKOS 1955). Die M-Form (mukoid) weist große und schleimige Kolonien auf, die teilweise konfluieren und eine glänzende Oberfläche zeigen. Die Bakterien haben eine vollständige Kapsel. Die S-Form (smooth) zeigt sich anhand von kleinen, feinen und nicht konfluierenden Kolonien und wird noch einmal in die S1-Form (Kapsel teilweise vorhanden) und die S2-Form (keine Kapsel) unterteilt. Die R-Form (rough) hat die größten Kolonien mit teilweise gezackten Rändern, eine Kapsel kommt nicht vor. Laut Bakos (BAKOS et al. 1952) besteht kein
B Schrifttum 16
Zusammenhang zwischen der Herkunft der Stämme und ihrer Morphologie. Münch (MÜNCH 1993) hingegen stellte fest, dass kleinere Kolonien vor allem von Stämmen gebildet werden, die aus Tieren mit Glässerscher Krankheit isoliert wurden, und größere Kolonien vor allem aus klinisch gesunden Tieren.
Bis 1992 wurde der Erreger anhand von verschiedenen unabhängigen Untersu- chungen in die Serovare A-D (BAKOS 1955), Jena 6-12 (KIELSTEIN et al. 1991a), 1-7 (MOROZUMI u. NICOLET 1986b) und ND1-ND5 (RAPP-GABRIELSON u.
GABRIELSON 1992) eingeteilt. Diese wurden dann jedoch nach dem Kielstein- Rapp-Gabrielson- (KRG-) Schema zu 15 Serotypen zusammengefasst (KIELSTEIN u. RAPP-GABRIELSON 1992). Tierversuche mit dem jeweiligen Referenzstamm ergaben für die Serotypen 1, 5, 10, 12, 13 und 14 eine hohe Virulenz (Tod der Tiere), für 2, 4 und 15 mittlere (Polyserositis), für 8 eine schwache und für 3, 6, 7, 9 und 11 keine Virulenz (s. B1.2.4). Eine Untersuchung von 290 Stämmen aus der ehemaligen DDR ergab, dass 1992 Serotyp 5 (23,8 %) und 4 (17,2 %) die höchste Prävalenz aufweisen (KIELSTEIN u. RAPP-GABRIELSON 1992). Dieses stimmt mit Ergeb- nissen aus den USA und Kanada überein, wo sie mit einer Häufigkeit von 24,3 und 16,1 % vorkommen (RAPP-GABRIELSON u. GABRIELSON 1992), sowie Dänemark (36 % und 22 %) (ANGEN et al. 2004) und Spanien (18,4 bzw. 16 %) (RUBIES et al.
1999). Da ein großer Teil der nach dem KRG-Schema untersuchten Stämme nicht typisiert werden kann (26,2 % der Isolate der ehemaligen DDR), ist die Existenz von weiteren Serotypen nicht ausgeschlossen.
1.2.1 Nachweis des Erregers
Der Nachweis von H. parasuis erfolgt zum einen kulturell auf NAD haltigen Nähr- böden (Kochblutagar mit NAD-Zusatz oder Blutagar mit einer beta-hämolysierenden Staphylokokken-Amme), die Isolierung ist jedoch schwierig und oft nicht erfolgreich (CALSAMIGLIA et al. 1999). Aufgrund seines langsamen Wachstums wird der Keim häufig durch andere Keime überwachsen, so dass der Nachweis auf molekularer Ebene gerade aus stark kontaminiertem Probenmaterial (Nasen- oder Tonsillen- tupfer) sinnvoll ist (CALSAMIGLIA et al. 1999). Obwohl allgemein angenommen wird, dass ein einzelner Stamm für den jeweiligen Ausbruch verantwortlich ist, wird die
B Schrifttum 17 Diagnostik zusätzlich dadurch erschwert, dass in einem Betrieb oder sogar aus einem Tier oftmals mehrere Stämme isoliert werden (OLVERA et al. 2006). Zur Abgrenzung von anderen Spezies der Gattung Haemophilus des oberen Respi- rationstraktes sind biochemische Untersuchungen notwendig, da sie sich in ihrer Kulturmorphologie nicht ausreichend voneinander unterscheiden. H. parasuis ist Katalase positiv, Indol und Urease negativ, anhämolysierend und kann Galaktose, Glukuronsäure, Mannose, Maltose und Saccharose verwerten (MOLLER u. KILIAN 1990).
Eine von Oliveira (OLIVEIRA et al. 2001) entwickelte PCR amplifiziert mit den Primern Hps-f und -r ein 821 bp großes Fragment aus der 16S rDNA von H. para- suis. Die Methode weist eine hohe Sensitivität auf, zeigte aber auch Kreuzreaktionen mit einigen Stämmen von Actinobacillus (A. indolicus, A. porcinus und A. minor).
Eine zweite PCR (ANGEN et al. 2007) amplifiziert mit drei Primern (HP1F3, HP2F2 und HP-Revx) ebenfalls aus der 16S rDNA ein 1086 bzw. 1090 bp großes Fragment.
Sie weist je nach Untersuchungsmaterial im Vergleich zur PCR von Oliveira zwar eine niedrigere Sensitivität auf (kein Unterschied mit aufgereinigter DNA, jedoch eine 10 x niedrigere Sensitivität bei der Anwendung von Reinkulturen), hat sich jedoch als 100 % speziesspezifisch erwiesen.
Ein etwas aufwändigerer Erregernachweis gelingt mit einem Capture Plate Hybridisation Assay (CALSAMIGLIA et al. 1999). Hierfür wird zunächst per PCR mit universellen Bakterienprimern eine Gensequenz aus der 16S rDNA aller sich in der Probe befindenden Bakterien amplifiziert. Hierbei wird das Amplifikat markiert, da sich unter den zugefügten Nukleotiden auch mit Digoxigenin-11 markiertes dUTP befindet. Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatten werden mit biotinylierten Oligo- nukleotiden vorinkubiert, die die speziesspezifischen 16S rDNA Sequenzen von H. parasuis beinhalten. Wird das PCR-Amplifikat auf diese Platten gegeben, binden die H. parasuis spezifischen Anteile; diese werden mittels Peroxidase markierter Antikörper gegen das Antidigoxigenin visuell sichtbar gemacht.
B Schrifttum 18
Alle drei PCR-Methoden ermöglichen zwar einen Speziesnachweis, nicht aber die Detektion von virulenzassoziierten Faktoren.
Auch der Nachweis mittels Immunhistochemie (SEGALES et al. 1997) erlaubt nur den Speziesnachweis und lässt ebenfalls keine Aussage über das Virulenzpotenzial des jeweiligen Stammes zu, zudem treten Kreuzreaktionen mit A. pleuropneumoniae auf. Aufgrund seiner Komplexität und des damit verbundenen Zeit- und Kostenauf- wandes eignet sich diese Methode vor allem für wissenschaftliche Untersuchungen, nicht jedoch für diagnostische Zwecke.
1.2.2 Virulenzfaktoren 1.2.2.1 Neuraminidase
Bislang ist wenig über die Virulenzfaktoren von H. parasuis bekannt. Lichtensteiger und Vimr konnten 1997 eine Neuraminidaseaktivität nachweisen (LICHTENSTEIGER u. VIMR 1997), da der Erreger aus Sialoglykokonjugaten Sialinsäure hydrolysiert, welche er für sein Wachstum benötigt. Die Rolle des Enzyms in der Virulenz ist bislang ungeklärt, möglicherweise dient es der Bereitstellung von Kohlenstoff und Stickstoff, demaskiert Rezeptoren als Voraussetzung zur Adhäsion und Invasion oder behindert die angeborene Immunabwehr des Wirtes (LICHTENSTEIGER u.
VIMR 2002). Bei Bacteroides fragilis und Streptococcus pneumoniae wurde beob- achtet, dass die Inaktivierung der Neuraminidase zu abgeschwächter Virulenz führt (GODOY et al. 1993; TONG et al. 2000) und es sich bei diesem Enzym um ein protektives Antigen handelt (IFEANYI u. BAILIE 1992). Es gelang Lichtensteiger 2002 die Neuraminidase aus der Membranfraktion von H. parasuis aufzureinigen und das Enzym zu reaktivieren (LICHTENSTEIGER u. VIMR 2002), das kodierende Gen wurde bislang jedoch nicht identifiziert.
1.2.2.2 Eisenrezeptoren
Weitere bekannte Virulenzfaktoren sind transferrinbindende Proteine (TbpB und TbpA, CHARLAND et al. 1995), die zu den Proteinen der äußeren Membran zählen (OMPs, outer membrane proteins). Auch unter den Pasteurellaceae enthält die Grup- pe der OMPs zahlreiche virulenzassoziierte oder -vermittelnde Moleküle. Hierbei
B Schrifttum 19 handelt es sich häufig um eisenregulierte OMPs (IROMPS, iron-regulated outer membrane proteins). Diese spielen während einer Infektion eine wichtige Rolle, da im Wirt kaum ungebundenes Eisen vorkommt und der Erreger dieses Defizit mittels Rezeptoren ausgleicht, welche eisenhaltige Moleküle, z.B. das Transferrin des Wir- tes, Hämoglobin oder mikrobielle Siderophoren, binden können. Transferrinbindende Proteine sind streng wirtsspezifisch, so bindet der Tbp-Rezeptor von A. pleuro- pneumoniae ausschließlich porzines Transferrin (GONZALEZ et al. 1995). Morton and Williams zeigten, dass auch H. parasuis porzines Transferrin binden kann (MORTON u. WILLIAMS 1989) und Charland et al. vermuteten, dass diese Fähigkeit auf zwei potentielle Polypeptide zurück geht (CHARLAND et al. 1995), welche zwar porzines Tansferrin, jedoch kein an porzines Lactoferrin gebundenes Eisen binden.
Del Río et al. wiesen in H. parasuis analog zu A. pleuropneumoniae eine TonB- Region mit den Genen tonB, exbBD und tbpBA und eine verstärkte Expression der transferrinbindenden Proteine unter Eisenmangelbedingungen nach (DEL RIO et al.
2005a). A. pleuropneumoniae besitzt zusätzlich einen Ferrichrom-Rezeptor, über welchen er Siderophore aufnehmen kann: die Synthese eigener Siderophore konnte bislang jedoch nicht nachgewiesen werden (MIKAEL et al. 2003). Allerdings zeigte eine isogene Mutante für den Ferrichromrezeptor FhuA keine abgeschwächte Viru- lenz (BALTES et al. 2003). Auch H. parasuis scheint einen solchen Rezeptor zu be- sitzen, der mittels kreuzreaktiver polyklonaler Antikörper gegen FhuA von A. pleu- ropneumoniae nachgewiesen wurde (DEL RIO et al. 2006b). Die DNA-Sequenzen der entsprechenden Gene stimmen zu 99-100 % überein, über die Bedeutung des Rezeptors ist jedoch bislang nichts bekannt. Allerdings konnte gezeigt werden, dass das Protein konstitutiv exprimiert und durch Anzucht unter Eisenmangelbedingungen nicht hochreguliert wird. Zusätzlich zum Ferrichromrezeptor FhuA exprimiert A. pleu- ropneumoniae den Hämoglobinrezeptor HgbA (SHAKARJI et al. 2006). Im Gegen- satz zu der fhuA-Mutante weist die hgbA-Mutante eine abgeschwächte Virulenz auf.
Die Existenz eines solchen Hämoglobinrezeptors bei H. parasuis wurde bislang nicht beschrieben. Da transferrinbindende Proteine vermutlich bei allen Stämmen von H. parasuis vorkommen, eignen sie sich nicht zur Identifizierung von virulenten Stäm- men (METCALF u. MACINNES 2007).
B Schrifttum 20
1.2.2.3 Fimbrien
1992 entdeckte Münch die Existenz von Fimbrien bei H. parasuis (MUNCH et al.
1992). Es handelt sich hierbei um filamentöse Strukturen, die bei anderen Pasteu- rellaceae häufig an der Adhäsion an Wirtszellen beteiligt sind. Die Ausbildung dieser Strukturen findet bei H. parasuis nur sehr schwach statt, wenn die Kultur auf Agar- platten gezogen wurde, und in größerer Menge, wenn der Erreger in Kontakt zu Wirtsgewebe steht, z.B. zu der Chorioallantoismembran eines embryonierten Hühnereis (MUNCH et al. 1992). Fimbrien kommen vermutlich ebenfalls in allen Stämmen von H. parasuis vor (METCALF u. MACINNES 2007).
1.2.2.4 Kapsel
Für diverse Gattungen der Familie der Pasteurellaceae ist die Ausbildung einer Kap- selstruktur bekannt. Polysaccharidhaltige Kapseln dienen einerseits dem Schutz des Bakteriums und zur Adhäsion von Nährstoffen, andererseits aber auch der Adhäsion an Wirtsstrukturen und der Abschirmung vor der Immunabwehr des Wirtes. Für 12 Serotypen von A. pleuropneumoniae (Biotyp 1, NAD abhängig) ist die Bildung einer Kapsel beschrieben, und eine unbekapselte Mutante von Serotyp 1 erwies sich im Tierversuch als avirulent (RIOUX et al. 2000). Untersuchungen zur Ausbildung einer Kapsel von H. parasuis fanden schon früh statt (CHANDLER et al. 1939), sie wurden zunächst im Zusammenhang zur Kolonieform gesehen (BAKOS 1955). Kielstein und Rosner isolierten 1991 (ROSNER et al. 1991) aus Tieren mit Glässerscher Krankheit häufiger unbekapselte Stämme als aus klinisch gesunden Tieren und sahen somit eine fehlende Bekapselung als Hinweis auf Virulenz.
1.2.2.5 Lipopolysaccharide, Lipooligosaccharide
Ebenfalls eine Rolle als Virulenzfaktoren bei anderen Mitgliedern der Familie der Pasteurellaceae spielen Lipopolysaccharide (LPS) und Lipooligosaccharide (LOS) als Bestandteil der äußeren Membran gramnegativer Bakterien. Beide bestehen aus drei Regionen: dem Lipid A als Anker in der Membran, einer Kernzone und dem O-Antigen, welches aus Polysaccharidketten besteht; und erschweren die Phago- zytose durch Abwehrzellen des Wirts. Mittels Bildung spezifischer Antikörper ist der
B Schrifttum 21 Wirt zwar in der Lage diesen Mechanismus aufzuheben, allerdings verändert sich bei einigen Pasteurellaceae die Oberflächenstruktur (Phasenvariation). Zur Phagozytose des Erregers ist in diesem Falle erneut die Bildung spezifischer Antikörper vonnöten.
Untersuchungen zur Phasenvariation von LOS von H. somnus konnten zeigen, dass die innere Kernregion hoch konserviert ist, die äußeren Kernepitope jedoch eine hohe Heterogenität und Phasenvariation aufweisen (ST. MICHAEL et al. 2005). Die Kernregion des LPS spielt bei A. pleuropneumoniae eine Rolle in der Adhäsion der Bakterien an den Zellen des Respirationstraktes (RIOUX et al. 1999).
Geht gleichzeitig eine hohe Anzahl gramnegativer Bakterien zugrunde (z. B. durch den Einsatz von Antibiotika), haben LPS und LOS zudem eine Toxinwirkung („Endo- toxin“). Da es sich bei H. parasuis um ein gramnegatives Bakterium handelt, sind LPS und LOS ebenfalls Bestandteil seiner äußeren Membran. In Versuchen mit verschiedenen Antiseren gegen LOS konnten Zucker et al. auch nach mehreren Kulturpassagen keine Variationen in den Reaktionen beobachten, zudem ergab sich keine Korrelation zwischen Virulenz und den ermittelten LOS-Gruppen (ZUCKER et al. 1996).
1.2.2.6 Toxine
Über die Sekretion von Toxinen durch H. parasuis ist bislang nichts bekannt, obwohl dieses für andere Pasteurellaceae beschrieben wurde. Pasteurella (P.) multocida produziert das Pasteurella multocida-Toxin (PMT) und verursacht in einer Misch- infektion mit Bordetella bronchiseptica das Krankheitsbild der Rhinitis atrophicans im Schwein. Diese ist gekennzeichnet durch den Abbau der Knochensubstanz der Nasenmuscheln. PMT beeinflusst hierbei Signalkaskaden in den Wirtszellen, wo- durch neben verschiedenen anderen Wirkungen (mitogene Wirkung) verstärkt Kalzium mobilisiert und der Knochen abgebaut wird (PULLINGER et al. 2001).
Andere Gattungen produzieren sogenannte RTX-Toxine (repeats in toxin), welche Ähnlichkeiten in ihrer Synthese und Sekretion sowie ihrer biologischen Wirkung aufweisen. An ihrem N-Terminus bestehen sie aus verschiedenen lipophilen Regio- nen und formen Poren oder andere Membrandefekte. Durch osmotische Schwellung kommt es zum Absterben der empfänglichen Zelle (BROWN et al. 1997). Hierzu
B Schrifttum 22
gehört das Leukotoxin (LKT) von Mannheimia (M.) haemolytica, welches an bovine Leukozyten bindet und in diesen Apoptose vermittelt (BROWN et al. 1997). Auch die schwache hämolytische Aktivität von M. haemolytica ist auf die Wirkung des LTKs zurückzuführen (MURPHY et al. 1995). Ebenfalls zu dieser Toxingruppe gehören die APX-Toxine I-IV von A. pleuropneumoniae. Neben der direkten Schädigung durch Porenbildung kommt es hier auch zu einer massiven Freisetzung wirtseigener inflammatorischer Mediatoren, welche ebenfalls gewebezerstörend wirken (BOSSE et al. 2002).
1.2.2.7 Sonstige virulenzassoziierte Faktoren
Viele andere Pasteurellaceae sezernieren Enzyme, welche als Virulenzfaktoren die- nen. Für H. influenzae und A. pleuropneumoniae ist beispielsweise eine IgA-Protea- se beschrieben, welche die Fähigkeit zur Spaltung von Immunkomplexen besitzt (KILIAN et al. 1979). Einige Stämme von P. multocida weisen eine Sialidaseaktivität auf. Diese wird für die vermehrte Besiedlung des Respirationstrakts und die Ent- stehung von Läsionen während der Infektion verantwortlich gemacht. Es handelt sich hierbei um ein glykolytisches Enzym, welches dem Bakterium Kohlenstoff aus wirts- eigenen Zuckerverbindungen zugänglich macht (SANCHEZ et al. 2004). Neben der Neuraminidaseaktivität (s. B1.2.2.1) sind für H. parasuis keine weiteren Enzyme mit einem möglichen Zusammenhang zur Virulenz bekannt.
1.2.2.8 Vergleichsstudien zur Identifizierung von virulenzassoziierten Faktoren
Mit dem Ziel, anhand von Stammdifferenzen die Ursache für unterschiedliche Viru- lenzeigenschaften zu identifizieren, wurden verschiedene Vergleichsstudien einzel- ner Stämme durchgeführt. Da eine vollständige Genomsequenz von H. parasuis bis- lang nicht vorliegt, handelt es sich um Methoden, die ohne bekannte Sequenzen durchführbar sind.
Die erste umfassende Studie zur Identifizierung von Virulenzfaktoren suchte mittels Differential Display Reverse Transcription (ddRT) -PCR nach Unterschieden im Transkriptom eines virulenten H. parasuis Stammes von Serovar 5 (HILL et al. 2003).
Dieser wurde unter verschiedenen Bedingungen kultiviert (35 °C, 40 °C, mit und
B Schrifttum 23 ohne Zugabe von hitzeinaktiviertem Schweineserum) und cDNA der einzelnen An- sätze wurde als Template in einer ddPCR eingesetzt. Diese wurde unter unspezi- fischen Bedingungen mit mehr als 20 verschiedenen Kombinationen willkürlicher Primer durchgeführt. Nach der Analyse der PCR-Produkte per SDS-PAGE wurde basierend auf den unterschiedlich transkribierten Genfragmenten eine zweite PCR der cDNA mit spezifischen Primern durchgeführt und zur Quantifizierung der Trans- kription genutzt. Sieben unterschiedlich transkribierte Genfragmente konnten identi- fiziert werden, der Nachweis für einen Zusammenhang mit der Virulenz von H. para- suis Stämmen konnte bislang nicht geführt werden. Da die Sequenzen in allen Referenzstämmen der 15 Serotypen nachgewiesen wurden, eignet sich keines der Fragmente auf genetischer Ebene für eine diagnostische Methode zur Unterschei- dung von virulenten und avirulenten Stämmen von H. parasuis. Ein zweiter Ansatz einer ddRT-PCR wurde ebenfalls mit einem virulenten Stamm von Serotyp 5 durch- geführt, die Anzucht erfolgte parallel unter Eisenmangel bzw. dem Zusatz von porzi- ner Cerebrospinalflüssigkeit (METCALF u. MACINNES 2007). Der Ansatz unter Ei- senmangel ergab zehn, der unter Zusatz von Cerebrospinalflüssigkeit neun hochre- gulierte Gene, bei denen es sich überwiegend um Stoffwechselgene handelte. Die Untersuchung der Referenzstämme auf das Vorhandensein der 19 Sequenzen zeigte, dass auch diese Gene in allen Referenzstämmen der Serotypen vorhanden waren. Allerdings exprimierten nur fünf virulente Stämme (vier Feldstämme von Serotyp 4, 5 und 12, sowie Stamm Nagasaki) ein Protein mit Homologien zu einer Hydrolase der Haloacid Dehalogenase (HAD) Superfamilie. Eine nähere Charakteri- sierung erfolgte bislang nicht.
Im Jahr 2005 verglichen del Río et al. mittels Repräsentativer Differenzanalyse (RDA) den Referenzstamm von Serotyp 2 (ein Serotyp mit einer hohen Prävalenz in Spanien) mit den Referenstämmen von Serotyp 1, 5 (beide hochvirulent) und 3 (schwach virulent). Die Methode geht auf Lisitsyn et al. zurück (LISITSYN et al.
1993) und sieht die Herstellung einer repräsentativen Probe des genetischen Materials beider Genome und einen PCR-Schritt vor, um die Komplexizität der Genome herabzusetzen und die Größe der Fragmente einzuschränken. Die Detek- tion der Differenzen geschieht durch mehrere sich abwechselnde Schritte aus Sub-
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traktion und anschließender selektiver Amplifizierung der unterschiedlichen Frag- mente. Del Rio et al. verwendeten eine modifizierte Form der RDA, in der auf den initialen PCR-Schritt verzichtet und nur ein Subtraktionsschritt mit anschließender Amplifikation durchgeführt wurde (DEL RIO et al. 2005b). Diese Modifikation wurde vorher bereits erfolgreich von Strommenger et al. angewendet (STROMMENGER et al. 2001). Del Rio et al. wiesen ein Fragment nach, welches spezifisch für den Referenzstamm von Serotyp 2 ist und Homologien zu einer Dihydropteroat-Synthase (dhps) von Shigella sonnei aufweist. Dhps-Gene stehen im Zusammenhang mit einer Sulfonamidresistenz, befinden sich bei anderen gramnegativen Erregern jedoch vor allem auf Plasmid-DNA (RADSTROM et al. 1991). Da im Referenzstamm von Sero- typ 2 keine solchen Plasmide nachgewiesen werden konnten, der Stamm diese Re- sistenz jedoch besitzt, postulieren die Autoren eine chromosomale Variante des Gens.
1.2.3 Typisierung von H. parasuis
Da die bisherige Einteilung in Serotypen keine Auskunft über die Virulenz einzelner Stämme gibt und eine Klassifizierung von virulenten und avirulenten Stämmen anhand von Virulenzfaktoren bislang nicht möglich ist, beschäftigten sich zahlreiche Studien mit der Identifikation anderer Typisierungsmerkmale, die eine solche Aus- sage zulassen. Die Schwerpunkte lagen hier auf der Identifizierung genetischer Un- terschiede einzelner Stämme oder dem Nachweis abweichender Proteinexpression.
Durch Vergleiche mit der klinischen Erkrankung der Tiere, von denen die Isolate ge- wonnen wurden, ergaben sich Rückschlüsse auf die Eignung der jeweiligen Methode zur Beurteilung der Virulenz eines Stammes.
1.2.3.1 DNA-basierte Typisierungsmethoden
Bei der Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) -PCR wird mittels spe- ziesspezifischer Primer ein Fragment amplifiziert und im Anschluss mit Restriktions- enzymen geschnitten. Die entstehenden Bandenmuster werden miteinander ver- glichen und zur Einteilung der Stämme in Gruppen verwendet. 2002 wurde diese Methode am tbpA Gen angewendet (DE LA PUENTE REDONDO et al. 2003). Die Untersuchung der Referenzstämme der 15 Serotypen ergab, dass die Serovare 5,
B Schrifttum 25 12, 14 und 15 das gleiche Muster zeigen, alle anderen Serovare jedoch voneinander unterschieden werden können. Klinische Isolate wiesen eine hohe Heterogenität auf und es wurden zahlreiche neue Muster identifiziert. Der Vergleich zwischen RFLP- Gruppe und Serotyp ergab keine Korrelation. Eine zweite Studie wendete die gleiche Methode an, nutzte jedoch ein Amplikon aus dem Gen aroA, einem Enzym der Biosynthese von aromatischen Aminosäuren (DEL RIO et al. 2006a). Neben den 15 Referenzstämmen der Serotypen von H. parasuis wurden auch verschiedene Arten der Gattung Actinobacillus (A.) untersucht. Der Versuch ergab sieben unter- schiedliche Gruppen. Die Serovare 1, 2, 4-6 und 8-15 von H. parasuis gehören der ersten Gruppe an, außerdem auch die beiden Stämme von A. porcinus und A. ureae.
Serotyp 3 und 7 von H. parasuis bilden mit den Serotypen 1, 4, 5, 9, 11 und 12 von A. pleuropneumoniae die zweite Gruppe. Die restlichen Bakterien verteilen sich auf die Gruppen III-VII. Die Methode ermöglicht eine Unterscheidung von verschiedenen Isolaten, eine Aussage über das Virulenzpotenzial eines Stammes ist jedoch nicht möglich.
Die Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (ERIC) -PCR basiert auf der Amplifikation repetitiver Konsensussequenzen und dem Abgleich des entstandenen Bandenmusters mittels Gelelektrophorese. Sie bietet die Möglichkeit genetische Un- terschiede zwischen einzelnen Isolaten darzustellen, jedoch keine Unterteilung von virulenten und avirulenten Stämmen. Laut einer Untersuchung durch Rafiee et al.
ergaben alle 15 Referenzstämme ein unterschiedliches Muster und ließen sich somit voneinander unterscheiden (RAFIEE et al. 2000). Zwölf Feldstämme von vermutlich zusammenhängenden Ausbrüchen der Glässerschen Krankheit ergaben ein einheit- liches Muster, dieses entsprach jedoch keinem Muster der Referenzstämme. Ruiz et al. verwendeten ebenfalls eine ERIC-PCR und verglichen deren Ergebnisse mit dem Bandenmuster aus präparierten Membranproteinen in der SDS-PAGE (RUIZ et al.
2001). Oliveira et al. verwendeten die ERIC-PCR in Kombination mit der Serotypi- sierung mittels Immunodiffusion zur Untersuchung von Clusterbildung und Prävalenz.
Sie fanden potenziell virulente Stämme unter den Serovaren 1, 2, 4, 5, 12, 13 und 14, bzw. unter den nicht typisierbaren Stämmen und wiesen eine hohe genetische Heterogenität unter den Stämmen nach (OLIVEIRA et al. 2003a).
B Schrifttum 26
Smart et al. verglichen 1987 verschiedene Stämme mittels Restriction Endonuclease Fingerprinting (REF), welches mittels Gelelektrophorese das Bandenmuster ver- schiedener Stämme vergleicht, deren extrahierte DNA vorher mit Restriktionsenzy- men verdaut wurde (SMART et al. 1988). Die untersuchten Referenzstämme (nach dem KRG-Schema Serotyp 1-9) ließen sich zwar voneinander abgrenzen, die Feld- isolate konnten jedoch anhand ihres Musters keinem dieser Serotypen zugeordnet werden. Die Herden wiesen überwiegend mehr als einen Stamm auf, wobei stets ein Stamm dominierte, und wenige Einzeltiere trugen mehr als einen Stamm. Die Auto- ren treffen keine Aussage über einen beobachteten Zusammenhang zwischen Viru- lenz und dem Bandenmuster. Auch diese Methode ermittelt genetische Unterschiede zwischen einzelnen Stämmen, nicht jedoch ihr Virulenzpotenzial.
Eine weitere PCR-basierte Untersuchungsmethode ist das MLST (Multi Locus Se- quence Typing), bei welcher Gensequenzen von housekeeping Genen einzelner Stämme sequenziert und die Ergebnisse miteinander verglichen werden. Anhand der Daten können Gemeinsamkeiten und Unterschiede analysiert, Clusteruntersuchun- gen durchgeführt, einzelne Stämme in Sequenztypen eingeteilt und Verwandt- schaftsgrade der Stämme untereinander errechnet werden. So werden die gene- tischen Unterschiede verschiedener Stämme untersucht, ein Zusammenhang zu ihrer Virulenz ergibt sich daraus jedoch nicht. Diese Methode wurde 2006 von Olvera et al. durchgeführt (OLVERA et al. 2006), indem sie Primer für verschiedene konser- vierte Gene verwendeten, die anhand von bekannten Sequenzen von H. influenzae oder homologer Bereiche anderer Bakterien der Familie der Pasteurellaceae kon- struiert wurden. In dieser Studie konnte erneut die große genetische Heterogenität des Erregers belegt werden, da eine hohe Anzahl von Sequenztypen ermittelt wurde und nur selten der gleiche Typ in mehreren Betrieben vorkam. Im Gegensatz zu anderen Bakterien, wo bestimmte virulenzassoziierte Klone gehäuft auftreten (SMITH et al. 2000), herrschten bei H. parasuis keine dominanten Klone vor. Neben der Isolation verschiedener Stämme aus einem Bestand bzw. von Einzeltieren, wur- den auch mehrere Stämme in derselben systemischen Läsion nachgewiesen. Dieses führte die Autoren zu der Theorie, dass der Ausbruch einer Krankheit möglicherweise
B Schrifttum 27 auch durch mehrere Stämme gleichzeitig verursacht wird und nicht, wie allgemein angenommen, nur auf einen Stamm zurückzuführen ist.
1.2.3.2 Proteinbasierte Typisierungsmethoden
Ebenfalls eine hohe Diversität unter Isolaten von H. parasuis ergab die Studie von Blackall et al., die mittels Multilocus Enzyme Electrophoresis (MLEE) acht Referenz- und 40 Feldstämme untersuchten (BLACKALL et al. 1997). Für die MLEE werden lösliche Proteine präpariert und in einem Stärkegel aufgetrennt. Horizontale Schnitte dieses Gels werden mit den Substraten verschiedener Enzyme inkubiert und die je nach Enzymaktivität entstehenden Bandenmuster miteinander verglichen. Durch den Vergleich der einzelnen Enzymnachweise und deren Laufweite im Gel konnten Rückschlüsse auf die genetischen Unterschiede geschlossen und Elektrophorese- typen (ET) eingeteilt werden. Es entstanden zwei Gruppen, Gruppe 1 enthielt alle Isolate von Serotyp 4 und 5, darunter auch zwei Referenzstämme für Serotyp 5, einige von Serotyp 13 und zwei nicht typisierbare Isolate. Gruppe 2 enthielt Feld- stämme von Serotyp 1, 2, 7, 9, 10 und 13 sowie die Referenzstämme von Serotyp 1, 2, 3, 4, 8 und 9. Die Serovare 4 und 13 verhielten sich somit uneinheitlich und ließen sich beiden Gruppen zuordnen. Ein Zusammenhang zwischen der Gruppeneinteilung und Virulenz konnte nicht beobachtet werden, da sich in beiden Gruppen Isolate von Tieren befanden, die Septikämie oder respiratorische Symptome aufwiesen. Diese Ergebnisse decken sich mit denen einer Studie von Rapp-Gabrielson et al. (RAPP- GABRIELSON et al. 1992a), welche ebenfalls mittels MLEE die Diversität von H. pa- rasuis Isolaten aus Nordamerika zeigten. Viele ETs bestanden nur aus einem Isolat und es konnte kein Zusammenhang zwischen genetischen Eigenschaften und der Virulenz eines Stammes beobachtet werden.
Mehrere Studien beschäftigten sich mit der Methode des PAGE-Typings. In einer älteren Untersuchung ergaben die Ganzzelllysate von acht Stämmen (zwei Isolate aus an Pneumonie erkrankten Tieren, sechs aus Tieren mit Glässerscher Krankheit) in SDS-PAGE-Gelen zwei unterschiedliche Proteinmuster, PAGE-Typ I und II (NICOLET et al. 1980). Typ II wurde durch die Anwesenheit eines 37 kDa großen Proteins definiert, Typ I über dessen Abwesenheit. Alle aus an Glässerscher Krank-
B Schrifttum 28
heit erkrankten Tieren isolierten Stämme gehörten Typ II an, woraus ein Zusam- menhang zwischen dem Protein und der Virulenz der Stämme geschlossen wurde.
Auf dem selben Schema basierend analysierten Morozumi et al. weitere Feldstäm- me, darunter Proben aus den Nasenhöhlen gesunder Tiere sowie aus Tieren mit Pneumonie und Polyserositis (MOROZUMI u. NICOLET 1986a). Von den aus Na- senhöhlen isolierten Stämmen gehörten sechs PAGE-Typ I an, die restlichen vier Typ II. Sämtliche Isolate aus Läsionen konnten PAGE-Typ II zugeordnet werden. Aus diesen Ergebnissen wurde erneut ein Zusammenhang zwischen dem 37 kDa großen Protein und Virulenz geschlossen.
Rosner et al. hingegen konnten keine Korrelation zwischen PAGE-Typ und Virulenz, bzw. Isolationsort und Virulenz ausmachen (ROSNER et al. 1991). Sie untersuchten Feldstämme von H. parasuis und teilten sie anhand des Musters in sieben PAGE- Typen ein, welche auf der Kombination bestimmter Proteinbanden basieren: Typ I (29, 37, 39 und 51 kDa), Typ IIa (27 und 45 kDa), Typ IIb (47 kDa), Typ IIIa (45 kDa), Typ IIIb (27 und 39 kDa), Typ IV (32 und 51 kDa) und Typ V (39 und 45 kDa).
Virulente Isolate befanden sich in den Typen I, IIa, IIb, IIIa und IIIb, avirulente Stäm- me gehörten den Typen IIa, IV oder V an.
In einer Studie von Oliveira et al. wurde das Proteinprofil von 98 Feldstämmen un- tersucht und computergestützt analysiert (OLIVEIRA u. PIJOAN 2004). Die Stämme entstammten dem oberen Respirationstrakt, pneumonischen Lungen und syste- mischen Lokalisationen (Perikard, Pleura, Gelenk, Gehirn und Lymphknoten). Es konnten sechs Cluster ermittelt und in zwei unterschiedliche PAGE-Typen eingeteilt werden, die anhand von Anwesenheit oder Abwesenheit von markanten Protein- banden im Größenbereich von 36-38 kDa definiert wurden. Eine Identifizierung der Proteine erfolgte nicht. Cluster 1 entsprach PAGE-Typ II und enthielt 77 Isolate, die jeweils eine markante Bande aufwiesen. Es handelte sich hauptsächlich um Stäm- me, die aus erkrankten Tieren isoliert wurden, darunter 29 Isolate aus Tieren mit Pneumonie und 39 Isolate aus systemischen Lokalisationen. PAGE-Typ I enthielt die Cluster 2-6, repräsentiert durch 21 Isolate, welche sämtlich keine dieser markanten Banden des entsprechenden Größenbereichs zeigten. Vier der 21 Proben wurden an
B Schrifttum 29 systemischen Lokalisationen isoliert, sechs aus Lungen mit Pneumonie und zehn Proben entstammten dem oberen Respirationstrakt von gesunden Schweinen.
PAGE-Typ II beinhaltete 27 unterschiedliche Muster, die Stämme entsprachen den Serotypen1, 2, 4, 5, 7, 12, 13 und 14. Dazu kamen nach dem KRG-Schema nicht typisierbare Isolate. In PAGE-Typ I waren bis auf Serotyp 3 die anderen oben ge- nannten Serotypen ebenfalls vorhanden, insgesamt handelte es sich um 14 ver- schiedene Proteinmuster aus fünf unterschiedlichen Clustern. In Typ I zeigten die Stämme demnach eine größere genetische Heterogenität als in Typ II. Die Ergeb- nisse dieser Studie zeigen anhand der Verteilung der Stämme einen möglichen Zu- sammenhang zwischen dem Auftreten dieser markanten Proteinbanden im Größen- bereich von 36-38 kDa und dem Virulenzpotenzial eines Stammes, jedoch keinen zwischen PAGE-Typ und Serotyp.
Eine kombinierte Untersuchung von DNA und Proteinmuster unternahmen Ruiz et al.
(RUIZ et al. 2001). Sie präparierten von 84 Feldstämmen Membranproteine und untersuchten diese in der SDS-PAGE. Zudem führten sie mit allen Stämmen eine ERIC-PCR durch. Die Ergebnisse beider Untersuchungen verglichen sie mit den bekannten Daten der Isolate über Isolationsort und Krankheitsbild. Ihre Studien ergaben ein homogeneres Muster für systemisch isolierte Stämme, dies galt sowohl für die SDS-PAGE als auch für das DNA-Profil. Daraus schlossen die Autoren eine Korrelation mit der Virulenz eines Stammes, auch wenn sie beide Parameter für unabhängig voneinander hielten, da Stämme des gleichen Genotyps unterschied- liche Proteinmuster aufwiesen.
1.2.3.3 Serologische Methoden
Die ersten Versuche zu den antigenen Eigenschaften von H. parasuis wurden von Bakos et al. (BAKOS et al. 1952; BAKOS 1955) mittels Präzipitationstests durch- geführt und ergaben vier unterschiedliche Serotypen (A-D).
Morozumi und Nicolet (MOROZUMI u. NICOLET 1986b) führten 1986 eine Immuno- diffusion mittels Agargel-Präzipitation mit Kaninchenseren durch und klassifizierten die Serotypen 1-7 (NICOLET et al. 1986). Mit der gleichen Methode identifizierten
B Schrifttum 30
Kielstein et al. zusätzlich die Serotypen Jena 6-12 (KIELSTEIN et al. 1991a) und Rapp-Gabrielson et al. ND1-5 (RAPP-GABRIELSON u. GABRIELSON 1992).
Kielstein et al. vereinheitlichten die Einteilung anhand der Untersuchungen weiterer Isolate mit der gleichen Methode und entwickelten die heutige Einteilung in 15 Serotypen nach dem sogenannten Kielstein-Rapp-Gabrielson- (KRG-) Schema (KIELSTEIN u. RAPP-GABRIELSON 1992). Alle anderen zum damaligen Zeitpunkt bekannten Serotypen wurden in dieses Schema eingegliedert.
Del Rio et al. verglichen 2003 die bekannte Immunodiffusionsmethode mit einem von ihnen angewandten indirekten Hämagglutinations- (IHA-) und einem Koagulations- test (DEL RIO et al. 2003). Der Koagulationstest zeigte diverse Kreuzreaktionen, der IHA jedoch führte zu spezifischen Ergebnissen und bis auf eine Ausnahme wurden durch IHA und Immunodiffusion alle untersuchten Stämme den gleichen Serotypen zugeordnet. Zusätzlich konnte die IHA 80 % der 25 als per Immunodiffusion nicht typisierbar einsortierten Stämme einem Serotypen zuordnen. Die gleiche Methode wurde 2004 von Angen et al. an dänischen Isolaten durchgeführt und nur drei Isolate ergaben in der IHA und der Immunodiffusion unterschiedliche Ergebnisse (ANGEN et al. 2004). Auch in diesem Versuch gelang mit der IHA die Typisierung von einigen Stämmen, die mit der Immunodiffusion misslang.
1.2.3.4 Vergleich der Typisierungsmethoden
Alle beschriebenen Methoden können einzelne Stämme voneinander abgrenzen. Je nach angewandter Methode werden die Stämme in unterschiedlich viele Gruppen eingeteilt, was entweder durch eine besonders sensitive Untersuchungsmethode bedingt ist oder durch eine geringe Anzahl untersuchter Proben. Je sensitiver die Methode, desto besser ist sie z.B. für epidemiologische Studien geeignet.
Sämtliche Methoden vermögen es jedoch nicht, einen virulenten Stamm von einem avirulenten zu unterscheiden. Zwar wurde in den ersten Studien mittels PAGE- Typing ein Zusammenhang zwischen Proteinmuster und Virulenz vermutet, weitere Ergebnisse aus Untersuchungen mit dieser Methode konnten diesen jedoch nicht bestätigen.
B Schrifttum 31 1.2.4 Tiermodelle
Verschiedene in vivo Versuche mit H. parasuis sind in der Vergangenheit durch- geführt worden. Sie unterschieden sich im Ziel der Studie, dem Tiermodell und der Wahl der Inokulationsroute.
Die ältesten Pathogenitätsstudien mit den Referenzstämmen der heute gültigen Serotypen führten Kielstein et al. 1992 durch (KIELSTEIN u. RAPP-GABRIELSON 1992), indem sie primäre SPF-Tiere intraperitoneal mit 5 x 108 KBE der 15 Refe- renzstämme inokulierten. Die mit Serotyp 1, 5, 10 12, 13 und 14 infizierten Tiere verstarben innerhalb von vier Tagen oder waren moribund. Tiere, die mit den Sero- typen 2, 4 und 15 infiziert waren, litten unter Polyserositis, der Referenzstamm 8 verursachte nur milde Symptome. Mit den Serotypen 3, 6, 7, 9 und 11 traten keine Symptome oder pathologische Veränderungen auf. Die Zuordnung eines Stammes zu einem Serotypen ermöglicht allerdings keine Zusage bezüglich seiner Virulenz, da sich die Isolate einer Serogruppe nicht einheitlich verhalten (OLIVEIRA u. PIJOAN 2004).
Auch durch andere Inokulationsrouten konnten Tiere erfolgreich infiziert werden. So verwendeten Nielsen et al. die intranasale Route (NIELSEN 1993), Blanco et al.
infizierten die Versuchstiere intratracheal (BLANCO et al. 2004) und Miniats et al.
führten eine aerosolisierte Belastung durch (MINIATS et al. 1991).
Die Manifestation einer Erkrankung wird durch den Immunstatus der Versuchstiere beeinflusst (BLANCO et al. 2004; NIELSEN 1980), weshalb die große Verbreitung des Erregers für die Durchführung von Versuchen zunehmend Probleme bereitet, da sie den Erwerb H. parasuis freier Tiere erschwert. Aus diesem Grund beschäftigten sich einige Studien mit der Austestung von alternativen Modellen.
1991 führten Morozumi et al. Versuche mit Mäusen und Meerschweinchen durch (MOROZUMI et al. 1982). Die Tiere wurden vergleichend intraperitoneal, intramusku- lär und intrapulmonal infiziert. Die Mäuse überlebten überwiegend und wiesen in der Sektion keine H. parasuis typischen Veränderungen auf, wohingegen die Mehrzahl der Meerschweinchen mit Septikämie, Serositis und Meningitis Symptome der klas-
B Schrifttum 32
sischen Glässerschen Kranktheit zeigte und verstarb. Die Empfindlichkeit von Meer- schweinchen gegenüber H. parasuis bestätigten Rapp-Gabrielson et al. (RAPP- GABRIELSON et al. 1992b). Sie stellten fest, dass Meerschweinchen bei intraperi- tonealer Infektionsroute innerhalb von 24 Stunden verstarben, Unterschiede in der Virulenz eines Stammes waren jedoch nur bei intratrachealer Infektion zu beob- achten.
Neben Labornagern kommen als alternatives Tiermodell auch künstlich aufgezogene Schweine in Betracht. Diese werden nach oder bereits während der Geburt von der Muttersau separiert und erhalten wahlweise porzines, bovines oder gar kein Ko- lostrum. So verwendeten Smart et al. in ihren Protektionsstudien Tiere aus einer H.
parasuis freien Herde, die mittels Kaiserschnitt entbundener Tiere aufgebaut wurde (SMART u. MINIATS 1989), und Miniats et al. setzten Gnotobioten ein (MINIATS et al. 1991). Hierbei handelt es sich um per Kaiserschnitt geborene Tiere, die keimfrei aufgezogen werden. Eine andere Form sind natürlich geborene, aber künstlich aufgezogene Ferkel (OLIVEIRA et al. 2003b) und sogenannte CDCD-Tiere (cesa- rean derived colostrum deprived), die der Bezeichnung nach per Kaiserschnitt gebo- ren und ohne Kolostrumgabe, nicht aber steril aufgezogen werden (VAHLE et al.
1997). Alle diese Modelle haben den Vorteil, dass die Studien am Wirtstier durch- geführt werden können, weil die Tiere naiv gegenüber H. parasuis sind. Nachteilig ist allerdings, dass sie ein äußerst schwaches Immunsystem besitzen und Versuche mit derart immunsupprimierten Tieren oftmals mit hohen Verlusten vor Versuchsbeginn einher gehen. In einer Studie, die die Eignung von natürlich geborenen und künstlich aufgezogenen Ferkeln als Tiermodell für H. parasuis untersuchte, erlebten nur 50 % der Tiere den Versuchsbeginn, obwohl sie ersatzweise bovines Kolostrum und eine Antibiotikatherapie erhalten hatten (OLIVEIRA et al. 2003b). Der hohe Haltungsauf- wand für solche empfindlichen Tiere und die Tierverluste machen Versuche mit immunsupprimierten Tieren sehr kostenintensiv. Eine aus solchen Tieren aufgebaute Herde stellt zwar optimale Versuchsbedingungen her, ist jedoch ebenfalls mit hohen Kosten verbunden.
B Schrifttum 33 Andere in vivo-Versuche beschäftigten sich mit Immunisierungsstudien gegen H. pa- rasuis. Hierfür wurden z.B. die Route per Aerosol (NIELSEN 1993), per subkutaner (SMART u. MINIATS 1989) und intramuskulärer Injektion durchgeführt (BAK u.
RIISING 2002).
Zur Untersuchung möglicher Kreuzimmunitäten zwischen den einzelnen Stämmen immunisierten Nielsen et al. Schweine mit einer Kultur der apathogenen Stämme 2, 3, 4 oder 7 und beobachteten eine Resistenz gegenüber einem dänischen Feld- stamm von Serotyp 5 (NIELSEN 1993). Dahingegen stellten Takahashi et al. fest, dass eine monovalente Immunisierung mit einem Feldstamm von Serotyp 2 oder dem Referenzstamm von Serotyp 5 (Stamm Nagasaki) zwar gegen eine homologe, nicht jedoch gegen eine heterologe Belastung schützt (TAKAHASHI et al. 2001). Im Gegensatz zu Nielsen et al. setzten sie einen sogenannten Bakterinimpfstoff, das heisst eine formalininaktivierte Ganzzellvakzine ein. Unvollständige Kreuzimmunität bestätigten auch Miniats et al., die Versuche an Gnotobioten durchführten (MINIATS et al. 1991). Sie immunisierten drei Tiergruppen mit verschiedenen Bakterinimpf- stoffen, denen jeweils ein anderer Feldstamm zugrunde lag (zwei virulente Stämme V1 und V2, ein avirulenter Stamm AV), je ein Drittel jeder Gruppe wurde per Aerosol mit Lebendkulturen der drei Stämme belastet. Eine Vakzinierung mit den virulenten Impfstämmen V1 oder V2 schützte sämtliche Tiere vor einer Belastung mit allen drei Testisolaten, wohingegen die Impfung mit dem avirulenten Stamm AV zwar gegen den einen virulenten V2, jedoch nicht gegen eine Belastung mit dem anderen viru- lenten Stamm V1 schützte. Kreuzimmunitäten konnten demnach nachgewiesen wer- den, ein vollständiger Schutz gegen alle Stämme wird jedoch nicht erlangt.
Versuche, die die Rolle maternaler Antikörper im Zusammenhang zu einem Impf- schutz untersuchten, ergaben deutlich reduzierte Krankheitssymptome in Ferkeln, deren Mütter vor der Geburt gegen H. parasuis (Serotyp 5) geimpft wurden (SOLANO-AGUILAR et al. 1999). Miniats et al. immunisierten Ferkel unterschied- lichen Alters mit einem Bakterinimpfstoff, um den optimalen Zeitpunkt für eine Vakzi- nierung herauszufinden. Sie stellten keinen Unterschied zwischen Tieren fest, die in der zweiten und vierten Lebenswoche geimpft wurden und denen, die in der dritten
B Schrifttum 34
und fünften, bzw. vierten und sechsten Lebenswoche geimpft wurden (MINIATS u.
SMART 1988).
Die in Dänemark (Glassinord®) und Deutschland (Porcilis® Glässer) zugelassenen Impfstoffe der Firma Intervet sind auf Serotyp 5 basierende Totimpfstoffe, die sich in dem verwendeten Adjuvans unterscheiden. Versuche mit Porcilis® Glässer haben er- geben, dass die Tiere zuverlässig gegen eine homologe Belastung geschützt sind, sich die Wirkung gegenüber einer heterologen Belastung mit Stämmen aus Serovar 1, 12, 13 und 14 jedoch als unvollständig erwiesen hat (BAK u. RIISING 2002). In Deutschland werden deshalb häufig bestandsspezifische Bakterinimpfstoffe ver- wendet.
Zusammenfassend ist es bisher zwar gelungen, klinische Erkrankungen durch Vakzinierung der Tiere gegen H. parasuis zu verhindern, ein übergreifender Schutz gegen heterologe Belastung wurde bislang jedoch nicht erreicht. Zudem ist die Un- terscheidung von geimpften und infizierten Tieren mit den bisher erhältlichen Vakzi- nierungsmethoden nicht möglich.
B Schrifttum 35 2 Ziel der Studie
Bei H. parasuis handelt es sich um einen Keim, der gerade in Betrieben mit hohen Hygienestandards zunehmend Probleme bereitet. Über seine Virulenzfaktoren und Pathogenitätsmechanismen ist bislang wenig bekannt, so dass derzeit keine Aus- sage darüber möglich ist, ob ein Stamm das Potenzial besitzt Erkrankungen hervor- zurufen oder ob es sich um einen avirulenten Kommensalen des oberen Respira- tionstraktes handelt.
Kenntnisse über die Virulenzfaktoren des Erregers sind für die Entwicklung diag- nostischer Methoden notwendig, welche neben dem Speziesnachweis auch Auskunft über das Virulenzpotenzial eines Stammes geben. Langfristig können diese Daten auch zur Entwicklung eines serovarübergreifenden Impfstoffes verwendet werden.
Als Voraussetzung für die Untersuchung potenzieller Virulenzfaktoren ist ein zuver- lässiges Tiermodell notwendig.
Das Ziel der vorliegenden Studie war es deshalb, neue Virulenzfaktoren von H. para- suis zu identifizieren und mit der Etablierung eines geeigneten Tiermodells zu be- ginnen.
C Material und Methoden 36
C Material und Methoden
1 Material
1.1 Geräte, Verbrauchsmittel und Chemikalien
Die in dieser Arbeit verwendeten Verbrauchsmittel und Chemikalien sind in Anhang I1 aufgelistet, die Geräte in den Fußnoten angegeben.
1.2 Lösungen und Puffer
Eine Auflistung der verwendeten Lösungen und Puffer findet sich in Anhang I2 auf- gelistet. Sie wurden soweit notwendig autoklaviert oder sterilfiltriert.
1.3 Bakterienstämme
Die in dieser Arbeit eingesetzten Bakterienstämme sind in Anhang I3 aufgeführt.
2 Methoden
2.1 Mikrobiologische Methoden
2.1.1 Kultivierung von Escherichia coli Stämmen
Escherichia (E.) coli Stämme wurden in Luria-Bertani (LB) Medium kultiviert (s. An- hang Tab. 11), welchem bei Bedarf Antibiotika zugesetzt wurden (100 µg Ampicillin).
Die Bebrütung der Bakterien erfolgte über Nacht aerob bei 37 °C im Brutschrank1 oder im Schüttelinkubator2.
2.1.2 Kultivierung von H. parasuis Stämmen
Die H. parasuis Stämme wurden als Flüssigkultur in Brain Heart Infusion (BHI) Me- dium (s. Anhang Tab. 11) unter Zusatz von 5 % Pferdeserum und 1 x Ersatz-Isovita- lex (EIVX) kultiviert. Die Bebrütung erfolgte für 24-48 Stunden bei 37 °C unter mikro- aerophilen Bedingungen (5 % CO2)3. Bei der Anzucht im Schüttelinkubator wurde das Medium zur Anreicherung mit CO2 vorher bei 37 °C über Nacht vorinkubiert. Zur
1 Memmert GmbH & Co. KG, Schwabach, Deutschland
2 innova 4300, NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC, Edison, USA
3 CO2-AUTO-ZERO, Heraeus, Hanau, Deutschland
C Material und Methoden 37 Anzucht auf Agarplatten wurde in der Regel Kochblutagar mit Nicotinamid (NAD) - Zusatz verwendet, je nach Bedarf wurden aber auch Schafsblut- oder Schweineblut- Agar mit einer Staphylococcus aureus-Amme, PPLO-Agar oder Columbia Sheep Blood (CSB) -Agar eingesetzt.
2.2 Molekularbiologische Methoden 2.2.1 Arbeiten mit DNA
2.2.1.1 Präparation chromosomaler DNA
Zur Präparation chromosomaler DNA von H. parasuis wurde ein Protokoll verwendet, welches einen Aufreinigungsschritt mit Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) zur Abtrennung von Proteinen und Polysacchariden beinhaltet (AUSUBEL et al. 1987).
An Tag 1 wurde ein fraktionierter Ausstrich des entsprechenden Stammes vorge- nommen. Mit einem angefeuchteten Tupfer wurde an Tag 2 das Material von der Platte entnommen und in insgesamt 3-4 Aliquots TEN-Puffer (s. Anhang Tab. 12) resuspendiert (je 275 µl). Nach Zugabe von 10 µl RNAse (10 mg/ml) und 275 µl Aqua dest. inkubierten die Ansätze für 30 Minuten im Wasserbad4 bei 37 °C. Im An- schluss folgte ein Zusatz von 15 µl 20 %igem SDS und 10 µl Proteinase K (20 mg/ml). Die Probe wurde gründlich gemischt, erneut bei 37 °C für eine Stunde im Wasserbad inkubiert und währenddessen das CTAB (s. Anhang Tab. 12) auf 50 °C5 erwärmt. Dem Ansatz wurden zunächst 125 µl 4M NaCl zugegeben, wieder gründlich gemischt, danach 80 µl CTAB hinzugegeben, erneut gemischt und für zehn Minuten im Wasserbad bei 65 °C erwärmt. Die Fällung begann mit der Zugabe von 780 µl Chloroform/Isoamyl (24:1). Nach gründlichem Mischen erhielt die Lösung ein homo- gen milchiges Aussehen. Durch einen Zentrifugationsschritt über fünf Minuten bei 12.000 g6 wurden drei unterschiedliche Phasen sichtbar, ausschließlich der Über- stand wurde in ein zweites Eppendorf-Reagiergefäß überführt und der Rest verwor- fen. Nach Zugabe von 780 µl Phenol/Chloroform/Isoamyl (25:24:1) wurde erneut
4 1004, Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel, Deutschland
5 Labtherm®, Liebisch, Bielefeld, Deutschland
6 mini Spin plus®, Eppendorf, Hamburg, Deutschland
C Material und Methoden 38
gemischt, zentrifugiert (fünf Minuten bei 12.000 g), der Überstand zurück behalten und der Rest verworfen. Die Präzipitation der DNA geschah durch Hinzufügen von 500 µl Isopropanol, vorsichtiges Mischen und erneutes Zentrifugieren (30 Minuten bei 12.000 g). Ein nachfolgender Waschschritt des Pellets beinhaltete nach der Zugabe von 500 µl 80 %igem Ethanol noch eine Zentrifugation für fünf Minuten bei 12.000 g. Nach dem Abnehmen des Alkohols wurde das Pellet für zehn Minuten an der Luft getrocknet und anschließend in ca. 50 µl Aqua dest. oder TE-Puffer über Nacht im Kühlschrank resuspendiert. Die Lagerung der chromosomalen DNA erfolgte bei -20 °C im Gefrierschrank.
2.2.1.2 Plasmidpräparationen
Zur Präparation kleinerer Mengen Plasmid-DNA wurde das modifizierte Alkalilysis Verfahren nach Birnboim angewendet (BIRNBOIM u. DOLY 1979). Hierfür wurden am Vortag 3 ml Medium mit dem gewünschten E. coli-Stamm beimpft, über Nacht bei 37 °C im Schüttler inkubiert und am nächsten Tag abzentrifugiert7 (10 min, 8.000 g).
Die Resuspension des Bakterienpellets erfolgte in 300 µl Tris-EDTA-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0; 10 mM EDTA, 0,1 mg/ml RNAse). Nach Zugabe von 300 µl NaOH- SDS-Lösung (0,2 M NaOH, 1 % SDS) wurde die Lösung bis zur Lyse der Bakterien, maximal jedoch für fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 300 µl K-Acetat-Puffer 3,2 M (pH 5,5) hinzugefügt, die Probe für zehn Minuten bei 12.000 g zentrifugiert und der Überstand in ein neues Reagiergefäß überführt. Die Präzipitation erfolgte durch Zugabe von 600 µl eiskaltem Isopropanol.
Einer Inkubation von fünf bis zehn Minuten bei Raumtemperatur folgte ein letzter Zentrifugationsschritt (10 min, 12.000 g). Nach Abnahme des Überstands wurde das Pellet an der Luft für zehn Minuten getrocknet und dann in 25 µl Aqua dest.
resuspendiert.
Für einen analytischen Verdau wurden maximal 5 µl der Präparation verwendet.
7 Sorvall® RC-5B Refrigerated Superspeed Centrifuge, Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA
C Material und Methoden 39 2.2.1.3 Polymerase-Kettenreaktion
In der Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) werden durch das Enzym Taq-DNA-Polymerase DNA-Abschnitte amplifiziert (MULLIS et al. 1986).
Sämtliche für alle Ansätze identisch eingesetzten Reagenzien wurden gemäß Proto- koll als Mastermix zusammen pipettiert und in Probengefäße aliquotiert. Es folgte dann für jedes Gefäß einzeln die Zugabe jener Reagenzien, in denen sich die An- sätze unterschieden, bis überall das erwünschte Gesamtvolumen (25 oder 50 µl) erreicht wurde. Als Template diente chromosomale DNA, resuspendiertes Kolonie- material oder Plasmid-DNA, die eingesetzte Menge betrug 10-20 ng/µl. Um die Reaktionen zu überprüfen wurden stets mindestens eine Positivkontrolle und eine Negativkontrolle mitgeführt. Zur Durchführung der PCR wurde ein Thermocycler8 ver- wendet, wobei die zu durchlaufenden Programme den einzelnen Primern und Frau- gestellungen angepasst wurden (s. Tab. 1). Die Standardpufferbedingungen: 1 x PCR-Puffer, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM pro Nucleotid, 0,5 µmol pro Primer, 1,0 bis 2,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase® oder Gotaq®, Template in variabler Menge.
Die Analyse der PCR-Produkte geschah mittels Agarosegel-Elektrophorese unter Mitführung eines Größenmarkers (2log Ladder®). Zur Aufreinigung von PCR-Produk- ten wurde das NucleoSpin® Extract II-Kit (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) nach Anweisung des Herstellers verwendet.
8 primus 96 advanced®, peQLab, Erlangen, Deutschland
