Aus dem Institut für
Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Untersuchungen zur Beeinflussung der Keratinozytenproliferation und der
Wundheilung über Purinrezeptoren
THESE
Zur Erlangung des Grades eines
PHILOSOPHICAL DOCTOR
- Ph.D. -
im Fachgebiet
Pharmakologie
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von
Karin Eva Lelieur
aus Lahr/Baden
Hannover 2004
Supervisor: Prof. Dr. Manfred Kietzmann
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie Tierärztliche Hochschule Hannover
Betreuungsgruppe: Prof. Dr. Manfred Kietzmann Prof. Dr. Gottfried Wozel
Klinik und Poliklinik für Dermatologie
Universitätsklinikum Carl Gustav Carus Dresden Prof. Dr. Gerhard Breves
Physiologisches Institut
Tierärztliche Hochschule Hannover
Externes Gutachten: Prof. Dr. Peter Illes
Institut für Pharmakologie und Toxikologie Medizinische Fakultät, Universität Leipzig
Tag der mündlichen Prüfung: 10.11.2004
Diese Arbeit wurde durch die Bayer AG gefördert.
Meinen Eltern in Liebe und Dankbarkeit
gewidmet
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 12
2 Schrifttum 13
2.1 Die Haut 13
2.1.1 Epidermis 14
2.1.1.1 Keratine 15
2.1.2 Dermis 16
2.1.3 Hypodermis 16
2.2 Wundheilung 16
2.2.1 Blutgerinnung 17
2.2.2 Entzündung 17
2.2.3 Zellwanderung und Proliferation 17 2.2.4 Wachstumsfaktoren und Zytokine 18 2.2.5 Beeinflussung der Wundheilung 19
2.2.5.1 Exogene Faktoren 19
2.2.5.2 Endogene Faktoren 19
2.2.5.3 Calcium 20
2.2.5.4 Prostaglandin (PG) E2 21
2.3 Adenosin, Purine und Pyrimidine 21
2.3.1 Natürliches Vorkommen 21
2.3.2 Extrazellulärer Metabolismus von ATP
und anderen Nucleotiden 22
2.3.3 Purinerge Rezeptoren 23
2.3.3.1 G-Protein gekoppelte Rezeptoren 24
2.3.3.2 Adenosin-Rezeptoren 24
2.3.3.3 P2Y-Rezeptoren 26
2.3.3.4 P2X-Rezeptoren 28 2.3.4 Purinerge Rezeptoren in der Haut 29 2.3.5 Verwendete purinerge Agonisten und Antagonisten 31
3 Material und Methoden 34
3.1 Fragestellung und Versuchsübersicht 34
3.2 Reagenzien und Geräte 36
3.2.1 Reagenzien für die Zellkultur 36
3.2.1.1 Zellkulturmedien 36
3.2.1.2 Substanzen 38
3.2.1.3 Bestimmung der Zellzahl 38
3.2.1.4 Bestimmung der Zellvitalität 39 3.2.1.5 Bestimmung der Zellproliferation (BrdU-Test) 39
3.2.1.6 Prostaglandinmessunng 39
3.2.2 Reagenzien für die RT-PCR 39
3.2.2.1 Probenaufbereitung 39
3.2.2.2 RT-PCR 40
3.2.3 Reagenzien für die Histologie und Immunhistochemie 40
3.2.4 Reagenzien für die In-vivo-Versuche 41
3.2.5 Lösungen 41
3.2.6 Kunststoffmaterial 42
3.2.7 Geräte für die Versuche an der Zellkultur 42
3.2.8 Geräte für die Analytik 42
3.2.9 Geräte für die RT-PCR 43
3.2.10 Geräte für In-vivo-Versuche, Histologie und
Immunhistochemie 43
3.3 Methoden 44
3.3.1 Zellkultur 44
3.3.1.1 Kultivierung der murinen Keratinozytenlinie MSC-P5 44 3.3.1.2 Aussäen der Mikrotiter-Kulturplatten 45
3.3.1.3 Gewinnung von primären Keratinozyten 46 3.3.1.4 Bestimmung der Zellvitalität mittels MTT-Test 46 3.3.1.5 Bestimmung der Zellproliferation mittels BrdU-Test 47 3.3.1.6 Ermittlung der Wachstumskurve mittels BrdU-Test 47 3.3.1.7 Proliferationsversuche an MSC-P5-Zellen 49 3.3.1.8 Bestimmung der PGE2-Konzentration
im Zellkulturüberstand mittels ELISA 49 3.3.1.9 Statistische Auswertung der Proliferations- und
PGE2-Bildungsversuche 50
3.3.2 RT-PCR 51
3.3.2.1 Isolierung der RNA 51
3.3.2.2 Primer 51
3.3.2.3 Gelabschätzung 53
3.3.2.4 DNA-Ausschluss 53
3.3.2.5 Durchführung der RT-PCR 54
3.3.2.6 Sequenzanalyse 54
3.3.3 Wundheilungsversuche 55
3.3.3.1 Tiere 55
3.3.3.2 Wundheilungsversuche 55
3.3.3.3 Statistik 56
3.3.4 Histologie 57
3.3.4.1 Aufarbeitung von MSC-P5-Zellen für den
Rezeptornachweis 57
3.3.4.2 Aufarbeitung von Maushaut für den Rezeptornachweis 57 3.3.4.3 Histologische Untersuchung der Wunden 57
3.3.4.4 Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung 58
3.3.5 Immunhistochemie 58
3.3.5.1 Rezeptoren A2B und P2Y2 58
3.3.5.2 BrdU 58
4 Ergebnisse 60
4.1 Expression von Purinrezeptoren in murinen
Keratinozyten 60
4.2 Sequenzanalyse der RT-PCR-Produkte 64 4.3 Beeinflussung der Zellproliferation durch purinerge
Agonisten und Antagonisten 65 4.4 Immunhistochemische Darstellung der Rezeptoren
A
2Bund P2Y
273
4.5 Beeinflussung der Zellvitalität durch ATP 77 4.6 Beeinflussung der PGE
2-Bildung durch ATP 80 4.7 Expression von PGE
2-Rezeptoren in MSC-P5-Zellen 81 4.8 Beeinflussung der Zellproliferation durch PGE
283 4.9 Expression von COX-1 und COX-2 in MSC-P5-Zellen
nach Behandlung mit purinergen Agonisten 84 4.10 Expression von Keratinen in MSC-P5-Zellen nach
Behandlung mit purinergen Agonisten 85 4.11 Beeinflussung der Wundheilung durch purinerge
Substanzen 87
4.11.1 Planimetrie 87
4.11.2 Histologie und Immunhistochemie 92
5 Diskussion 95
5.1 In-vitro-Untersuchungen 95
5.1.1 Expression von Purinrezeptoren in murinen keratinozyten 95 5.1.2 Sequenzanalyse der RT-PCR-Produkte 96 5.1.3 Beeinflussung der Zellproliferation und –vitalität durch
purinerge Substanzen 96
5.1.4 Beeinflussung der PGE2-Bildung durch purinerge Agonisten 98 5.1.5 Expression von COX-1 und COX-2 nach Behandlung
mit purinergen Agonisten 99 5.1.6 Expression von Keratinen nach Behandlung
mit purinergen Agonisten 99 5.1.7 Zusammenfassende Betrachtung zu den
In-vitro-Untersuchungen 100
5.2
In-vivo-Untersuchungen 1035.2.1 Modell 103
5.2.2 Beeinflussung der Wundheilung durch purinerge Substanzen 103
5.3 Schlussfolgerung und Ausblick 105
6 Zusammenfassung 106
7 Summary 107
8 Literaturverzeichnis 108
9 Veröffentlichungen 134
V
erzeichnis der verwendeten AbkürzungenAbb. Abbildung
ADP Adenosin-Diphosphat ATP Adenosin-Triphosphat BrdU Brom-Desoxyuridin
cAMP cyclisches Adenosin-Monophosphat
COX Cyclooxygenase DEPC Diethylpyrocarbonat DAG Diacylglycerol
EDTA Ethylendiamintetraacetat ELISA enzyme-linked immuno sorbent assay
FKS Fetales Kälberserum
GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
IP3 Inositol 1,4,5-Triphosphat
mA Milliampere MAPK mitogen activated protein kinase
NADH Nicotinamidadenindinucleotid
NADPH Nicotinamidadenindinucleotidphosphat NECA 5’-N-Ethylcarboxamidoadenosin
PG Prostaglandin
PKC Proteinkinase C
PLC Phospholipase C
Str. Stratum Tab. Tabelle
UDP Uridin-Diphosphat UTP Uridin-Triphosphat
1 Einleitung
Seit geraumer Zeit ist bekannt, dass ATP in der Zelle als universeller Träger der Stoffwechselenergie unersetzlich ist. Jedoch wurde im Laufe der letzten Jahrzehnte immer offensichtlicher, dass ATP und auch die anderen Purine, ADP und Adenosin, sowie die Pyrimidine UDP und UTP über Purinrezeptoren mannigfaltige Geschehnisse im Extrazellularraum des Organismus beeinflussen. Dabei liegt der Schwerpunkt der Forschung vor allem auf der Untersuchung der Neurotransmission und der Herz-Kreislauf-Regulierung.
Purine und Pyrimidine lenken jedoch auch die Proliferation, Differenzierung und Apoptose zahlreicher Zellarten.
Die Beeinflussung der Zellproliferation durch purinerge Substanzen kann insbesondere im Rahmen der Wundheilung von herausragendem Interesse sein. Durch die Verletzung der Zellen kommt es im Wundbereich zu einer massiven Freisetzung von Nucleotiden. Diese können an eine Vielzahl von Purinrezeptoren binden, die sich in unterschiedlichen Expressionsmustern an der Oberfläche der verschiedenen Zellarten befinden.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es zu untersuchen, welche Purinrezeptoren in der obersten Zellschicht der Epidermis, den Keratinozyten, exprimiert werden, und ob und in welcher Form sie das Wachstum dieser Zellen in vitro und in vivo steuern. Mittels der RT- PCR-Technik wird für die Epidermis vier verschiedener Mausstämme sowie für die murine Keratinozyten-Linie MSC-P5 das Expressionsprofil der Purinrezeptoren erstellt. Im Anschluss wird ermittelt, über welche dieser Rezeptoren das Wachstum der MSC-P5-Zellen beeinflusst wird. Anhand der Erkenntnisse, die aus den In-vitro-Untersuchungen gewonnen werden, wird versucht, mit purinergen Substanzen gezielt in das Wundheilungsgeschehen einzugreifen.
2 Schrifttum
2.1 Die Haut
Als Grenzfläche zwischen Organismus und Umwelt ist die Haut einerseits eine für den Körper essentielle Schutzhülle gegenüber chemischen und physikalischen Einwirkungen sowie Krankheitserregern. Andererseits bildet sie über ihre Rezeptoren eine Kontaktfläche zur Außenwelt und gibt Informationen an das zentrale Nervensystem weiter. Des weiteren ist sie an der Wärmeregulation, dem Erhalt des Wasser- und Ionenhaushalts und am immunologischen Geschehen beteiligt. Die Haut der Säugetiere besteht aus drei Schichten:
Epidermis, Dermis und Hypodermis (HABERMEHL 1996). Der mikroskopische Aufbau muriner Epidermis und Dermis ist in der Abb. 1 dargestellt.
Epidermis
Dermis
Abb. 1: murine Epidermis und Dermis, Hämatoxilin-Eosin-Färbung, Vergrößerung 400-fach.
2.1.1 Epidermis
Die Epidermis besteht überwiegend aus Keratinozyten und bildet in Form eines mehrschichtigen Plattenepithels die äußerste Schicht der Haut. Viele Zellen der Epidermis führen eine Migration von der Epithelbasis an die Oberfläche durch und verhornen dabei. Die Keratinozyten verändern während ihrer Wanderung ihre Gestalt und Funktion; daher wird die Epidermis nochmals in fünf Schichten unterteilt. Von außen nach innen bilden Stratum (Str.) corneum und teilweise das Str. lucidum das Str. superficiale. Zum Str. profundum gehören Str. granulosum, Str. spinosum und Str. basale. Während in den tieferen Zellschichten die zyklische Erneuerung der Keratinozyten gesichert wird, bilden die Epithellagen an der Oberfläche die eigentliche Schutzschicht der Haut (LIEBICH 1993).
Die iso- bis hochprismatischen Zellen des Str. basale sind über Semidesmosomen fest mit der Basalmembran und somit auch mit der Dermis verbunden. Die basalen Keratinozyten sind mitotisch aktiv. Ein großer Teil entwickelt sich zu postmitotischen, nicht teilungsfähigen Zellen, und beginnt mit der Wanderung nach außen (FUCHS 1990).
Die postmitotischen, polygonalen Zellen des Str. spinosum sind reich an glutamin- und lysin- reichen Proteinen wie Involukrin und Lorikrin, welche an der Innenseite der Plasmamembran der Zellen gelagert werden (RICE und GREEN 1979, MEHREL et al. 1990). Im Str.
granulosum beginnt die Abflachung der Keratinozyten sowie die Degeneration der Zellorganellen. Es kommt zum Zerfall des Kerns und zur Dehydrierung der Membransysteme, welche sich unter dem Plasmalemm verdichten. Die zunehmende Permeabilität der Zellmembran führt zu einem Calcium-Einstrom, welcher die epidermale Transglutaminase aktiviert. Diese katalysiert die Bildung von Lysin-Isopeptid-Brücken und führt somit zur Verbindung der Hüllproteine und Bildung der „cornified envelope“ (RICE und GREEN 1979).
Ein weiteres Merkmal des Differenzierungsprozesses ist im Str. spinosum die Bildung des Profilaggrins (DALE et al. 1978), welches den überwiegenden Teil der Keratohyalingranula ausmacht (FLECKMAN et al. 1985). Im Str. granulosum entsteht durch die Abspaltung von Phosphatgruppen aus dem Profilaggrin das Filaggrin; dies führt zur Aggregation der Keratinfilamente und deren Vernetzung über Disulfidbrücken (RESING et al. 1984).
Im oberen Str. spinosum befinden sich kleine lamellierte Zellorganellen, die „Odland bodies“, welche verschiedene Enzyme und Lipide (Ceramide, Cholesterinsulfat) enthalten (WERTZ et
al. 1984). Sie werden in den Interzellularraum ausgestoßen, umgeben die flachen Zellen des Str. lucidum und bilden so eine wasserdichte Barriere, deren Struktur als „brick and mortar model“ beschrieben wurde (ELIAS et al. 1981). Da im Str. lucidum sämtliche Stoffwechselprozesse zugrunde gehen, kommt es auch nicht zu transzellulären Stofftransporten. Das Str. corneum besteht aus abgestorbenen, extrem flachen Keratinozyten, die sich an der Oberfläche aus dem Epithelverband lösen und abschilfern (LIEBICH 1993).
2.1.1.1 Keratine
Ein wichtiges Produkt der Keratinozyten ist das schwefelreiche Strukturprotein Keratin. Die Synthese setzt in den Zellen des Str. basale ein. Auf Höhe des Str. granulosum vernetzen sich die Keratinbündel dreidimensional und bilden unter der fortschreitenden Dehydrierung dichte, zusammenhängende Lagen (LIEBICH 1993).
Die Keratine sind von besonderem Interesse, weil sie je nach Differenzierungsstadium der epithelialen Zellen in unterschiedlichen Mustern exprimiert werden (BOWDEN et al. 1987, O’GUIN et al. 1987). Eine Verschiebung des Keratinprofils wird auch bei diversen Hauterkrankungen beschrieben (WEISS et al. 1984).
Man unterscheidet Typ I- und Typ II-Keratine. Typ I-Keratine sind kleiner (40-64 kDa), von saurem pH (4,8-5,7) und reagieren immunologisch mit dem Antikörper AE1, während Typ II- Keratine größer (54-70 kDa) sowie von höherem pH (5.8-8.0) sind und mit AE3 reagieren (EICHNER et al. 1984, BOWDEN et al. 1987). Keratine werden oft paarweise reguliert und exprimiert, wobei ein Keratin des Typs I und eins des Typs II miteinander assoziieren. So wird z.B. in der menschlichen Epidermis bereits im Str. basale das Keratin-Paar K5 und K14 exprimiert, während die Keratine K1 und K10 erst in sich differenzierenden Keratinozyten zu finden sind (FUCHS 1990). Beispielsweise bei Psoriasis in den betroffenen Hautarealen oder im Bereich von Wunden exprimieren die aktivierten, hyperproliferativen Keratinozyten zusätzlich die Keratine K6 und K16, wobei Interleukin-1 als der Auslöser und der Tumor Nekrose Faktor α (TNF α) als Erhalter dieses Prozesses gelten (WEISS et al. 1984, PALADINI et al. 1996, FREEDBERG et al. 2001, BERNOT et al. 2002). Die Theorie der differenzierungsspezifischen Keratin-Paare konnte bei diversen Säugetieren, u. a. der Maus, sowie beim Huhn verifiziert werden (O’GUIN et al. 1987).
2.1.2 Dermis
Die Dermis bildet die bindegewebige Unterlage der Epidermis und wird durch die Basalmembran von dieser abgegrenzt. Aufgrund der unterschiedlichen Dichte und Anordnung der Kollagenfasern wird sie in zwei Schichten unterteilt.
Das aus lockerem Bindegewebe zusammengesetzte Str. papillare ist mit der Epidermis über die Papillarkörper verbunden und bildet die strukturelle Grundlage für die hohe mechanische Stabilität der äußeren Hautschichten. Eine ausgeprägte Mikrovaskularisation und vegetative Innervation ermöglichen dem Str. papillare zusätzlich die Erfüllung stoffwechselaktiver, immunologischer, kreislaufregulatorischer und sensorischer Funktionen. Vornehmlich in dieser Schicht sind Haare, Talg- und Schweißdrüsen eingelagert.
Das tiefere Str. reticulare ist faserreich, zellarm und straff. Es ermöglicht die Plastizität der Haut (LIEBICH 1993).
2.1.3 Hypodermis
Die Hypodermis besteht aus lockerem, unregelmäßig angeordnetem Bindegewebe und verbindet die Haut verschieblich mit Faszien und Muskulatur (LIEBICH 1993).
2.2 Wundheilung
Die Wunde ist eine Störung der anatomischen und funktionellen Kontinuität eines Gewebes oder Organs. Die Wundheilung ist ein dynamischer Prozess, bei dem mit Hilfe der involvierten physikalischen, chemischen, biologischen und morphologischen Vorgänge durch Bildung neuer Strukturen und Wiederherstellung der Gewebseinheit die ursprüngliche Funktion wieder erlangt werden soll. An der Heilung einer Defektwunde der Haut sind Wundkontraktion, Gefäßneubildung, Granulation und Epithelisation beteiligt (SEDLARIK und AUDRING 1993).
Klinisch werden die Primärheilung (per primam intentionem) und die Sekundärheilung (per secundam intentionem) unterschieden. Minimaler Gewebsverlust bzw. -untergang, minimale
bakterielle Kontamination und schichtgerechte Adaptation der Wundränder ermöglichen eine Primärheilung. Der komplikationslose Wundheilungsverlauf lässt sich in drei Phasen unterteilen: Exsudationsphase mit Blutstillung und Entzündung (0. – 4. Tag), Proliferations- phase mit Granulation und Epithelisierung (4. – 14. Tag), Differenzierungsphase (ab der 2.
Woche) (EITEL und SKLAREK 1988).
2.2.1 Blutgerinnung
Wurden bei der Wundsetzung Blutgefäße verletzt, kommt es zum Kontakt zwischen Blutplättchen und Kollagenfasern. Dies führt zur Aktivierung des Gerinnungssystems und Freisetzung von vasokonstriktorischen Mediatoren. Die Blutplättchen setzen Thrombin frei, welches das lösliche Fibrinogen in Fibrin umwandelt. Der hierbei gebildete Thrombus ist Voraussetzung zur Blutstillung, mechanischer Wundschutz und Matrix für später einwandernde Zellen. Zusätzlich sezernieren die Blutplättchen über ihre α-Granula Zytokine und Wachstumsfaktoren, welche für Immunzellen (neutrophile Granulozyten, Monozyten) chemotaktisch und für andere (Endothelzellen, Fibroblasten, Keratinozyten) proliferationsfördernd sind (BOWLER 2002).
2.2.2 Entzündung
Bereits wenige Minuten nach der Wundsetzung beginnt die Entzündungsreaktion. Sie hält Tage bis Wochen an. Zunächst werden neutrophile Granulozyten angezogen. Sie phagozytieren Bakterien und bewirken durch den Verdau fibrinöser Matrix ein Microdébridement. Außerdem sezernieren sie vasodilatatorische Substanzen und Zytokine, die Fibroblasten und Keratinozyten aktivieren sowie chemotaktisch auf Makrophagen wirken.
Letztere sind ebenfalls an der Phagozytose sowie an der Bildung von Zytokinen und Wachstumsfaktoren beteiligt (HUNT et al. 2000).
2.2.3 Zellwanderung und Proliferation
Innerhalb der ersten Stunden lösen sich Keratinozyten aus dem Zellverband am Rande der Wunde und wandern über die Wundfläche. Dafür müssen sie über eine Neuordnung der
Integrinrezeptoren und eine Umformung des Zytoskelettes sowie des Keratinfilamente-Netzes die Fähigkeit zur Migration erlangen. Anschließend vermehren sie sich und differenzieren.
Nach wenigen Tagen wandern Fibroblasten in die Matrix ein und sezernieren Kollagen und Proteoglykane. Dies führt zur Gewebefestigung und bildet zudem eine Grundlage für die Angiogenese.
Keratinozyten und Fibroblasten bilden Proteasen, welche nekrotisches Gewebe und Kollagen auflösen. Dadurch wird die Gewebe-Umbildung erleichtert. Dieser Prozess kann sich über viele Monate erstrecken und ermöglicht die Anordnung der zunächst zufällig orientierten Kollagenfasern entlang der Spannungslinien.
Von essentieller Bedeutung ist die Einsprossung von Blutgefäßen, die das neu gebildete Gewebe mit Nährstoffen versorgen. Sinkt die Laktatbildung und steigt die Sauerstoffsättigung im Gewebe, so wird die Angiogenese eingestellt (HUNT et al. 2000).
2.2.4 Wachstumsfaktoren und Zytokine
Um ihren Anteil an der Wundheilung zu leisten, müssen Keratinozyten, Fibroblasten und Endothelzellen untereinander und mit anderen Zelltypen kommunizieren. Dafür produzieren und sezernieren sie Wachstumsfaktoren und Zytokine und exprimieren die entsprechenden Rezeptoren.
An der Wundheilung beteiligt sind unter anderem die Wachstumsfaktoren EGF (epidermal growth factor), FGF (fibroblast growth factor), IGF (insulin-like growth factor), KGF (keratinocyte growth factor), PDGF (platelet derived growth factor), TGF (transforming growth factor) und VEGF (vascular endothelial growth factor) (GRAZUL-BILSKA et al.
2003). Rekombinantes humanes PDGF-BB wird unter dem Namen Becaplermin® erfolgreich bei der Behandlung schlecht heilender Wunden eingesetzt (SMIELL et al. 1999).
Erst relativ spät wurde erkannt, dass neben den dendritischen Zellen und anderen klassischen immunologischen Zellen auch die Keratinozyten wesentlich an der Bildung epidermaler Zytokine beteiligt sind. Tatsächlich sind sie dazu befähigt, die meisten dieser Zytokine zu produzieren. Dazu gehören unter anderem die Interleukine (IL) 1, 6, 7, 8, 10, 12, 15, 18 und 20, TNFα sowie die Interferone (IFN) α, β und γ. Diese Mediatoren beeinflussen nicht nur die Keratinozytenproliferation und -differenzierung, sondern auch das Einwandern
inflammatorischer Zellen. Einige besitzen sogar systemische immunologische Wirkung (GRÖNE 2002).
2.2.5 Beeinflussung der Wundheilung
Diverse exogene und endogene Faktoren beeinflussen die physiologische Wundheilung.
2.2.5.1 Exogene Faktoren
Wird eine Wunde im Rahmen einer Operation gesetzt, so gilt es eine Wundinfektion zu vermeiden. Begünstigt wird diese Komplikation neben einer Bakterieneinschleppung auch durch unscharfe Skalpellklingen, eine längere Operationsdauer sowie das Zurücklassen nekrotischen Gewebes (STELZNER 1991). Weiterhin üben niedriger Sauerstoffdruck, mechanischer Druck und kalte Umgebungstemperaturen einen negativen Einfluss auf die Wundheilung aus (SEDLARIK 1993, WHITNEY und WICKLINE 2003).
Von Bedeutung sind auch pharmakologische Substanzen, die gezielt zur Förderung der Wundheilung oder aber aus anderen Gründen beim Patienten angewandt werden. So ist bekannt, dass Heparin, Lokalanästhetika, salizylathaltige Antipyretika und Analgetika, kortikoide Steroide sowie Zytostatika die Wundheilung nachteilig beeinflussen (SEDLARIK 1993). Antibiotika verlangsamen im allgemeinen ebenfalls die Heilung, sind jedoch in vielen Fällen unerlässlich. Sie sollten dann grundsätzlich nicht lokal, sondern systemisch verabreicht werden (LARSEN et al. 2003).
2.2.5.2 Endogene Faktoren
Neben Lebensalter, psychischer Verfassung und vegetativ-nervösen Reizen gehören vor allem der Ernährungszustand sowie der hormonelle Status des Patienten zu den wichtigen endogenen Faktoren, die über Verlauf und Dauer der Wundheilung entscheiden.
Hungern im allgemeinen, insbesondere aber ein Proteinmangel hemmen die Proliferation des Granulationsgewebes. Dies beruht u.a. auf einer verminderten Fibroblastenproliferation, Kollagensynthese und Neovaskularisation. Des weiteren bedarf es für eine ungestörte Wundheilung essentieller Fettsäuren (SLONE 2004).
Von Bedeutung für die Wundheilung sind auch Vitamine. Vitamin C ist essentiell für den Kollagenerhalt sowie die Stabilität der Gefäße (CHVAPIL und HURYCH 1968). Während Vitamin C unabdingbar für ein gesundes Bindegewebe ist, spielt Vitamin A eine wichtige Rolle bei der Re-Epithelisierung. Auch ein Mangel an anderen Vitaminen (B-Gruppe, D, E und K) sowie an diversen Mineralstoffen und Spurenelementen verzögert die Heilung einer Wunde und muss aus diesem Grunde ausgeglichen werden (SEDLARIK 1993).
Diverse Hormone beeinflussen ebenfalls die Wundheilung. Zu den stimulierenden Hormonen gehören STH (somatotropes Hormon), TSH (Thyreoidea-stimulierendes Hormon), Calcitonin, die Sexualhormone Östrogen und Testosteron sowie Insulin. Einen negativen Einfluss auf die Wundheilung üben Thyroxin, Gestagene, ACTH (adrenocorticotropes Hormon) und Kortikoide aus (SEDLARIK 1993).
2.2.5.3 Calcium
Calcium reguliert sowohl intra- als auch extrazellulär das Wachstum der Keratinozyten. In vitro konnte gezeigt werden, dass bei einer geringen Calcium-Konzentration (< 0,1 mol/l) die Proliferation im Vordergrund steht, während es bei höheren Konzentrationen zur Bildung von Cytokeratinen und anderen Differenzierungsmarkern kommt (HENNINGS et al. 1980, PILLAI und BIKLE 1992, YUSPA et al. 1989). MENON und ELIAS (1991) stellen anhand der Oxalat-Pyroantimonat-Technik die Calcium-Speicher in der Epidermis von Mäusen dar.
Sie können einen deutlichen Calcium-Gradienten zwischen den Epithelschichten zeigen. So ist der Gehalt an Calcium-Ionen in der Basalzellschicht gering, während er im Stratum granulosum zunächst extrazellulär und dann auch intrazellulär steigt. Im Stratum superficiale sinkt er wiederum. Die Mechanismen, die diesem Gradienten zugrunde liegen, sind noch unbekannt.
Im Rahmen der Wundheilung spielt Calcium bereits in der Gerinnungsphase als Faktor IV eine wichtige Rolle. In der inflammatorischen Phase aktiviert es Phospholipasen sowie Proteinkinasen und ist in der Membranfunktion involviert. Über die Calcium-Funktionen in späteren Wundheilungsphasen ist wenig bekannt, aber sicherlich sind Calcium-Gradienten auch hier von Bedeutung (LANSDOWN 2002). Im klinischen Bereich wurden positive Erfahrungen mit Calcium-Alginaten als Wundauflagen gemacht (THOMAS 2000a, 2000b, 2000c).
2.2.5.4 Prostaglandin (PG) E2
PGE2 ist ein Entzündungsmediator. Es gehört zur Familie der Eicosanoide und ist somit Produkt der Cyclooxygenasen (COX). Offensichtlich ist PGE2 an der Regulation der Proliferation von Keratinozyten beteiligt. So ist der Spiegel in tumorös entarteten Keratinozyten sowohl in vitro als auch in vivo stark erhöht (ROLLAND et al. 1980, VANDERVEEN et al. 1986, THOMPSON et al. 2001). Eine erhöhte PGE2-Konzentration kann in vitro und in vivo zu einer Steigerung der Keratinozytenproliferation führen (LUPULESCU 1975, LOWE und STOUGHTON 1977, FÜRSTENBERGER und MARKS 1978, PENTLAND und NEEDLEMANN 1986, CONCONI et al. 1996, KONGER et al.
1998). Da in vitro nicht konfluent wachsende Keratinozyten sowie Keratinozyten eines mechanisch unterbrochenen Zellrasens vermehrt PGE2 produzieren (PENTLAND und NEEDLEMANN 1986, RYS-SIKORA et al. 2000), kann angenommen werden, dass PGE2 in nicht unerheblichem Maße am Wundheilungsprozess beteiligt ist. HUANG et al. (1991) zeigen, dass eine Stimulation der Mitogenese durch ATP in Fibroblasten u.a. abhängig ist von einer erhöhten Abgabe von Arachidonsäure und der damit einhergehenden PGE2-Synthese.
PGE2 bindet an spezifische Prostaglandin-Rezeptoren. Vier Rezeptoren sind bisher bei Säugetieren geklont worden. Sie werden EP1, EP2, EP3 und EP4 genannt und unterscheiden sich in ihren pharmakologischen Profilen und Signalwegen (COLEMANN 2000).
2.3 Adenosin, Purine und Pyrimidine
2.3.1 Natürliches VorkommenDas Nucleosid Adenosin entsteht aus der Verbindung der Purin-Base Adenin mit dem Zucker Ribose. Durch die Veresterung der 5’-OH-Gruppe der Zuckerkomponente des Adenosins mit Phosphat entsteht Adenosin-5’-Monophosphat (AMP). Bei der Verknüpfung des 5’-Phosphat- Restes über Säureanhydrid-Bindungen mit weiteren Phosphat-Resten entstehen Adenosin- Diphosphat (ADP) bzw. –Triphosphat (ATP). Uridin-Diphosphat (UDP) und –Triphosphat (UTP) entstehen analog aus der Pyrimidin-Base Uracil (KOOLMAN und RÖHM, 1994).
ATP ist der universelle Träger der Stoffwechselenergie im Organismus und verbindet Katabolismus und Anabolismus. Weiterhin haben ATP und die anderen Nucleotide in jeder Zelle eine Reihe weiterer Funktionen: als Baustein der RNA und DNA sowie als Enzym- Cofaktoren (LEHNINGER et al. 1994). HOLTON (1959) stellt beim Kaninchen fest, dass es nach der Stimulierung von sensorischen Nerven zu einem Anstieg der ATP-Konzentration im Perfusat der Ohr-Arterie kommt. Zu diesem Zeitpunkt ist noch unklar, von welchen Zellen das ATP stammt. Mittlerweile ist bekannt, dass diverse Zellen die Fähigkeit besitzen, Purine an den Extrazellulärraum abzugeben (GORDON 1986). INGERMAN et al. (1979) untersuchen in vitro die Plasma-Konzentration von ATP nach der Plättchen-Aktivierung durch Thrombin. Sie beträgt ca. 12 µmol/l. Thrombozyten speichern Adenosin-, Uridin- und Guanidin-Nucleotide in spezifischen Speicherorganellen. Der Anteil an Adenosin- Nucleotiden liegt bei den untersuchten Spezies (Mensch, Meerschweinchen, Kaninchen und Rind) jeweils über 80 % vom Gesamt-Nucleotidgehalt (GOETZ et al. 1971). BORN und KRATZER (1984) bestimmen mittels Luciferase-Assay die Konzentration von freiem ATP im Vollblut von Menschen, Ratten und Kaninchen. Zwei bis vier Sekunden nach der Arterienpunktion liegt sie beim Menschen bei 2 µmol/l und bei Ratte und Kaninchen bei 0,2 µmol/l. Nach drei bis fünf Minuten steigt die Konzentration im Blut aller Probanden auf 20 µmol/l. GONZALEZ-ALONSO et al. (2002) bestimmen mittels der gleichen Technik die ATP-Konzentration im Plasma, gewonnen aus Femoral-Arterien und -Venen von Menschen.
Sie beträgt bei Ruhe ca. 0,65 µmol/l und steigt unter körperlicher Anstrengung auf das Mehrfache an. Für Adenosin beträgt die Plasma-Konzentration 0,31 µmol/l (MILLS et al.
1976). SAIAG et al. (1995) weisen die Abgabe von UTP in den Extrazellulärraum nach. Sie zeigen, dass Endothelzellen bei mechanischer Stimulierung UTP sezernieren.
LAZAROWSKI et al. (1997) können dies für Astrocytoma-Zellen bestätigen.
2.3.2 Extrazellulärer Metabolismus von ATP und anderen Nucleotiden
Nucleotide werden extrazellulär durch Ectonucleotidasen über Hydrolyse-Reaktionen abgebaut, wobei Nucleoside und freie Phosphatgruppen freigesetzt werden. Diese können wiederum von Zellen aufgenommen und zur Nucleotidsynthese genutzt werden (PASTOR- ANGLADA et al. 1998).
Zu den momentan bekannten Ectonucleotidasen zählen die E-NTPDase-(Ecto-Nucleosid Triphosphat Diphosphohydrolase)-Familie, die E-NPP-(Ecto-Nucleotid Pyrophosphatase/
Phosphodiesterase)-Familie, basische Phosphatasen und Ecto-5’-Nucleotidasen. Sie sind im Organismus weit verbreitet und werden häufig koexprimiert. Üblicherweise sind sie membrangebunden, es existieren jedoch ebenfalls freie Isoformen, die Exonucleotidasen genannt werden. Für die maximale enzymatische Aktivität sind ein basisches Milieu sowie die Präsenz von divalenten Kationen wie Calcium- oder Magnesiumionen nötig (ZIMMERMANN 2000).
2.3.3 Purinerge Rezeptoren
Die Geschichte der Erforschung der Rolle der Purine als extrazelluläre Botenstoffe beginnt mit Untersuchungen über die Wirkung von Adenosin und AMP im Herz-Kreislauf-Geschehen sowie im Darm (DRURY und SZENT-GYÖRGYI 1929). Es folgen weitere Versuche am Herz-Kreislauf-System, aber auch an Thrombozyten (BORN 1962) und Mastzellen (COCKCROFT und GOMPERTS 1980). Im Laufe der Zeit wird festgestellt, dass Purine die unterschiedlichsten Zellen und Körperfunktionen beeinflussen (RALEVIC und BURNSTOCK 1998).
Den ersten konkreten Hinweis auf die Existenz spezifischer Purinrezeptoren liefern SATTIN und RALL (1970). Ihre Untersuchungen ergeben, dass die durch Adenosin bedingte cAMP- Anhäufung in Hirnzellen von Ratten durch Methylxanthine antagonisiert werden kann. 1978 schlägt BURNSTOCK eine Unterteilung der Purinrezeptoren in P1- und P2-Rezeptoren vor, wonach Adenosin der natürliche Ligand für P1- und ATP und ADP die natürlichen Liganden für P2-Rezeptoren sind. Diese Hauptunterteilung ist grundsätzlich erhalten geblieben.
Basierend auf neuen Erkenntnissen über die Spezifität sowie Molekularstruktur der verschiedenen Purinrezeptoren wurde eine weitere Unterteilung vorgenommen (ALEXANDER et al. 2004). So gehören zu der Familie der P1-Rezeptoren, auch Adenosin- Rezeptoren genannt, vier G-Protein-gekoppelte Rezeptoren: A1, A2A, A2B und A3. Die P2- Rezeptor-Familie wird unterteilt in die Ionen-Kanal-gekoppelten P2X und die G-Protein- gekoppelten P2Y-Rezeptoren.
2.3.3.1 G-Protein-gekoppelte Rezeptoren
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren bilden die größte Superfamilie an Proteinen im Organismus. Sie bestehen aus sieben transmembranären, α-helikalen Segmenten, die abwechselnd über extra- und intrazelluläre Schleifen verbunden sind. Das Stickstoff-Ende befindet sich extra-, das Carboxyende intrazellulär. Es sind sechs Subfamilien bekannt. Die Adenosin- und P2Y-Rezeptoren gehören der Subfamilie A (Rhodopsin-Rezeptor ähnliche G- Protein-gekoppelte Rezeptoren) an. Am G-Protein findet ein Guanin-Nukleotid-Austausch statt: die Aktivierung des Rezeptors bewirkt eine Strukturänderung in der α-Untereinheit des G-Proteins, welche zu einer Abgabe von GDP, gefolgt von einer GTP-Bindung, führt.
Daraufhin dissoziiert die GTP-gebundene Form der α-Untereinheit vom Rezeptor sowie vom stabilen βγ-Dimer. Sowohl die GTP-gebundene α-Untereinheit als auch das βγ-Dimer können verschiedene Signalwege wie die Stimulation oder Inhibition der Adenylat-Zyklase, Aktivierung von Phospholipasen, sowie Regulierung der Kalium- und Calcium-Kanal- Aktivität modulieren. Adenosin- und P2Y-Rezeptoren sind an verschiedene G-Proteine gekoppelt. Die meisten Rezeptoren sind an mehrere unterschiedliche G-Proteine (z.B. G0, Gi, Gs, ...) gekoppelt (GETHER 2000).
2.3.3.2 Adenosin-Rezeptoren
Aufgrund der Ergebnisse molekularer, biochemischer und pharmakologischer Studien kann heute eine Einteilung der Adenosin-Rezeptoren in vier Subtypen durchgeführt werden (Tabelle 1) (RALEVIC und BURNSTOCK 1998).
Tabelle 1: Übersicht Adenosin-Rezeptoren (FREDHOLM et al. 2000, KLOTZ 2000)
Rezeptor A1 A2A A2B A3
G-Protein- Kopplung
Gil/2/3
Go
Gs
Golf
G15/16
Gs
Gq/11
Gi2/3
Gq/11
Selektive Agonisten
z.B. CPA
(N6-Cyclopentyl- adenosin)
z.B. CGS21680 z.B. IB-MECA
(N6-(3- Iodobenzyl)- Adenosin-5’-N- Methyluronamid) Selektive
Antagonisten
z.B. DPCPX (8- Cyclopentyl-1,3- Dipropylxanthin)
z.B. ZM241385 z.B. Enprofyllin z.B. MRS 1067
Alle vier Adenosin-Rezeptoren konnten bislang bei Mensch, Ratte und Maus nachgewiesen werden. Die Proteine bestehen aus 317 bis 412 Aminosäuren, was einer Größe von ca. 36 bis 45 kDa entspricht. Die Rezeptoren besitzen Glykosylierungsstellen, wobei die Wirkung der Glykosylierung unbekannt ist (OLAH und STILES 1995).
Alle chemisch hergestellten Agonisten, ob spezifisch oder unspezifisch, basieren auf der Struktur des natürlichen Liganden Adenosin. Adenosin selbst ist aufgrund seiner schnellen Metabolisierung durch diverse Enzyme für pharmakologische Studien wenig geeignet. Um die Potenz oder Selektivität zu erhöhen, wird bei der Synthese von Agonisten das Molekül Adenosin an einer oder mehreren von drei möglichen Stellen substituiert: die 5’-Position der Ribose und die 2- sowie N6-Position des Purins.
Methylxanthine sind die Prototypen der Antagonisten für Adenosin-Rezeptoren. Andere Strukturen wie die Triazoloquinazoline, Triazolotriazine, Dihydropyridine und Adenin- Derivate bilden die Basis für Nicht-Xanthin-Antagonisten. Während für die Rezeptoren A1, A2A und A3 potente spezifische Agonisten, Antagonisten und Radioliganden synthetisiert werden konnten, fehlt für den Rezeptor A2B ein spezifischer Agonist (KLOTZ 2000).
Ein gemeinsames Merkmal der Adenosin-Rezeptoren ist die Kopplung an die Phospholipase C (PLC). Ihre Aktivierung führt zur Hydrolyse von Phosphatidylinositol-4,5-Diphosphat
(PIP2), wodurch Diacylglycerol (DAG) und Inositol-1, 4, 5-Triphosphat (IP3) entstehen. Dies bewirkt wiederum eine Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) sowie eine Erhöhung des intrazellulären Calcium-Spiegels (BERRIDGE 1993). Zusätzlich greifen die Adenosin- Rezeptoren in die Regulation der Adenylat-Cyclase ein. So bewirken die A1- und A3- Rezeptoren eine Inhibition, die A2A- und A2B-Rezeptoren dagegen eine Stimulation der Adenylatcyclase. Auf diese Weise beeinflussen sie den zellulären Gehalt an cyclischem Adenosin-Monophosphat (cAMP) (FREDHOLM et al. 2000).
2.3.3.3 P2Y-Rezeptoren
P2Y-Rezeptoren sind Proteine, die aus 308 bis 377 Aminosäuren bestehen und je nach Glykosylierung eine Molekülmasse von 41 bis 53 kDa besitzen.
P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2Y11, P2Y12, P2Y13 sowie P2Y14 sind bei Säugetieren geklonte Rezeptoren für Nukleotide. Für manche der Rezeptoren, wie bspw. p2y5, sind keine Agonisten bekannt, sie werden daher „orphan receptors“ genannt. Andere Subtypen (z.B.
chick p2y3, Xenopus p2y8) sind wiederum bei Säugetieren nicht geklont worden (KING et al.
2000, ZHANG et al. 2002; ABBRACHIO et al. 2003).
Die natürlichen Agonisten der P2Y-Rezeptoren sind die Purine ATP und ADP sowie die Pyrimidine UTP und UDP. Wie bei den Adenosin-Rezeptoren auch kommt es bei der Ligandenbindung an einen P2Y-Rezeptor über die Kopplung an ein G-Protein zur Aktivierung der PLC, welche zur IP3-Bildung und Calcium-Mobilisierung aus intrazellulären Speichern führt. Für manche P2Y-Rezeptoren ist auch eine Kopplung an die Adenylat- Cyclase beschrieben (RALEVIC und BURNSTOCK 1998). Zusätzlich aktivieren P2Y2- Agonisten über die PKC MAP-Kinasen (HUWILER und PFEILSCHIFTER 1994, GRAHAM et al. 1996, GAO et al. 1999). Generell ist die Potenz der Agonisten und Antagonisten abhängig von der Spezies und von der Rezeptordichte des jeweiligen Gewebes. In Tabelle 2 sind die wichtigsten Charakteristika der P2Y-Rezeptoren aufgeführt.
Tabelle 2: Übersicht P2Y-Rezeptoren (KING et al. 2000, NICHOLAS 2001, ZHANG et al.
2002, ABBRACCHIO et al. 2003)
Rezeptor P2Y1 P2Y2 P2Y4 P2Y6 P2Y11 P2Y12 P2Y13 P2Y14
Weitere oder ehemalige Namen
P2Y P2T
P2U Uridin Nucleotid Rezeptor, Pyrimidino- ceptor
Uridin Nucleotid Rezeptor, Pyrimidino- ceptor
P2Y P2TAC UDP- Glukose- Rezeptor
Natürliche Agonisten
ADP (ATP)
UTP ATP
UTP (ATP)
UDP UTP
ATP ADP ADP ATP
UDP- Glukose Weitere
Agonisten
2MeSATP 2MeSADP
2MeSATP 2MeSATP 2MeSADP 2MeSADP 2MeSATP
UDP- Galaktose Spezifische
Agonisten
ARC- 67085MX Antagonisten Suramin
PPADS (Pyridoxal- phosphat- 6-
Azophenyl- 2’-4’-Di- sulphonat)
Suramin PPADS Reactive- Blue 2
Suramin PPADS Reactive- Blue 2
Suramin Reactive- Blue 2
2MeSAMP Clopidogrel
Spezifische Antagonisten
MRS2279
Kopplung Gq/G11 Gq/G11
Gi?
Gq/G11
Gi?
Gq/G11 Gq/G11
Gs
Gαi Gi/o
2.3.3.4 P2X-Rezeptoren
P2X-Rezeptoren sind vor allem in reizleitenden Geweben wie Nervenzellen und Zellen der glatten Muskulatur vertreten. Sie sind jedoch auch in Makrophagen (SURPRENANT et al.
1996) oder Epithelien (GRÖSCHEL-STEWART et al. 1999) nachweisbar. Es handelt sich um membrangebundene Ionenkanäle, die vom natürlichen Liganden ATP aktiviert werden (LAMBRECHT 2000). Mehrere Untereinheiten bilden eine homomere oder heteromere Pore.
Die genaue Anzahl der Proteine, die eine Rezeptoreinheit bilden, ist bisher nicht bekannt, es werden allerdings trimere und/oder hexamere Strukturen vermutet (KAKH et al. 2000).
Sieben verschiedene Proteine (P2X1-7) konnten bisher geklont werden (RALEVIC und BURNSTOCK 1998).
Die Proteine bestehen aus 379 bis 595 Aminosäuren mit zwei hydrophoben Transmembran- Domänen und einer extrazellulären, cysteinreichen, hydrophilen Schleife. Sie vermitteln im Gegensatz zu den G-Protein gekoppelten Purinrezeptoren eine schnelle (innerhalb von 10 ms) und nicht selektive Permeabilität für Kationen (Na+, K+ und Ca2+), woraus eine Depolarisierung der Zelle folgt (KHAKH et al. 2001).
Der P2X7-Rezeptor nimmt eine Sonderstellung ein, indem er nur homomere Ionenkanäle formt (TORRES et al. 1999). Nach einer kurzen Stimulierung durch ATP oder andere Agonisten kommt es zunächst zu einem Kationeneinstrom, wie er auch bei den anderen P2X- Rezeptoren zu beobachten ist. Bei wiederholten Rezeptorstimulierungen kommt es allerdings zur Bildung einer nicht-selektiven Pore, die auch für größere Moleküle durchlässig ist, wodurch es zum Tod der Zelle kommt (SURPRENANT et al. 1996). Darüber hinaus stellen KIM et al. (2001) fest, dass die Aktivierung des Rezeptors zu seiner Dephosphorylierung führt, und dass diverse Proteine mit ihm interagieren. Die Autoren schließen aus ihren Ergebnissen, dass diese Proteine an den Zytoskelett-Veränderungen beteiligt sind, die zum Zelltod führen. An Makrophagen führt eine Stimulierung des P2X7-Rezeptors zu einer Freisetzung von IL-1β (FERRARI et al. 1997). SOLLE et al. (2001) zeigen, dass der P2X7- Rezeptor an der Externalisierung von pro-IL-1β und dessen Aktivierung durch die Caspase-1 beteiligt ist. In Tabelle 3 sind die drei Gruppen der P2X-Rezeptoren dargestellt.
Tabelle 3: Übersicht P2X-Rezeptoren (KHAKH et al. 2000):
Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3
P2X1
P2X3
P2X2
P2X5
P2X4
P2X6
P2X7
αβmeATP-sensitiv nicht αβmeATP-sensitiv nicht αβmeATP-sensitiv schnell desensitiviert (< 1 s) langsam desensitiviert (> 1 s) langsam oder nicht
desensitiviert
Suramin-sensitiv Suramin-sensitiv nicht Suramin-sensitiv
Da bisher nur wenige selektiv wirkende Agonisten und Antagonisten entwickelt wurden, bleibt es schwierig, einen einzelnen P2X-Rezeptor-Typen zu stimulieren (LAMBRECHT 2000).
2.3.4 Purinerge Rezeptoren in der Haut
Erste Hinweise auf die Präsenz purinerger Rezeptoren in der Epidermis geben intrazelluläre Calcium-Messungen in der Zellkultur. So führt die Zugabe diverser Nucleotide zu einer kurzfristigen Erhöhung des intrazellulären Calcium-Spiegels in primären humanen (PILLAI und BIKLE 1992, DIXON et al. 1999) und caninen Keratinozyten (SUTER et al. 1991) sowie in der Keratinozyten-Linie HaCaT (LEE et al. 2001, BURELL et al. 2003).
Zahlreiche Proliferationsversuche erhärten die Hypothese, dass über purinerge Rezeptoren in vitro das Wachstum von Zellen (HUANG et al. 1989, WANG et al. 1991, RATHBONE et al.
1992a, YUH und SHEFFIELD 1998, THELLUNG et al. 1999) und insbesondere von Keratinozyten (PILLAI und BIKLE 1992, DIXON et al. 1999, LEE et al. 2001, BURELL et al. 2003) beeinflusst wird. Aufgrund der Beobachtungen, dass ATP und UTP in ihrem proliferativen Effekt um einen Rezeptor konkurrieren (SUTER et al. 1991, PILLAI und BIKLE 1992), wird gemutmaßt, dass auch über den P2Y2-Rezeptor das Wachstum der Keratinozyten reguliert wird (DIXON et al. 1999). An Fibroblasten scheint dagegen der P2Y1-Rezeptor wichtiger zu sein. So wirken hier die Agonisten ATP und ADP mitogen, UTP dagegen nicht (HUANG et al. 1989). Zusätzlich stellen RATHBONE et al. (1992b) fest, dass
ein weiterer Purinrezeptor-Typ bei der Regulation des Zellwachstums involviert ist. Anhand weiterer Proliferationsversuche können sie belegen, dass ein Adenosin-Rezeptor des Typs A2
die Wirkung mitogener Effekte mediiert. Dies können YUH und SHEFFIELD (1998) an epithelialen Zellen und THELLUNG et al. (1999) an Fibroblasten bestätigen. Endotheliale Zellen werden über die Rezeptoren A2A, A2B, P2Y1 und P2Y2 zu vermehrtem Wachstum angeregt (BURNSTOCK 2002).
Allerdings wurden auch entgegengesetzte Feststellungen gemacht. So wird berichtet, dass Adenosin und ATP das Wachstum primärer humaner Keratinozyten hemmen. So sinkt der mitotische Index um mehr als die Hälfte, wenn dem Zellkulturmedium hohe Konzentrationen (1 mmol/l) an Adenosin, ATP oder ADP zugesetzt werden (HARPER et al. 1974, COOK et al. 1995). Vermutlich werden bei höheren Konzentrationen an Adenosin und ATP andere, weniger empfindliche Rezeptoren angesprochen. Versuche mit dem P2X7-Agonisten BzATP bestätigen dies an Keratinozyten. Der gleiche Effekt wird mit dem P2X5-Agonisten ATPγS erzielt (GREIG et al. 2003c). WEN und KNOWLES (2003) zeigen, dass Adenosin über den A3-Rezeptor zur Apoptose humaner Hepatom-Zellen führt.
DIXON et al. (1999) berichten, dass primäre humane Keratinozyten den P2Y2-Rezeptor auf mRNA-Ebene exprimieren. YUH und SHEFFIELD schließen aus pharmakologischen Wirkungen von Adenosin an mammären Epithelialzellen auf die Existenz eines Adenosin- Rezeptors an diesen Zellen (YUH und SHEFFIELD 1998). Zur Zeit der Durchführung der in dieser Arbeit beschriebenen Ergebnisse erscheinen Ergebnisse zu Untersuchungen über die mRNA-Expression von P2Y-Rezeptoren in humanen Keratinozyten. Normale humane Keratinozyten und die Zelllinie HaCaT exprimieren die Rezeptoren P2Y1, P2Y2, P2Y4 und P2Y6 (BURELL et al. 2003). Vor kurzem wurden Ergebnisse umfangreicher immunhistochemischer Studien veröffentlicht. So können die Rezeptoren P2Y1, P2Y2 und P2X5 im Stratum basale, der P2X7-Rezeptor dagegen im Stratum corneum nachgewiesen werden (GREIG et al. 2003c). Der P2Y4-Rezeptor wird in Basalzellkarzinomen und in schwacher Ausprägung in der Epidermis festgestellt (GREIG et al. 2003b). In einem Wundmodell bei der Ratte kann eine Erhöhung der P2Y1- und eine Verminderung der P2Y2- Rezeptordichte im regenerierenden Epithel gezeigt werden. P2X7-Rezeptoren sind im Bereich der Wunde nicht vorhanden (GREIG et al. 2003 a).
MONTESINOS et al. (1997) haben das mRNA-Expressionsprofil für Adenosin-Rezeptoren in fibroblastischen (CCD-25sk) und endothelialen (HUVEC) Zellen bestimmt. Während die
Endothelzellen alle vier Rezeptoren exprimieren, ist in den Fibroblasten der A1-Rezeptor nicht vorhanden. Der lokal angewandte spezifische A2A-Agonist CGS-21680 (4-[{N-Ethyl-5’- Carbamoadenosyl-2-yl}Aminoethyl]phenylpropionisäure) beschleunigt die Wundheilung bei Mäusen und diabetischen Ratten. Dieser Effekt wird durch den spezifischen A2A- Antagonisten DMPX (3,7-Dimethyl-1-Propargylxanthin) aufgehoben. Histologische Untersuchungen ergeben, dass eine Behandlung mit CGS-21680 die Fibroblasten-Infiltration, die Dichte der Matrix, die Re-Epithelisierung und die Angiogenese sowie Vaskulogenese erhöht. Das inflammatorische Infiltrat bleibt dagegen unverändert (MONTESINOS et al.
1997, 2004). In A2A-Rezeptor-Knockout-Mäusen wird die Wundheilung durch CGS-21680 nicht beschleunigt. Die Angiogenese ist bei den Knockout-Tieren verzögert (MONTESINOS et al. 2002). Neuesten Datums ist die Erkenntnis, dass UTP über eine Aktivierung der MAPK- Kaskade die Heilung von Hornhautulcera fördert (PINTOR et al. 2004).
2.3.5 Verwendete purinerge Agonisten und Antagonisten
Folgende Substanzen wurden in den in dieser Arbeit beschriebenen Untersuchungen verwendet: ATP, UTP, UDP, 2MeSATP, Suramin, NECA und Enprofyllin. Die chemischen Strukturen dieser Substanzen sind in den Abbildungen 2-8 dargestellt.
ATP (Abb. 2) bindet an alle sieben P2X-Rezeptoren, aber nur an einige P2Y-Rezeptoren, wobei die Wirkung unterschiedlich ist. So soll ATP laut LEON et al. (1997) an menschlichen P2Y1-Rezeptoren antagonistisch wirken. PALMER et al. (1998) behaupten dagegen, ATP sei ein partieller Agonist bei hoher und ein Antagonist bei geringer Rezeptor-Dichte. Am P2Y2- Rezeptor wirkt ATP eindeutig agonistisch (LUSTIG et al. 1993). Am menschlichen P2Y4- Rezeptor soll ATP antagonistisch, am P2Y4-Rezeptor der Ratte dagegen agonistisch wirken (KENNEDY et al. 2000). Am P2Y6-Rezeptor wirkt ATP sehr schwach agonistisch (NICHOLAS et al. 1996), an den P2Y11- und P2Y13-Rezeptoren agonistisch (COMMUNI et al. 1997; ZHANG et al. 2002) und am P2Y12-Rezeptor zeigt ATP keine Wirkung (ABBRACCHIO et al. 2003). Generell wird davon ausgegangen, dass UTP (Abb. 3) an P2X- Rezeptoren nicht bindet (RALEVIC und BURNSTOCK 1998), auch wenn z.T. gegenteilige Ergebnisse vorliegen (VON KÜGELGEN und STARKE 1990, CHEN et al. 1995). UTP wirkt an den P2Y2-, P2Y4 und P2Y6-Rezeptoren agonistisch. Es bindet nicht an die P2Y1- und P2Y11-Rezeptoren (KING et al. 2000). Für UDP (Abb. 4) ist eine agonistische Wirkung nur
am P2Y6-Rezeptor bekannt (RALEVIC und BURNSTOCK 1998). Durch die Methylierung von ATP entsteht mit 2MeSATP (Abb. 5) eine stabilere Form, die ein starker und selektiver Agonist der Rezeptoren P2Y1 und P2Y11 ist. 2MeSATP bindet jedoch auch an die Mehrzahl der P2X-Rezeptoren (RALEVIC und BURNSTOCK 1998). Suramin (8-(3-Benzamido-4- Methylbenzamido)-Naftalen-1,3,5-Trisulfonsäure) (Abb. 6) ist ein unspezifischer P2- Antagonist. Allerdings bindet es nicht an alle P2-Rezeptoren, so beispielsweise nicht oder nur schlecht an die P2X4-, P2X6-, P2Y4- und P2Y6-Rezeptoren. Zusätzlich inhibiert es die Aktivität von Ecto-Nucleotidasen, die Bindung von Wachstumsfaktoren, sowie die GTPase- Aktivität einiger G-Proteine und DNA- und RNA-Polymerasen (RALEVIC und BURNSTOCK 1998). 5’-N-Ethylcarboxamidoadenosin (NECA) (Abb. 7), auch Adenosin-5’- N-Ethyluronamid genannt, ist ein unspezifischer Adenosin-Rezeptoren-Agonist und gemessen an der cAMP-Bildung einer der wirksamsten Agonisten am A2B-Rezeptor (BRACKETT und DALY 1994, KLOTZ et al. 1998). Enprofyllin (3-(n-Propylyl)-Xanthin) (Abb. 8) blockiert spezifisch den A2B-Rezeptor und besitzt wie andere Methylxanthine antiasthmatische Eigenschaften (FEOKTISTOV und BIAGGIONI 1996).
O
OH OH CH2 P O
O
O- P
O O
O- P
O
O- O-
N N N N
NH2
O
OH OH CH2 P O
O
O- P
O O
O- P
O
O- O-
N N
O
O H
Abb. 2: Strukturformel von ATP Abb. 3: Strukturformel von UTP
O
OH OH CH2 P O
O
O- P
O
O- O-
N N
O
O H
O
OH OH CH2 P O
O
O- P
O O
O- P
O
O- O-
N N N N
NH2
H2C S
Abb. 4: Strukturformel von UDP Abb. 5: Strukturformel von 2MeSATP
SO3-
-O3S
SO3- NH C O
CH3 CNH
O C NH
NH SO3-
O NH C CH3
O C NH SO3- SO3-
O
Abb. 6: Strukturformel von Suramin
O
OH H5C2HN
O
OH N N N N
NH2
N N N N
O
O
CH2 H
H H
CH2 CH3
Abb. 7: Strukturformel von NECA Abb. 8: Strukturformel von Enprofyllin
3 Material und Methoden
3.1 Fragestellung und Versuchsübersicht
In der vorliegenden Arbeit sollte die Rolle purinerger Agonisten und Antagonisten im Wundheilungsgeschehen an Mäusen untersucht werden. Dabei wurde ein Schwerpunkt auf metabotropische Purinrezeptoren gelegt. Zunächst wurde das Rezeptor-Expressionsprofil in primären Epidermalzellen und der Keratinozytenlinie MSC-P5 untersucht. Anschließend sollte in In-vitro-Untersuchungen ermittelt werden, welchen Einfluss purinerge Agonisten und Antagonisten auf das Keratinozytenwachstum ausüben und welche Rezeptoren an diesem Geschehen beteiligt sind. Zudem sollte festgestellt werden, in welchem Maße die Bildung von PGE2 an der Beeinflussung der Proliferation der Keratinozyten involviert ist.
Im zweiten Teil der Arbeit schlossen sich In-vivo-Untersuchungen an. Ein Modell der verzögerten Wundheilung sollte es ermöglichen, den Einfluss purinerger Substanzen auf das Keratinozytenwachstum am Gesamtorganismus zu untersuchen. Dazu wurde Mäusen, die mit dem Glucocorticoid Dexamethason vorbehandelt wurden, eine Wunde gesetzt. Die Wunden wurden mit purinergen Agonisten und Antagonisten behandelt. Die Wundflächen konnten mit denen der Kontrolltiere verglichen werden. Tabelle 4 gibt einen Überblick über die durchgeführten Versuche.
Tab. 4: Versuchsübersicht.
Versuchsansatz Art der Versuche Methode I
Expression von Purinrezeptoren in murinen Epidermalzellen und der murinen
Keratinozytenlinie MSC-P5
RT-PCR
II Beeinflussung der Zellproliferation durch
purinerge Agonisten und Antagonisten BrdU-Assay
III Darstellung der Rezeptoren P2Y2 und A2B Immunhistochemie IV Beeinflussung der Zellvitalität durch ATP MTT
V Beeinflussung der PGE2-Bildung ELISA
VI Expression von PGE2-Rezeptoren RT-PCR
VII Beeinflussung der Zellproliferation durch PGE2 BrdU-Assay
VIII Expression von COX1 und COX2 RT-PCR
IX Expression von Keratinen RT-PCR
X Beeinflussung der Wundheilung durch purinerge Agonisten und Antagonisten
Planimetrie, Histologie, BrdU-Färbung
3.2 Reagenzien und Geräte
3.2.1 Reagenzien für die Zellkultur3.2.1.1 Zellkulturmedien
Zellkulturmedium RPMI 1640 Biochrom, Berlin
Als Basismedium wurde für die Kultur der MSC-P5-Zellen RPMI 1640 - Kulturmedium verwendet. Dies setzt sich folgendermaßen zusammen (Angaben in mg/l):
NaCl 6000 L-Methionin 15 KCl 400 L-Phenylalanin 15 MgSO4 x 7H2O 100 L-Prolin 20 NaH2PO x 2H2O 1512 L-Serin 30 Ca(NO3)2 x 4H2O 100 L-Threonin 20 D-Glucose 2000 L-Tryptophan 5 Phenolrot 5 L-Tyrosin 20 NaHCO3 2000 L-Valin 20 L-Arginin 200 Glutathion 1 L-Asparagin 50 Biotin 0,2 L-Asparaginsäure 20 Vitamin B12 0,005 L-Cystein 50 D-Ca-Pantothenat 0,25 L-Glutamin 300 Cholinchlorid 3 L-Glutaminsäure 20 Folsäure 1 Glycin 10 Myo-Inositol 35 L-Histidin 15 Nicotinamid 1 L-Hydroxyprolin 20 p-Aminobenzoesäure 1 L-Isoleucin 50 Pyridoxal-HCl 1 L-Leucin 50 Riboflavin 0,2 L-Lysin-HCl 40 Thiamin-HCl 1
Zellkulturmedium William’s E Medium Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Als Basismedium wurde für die Kultur der primären murinen Keratinozyten William’s E - Kulturmedium verwendet. Dieses setzt sich folgendermaßen zusammen (Angaben in mg/l):
NaCl 6800 L-Lysin-HCl 87,5 KCl 400 L-Methionin 15 MgSO4 x 7H2O 158,3 L-Phenylalanin 25 NaH2PO x 2H2O 200 L-Prolin 30 CaCl2 x 2H2O 264,9 L-Serin 10 Natriumpyruvat 25 L-Threonin 40 D-Glucose 2000 L-Tryptophan 10 Phenolrot 10 L-Tyrosin 35 NaHCO3 2200 L-Valin 50 CuSO4 x 5H2O 0.00009 Glutathion 0,05 Fe(NO3) x 9H2O 0 L-Ascorbinsäure 2 MnCl2 x 4H2O 0,0001 Biotin 0,5 ZnSO4 x 7H2O 0,0002 Calciferol 1
D-Ca-Pantothenat 1
L-Alanin 90 Cholinchlorid 1,5 L-Arginin-HCl 60,5 Folsäure 1 L-Asparagin x H2O 20 Myo-Inositol 2 L-Asparaginsäure 30 Menadion x NaHSO3 x 3H2O 0,01 L-Cystein 40 Nicotinamid 1 L-Cystin 20 Pyridoxal-HCl 1 L-Glutamin 292 Riboflavin 0,1 L-Glutaminsäure 50 Thiamin-HCl 1 Glycin 50 DL-α-Tocopherolphosphat x Na2 0,01 L-Histidin-HCl x H2O 20,3 Vitamin A-Acetat 0,1 L-Isoleucin 50 Vitamin B12 0,2 L-Leucin 75 Methyllinolat 0,03
3.2.1.2 Substanzen
Fetales Kälberserum Biochrom, Berlin
EDTA (Versen) 1% Biochrom, Berlin
Trypsin/EDTA (0,05%/0,02%) Biochrom, Berlin
Trypsin (Trockensubstanz) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
L-Glutamine Sigma-Aldrich, Taufkirchen
rh EGF Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Kollagen (Rat Tail, Typ VII) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
PVP-Jod Braunol® Braun, Melsungen
Amphotericin B Biochrom, Berlin
Bacitracin Biochrom, Berlin
Gentamicin Biochrom, Berlin
Neomycin Biochrom, Berlin
Penicillin Biochrom, Berlin
Streptomycin Biochrom, Berlin
PGE2 Sigma-Aldrich, Taufkirchen
ATP Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Enprofyllin Sigma-Aldrich, Taufkirchen
2MeSATP Sigma-Aldrich, Taufkirchen
NECA Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Suramin Sigma-Aldrich, Taufkirchen
UDP Sigma-Aldrich, Taufkirchen
UTP Sigma-Aldrich, Taufkirchen
3.2.1.3 Bestimmung der Zellzahl
Trypanblau Merck, Darmstadt
3.2.1.4 Bestimmung der Zellvitalität
Celltiter 96®
Aqueous One Solution Cell Proliferation Promega, Mannheim
3.2.1.5 Bestimmung der Zellproliferation (BrdU-Test)
Cell Proliferation ELISA System, Version 2 Amersham, Freiburg
3.2.1.6 Prostaglandinmessung
PGE2-Immunoassay R&D Systems, Minneapolis, USA
3.2.2 Reagenzien für die RT-PCR
3.2.2.1 Probenaufbereitung
peqGold TRIFASTTM Peqlab, Erlangen
peqGold OptipureTM Peqlab, Erlangen
Chloroform (+ 0,75% Ethanol) Merck, Darmstadt 2-Propanol (Isopropanol) Merck, Darmstadt
Ethanol Merck, Darmstadt
Laurylsulfat (SDS) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Natriumacetat Merck, Darmstadt
DEPC (Diethylpyrocarbonat) ROTH, Karlsruhe
Guanidinhydrochlorid Sigma-Aldrich, Taufkirchen
RNAse-free DNAse Qiagen, Hilden
10x RQ1 Reaction Buffer Qiagen, Hilden
3.2.2.2 RT-PCR
SuperscriptTM One-Step RT-PCR Invitrogen, Karlsruhe with PlatinumTM Taq
RNase-Inhibitor Roche Applied Biosystems, Mannheim
Agarose Life Technologies, Paisley, Schottland
Ethidiumbromid ROTH, Karlsruhe
Ficoll Sigma-Aldrich, Taufkirchen
3.2.3 Reagenzien für die Histologie und Immunhistochemie
Paraformaldehyd (reinst) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Ethanol Merck, Darmstadt
Methanol Merck, Darmstadt
Xylol Applichem, Darmstadt
Entellan Merck, Darmstadt
Primärantikörper Kaninchen Anti-A2B Rezeptor Chemicon, Temecula/USA Primärantikörper Kaninchen Anti-P2Y2 Rezeptor Chemicon, Temecula/USA Sekundärantikörper Alexa FluorTM 488 MoBiTec, Göttingen Ziege Anti-Kaninchen IgG
Primärantikörper Maus-Anti-BrdU Roche, Indianapolis/USA Biotinilierter Kaninchen Anti-Maus Antikörper DakoCytomation, Hamburg Streptavidin, HRP-konjugiert DakoCytomation, Hamburg
Ziegenserum DakoCytomation, Hamburg
Kaninchenserum DakoCytomation, Hamburg
5-Brom-2’-Deoxyuridin Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Diaminobenzidin Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Triton X-100 Serva, Heidelberg
Paraffin Histoplast® Serva, Heidelberg
Formamid Fluka, Buchs/Schweiz
Salzsäure Merck, Darmstadt
Hämalaun Merck, Darmstadt
Eosin Merck, Darmstadt
Borsäure Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Bovines Serumalbumin Sigma-Aldrich, Taufkirchen Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan Merck, Darmstadt
Ammoniumaluminiumsulfat Fluka, Buchs/Schweiz
Ammoniumnickelsulfat Fluka, Buchs/Schweiz
Natriumcitrat Merck, Darmstadt
Natriumchlorid Merck, Darmstadt
3.2.4 Reagenzien für die In-vivo-Versuche
Dexa 8 mg inject Jenapharm, Jena
(Dexamethasondihydrogenphosphat-Dinatrium)
Isotonische Kochsalzlösung Fresenius, Bad Homburg Enthaarungscreme Veet Reckitt Benckiser, Mannheim
Basisgel P & M Cosmetics, Telgte
3.2.5 Lösungen PBS (0,01 mol/l)
NaCl 8 g/l Merck, Darmstadt
KCl 0,2 g/L Merck, Darmstadt
Na2HPO4 . 2H2O 1,44 g/l Merck, Darmstadt
KH2PO4 0,2 g/l Merck, Darmstadt
TBE-Puffer (10x)
1 mol/l Tris, 0,9 mol/l Borsäure und 0,01 mol/l EDTA wurden in destilliertem Wasser gemischt.
TBS
0,9 %iger NaCl-Lösung wurde 1 mol/l Tris zugefügt und auf einen pH-Wert von 7,6 eingestellt.
3.2.6 Kunststoffmaterial
25 cm² Kulturflasche Greiner, Frickenhausen 6-well Kulturplatte Greiner, Frickenhausen 96-well Kulturplatte Greiner, Frickenhausen
3.2.7 Geräte für die Versuche an der Zellkultur
Trockenschrank UM 100-800 Memmert, Schwabach CO2-Inkubator Nuaire NU 4500E Zapf Instruments, Sarstedt Mikroskop Zeiss axiovert 25 Omnilab, Geerden
Kühlzentrifuge Eppendorf 5804 R Eppendorf, Hamburg
Sterilbank Dynatech Laboratories, Denkendorf
Sieb 100 mesh Sigma-Aldrich, Taufkirchen
3.2.8 Geräte für die Analytik
MRX Microplate-Reader Dynatech Laboratories, Denkendorf Kühlzentrifuge Eppendorf 5403 Eppendorf, Hamburg
Tischzentrifuge Eppendorf 5415 L Eppendorf, Hamburg Rundschüttler Reax 2000 Heidolph, Kehlheim
3.2.9 Geräte für die RT-PCR
Thermocycler Personal Cycler Biometra, Göttingen Agarosegelelektrophorese:
Stromversorgung PS304 Gibco BRL, Karlsruhe Elektrophoresekammer Agagel Mini Biometra, Göttingen UV-Lampe Transilluminator TI1 Biometra, Göttingen
3.2.10 Geräte für In-vivo-Versuche, Histologie und Immunhistochemie
Biopsy Punch Stiefel Laboratorium GmbH,
Offenbach am Main
Objektträger ROTH, Karlsruhe
Adhäsionsobjektträger Superior, Marienfeld
Rotationsmikrotom Jung, Nussloch
Cryostatmikrotom HM560M MIKROM, Walldorf
Axioskop Zeiss, Oberkochen
Axiocam Zeiss, Oberkochen
Bildbearbeitung KS 400 3.0 Kontron Systems, Eching/München
3.3 Methoden
3.3.1 Zellkultur3.3.1.1 Kultivierung der murinen Keratinozytenlinie MSC-P5
MSC-P5 (Cell line Service, Heidelberg) ist eine Linie von Keratinozyten, die durch Transfektion mit dem Sarcoma Virus zu Tumorzellen transformiert wurden (FUSENIG und WORST 1975). In der Abbildung 9 sind MSC-P5-Zellen drei Tage nach Aussaat zu sehen.
Abb. 9: Morphologie von MSC-P5-Zellen, 72 Stunden nach Aussaat. Vergrößerung 200-fach, Phasenkontrast.
Die Kultivierung der Zellen erfolgte in 25 cm²-Flaschen im Brutschrank bei 37°C und 5%
CO2. Ein Umsetzen der Zellen erfolgte frühestens wenn der Kulturflaschenboden konfluent
