Methoden .1 Zellkultur

3.3.1.1 Kultivierung der murinen Keratinozytenlinie MSC-P5

MSC-P5 (Cell line Service, Heidelberg) ist eine Linie von Keratinozyten, die durch Transfektion mit dem Sarcoma Virus zu Tumorzellen transformiert wurden (FUSENIG und WORST 1975). In der Abbildung 9 sind MSC-P5-Zellen drei Tage nach Aussaat zu sehen.

Abb. 9: Morphologie von MSC-P5-Zellen, 72 Stunden nach Aussaat. Vergrößerung 200-fach, Phasenkontrast.

Die Kultivierung der Zellen erfolgte in 25 cm²-Flaschen im Brutschrank bei 37°C und 5%

CO2. Ein Umsetzen der Zellen erfolgte frühestens wenn der Kulturflaschenboden konfluent

bewachsen war und spätestens eine Woche nach dem Aussäen. Hierfür wurden das alte Medium abgesaugt und die Zellen mit 2 ml EDTA-Lösung je Kulturflasche eine Minute lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Entfernen der Lösung wurden die Zellen zehn Minuten lang mit 1,5 ml Trypsin-Lösung im Brutschrank inkubiert. Nach der Überführung der Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen wurde für 10 Minuten bei 4°C und 1000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und das Zellpellet in 5 ml RPMI 1640-Medium (10% FKS, 100 I.E./ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin) resuspendiert. Bei der Routineumsetzung wurden weitere 15 ml Medium hinzugefügt und die Zellsuspension auf 4 Kulturflaschen verteilt. Der Mediumwechsel erfolgte drei Stunden nach der Aussaat.

3.3.1.2 Aussäen der Mikrotiter-Kulturplatten

Wie bei dem Umsetzen wurden die abgelösten Zellen zentrifugiert und in 5 ml Medium resuspendiert. Diese Zellsuspension wurde in ein Becherglas überführt und mittels eines Magnetrührers homogen gehalten. 50 µl der Zellsuspension wurden in 100 µl Trypanblaulösung (40 mg Trypanblau in 10 ml aq. dest. gelöst) überführt. Ein Aliquot dieser Mischung wurde auf eine Neubauer-Zählkammer gegeben. Die Bestimmung der Zellzahl in den vier Quadranten erfolgte unter dem Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung. Durch Trypanblau ist eine Unterscheidung zwischen vitalen und geschädigten bzw. toten Zellen möglich. Der Farbstoff wird von allen Zellen aufgenommen, jedoch nur von den vitalen Zellen wieder ausgeschieden. Bei toten und geschädigten Zellen färben sich das Zytoplasma und der Kern blau. Ein Quadrant enthält 0,1 µl Zellsuspension. Durch Bildung des Mittelwertes aus den vier Quadranten, Multiplizieren mit dem Faktor 3 für die Trypanblauverdünnung und dem Faktor 10.000 ergibt sich die Zellzahl/ml. Nach der Bestimmung der Gesamtzellzahl wurde die Zellsuspension auf die erwünschte Zelldichte eingestellt. In den 96-well-Kulturplatten wurden 100 µl Zellsuspension je Vertiefung ausgesät.

3.3.1.3 Gewinnung von primären Keratinozyten

Es wurden Primärkulturen aus der Schwanzepidermis vier verschiedener Mausstämme angelegt. Die Mäuse wurden bei Charles River (Sulzfeld) bezogen. Die genauen Bezeichnungen der Mausstämme lauten: Crl:NMRI, BALB/cAnNCrl, C57BL/6NCrl und DBA/2NCrl.

Nach dem Töten der Mäuse durch zervikale Dislokation wurde die Schwanzhaut abpräpariert und fünfzehn Minuten in einer eisgekühlten PVP-Jod/PBS-Lösung (1:1) desinfiziert. In drei Schritten à zehn Minuten wurden die Hautproben in eisgekühltem PBS gewaschen. Nach einer fünfstündigen Inkubation in einer 0,5%igen Trypsin-Lösung bei 4°C wurde die Epidermis von der Dermis gelöst und kleingeschnitten. Nach zehnminütigem Rühren in William’s E Medium wurden die Zellen durch ein Sieb separiert und anschließend zentrifugiert (10 min, 150 x g). Nach dem Verwerfen des Überstandes wurde das Pellet in 5 ml William’s E Medium suspendiert und in eine mit Kollagen beschichtete Kulturflasche überführt. Dem William’s E Medium wurden 200 mmol/l L Glutamine, 1 mg/ml Neomycin, 50 I.E./ml Bacitracin, 10 mg/ml Gentamicin, 250 µg/ml Amphotericin und 10 ng/ml rekombinantes humanes EGF zugesetzt. Nach viertägiger Kultur wurden die Primärzellen in Trifast^ gelöst und für die RNA-Isolierung verwendet.

3.3.1.4 Bestimmung der Zellvitalität mittels MTT-Test

Die Überprüfung der Zellvitalität erfolgte mit dem Cell Titer 96^® Aqueous One Solution Cell Proliferation-Assay. Die in dem Test verwendeten Tetrazoliumsalze stellen Enzymaktivitäten dar, bei denen Reduktionsäquivalente gebildet werden. Vitale Zellen setzen durch Reduktion das gelbe, wasserlösliche Tetrazoliumsalz [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxy-methoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium] zu dem braunen wasserlöslichen Formazan um. Als Elektronenkopplungsreagenz dient Phenazin-Ethosulfat. NADPH und NADH sind für die Umwandlung essentiell.

Die Reagenz-Lösung wurde zur Durchführung des Tests im Verhältnis 1:5 mit RPMI 1640-Medium verdünnt. Nach Absaugen des Zellkulturüberstandes wurden 100 µl dieser Lösung je

Kavität auf die Zellen pipettiert. Die Messung der Extinktion bei einer Wellenlänge von 490 nm erfolgte nach einer einstündigen Inkubation im Brutschrank.

3.3.1.5 Bestimmung der Zellproliferation mittels BrdU-Test

Die Proliferationsaktivität der Zellen wurde durch einen Brom-Desoxyuridin-(BrdU)-Test dargestellt. Das Prinzip des Testes beruht darauf, dass anstelle von Thymidin BrdU in die DNA der Zellen eingebaut und anschließend mit einem ELISA quantifiziert wird. Dabei wird ein spezifischer, peroxydasegebundener Antikörper genutzt. Die Peroxydase setzt das Substrat TMB (3,3‘5,5‘-Tetramethylbenzidin) um. Proportional zu der Menge des an den Antikörper gekoppelten Enzyms kommt es zu einer Blaufärbung der Lösung.

Die Vorbereitung der für den Test benötigten Reagenzien erfolgte nach Angaben des Herstellers. Dazu zählen Markierungsreagenz (BrdU-labeling Reagenz), Blockierungspuffer, BrdU-Antikörper und Waschpuffer.

Zu Beginn des Tests erfolgte das Markieren der Zellen mit dem Markierungsreagenz (10 µl/Kavität). Nach einer dreistündigen Inkubation im Brutschrank wurden der Überstand abgesaugt und 200 µl Fixationslösung in jede Kavität pipettiert. Die anschließenden Schritte erfolgten bei Raumtemperatur. 30 Minuten später wurde die Lösung entfernt und durch 200 µl Blockierungspuffer ersetzt. Nach weiteren 30 Minuten wurde diese wiederum durch 100 µl Antikörperlösung ersetzt. Nach einer 60-minütigen Inkubation erfolgte das Entfernen der ungebundenen Antikörper durch dreimaliges Waschen mit je 300 µl Waschpuffer. Hierauf erfolgte die Zugabe von 100 µl Substratlösung pro Kavität. Nach Blaufärbung des Substrats wurde die Reaktion durch Zugabe von 25 µl H2SO4 (2N) abgebrochen. Dabei erfolgte ein Umfärben von Blau zu Gelb. Die Farbintensität wurde fotometrisch bei einer Wellenlänge von 450 nm bestimmt.

3.3.1.6 Ermittlung der Wachstumskurve mittels BrdU-Test

Um zu ermitteln, zu welchem Zeitpunkt eine proliferationsfördernde Substanz ihren maximalen Effekt im BrdU-Test zeigt, wurden Wachstumskurven für MSC-P5 erstellt. Zum Zeitpunkt 0 wurden 5.000 Zellen je Kavität (entspricht 10.000 Zellen/cm²) in mit 10 % FKS angereichertem RPMI 1640-Medium ausgesät. Ein Mediumwechsel erfolgte nach 24 Stunden.

Dabei wurde den Zellen entweder erneut angereichertes Medium oder reines RPMI 1640-Medium zugeführt. Jeweils 24, 48, 72, 96, 120 und 144 Stunden nach der Aussaat wurde den Zellen BrdU-labeling Reagenz (1:100 mit RPMI 1640 verdünnt) zugefügt und im Anschluß ein BrdU-Test durchgeführt. Die Proliferation der MSC-P5-Zellen in Abhängigkeit vom Medium und von der Zeit nach der Aussaat ist in der Abbildung 10 dargestellt.

0 500 1000 1500 2000 2500

0 24 48 72 96 120 144

Std. nach Aussaat

BrdU-Einbau

ohne FKS mit FKS

Abb. 10: Proliferationsbestimmung von MSC-P5-Zellen in Abhängigkeit vom Medium und von der Zeit nach der Aussaat. Angabe von Mittelwert ± Standardabweichung von sechs einzelnen Messungen.

Demnach ist zu sehen, dass es bei den Zellen, die beim Mediumwechsel reines RPMI 1640-Medium erhielten, zu keinem Anstieg der Proliferationsaktivität kam. Die kontinuierlich in angereichertem Medium kultivierten Zellen zeigten dagegen eine signifikante Erhöhung der Proliferationsaktivität, die 120 Stunden nach der Aussaat ihren Höhepunkt erreicht hatte.

3.3.1.7 Proliferationsversuche an MSC-P5-Zellen

In Anlehnung an die Ergebnisse der Bestimmung der Wachstumskurve für MSC-P5 wurden die Proliferationsversuche mit zu testenden Substanzen wie folgt durchgeführt:

Zur Stunde 0 wurden in angereichertem RPMI 1640-Medium jeweils 5.000 Zellen je Kavität in eine 96-well Kulturplatte ausgesät. Nach 24 Stunden wurde das alte Medium abgesaugt und mit reinem RPMI 1640-Medium, in dem die Testsubstanz oder das Vehikel gelöst war, ersetzt. Zur Stunde 120 wurde das Medium abgesaugt und durch BrdU-Markierungs-Reagenz (1:100 mit RPMI 1640 verdünnt) ersetzt. Nach einer dreistündigen Inkubationszeit (Stunde 123) erfolgte der BrdU-Test wie oben beschrieben. In den mit den Testsubstanzen durchgeführten Versuchen wurden die Ergebnisse relativ zur Kontroll-Gruppe (Ko = 100%) ausgedrückt.

3.3.1.8 Bestimmung der PGE2-Konzentration im Zellkulturüberstand mittels ELISA

Die PGE2-Konzentration im Zellkulturüberstand wurde mit Hilfe eines kompetitiven Immunabsorptionstestes (ELISA) bestimmt. Dabei konkurriert das in der Probe vorhandene PGE2 mit einer definierten Menge an Alkalische-Phosphatase-konjugiertem PGE2 um die Bindung an eine limitierte Anzahl von monoklonalen Maus-Antikörpern. Diese Antikörper haften wiederum mit ihrem Fc-Ende an eine mit spezifischen Antikörpern beschichtete Platte.

Nach der Inkubationspause mit dem Probenüberstand wurde die Platte gewaschen, um ungebundenes PGE2 zu entfernen. Je mehr PGE2 in dem Probenüberstand vorhanden war, desto weniger markiertes PGE2 haftete am Plattenboden. Durch die Zugabe des Entwicklungsreagenz p-Nitrophenyl-Phosphat, welches von der Alkalischen Phosphatase zu einem gelben Farbstoff hydrolysiert wird, wurde die Entwicklung des ELISA ermöglicht.

Über die fotometrische Extinktionsmessung bei 450 nm wurde der PGE2-Gehalt des Probenüberstandes quantifiziert. Eine frisch angesetzte Standardreihe, die von 39 bis 5000 pg PGE2/ml reichte, wurde bei jedem Messansatz mitgeführt. Aus den Bindungsraten, die mit den Standards ermittelt wurden, konnten Kalibrierungskurven erstellt werden, auf die die Extinktionen der Proben bezogen wurden.

3.3.1.9 Statistische Auswertung der Proliferations- und PGE2-Bildungsversuche

Zur Untersuchung auf signifikante Unterschiede wurde der Kruskal-Wallis ANOVA Rangsummentest, gefolgt vom Mann-Whitney Rangsummentest, verwendet. Dabei galten Irrtumswahrscheinlichkeiten von 5 % als signifikant, von 1 % als hochsignifikant und von 0,1

% als höchstsignifikant.

3.3.2 RT-PCR

3.3.2.1 Isolierung der RNA

Die Extraktion der RNA erfolgte mit peqGOLD^TM Trifast. Dazu wurden die Zellen einer 25 cm²-Kulturflasche zunächst mit 3 ml peqGOLD^TM Trifast lysiert und in ein neues Gefäß überführt. Durch die Zugabe von 0,6 ml Chloroform und, nach zehnminütiger Inkubation, Zentrifugation bei 12.000 x g und 4°C für 5 Minuten kam es zu einer Phasentrennung: die untere rote Phenol-Chloroform-Phase (DNA und Proteine enthaltend), die Interphase und die obere farblose wässrige Phase. Die RNA-enthaltende wässrige Phase wurde in ein neues Gefäß überführt. Durch das Hinzufügen von 1,5 ml Isopropanol wurde die RNA präzipitiert.

Nach Durchmischung und zehnminütiger Inkubationszeit bei Raumtemperatur wurde die RNA durch Zentrifugation (12.000 x g, 4°C, 10 min) pelletiert. Das Pellet wurde zweimal mit 0,3 ml Ethanol (75%) gewaschen.

Anschließend wurde ein DNA-Verdau durchgeführt. Dabei wurde das Pellet in 30 µl DEPC-Wasser aufgenommen, mit 5 µl RQ1 RNAse-free DNAse^® sowie 4 µl RQ1 Reaktionspuffer^® versetzt und 15 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Es folgte eine zweite Aufbereitung mit Trifast^TM. Je nach Pelletgröße wurde die RNA in 20 – 50 µl mit DEPC gereinigtem Wasser gelöst und bis zur weiteren Verwendung bei – 20°C gelagert.

3.3.2.2 Primer

Die für die RT-PCR benötigten Primer-Sequenzen wurden entweder abgeleitet oder aus Publikationen übernommen (Fa. Big Biotech, Freiburg). Optimale Zyklenzahl und Annealing-Temperatur wurden für die jeweiligen Primer-Paare in Vorversuchen ermittelt. In Tabelle 5 sind die verwendeten Primer aufgelistet.

Tabelle 5: Sequenzen und RT-PCR-Bedingungen der verwendeten Primer

Primer Sequenz (5‘-3‘) Optimale

Zyklenzahl